Ім'я файлу: Розробка отримання глюкоізомерази із Lactobacillus brevis та її
Розширення: docx
Розмір: 553кб.
Дата: 26.06.2020
скачати
Розширення: docx
Розмір: 553кб.
Дата: 26.06.2020
скачати
ЛІТЕРАТУРНИЙ ОГЛЯД ЗА ТЕМОЮ КУРСОВОГО ПРОЕКТУ
Лактобактерії (лат. Lactobacillus) - рід грампозитивних анаеробних неспороутворюючих молочнокислих бактерій. Також називаються лактобацили.
Лактобактерії зазвичай мають правильну форму довгої «палички»,
іноді коковидної, розташовуються в коротких ланцюжках або поодинці. У процесі свого нормального метаболізму лактобактерії здатні утворювати молочну кислоту, перекис водню, продукувати лізоцим і речовини з антибіотичною активністю: реутерін, плантаріцін, лактоцідін, лактолін. Гетероферментативні види лактобацил в якості кінцевих продуктів, крім того, можуть продукувати оцтову кислоту і вуглекислий газ.
Лактобактерії - нормальна мікрофлора людини
Багато видів лактобактерій (лактобацил) є нормальною мікрофлорою шлунково-кишкового тракту, починаючи від порожнини рота і закінчуючи товстою кишкою. Раніше вважалося, що в шлунку лактобактерії практично відсутні (102-103 КУО/ мл шлункового соку). Однак, в 2005 році в шлунку здорових людей були виявлені штами лактобактерій, що пристосувалися, подібно Helicobacter pylori до існування в різко кислому середовищі шлунка: L. gastricus, L. antri, L. kalixensis, L. ultunensis (Циммерман Я.С.)[1]. У тонкій кишці є невелика кількість лактобактерій, розташованих в пристінному шарі (103-104 КУО / мл кишкового соку). У товстій кишці лактобактерій значно більше (106-107 КУО/ г фекалій), вони представлені видами: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus і іншими [2].
В табл.1 відображені види бактерій, що знаходяться в кишківнику людини.
Таблиця 1 - Бактерії, які можна знайти в кишківнику людини
| Бактерія | Ймовірність знаходження (%) |
| Bacteroides fragilis | 100 |
| Bacteroides melaninogenicus | 100 |
| Bacteroides oralis | 100 |
| Enterococcus faecalis | 100 |
| Escherichia coli | 100 |
| Enterobacter sp. | 40-80 |
| Klebsiella sp. | 40-80 |
| Bifidobacterium bifidum | 30-70 |
| Staphylococcus aureus | 30-50 |
| Lactobacillus | 20-60 |
| Clostridium perfringens | 25-30 |
| Proteus mirabilis | 5-55 |
| Clostridium tetani | 1-35 |
| Clostridium septicum | 5-25 |
| Pseudomonas aeruginosa | 3-11 |
Безпосередньо контактуючи з ентероцитами, лактобактерії (як і біфідобактерії) стимулюють механізми захисту організму людини, в тому числі збільшення швидкості регенерації слизової оболонки, впливають на синтез антитіл до споріднених, але володіючих патогенними властивостями мікроорганізмів, активують фагоцитоз, а також синтез лізоциму, інтерферонів та цитокінів. Лактобактерії продукують ряд гідролітичних ферментів, зокрема, лактазу, що розщеплює лактозу (молочний цукор) і перешкоджає розвитку лактазній недостатностоті. Лактобактерії підтримують кислотність товстої кишки на рівні 5,5-5,6 рН.
Лактобактерії - нормальна і патогенна мікрофлора піхви
Лактобактерії (лактобацили) є превалюючим типом нормальної мікрофлори вульви і піхви (106- 109 КУО / мл виділень). Основні види представлених в піхві лактобацил наступні: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus cellobiosum. Головні функції лактобактерій в піхві - підтримувати кисле середовище і пригнічувати ріст умовно-патогенних мікроорганізмів. Раніше всі лактобактерії, які виявляли у піхві, називали паличками Дедерлейна (на честь німецького гінеколога A. Doderlein, 1860-1941) [3].
Лактобактерії L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii і L. iners поряд з Atopobium vaginae, Leptotrichia amnionii, Sneathia sanguinegens, Eggerthella spp. асоціюють з бактеріальним вагінітом [4].
1.1. Характеристика Lactobacillus brevis
О
пис і значимість. Lactobacillus brevis - це вид молочнокислих бактерій, всі з яких є грампозитивними, неспороутворюючими організмами, основний метаболічний шлях яких включає ферментацію гексозних цукрів для отримання молочної кислоти.Значення всіх молочнокислих бактерій протягом всієї історії аж до сьогодення полягає у їх метаболізмі, який використовується для збереження харчових продуктів і напоїв. Незважаючи на простий метаболічний шлях, молочнокислі бактерії відіграють помітну роль в
Рис. 1.1 - Lactobacillus brevis
світовому продовольчому постачанні та виробництві деяких сортів пива і вина. Разом з іншими бактеріями, що виробляють молочну кислоту - L. brevis відіграє незамінну роль у бродінні деяких продуктів, таких як квашена капуста, і солоні огірки, і також є найпоширенішою причиною зіпсованого пива. Насправді, у Німеччині в якийсь момент більше половини випадків псування пива були пов'язані тільки з L. brevis[5].
Важливість секвенированного геному L. brevis полягає в тому, що інтегральні білки і ферменти можуть бути виділені й використані в такому експерименті, як спостереження штамів хмілестійких молочнокислих бактерій пивного псування або виділення ДНК декарбоксилази, яка може бути клонована і вставлена в іншу хромосомну ДНК для кодування нових білків для цього штаму.
Структура геному. Секвенування всього геному було проведено в Міністерстві енергетики США. Завершення секвенування геному L. brevis показало, що ця бактерія є округлою і має одну хромосому довжиною 2,3 Мpb, що містить 2185 білків і 82 РНК. Дві плазміди, що також були секвеновані є набагато меншими за довжиною і мають 11 і 12 білків [6].
Еволюція системи Лактобацили розкриває багато про спадщину видів і втрати генів предків, а також може підказати, де відбувалися дуплікації і додавання нових і унікальних генів. "Филогенетичний аналіз, порівняння змісту генів по всій групі і реконструкція наборів генів предків вказують на поєднання великої втрати генів і придбання ключових генів за допомогою горизонтального переносу генів в ході коеволюції молочнокислих бактерій з їх місцеперебуваннями" [6]. Однією помітною відмінністю L. brevis від інших видів - є втрата генів, що здійснюють біосинтез аргініну та ароматичних амінокислот.
Клітинна структура і метаболізм. Lactobacillus brevis і лактобацили в цілому є грампозитивними, палочкоподібними, не спороутворюючими бактеріями, розташованими поодиноко. Це передбачає товсту клітинну стінку і внутрішню мембрану у формі стрижня. Хоча секвенирований геном L. brevis відносно невеликий, молочнокислі бактерії можуть кодувати безліч різних транспортерів для задоволення потреб як прототрофних, так і ауксотрофних штамів. Бактерії L. brevis є аеробними бактеріями, вони рухливі і пробіотичні [7].
Ф
ерментація є одним з найбільш поширених шляхів метаболізму у L. brevis і більшості інших молочнокислих бактерій. У цьому метаболічному шляху цукор (гексози) перетворюється в молочну кислоту 6-фосфоглюконатним шляхом, виробляюч CO2 і етанол [8]. Енергія (АТФ) генерується шляхом субстратного фосфо-лювання. Рис. 1. 2 - Процес кон’югації
Кінцевий продукт бродіння - молочна кислота, яка сприяє отриманню таких харчових продуктів, як сир, йогурт, кисломолочні продукти та ін. шляхом інгібування росту інших організмів і зниження рН продуктів. На цьому шляху відбувається безліч метаболічних реакцій, однією з яких є розщеплення молочних продуктів для виробництва сиру. L. brevis використовують в промисловому виробництві, як закваску для декількох типів пива і хліба.
Розповсюдження. L. brevis в основному зустрічаються в їжі. Він може бути знайдений на молочних фермах у сирому молоці, особливо в бичачих фекаліях; однак він рідко поєднується з еукариотами симбіотичним чином [9].
Найчастіше ці бактерії живуть в їжі, де вони виконують свій метаболізм. L. brevis спеціально використовують у виробництві кислих продуктів харчування.
Одна з найцікавіших взаємодій - це взаємодія з кишковою флорою людини. Лактобацила при прийомі всередину надає пробіотичні дію, так як покращує роботу імунної системи [10].
Застосування в біотехнології. L. brevisстійкий до хмелю, викликає псування пива. Цей штам бактерій легко вивчати та досліджувати, тому що відомі його оптимальні умови росту: найшвидший ріст відбувається при t = 30°С і при рН 4-6. Тільки кілька штамів L. brevis є нестійкими до сполук хмелю. Інше джерело показує, що при проведенні ДНК-PCR-аналізу на Lactobacillus brevis штами, виявлені на пивоварних заводах, були виділені праймером, який може призвести до розрізнення псування і не псування штамів молочнокислих бактерій. Цей фрагмент праймера був названий hitA, і він може кодувати білки, які відповідають за незв'язаний АТФ мембранний транспортер, який був помічений у прокаріотичних, а також і у еукаріотичних видів. У середовищі Гіркого хмелю мембрана розпадається через чутливість градієнта рН, і H+ обмінюється на двовалентні катіони, наприклад Mn2+. В ході експерименту був зроблений висновок про те, що ген hitA може бути відповідальний за створення продуктів, які є хмелестійкими, через введення іонів металів, що по суті руйнує інтактний протонний градієнт [11].
1.2. Характеристика поживних середовищ для L. brevis
Для виділення лактобактерій - основних представників симбіотичної мікрофлори запропонований ряд поживних середовищ.
Відоме поживне середовище (табл. 1111) для виділення молочнокислих бактерій (Абросимова Н.А., Кушнарьова М.В. Поживне середовище для виділення молочнокислих бактерій // Лабораторна справа, 1991, № 3, с.78-79) НА МОВІ ОРИГІНАЛУ!!! ДУМАЮ ВОНО БУЛО РОСІЙСЬКЕ до складу якої входять, г / л:
Таблиця 11- _Склад сухого поживного середовища
| Сухе поживне середовище | |
| Пептон | 20,0 |
| Агар КД | 30,0 |
| Глюкоза | 18,0 |
| Цитрат амонію | 2,0 |
| Калію дигідрофосфат | 6,0 |
| Крижана оцтова кислота | 1,32 |
| Розчин солей | 5,0 |
| Вода дистильована | до 1 л |
На даному середовищі добре ростуть різні молочнокислі бактерії,
воно володіє селективними властивостями, але його недоліком є багатокомпонентність і важкодоступність ряду інгредієнтів.
Відоме живильне середовище для виділення лактобактерій (табл. 11), яке містить ( г/ л):
Таблиця 11- _Склад
| Сірчанокислий марганець | 0,049-0,05 |
| Сірчанокислий магній | 0,19-0,20 |
| L-цистеїн солянокислий | 0,095-0,10 |
| Калій фосфорнокислий 2-заміщений | 1,95-2,0 |
| Петон | 4,9-5,0 |
| Глюкоза | 19,8-20,0 |
| Агар-агар | 14,9-15,1 |
| Стерильний крейда | 9,9-10,0 |
| Гідролізат молозивний казеїно-сироваткової маси | все інше |
На даному середовищі добре ростуть лактобактерії, індикація
колоній яких здійснюється по розплавленню крейди під колонією. Однак це середовище не володіє селективними властивостями, і на ній можуть рости будь-які бактерії, в.ч. кишкова паличка або ентерококи, які також можуть виробляти кислоти і знебарвлювати середу під колоніями. Вона не прозора, що ускладнює опис колоній, що виросли. Крім того, не всім лабораторіям доступний гідролізат молозивний казеїно-сироваткової маси.
Відоме середовище для виділення лактобактерій, склад якої представлений в наступному вигляді (табл. 11), г / л:
Таблиця 11- _Склад
| Панкреатичний гідролізат казеїну сухий | 15-30 |
| Екстракт кормових дріжджів сухий | 3-7 |
| Глюкоза | 17-25 |
| Цистеїн | 0,1-0,3 |
| Залізо сірчанокисле 7-водне | 0,03-0,06 |
| Магній сірчанокислий 7-водний | 0,6-1,0 |
| Цитрат амонію | 1,5-3,5 |
| Калій фосфорнокислий 1-заміщений | 4,0-8,0 |
| Натрій лимоннокислий 3-заміщений | 6,0-8,5 |
| Натрій оцтовокислий плавлений | 7,0-8,0 |
| Агар мікробіологічний | 7-12,0 |
| Кухонна сіль | 3,0-8,0 |
| Крісталвіолет | 0,002-0,0025 |
| Поліміксин М сульфат | 0,04-0,06 |
| Вода дистильована | інше |
Середовище має вираженої селективність, готується без стерилізації.
Однак вона має фіолетове забарвлення, що ускладнює дослідження колоній в світлі, ряд компонентів дорогий і важкодоступний.
Відоме просте, легко відтворене поживне середовище для виділення молочнокислих бактерій (Квасніков Є.І., Нестеренко О.А. Молочнокислі бактерії та шляхи їх використання. - М .: Наука, 1975. - С.60-61, прототип).
Дане середовище складається з, мас.%:
| Рослинний відвар (капуста) | 10,0 |
| Пептон | 1,0 |
| Глюкоза | 2,0 |
| Етиловий спирт | 8-16 |
| Агар | 2,0 |
| Дистильована вода | інше |
Недоліком даного середовища є слабкі ростові і селективні властивості, в результаті чого на ній в рівній мірі ростуть бактерії інших родів, які можуть пригнічувати ріст молочнокислих бактерій, особливо при їх низькій концентрації в досліджуваному матеріалі.
Завданням запропонованого винаходу є отримання простий у приготуванні і економічного живильного середовища для виділення молочнокислих бактерій з фекалій тварин.
Поставлена задача досягається тим, що запропоноване живильне середовище для виділення лактобактерій, що включає капустяний відвар, глюкозу, агар, відрізняється тим, що в якості додаткових джерел живлення і селективності містить молочну сироватку, дріжджовий автолізат і оцтову кислоту при наступному співвідношенні компонентів, мас.%:
1 2 3 4 5