1   2   3   4   5
Ім'я файлу: Розробка отримання глюкоізомерази із Lactobacillus brevis та її
Розширення: docx
Розмір: 553кб.
Дата: 26.06.2020

  1. ЛІТЕРАТУРНИЙ ОГЛЯД ЗА ТЕМОЮ КУРСОВОГО ПРОЕКТУ


Лактобактерії (лат. Lactobacillus) - рід грампозитивних анаеробних неспороутворюючих молочнокислих бактерій. Також називаються лактобацили.

Лактобактерії зазвичай мають правильну форму довгої «палички»,

іноді коковидної, розташовуються в коротких ланцюжках або поодинці. У процесі свого нормального метаболізму лактобактерії здатні утворювати молочну кислоту, перекис водню, продукувати лізоцим і речовини з антибіотичною активністю: реутерін, плантаріцін, лактоцідін, лактолін. Гетероферментативні види лактобацил в якості кінцевих продуктів, крім того, можуть продукувати оцтову кислоту і вуглекислий газ.

Лактобактерії - нормальна мікрофлора людини

Багато видів лактобактерій (лактобацил) є нормальною мікрофлорою шлунково-кишкового тракту, починаючи від порожнини рота і закінчуючи товстою кишкою. Раніше вважалося, що в шлунку лактобактерії практично відсутні (102-103 КУО/ мл шлункового соку). Однак, в 2005 році в шлунку здорових людей були виявлені штами лактобактерій, що пристосувалися, подібно Helicobacter pylori до існування в різко кислому середовищі шлунка: L. gastricus, L. antri, L. kalixensis, L. ultunensis (Циммерман Я.С.)[1]. У тонкій кишці є невелика кількість лактобактерій, розташованих в пристінному шарі (103-104 КУО / мл кишкового соку). У товстій кишці лактобактерій значно більше (106-107 КУО/ г фекалій), вони представлені видами: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus і іншими [2].

В табл.1 відображені види бактерій, що знаходяться в кишківнику людини.
Таблиця 1 - Бактерії, які можна знайти в кишківнику людини

Бактерія

Ймовірність знаходження (%)

Bacteroides fragilis

100

Bacteroides melaninogenicus

100

Bacteroides oralis

100

Enterococcus faecalis

100

Escherichia coli

100

Enterobacter sp.

40-80

Klebsiella sp.

40-80

Bifidobacterium bifidum

30-70

Staphylococcus aureus

30-50

Lactobacillus

20-60

Clostridium perfringens

25-30

Proteus mirabilis

5-55

Clostridium tetani

1-35

Clostridium septicum

5-25

Pseudomonas aeruginosa

3-11


Безпосередньо контактуючи з ентероцитами, лактобактерії (як і біфідобактерії) стимулюють механізми захисту організму людини, в тому числі збільшення швидкості регенерації слизової оболонки, впливають на синтез антитіл до споріднених, але володіючих патогенними властивостями мікроорганізмів, активують фагоцитоз, а також синтез лізоциму, інтерферонів та цитокінів. Лактобактерії продукують ряд гідролітичних ферментів, зокрема, лактазу, що розщеплює лактозу (молочний цукор) і перешкоджає розвитку лактазній недостатностоті. Лактобактерії підтримують кислотність товстої кишки на рівні 5,5-5,6 рН.
Лактобактерії - нормальна і патогенна мікрофлора піхви

Лактобактерії (лактобацили) є превалюючим типом нормальної мікрофлори вульви і піхви (106- 109 КУО / мл виділень). Основні види представлених в піхві лактобацил наступні: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus cellobiosum. Головні функції лактобактерій в піхві - підтримувати кисле середовище і пригнічувати ріст умовно-патогенних мікроорганізмів. Раніше всі лактобактерії, які виявляли у піхві, називали паличками Дедерлейна (на честь німецького гінеколога A. Doderlein, 1860-1941) [3].

Лактобактерії L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii і L. iners поряд з Atopobium vaginae, Leptotrichia amnionii, Sneathia sanguinegens, Eggerthella spp. асоціюють з бактеріальним вагінітом [4].
1.1. Характеристика Lactobacillus brevis
О пис і значимість. Lactobacillus brevis - це вид молочнокислих бактерій, всі з яких є грампозитивними, неспороутворюючими організмами, основний метаболічний шлях яких включає ферментацію гексозних цукрів для отримання молочної кислоти.

Значення всіх молочнокислих бактерій протягом всієї історії аж до сьогодення полягає у їх метаболізмі, який використовується для збереження харчових продуктів і напоїв. Незважаючи на простий метаболічний шлях, молочнокислі бактерії відіграють помітну роль в
Рис. 1.1 - Lactobacillus brevis

світовому продовольчому постачанні та виробництві деяких сортів пива і вина. Разом з іншими бактеріями, що виробляють молочну кислоту - L. brevis відіграє незамінну роль у бродінні деяких продуктів, таких як квашена капуста, і солоні огірки, і також є найпоширенішою причиною зіпсованого пива. Насправді, у Німеччині в якийсь момент більше половини випадків псування пива були пов'язані тільки з L. brevis[5].

Важливість секвенированного геному L. brevis полягає в тому, що інтегральні білки і ферменти можуть бути виділені й використані в такому експерименті, як спостереження штамів хмілестійких молочнокислих бактерій пивного псування або виділення ДНК декарбоксилази, яка може бути клонована і вставлена в іншу хромосомну ДНК для кодування нових білків для цього штаму.

Структура геному. Секвенування всього геному було проведено в Міністерстві енергетики США. Завершення секвенування геному L. brevis показало, що ця бактерія є округлою і має одну хромосому довжиною 2,3 Мpb, що містить 2185 білків і 82 РНК. Дві плазміди, що також були секвеновані є набагато меншими за довжиною і мають 11 і 12 білків [6].

Еволюція системи Лактобацили розкриває багато про спадщину видів і втрати генів предків, а також може підказати, де відбувалися дуплікації і додавання нових і унікальних генів. "Филогенетичний аналіз, порівняння змісту генів по всій групі і реконструкція наборів генів предків вказують на поєднання великої втрати генів і придбання ключових генів за допомогою горизонтального переносу генів в ході коеволюції молочнокислих бактерій з їх місцеперебуваннями" [6]. Однією помітною відмінністю L. brevis від інших видів - є втрата генів, що здійснюють біосинтез аргініну та ароматичних амінокислот.

Клітинна структура і метаболізм. Lactobacillus brevis і лактобацили в цілому є грампозитивними, палочкоподібними, не спороутворюючими бактеріями, розташованими поодиноко. Це передбачає товсту клітинну стінку і внутрішню мембрану у формі стрижня. Хоча секвенирований геном L. brevis відносно невеликий, молочнокислі бактерії можуть кодувати безліч різних транспортерів для задоволення потреб як прототрофних, так і ауксотрофних штамів. Бактерії L. brevis є аеробними бактеріями, вони рухливі і пробіотичні [7].

Ф ерментація є одним з найбільш поширених шляхів метаболізму у L. brevis і більшості інших молочнокислих бактерій. У цьому метаболічному шляху цукор (гексози) перетворюється в молочну кислоту 6-фосфоглюконатним шляхом, виробляюч CO2 і етанол [8]. Енергія (АТФ) генерується шляхом субстратного фосфо-лювання.
Рис. 1. 2 - Процес кон’югації

Кінцевий продукт бродіння - молочна кислота, яка сприяє отриманню таких харчових продуктів, як сир, йогурт, кисломолочні продукти та ін. шляхом інгібування росту інших організмів і зниження рН продуктів. На цьому шляху відбувається безліч метаболічних реакцій, однією з яких є розщеплення молочних продуктів для виробництва сиру. L. brevis використовують в промисловому виробництві, як закваску для декількох типів пива і хліба.

Розповсюдження. L. brevis в основному зустрічаються в їжі. Він може бути знайдений на молочних фермах у сирому молоці, особливо в бичачих фекаліях; однак він рідко поєднується з еукариотами симбіотичним чином [9].

Найчастіше ці бактерії живуть в їжі, де вони виконують свій метаболізм. L. brevis спеціально використовують у виробництві кислих продуктів харчування.

Одна з найцікавіших взаємодій - це взаємодія з кишковою флорою людини. Лактобацила при прийомі всередину надає пробіотичні дію, так як покращує роботу імунної системи [10].

Застосування в біотехнології. L. brevisстійкий до хмелю, викликає псування пива. Цей штам бактерій легко вивчати та досліджувати, тому що відомі його оптимальні умови росту: найшвидший ріст відбувається при t = 30°С і при рН 4-6. Тільки кілька штамів L. brevis є нестійкими до сполук хмелю. Інше джерело показує, що при проведенні ДНК-PCR-аналізу на Lactobacillus brevis штами, виявлені на пивоварних заводах, були виділені праймером, який може призвести до розрізнення псування і не псування штамів молочнокислих бактерій. Цей фрагмент праймера був названий hitA, і він може кодувати білки, які відповідають за незв'язаний АТФ мембранний транспортер, який був помічений у прокаріотичних, а також і у еукаріотичних видів. У середовищі Гіркого хмелю мембрана розпадається через чутливість градієнта рН, і H+ обмінюється на двовалентні катіони, наприклад Mn2+. В ході експерименту був зроблений висновок про те, що ген hitA може бути відповідальний за створення продуктів, які є хмелестійкими, через введення іонів металів, що по суті руйнує інтактний протонний градієнт [11].
1.2. Характеристика поживних середовищ для L. brevis
Для виділення лактобактерій - основних представників симбіотичної мікрофлори запропонований ряд поживних середовищ.

Відоме поживне середовище (табл. 1111) для виділення молочнокислих бактерій (Абросимова Н.А., Кушнарьова М.В. Поживне середовище для виділення молочнокислих бактерій // Лабораторна справа, 1991, № 3, с.78-79) НА МОВІ ОРИГІНАЛУ!!! ДУМАЮ ВОНО БУЛО РОСІЙСЬКЕ до складу якої входять, г / л:

Таблиця 11- _Склад сухого поживного середовища

Сухе поживне середовище

Пептон

20,0

Агар КД

30,0

Глюкоза

18,0

Цитрат амонію

2,0

Калію дигідрофосфат

6,0

Крижана оцтова кислота

1,32

Розчин солей

5,0

Вода дистильована

до 1 л


На даному середовищі добре ростуть різні молочнокислі бактерії,

воно володіє селективними властивостями, але його недоліком є ​​багатокомпонентність і важкодоступність ряду інгредієнтів.

Відоме живильне середовище для виділення лактобактерій (табл. 11), яке містить ( г/ л):
Таблиця 11- _Склад

Сірчанокислий марганець

0,049-0,05

Сірчанокислий магній

0,19-0,20

L-цистеїн солянокислий

0,095-0,10

Калій фосфорнокислий 2-заміщений

1,95-2,0

Петон

4,9-5,0

Глюкоза

19,8-20,0

Агар-агар

14,9-15,1

Стерильний крейда

9,9-10,0

Гідролізат молозивний казеїно-сироваткової маси

все інше


На даному середовищі добре ростуть лактобактерії, індикація

колоній яких здійснюється по розплавленню крейди під колонією. Однак це середовище не володіє селективними властивостями, і на ній можуть рости будь-які бактерії, в.ч. кишкова паличка або ентерококи, які також можуть виробляти кислоти і знебарвлювати середу під колоніями. Вона не прозора, що ускладнює опис колоній, що виросли. Крім того, не всім лабораторіям доступний гідролізат молозивний казеїно-сироваткової маси.

Відоме середовище для виділення лактобактерій, склад якої представлений в наступному вигляді (табл. 11), г / л:
Таблиця 11- _Склад

Панкреатичний гідролізат казеїну сухий

15-30

Екстракт кормових дріжджів сухий

3-7

Глюкоза

17-25

Цистеїн

0,1-0,3

Залізо сірчанокисле 7-водне

0,03-0,06

Магній сірчанокислий 7-водний

0,6-1,0

Цитрат амонію

1,5-3,5

Калій фосфорнокислий 1-заміщений

4,0-8,0

Натрій лимоннокислий 3-заміщений

6,0-8,5

Натрій оцтовокислий плавлений

7,0-8,0

Агар мікробіологічний

7-12,0

Кухонна сіль

3,0-8,0

Крісталвіолет

0,002-0,0025

Поліміксин М сульфат

0,04-0,06

Вода дистильована

інше


Середовище має вираженої селективність, готується без стерилізації.

Однак вона має фіолетове забарвлення, що ускладнює дослідження колоній в світлі, ряд компонентів дорогий і важкодоступний.

Відоме просте, легко відтворене поживне середовище для виділення молочнокислих бактерій (Квасніков Є.І., Нестеренко О.А. Молочнокислі бактерії та шляхи їх використання. - М .: Наука, 1975. - С.60-61, прототип).
Дане середовище складається з, мас.%:

Рослинний відвар (капуста)

10,0

Пептон

1,0

Глюкоза

2,0

Етиловий спирт

8-16

Агар

2,0

Дистильована вода

інше


Недоліком даного середовища є слабкі ростові і селективні властивості, в результаті чого на ній в рівній мірі ростуть бактерії інших родів, які можуть пригнічувати ріст молочнокислих бактерій, особливо при їх низькій концентрації в досліджуваному матеріалі.

Завданням запропонованого винаходу є отримання простий у приготуванні і економічного живильного середовища для виділення молочнокислих бактерій з фекалій тварин.

Поставлена задача досягається тим, що запропоноване живильне середовище для виділення лактобактерій, що включає капустяний відвар, глюкозу, агар, відрізняється тим, що в якості додаткових джерел живлення і селективності містить молочну сироватку, дріжджовий автолізат і оцтову кислоту при наступному співвідношенні компонентів, мас.%:

  1   2   3   4   5

скачати

© Усі права захищені
написати до нас