Ім'я файлу: Лекція_8.doc
Розширення: doc
Розмір: 79кб.
Дата: 22.03.2020
скачати

ðžð²ð°ð» 12


ЛЕКЦІЯ № 8
БІОТЕХНОЛОГІЧНІ СПОСОБИ ОДЕРЖАННЯ БЕЗВІРУСНОГО САДИВНОГО МАТЕРІАЛУ ТА МЕТОДИ КРІОЗБЕРЕЖЕННЯ
План

  1. Одержання безвірусних рослин ін вітро.

  2. Методи знезараження посадкового матеріалу.

  3. Діагностика рослин на наявність вірусів.

  4. Методи кріозберігання.


1. Віруси – неклітинні форми життя, які мають власний геном (молекулу ДНК або РНК) і здатні до відтворення лише в живих клітинах хазяїна (рослини, тварини, бактерії), тобто є паразитами на генетичному рівні.

Залежно від виду нуклеїнової кислоти розрізняють ДНК- і РНК-вмісні віруси, які зверху оточені білковою оболонкою – капсидом. Переважна більшість фітовірусів РНК-вмісні.

Віруси позбавлені багатьох ознак, притаманих всім живим істотам: у них відсутні спеціальні пристосування для самостійної циркуляції в природі, вони не можуть репродукуватись в ізольованому вигляді і у них відсутні енергетичні системи.

У 1966 році на Міжнародному мікробіологічному конгресі було вирішено виділити віруси в окреме самостійне царство – Vira. Віруси діляться на 30 таксономічних груп. Поза клітиною-хазяїна вірус перебуває в нереплікованому стані (стані віріону). Діаметр віріонів становить 20-300 нм, що значно менше за найменших прокаріот.

Віруси потрапляють у клітину найчастіше за допомогою комах або в результаті механічного пошкодження тканин рослини. Нуклеїнова кислота вірусу залишає білкову оболонку і стає активною: реплікується і транслюється у вірусні нуклеїнові кислоти і білки, з яких самозбираються нові віруси. Дочірні віруси виходять з клітини-хазяїна, яка гине. У природі їх розповсюдження забезпечується різними способами: через насіння, корені, бульби, цибулини, пилок, через грунт, рештки хворих рослин, воду, комах-перенощиків або зооспор деяких нижчих грибів. Найчастіше саме людина сприяє розповсюдженню вірусів при щепленні, підрізуванні, пасинкуванні або пікіровці рослин.

Відмічається, що найбільше вірусів міститься у нестиглому насінні, а у стиглому вони поступово інактивуються, що пояснюється переходом насіння до стану спокою і накопичення інгібіторів, які пригнічуютьактивність вірусу (Московець С.М. 1971). Ураження відбувається шляхом повільного транспорту вірусів по рослині. Саме факт повільного переміщення вірусів забезпечує їх відсутність у новостворених меристематичних тканинах, які вилучається і використовуються у практиці для мікроклонального розмноження рослин.

Вірусні захворення різко знижують кількість і якість урожаю різних сільськогосподарських рослин. Наприклад, збитки від вірусу жовтої карликовості складають до 40% урожаю ячменю. Вірусна хвороба цукрового буряка (ризоманія) знижує вдвічі урожай і на 5-6% - цукристість солодких коренів.

На сьогодні відомо понад 400 фітовірусів і ще більше вірусних захворювань у різних рослин. Класифікують захворювання на дві великі групи: мозаїки і жовтухи. Основна симптоматика мозаїк – нерівномірне (мозаїчне) забарвлення листків, яке обумовлене порушеннями пластидного апарату клітин; листки часто бувають зморшкуватими. Характерні ознаки жовтух – загальний хлороз листків, які мають жовтуватий відтінок і скручуються. Листя надзвичайно насичується вуглеводами, що приводить до їх підвищеної жорсткості і крихкості.

На практиці основними засобами з вірусними захворюваннями є: виведення стійких та імунних сортів с.г. культур, знищення комах, бур’янів, хворих рослин, регулювання строків посіву та збирання с.г. рослин,фізичні та хімічні засоби обробки насіннєвого та садивного матеріалу, вакцинація та ін.

Особливі перспективи для оздоровлення рослинного матеріалу від вірусних захворювань відкриває метод культивування верхівкових меристем ін вітро у поєднанні з методами термо- і хіміотерапії.

Перші дослідники, які працювали з культурою ізольованих тканин і органів рослин, проводили експеременти чисто фізіологічного напрямку. У 1934 році один із засновників цього методу П.Уайт (США) повідомив, що віруси відсутні у кінцівках коренів рослин, уражених вірусом тютюнової мозаїки. Подібні результати були одержані у 1949 році в дослідах М.Корнюа і П.Лімансе. Відсутність вірусів в апексах розміром 0,1 мм складає основу методу одержання оздоровлених (безвірусних) рослин з меристем ін вітро, який запропонували Ж.Морель і К.Мартен. У 1952 році вони одержали безвірусні жоржини від уражених рослин.

Чому віруси відсутні у верхівочних меристемах?

Найбільш сприятливими органами для репродукції вірусів є тканини листків. У вірусів відсутні більш будь-які спеціальні пристосування для самостійного (автономного) пересування по рослині, тому можна передбачити симпластичний або апопластичний шлях їх міграції по сформованих тканинах і органах. Відомо, що обмін речовин і органічний зв’язок між клітинами здійснюється крізь пори, які мають власні, дуже маленькі отвори, крізь які проходять тяжі цитоплазми – плазмодесми. Завдяки плазмодесмам з’єднуються в єдине ціле цитоплазми усіх живих клітин і утворюється так званий симпласт.

Мікроскопічні дослідження свідчать, що клітини верхівкової меристеми у період активного поділу дрібні, з тонкою целюлозною оболонкою ізодіаметричної форми. Вони щільно зімкнені між собою, не мають міжклітинників.

Отже існують такі спостереження:

  • Віруси повільно розповсюджуються по рослині;

  • Клітини меристем швидко діляться;

  • Серед клітин верхівкових меристем відсутні міжклітинники, недостатньо налагоджена система плазмодесм, що ускладнює апопластний і симпластний шлях переміщення вірусу.

Таким чином, є всі підстави зробити припущення, що анатомо-фізіологічні особливості верхівкових меристематичних клітин роблять неможливим надходження до них вірусів. Вірус не встигає за швидким утворенням перших груп меристематичних клітин у верхівці розміром близько 0,075-0,1 мм. Розмір меристем визначає поріг концентрації вірусних частинок.

Як правило, для ефективного звільнення від вірусів використовують шматочки меристем розміром 0,10-0,15 мм. Проте чим меншаза розміром меристема, тим складніше вона приживається на поживному середовищі і регенерується у цілу рослину. Метод мікроклонального оздоровлення стає більш надійним і ефективним при додатковій термообробці і хіміотерапії рослин.
2. Окремі фізичні і хімічні фактори мають стимулюючу або пригнічуючу дію на віруси, а також на рослини, у яких вони репродукуються. До цих факторів належать температура, різні види випромінювання, постійне магнітне поле, рН середовища, деякі хімічні речовини.

Термотерапія рослин (дія високих температур) – один із ефективних методів профілактики і лікування вірусних захворювань. Піонером застосування термотерапії для лікування рослин вважають П.Кобуса, який у 1889 році використовував гарячу воду проти вірусного захворювання цукрової тростини. Новий етап у розвитку термотерапії почався у 1935 році, коли американець Л.Кункель застосував гаряче повітря для лікування персика від жовтухи, дрібноплодності і розеточні.

Різні методики оздоровлення рослин від вірусів методом термотерапії передбачають інактивацію вірусної інфекції – температурами 30-50ºC, які протягом певного періоду експозиції не завдають шкоди фізіології самої рослини. Цей метод дозволяє брати для оздоровлення більші за розміром меристеми, які набагато краще виживають на поживних середовищах ін вітро (0,3-0,8 мм). Застосування методу особливо ефективне при отриманні безвірусних рослин, які вегетативно розмножуються (картоплі, яблуні, кісточкових, винограду, хмелю, суниці, малини, квітів та ін.)

Широке впровадження в сільськогосподарську практику безвірусного садивного матеріалу картоплі стало можливем саме завдяки поєднанню методів верхівкових меристем і термотерапії. Ця технологія складається з таких етапів:

  1. Термічна обробка матеріалу (бульб або укорінених верхівок)

  2. Виділення верхівкових меристем і регенерація з них рослин

  3. Індукція столоно- і бульбоутворення. Одержання мікробульб картоплі ін вітро.

Застосування цього методу дозволяє за 3-4 місяці одержати 2-3 тис. рослин придатних для висадки у грунт, тобто близько 20 тис. мікробульб за 9-10 місяців з однієї рослини. Це має велике значення для елітного насінництва. В Інституті картоплярства УААН цим методом оздоровлено понад 70 сортів картоплі. Одержаний таким чином матеріал розмножують протягом двох років у польових умовах, що дає можливість на третій рік мати достатню кількість елітного насінного матеріалу. На експерементальній базі Інституту картоплярства одночасно розмножують 30 тис. рослин ін вітро і одержують три врожаї на рік (це становить близько 100 тис. мікробульб). Розроблений метод скорочує строки розмноження картоплі з 10 до 3-х років.

Метод хіміотерапії базується на обробці рослин речовинами –інгібіторами вірусів або на їх додаванні до поживного середовища ін вітро. Вчені вишукують антивірусні препарати, які виробляються самими рослинами. Позитивні результати одержані в цьому напрямку при використані екстрактів лаванди, ромашки, шавлії та ін. лікарських рослин.

Відома антивірусна дія антибіотиків. Іманін – антибіотик, вилучений із звіробою, сприяє підвищенню стійкості томатів до деяких вірусних захворювань. Комплексне передсадивне застосування тіосечовини і гіберелінів для обробки бульб картоплі сприяє зниженню продукції Х і Y- вірусів у рослин.

Велике значення має рН середовище при самореплікації вірусу. У дослідах на картоплі встановлено, що при значеннях рН близько 10 відбувається дезагрегація вірусів і втрата їх активності.

Метод верхівкових меристем і хіміотерапія успішно доповнюють один одного при використанні панкреотичної РНК-ази, яку додають до поживного середовища. Відсоток здорових рослин-регенерантів на середовищі з РНК-азою у 1,5-2 рази вищий, ніж без неї. Щоб збільшити частку безвірусних меристемних рослин, до поживного середовища часто додають препарат «вірозол» (синтетичний рибоварин).

Існують інші методи одержання безвірусного рослинного матеріалу. Наприклад, метод мікрощеплення, який застосовують при умові, що насіння цитрусових, персика і багатьох плодових культур не передає віруси і залишається здоровим. Рослини, які виросли у пробірці ін вітро з насіння, готують під бінокулярним мікроскопом для мікрощеплення – рослину зрізують, а на кінці залишка стебла роблять надріз, із яким щеплюють необхідний меристематичний експлант.
3. Найважливіша перевага мікророзмноження – одержання величезної кількості рослин – може перетворитись у дуже небезпечний недолік, якщо матеріал не буде перевірений на чистосортність і відсутність вірусів.

Крім того вірус може знаходитись у рослині в прихованому (латентному) стані і зовнішні ознаки не виявляються.

Фізичні і біологічні особливості вірусів потребують специфічних методів їх діагностики. Сучасний стан досліджень передбачає використання таких методів діагностики на наявність у них вірусів:

  • Метод електронної мікроскопії;

  • Індикаторний (біологічний) метод;

  • Метод імунодіагностики (імуноферментний аналіз).

Більш детально ці питання розглядаються призахисті модуля та підготовки студентами рефератів.
4. Можливість підвищення врожайності і поліпшення господарсько цінних ознак рослин забезпечують за наявності і підтримки різноманітних колекцій зародкової плазми та банків генетичних ресурсів рослин (генетичних банків). Сюди можуть бути віднесені різні форми рослин (релікти, ендеми), а також форми, створені традиційними методами чи із залученням нетрадиційних методів – культури тканин, клітинної та генної інженерії.

Ефективним способом збереження генофонду рослин є консервація насіння або частин рослин в умовах заморожування. Для насіння достатніми умовами є температура – 18-20˚C та вологість 3-7%, за яких зберігання може здійснюватись протягом 50-100 років. Найперспективнішим способом довготривалого зберігання насіння є кріоконсервування і зберігання його у парі рідкого азоту (- 160˚C) або в рідкому азоті (- 196˚C). У генетичних банках ряду країн (Польші, Китаю, Японії, США) надійним засобом зберігання генофонду рослин є кріоконсервація – зберігання за температури рідкого азоту - 196˚C. За таких умов можна призупинити ті генетичні зміни, що настають під час тривалого культивування клітин і тканин ін вітро.

Отже на сьогодні єдиним засобом необмеженого зберігання штамів клітин, тканин, органів рослин є кріозберігання. Цим терміном позначають складний багатоетапний процес, який використовують для тривалого зберігання у незмінному вигляді живих клітин, тканин і органів у стані анабіозу.

Основні етапи схеми кріозберігання:

  • Асептичне ізолювання і культивування рослинних тканин;

  • Адаптація до низьких температур (за необхідності);

  • Попереднє культивування матеріалу на відповідному живильному середовищі, доповненому кріпротекторами протягом певного періоду;

  • Додавання кріпротекторів до зразків на підготовчій стадії заморожування;

  • Контрольне охолодження і заморожування проб;

  • Зберігання в рідкому азоті;

  • Швидке розморожування рослинних тканин;

  • Відмивання кріопротекторів;

  • Повторне культивування відновлених тканин та індукція їх регенерації.

Найбільш відповідальним етапом кріозбереження вважається процедура заморожування. Цей процес відносно простий для об’єктів з дуже низьким вмістом води (пилок, насіння), які можна безпосередньо занурювати у рідкий азот і проводити розморожування на повітрі у звичайних умовах. Труднощі виникають при заморожуванні тканин або органів рослин великого розміру. Збереження життєздатності об’єктів за рахунок зниження фази рідкої води забезпечується програмним заморожуванням у присутності кріопротекторів з постійною малою швидкістю (0,3 – 1 град/хв) до - 40 ºС. Присутність кріопротекторів дозволяє вільній воді вийти з клітин і кристалізуватись вже на поверхні у розчині.

Кріопротектори – це речовини, які зв’язують вільну воду як в міжклітинниках, так і в клітинах; ускладнюють її кристалізацію за рахунок утворення з нею водневих зв’язків; зменшують ущільнення протопластів клітин при заморожуванні. Використовують різноманітні речовини-кріопротектори: диметилсульфоксид (ДМСО), поліетиленгліколь (ПЕГ), поліетиленоксид, етеленгліколь, гліцерин, сахарозу, сорбіт, маніт, лактозу та ін.

Методи кріозберігання:

1). Заморожування бруньок і меристем. Кріозберігання генетичних ресурсів меристемами має переваги порівняно з іншими способами. Це пояснюється тим, що меристеми розвиваються безпосередньо в рослини за умови забезпечення високої генетичної стабільності, порівняно легко витримують заморожування, оскільки складаються з дрібних клітин, в яких немає вакуолей. Для заморожування меристем найчастіше використовують занурення в рідкий азот або заморожування з поступовим охолодженням. Результати роботи з меристемами гороху і полуниці свідчать, що коли швидкість охолодження дорівнює 0,6-0,8˚C за 1 хв, зберігається достатньо висока життєздатність – 95%, і після 8-26-тижневого зберігання у рідкому азоті вона залишається на рівні 73%.

2). Особливості заморожування культур клітин і тканин. Відповідні зразки клітинних культур вміщують у спеціальні ампули об’ємом 2 мл у стерильних умовах. У них звичайно утримують 1 млн. клітин. Спочатку проводять повільне охолодження з однаковою швидкістю, а потім поступове заморожування під впливом низьких температур одно- або багаторазово, потім застосовують занурення в рідкий азот за температури - 196˚C. Розморожування здійснюють протягом 1-2 хв, за умови, що пробірки погойдуються.

3). Заморожування протопластів. Протопласти значно відрізняються від суспензії клітин: у них відсутні клітинна стінка і цитоплазматичний зв’язок із сусідніми клітинами. Використовують суміш 5% диметилсульфоксиду (ДМСО) і 10% глюкози. Інші процедури в принципі не відрізняються від таких самих для культури клітин.

Для визначення життєздатності клітинних культур використовують такі тести:

  • Фарбування флюоресциндіацетатом (ФДА); лише живі клітини можуть зафарбовуватись ФДА і флуоресціювати в ультрафіолетовому світлі.

  • 2,3,5-трифенілтетразоліумхлоридний метод (ТТХ). Клітини після виживання перетворюються у формазон, що є червоною субстанцією, нерозчинною у воді (розчиняється у разі додавання етанолу.


Фактори які впливають на життєздатність клітин після кріозберігання:

    1. Вид і фізіологічний стан культур перед заморожуванням. Наприклад ізольовані меристеми рослин, що у природі стійкі проти низьких температур, характеризуються більш високою життєздатністю після розморожування ніж, наприклад тропічні. Клітини після мітотичного поділу стійкіші проти заморожування, ніж клітини, що знаходяться в різних фазах мітотичного циклу.

    2. Вид кріопротекторів. Ступінь виживання рослин після зберігання у рідкому азоті значною мірою залежить від правильного добору і комбінування кріпротекторів. Часто перед заморожуванням використовують ДМСО, аміномасляну кислоту, гліцерин, різноманітні цукри, сахароспирти, амінокислоти, які виконують кріозахисну функцію.

3. Швидкість охолодження. За класичним методом, охолоджені кріопротектори повільно додають до попередньо охолоджених відповідних культур.За досвідом, найуспішніше кріозбереження відбувається, коли зразок повільно і поступово охолоджують зі швидкістю від одного до кількох градусів Цельсія за 1 хв.

4. Гранична температура охолодження зразків до перенесення в рідкий азот. Позитивні результати одержано при охолоджені зразків в інтервалі 30-40˚C за 1 год. Вважається, що в цій температурній межі дегідратування клітин оптимальне.

5. Температура зберігання. Всі температури. За винятком температури рідкого азоту (- 196˚C) та пари рідкого азоту (-160˚C), є непридатними для тривалого зберігання рослинних тканин.

6. Температура і швидкість розморожування. Велика частина рослинних тканин зберігає максимальну життєздатність у разі швидкого розморожування на водяній бані за температури 40˚C, швидкість якого може дорівнювати від 10 до кількох сотень градусів Цельсія за 1 хв.
Відновлення клітин після розморожуванн.

Цей період особливо важливий для культур клітин і протопластів. Відразу після розморожування видаляють кріопротектори і рослинні об’єкти переносять в стандартні умови культивування. Застосовують поступове додавання стандартного живильного середовища після розведення і збагачення його манітолом і сорбітолом, культивування у вигляді крапель, на напіврідкому живильному середовищі.
За деякими дослідженнями, до 2040 р. щорічно будуть зникати від 20 до 75 видів рослин. Тому важливим є прийняття міжнародних конвенцій щодо захисту і консервації біорізноманіття в цілому, зокрема рослин.

Фундаментальною базою для збереження генетичного складу рослин і його розмаїття є колекції, тому в різних країнах світу інтенсивно формують банки і бази даних рослин, які об’єднують в єдину світову інформаційну мережу.

Вітчизняний і світовий досвід довів, що для збереження генофонду найнадійнішим є створення банків генетичних ресурсів рослин (генетичних банків). На сьогодні у різних країнах світу функціонують понад 1300 генетичних банків рослин.

В Україні формування Національного генетичного банку рослин розпочато у 1992 р. в Інституті рослинництва ім. В.Я. Юр’єва у співдружності з Інститутом проблем кріобіології та кріомедецини НАН України. На сьогодні відпрацьовано умови кріоконсервації, зберігання та відновлення життєздатності вегетативних частин, меристем плодових, ягідних культур, картоплі, часнику; насіння рослин зі зниженою здатністю до тривалого зберігання (жита, сої, конопель, льону, цибулі, перцю, баклажанів; пилку (жита, тритікале, кукурудзи, соняшнику, плодових культур). Розроблено обладнання для заморожування і розморожування, для кріосховищ, підібрано оптимальні види контейнерів для кріозбереження різних типів і кількостей рослинного матеріалу.

Рослинні банки не лише зберігають чисельні види, а й інформацію про них. Тому створюються каталоги з електронними версіями яких можна познайомитись в мережі Інтернет. Банки генів слугують також для вдосконалення систематики рослинного світу та відпрацювання нових підходів ідентифікації. Для цього використовують методи дослідження геному, а саме вивчення нуклеотидного складу ДНК.

Крім того передбачаються вивчення:

  • Морфології та ультраструктури;

  • Потреби в факторах росту та живлення;

  • Фізіолого-біохімічні особливості метаболічних процесів

  • Білкового поліморфізму;

  • Амінокислотного складу.

Проте найважливіша функція колекцій та банків – слугувати джерелом вихідного матеріалу для біотехнологій.

На сьогодні успішне кріозбереження клітинних і тканинних культур ін вітро здійснено майже для 70 видів рослин, половина з яких – меристеми. Вченими вже одержані рослини-регенеранти картоплі, моркви, гороху, суниць, томатів з меристем, які зберігались при наднизьких температурах. Активно проводяться дослідження з кріозбереження клітинних штамів-продуцентів економічно важливих речовин. Таким чином, захист і збереження рослинних ресурсів являє собою гідну задачу для біотехнології.
скачати

© Усі права захищені
написати до нас