ПРОМИСЛОВА
БІОТЕХНОЛОГІЯ
ЛЕКЦІЯ №7
Основні питання:
1. Процеси виробництва корисних речовин:
- Органічні кислоти
Органічні кислоти широко використовують у харчовій і фармацевтичній промисловості, в техніці і як хімічна сировина.
Окремі органічні кислоти (лимонну, яблучну) можна отримувати екстракцією з природної рослинної сировини; інші (оцтову, молочну) − в процесах органічного синтезу.
Більше 50 органічних кислот можуть бути отримані на основі мікробіологічного синтезу.
Біотехнологічні методи їх отримання до теперішнього часу детально розроблені.
Органічні кислоти в системі мікробного метаболізму є продуктами деградації джерела енергії та вуглецю.
- лимонна, кетоглутарова, бурштинова, фумарова і яблучна кислоти − інтермедіати циклу трикарбонових кислот у більшості аеробних мікрорганізмів.
- Глюконова, кетоглюконова і винна кислоти – проміжні продукти прямого окислення глюкози (без фосфорилювання) деяких аеробних бактерій і грибів.
- Молочна, масляна і пропіонова кислоти є кінцевими продуктами метаболізму вуглеводів у анаеробних бактерій.
- Оцтова кислота − продукт окислення етанолу; аліфатичні моно- і дикарбонові кислоти − проміжні продукти окислення нормальних алканів.
- Таким чином, можливості мікроорганізмів для отримання на основі їх метаболізму органічних кислот великі.
- Для надсинтезу окремих кислот потрібні селективні, строго визначені умови. При збалансованому рості мікроорганізмів на повноцінному середовищі накопичення органічних кислот не відбувається, так як будучи проміжними продуктами в системі мікробного метаболізму, органічні кислоти − вихідний матеріал для синтезу інших макромолекул.
- Час максимальної швидкості утворення в клітині органічних кислот, як і багатьох інших метаболітів, не збігається в часі зі швидкістю розмноження клітин і накопиченням біомаси. Надсинтез органічних кислот спостерігається при гальмуванні швидкості росту продуценту і блокуванні процесів біосинтезу, що вимагають участі кислот в якості субстрату, тобто при порушенні процесів дисиміляції наявного ендогенного субстрату і процесів синтезу основних (азотовмісних) компонентів клітини. Такими умовами, як правило, є повний або надмірний вміст в середовищі джерела вуглецю і енергії та дефіцит біогенних елементів, що обмежують ріст клітин.
Більшість органічних кислот отримують, обмежуючи ріст клітин продуцентів дефіцитом азоту або фосфору при надлишку вуглецевмісного субстрату.
Тому мікробіологічні процеси отримання органічних кислот − двофазні
- на першому етапі відбувається так зване збалансоване зростання при максимальному накопиченні біомаси та споживанні вуглецевого і енергетичного субстрату, а також лімітуючого біогену;
- на другому етапі − відбувається уповільнення швидкості росту клітин.
- В результаті цього приріст біомаси припиняється і починається інтенсивне кислотоутворення.
- Тривалість фази інтенсивності кислото утворення визначається наявністю вуглецевого субстрату в середовищі.
- Важливою умовою кислотоутворення більшості органічних кислот (за винятком молочної) є відповідний оптимізований режим аерації, а також величина рН середовища.
- Здатність продукувати ту чи іншу кислоту − широко розповсюджена серед мікроорганізмів властивість.
- Як виробничі культури використовують спеціально підібрані штами, що продукують цільову кислоту у вигляді монопродукту з високими виходами та ефективним засвоєнням вуглецевого субстрату.
- При виробництві органічних кислот економічний коефіцієнт по вуглецю досягає 90% і вище.
- Як продуценти використовують бактеріальні, дріжджові і грибні культури (Lactobacillus, Arthrobacter, Alcaligenes, Candida, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma).
Способи ферментації в мікробіологічних процесах виробництва органічних кислот − різноманітні. Серед них − поверхневі рідкі та твердофазні процеси, а також глибинні, включаючи проточні культури.
В останні роки розроблено принципово нові й ефективні біотехнології з використанням іммобілізованих цілих клітин і ферментів.
Також різноманітні субстрати, які використовуються у виробництві органічних кислот.
Глюкозу і цукрозу все більше замінюють на доступніші комплексні середовища (мелясу, гідролізний крохмаль). Раніше (60-ті роки) були розроблені нові процеси отримання органічних кислот на рідких парафінах нафти.
Отримання лимонної кислоти
Лимонна кислота (СН2−СООН−СОНСООН−СН2СООН) − трьохосновна оксикислота, широко поширена в плодах і ягодах. Вона активно застосовується в харчовій промисловості при виробництві кондитерських виробів і напоїв, у фармацевтичній, хімічній і текстильній промисловості.
Лимонна кислота була ідентифікована як продукт метаболізму цвілевих грибів в 1893 р. Вемером.
Сьогодні це кислота за обсягами виробництва (понад 350 тис. т/рік) займає перше місце серед всіх органічних кислот.
- У мікроорганізмів синтез лимонної кислоти реалізується в циклі дикарбонових кислот і здійснюється в результаті конденсації кислоти з чотирма атомами вуглецю і двома карбоксильними групами і кислоти з одною карбоксильною групою.
- Утворена в результаті гліколізу піровіноградная кислота зв'язується з вуглекислотою; синтезована при цьому щавелевооцтова кислота реагує з оцтовою кислотою з утворенням лимонної кислоти, тобто утворення лимонної кислоти включає реакції гліколізу і ряд реакцій циклу Кребса.
- При кожному оберті циклу молекула щавелевооцтової кислоти взаємодіє з оцтовою, утворюючи лимонну кислоту:
- Виробництво лимонної кислоти методом ферментації цвілевих грибів належить до числа давніх біотехнологічних процесів. Перше виробництво було реалізовано в кінці XIX століття. Удосконалення процесу отримання лимонної кислоти тісно пов'язане з розробкою багатьох фундаментальних аспектів мікробіології (боротьбою з мікробним забрудненням виробничої культури, оптимізацією складу поживних середовищ, селекцією високопродуктивних штамів тощо.).
У промисловому виробництві лимонної кислоти в якості продуцента в основному використовують Aspergillus niger, але також застосовують і A. wentii. Процес ферментації досить складний, тому що лимонна кислота є продуктом первинного метаболізму грибів, і навіть незначне виділення даного продукту в навколишнє середовище свідчить про виражений дисбаланс клітинного метаболізму.
- Ріст продуценту і синтез кислоти зазвичай регулюють складом середовища (цукру, P, Mn, Fe, Zn).
- Надсинтез лимонної кислоти реалізується при великих концентраціях цукрів в середовищі (14-24%) і є відповідною реакцією продуцента на дефіцит фосфору, а також інших металів, хоча їх роль до кінця не вивчена.
- Оптимум рН на стадії кислото утворення становить 1.7−2.0. У більш лужному середовищі процес зсувається в бік накопичення щавлевої і глюконової кислот. В якості основи середовища зазвичай використовують глюкозний сироп, гідролізат крохмалю або мелясу. Останню попередньо розбавляють до необхідного рівня цукрі і обробляють з метою зниження вмісту металів.
Існує декілька варіантів процесу: беззмінний, беззмінний з додаванням компонентів і метод плівок.
- Джерелом азоту служать солі амонію (0.2%); концентрація фосфатів (0.01-0.-2%).
- Як піногасники використовують природні олії з високим вмістом жирних кислот.
- Дуже важливе значення має рівень аерації культури.
- У виробництві лимонної кислоти застосовують кілька варіантів процесу. Поверхневий спосіб реалізується на твердому сипучому середовищі і в рідкій фазі. При рідкофазної поверхневої ферментації поживне середовище розливають в кювети шаром від 8 до 18 см. Кювети розміщують на стелажах в попередньо простерилізованій парами формаліну бродильній камері. Через спеціальні повітроводи зі струмом стерильного повітря поверхню середовища інокулююст вихідною музейною культурою.
- Як посівний матеріал використовують попередньо отримані також в умовах поверхневої культури і висушені спори (конідії) з розрахунку 50-75 мг конідій на 1 м2 площі кювет.
Твердофазна ферментація має багато спільного з поверхнево-рідкофазним процесом.
Як середовище використовують пористий матеріал (картопля, пшеничні висівки).
Матеріал попередньо стерилізують, після охолодження інокулюють суспензією спор. Ферментація відбувається в лотках при 25-30 C протягом 6-7 днів.
Утворену лимонну кислоту екстрагують водою (метод Коджи). Починаючи з 1950 р., промислові процеси отримання лимонної кислоти стали переводити в умовах глибинної культури.
У 60-ті роки почали розробляти процеси отримання лимонної кислоти на основі рідких вуглеводнів (С9-С30) з використанням продуцентів дріжджів (Candida) і бактерій (Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter), а також із застосуванням методу проточних культур. Ці технології в майбутньому мають певні технологічні перспективи.
Готовий продукт − високоочищену кристалічну лимонну кислоту отримують в ході постферментаційної стадії.
У зброджених розчинах містяться, крім цільової кислоти, також глюконова і щавелева кислоти, залишки незброджених цукрів і мінеральні солі. Для виділення лимонної кислоти з даного розчину її пов'язують гідроокисом кальцію з утворенням важкорозчинного цитрату кальцію:
2 С6Н8О7 + 3 Са (ОН)2 = Са3(С6Н5О7)2 + 6 Н2О.
Одночасно утворюються кальцієві солі глюконової і щавлевої кислот, глюконат кальцію Са(С6Н11О7)2 і оксалат кальцію СаС2О4. Кальцієві солі лимонної та щавлевої кислот випадають в осад, а глюконат кальцію і основна частина органічних і мінеральних компонентів меляси залишаються в розчині.
Осад відділяється на вакуум-фільтрі, промивається та висушується.
Далі для переходу лимонної кислоти в вільний стан і звільнення від оксалату кальцію осад обробляють сірчаною кислотою з подальшою фільтрацією.
Розчин лимонної кислоти фільтрують, концентрують вакуум-випарюванням і піддають кристалізації при повільному охолодженні до 8-10°С.
Отримані кристали відділяють в центрифузі від маточника і висушують в сушарках при 30-35°С. Готовий продукт містить не менше 99.5% лимонної кислоти (в перерахунку на моногідрат), зольність − не вище 0.1-0.35%.
Отримання молочної кислоти
Молочна кислота (СН3СНОНСООН) −
органічна одноосновна кислота, що утворюється в результаті анаеробного перетворення вуглеводів молочнокислими бактеріями.
У 1847 р. С. Блодно довів, що дана кислота є продуктом бродіння, а Л. Пастер встановив, що цей процес викликають бактерії. Утворення молочної кислоти з глюкози можливо декількома шляхами. При зброджуванні гомоферментнимии молочнокислими бактеріями:
С6Н12О6 → 2 СН2ОН2СНОНСНО (глицеральдегид) → 2СН3СОСНО (метилгліоксаль) + 2Н2О,
СН3СОСНО (метилгліоксаль) + Н2О →
→ СН3СНОНСООН (молочна кислота).
Для промислового отримання молочної кислоти використовують гомоферментні молочнокислі бактерії.
У гомоферментних молочнокислих бактерій тільки 3% субстрату перетворюється в клітинний матеріал, а решта трансформується в молочну кислоту, вихід якої досягає до 1.5%.
- Другий шлях, гетероферментний, включає розпад глюкози до піровіноградної кислоти і відновлення останньої до молочної кислоти:
С6Н12О6 → СН3СОСООН + Н2 → СН3СНОНСООН.
Застосовують молочну кислоту в харчовій промисловості для отримання напоїв, мармеладу, в процесах консервування, а також в кормовииробництві.
Солі молочної кислоти використовують у фармацевтиці. Промислове виробництво молочної кислоти розпочато наприкінці ХІХ століття за участю молочнокислих бактерій Lactobacillus delbrueckii, L. leichmannii, L. bulgaricus.
Молочнокисле бродіння протікає в анаеробних умовах, однак лактобацили відносяться до факультативних анаеробів, тому при ферментації повітря повністю не видаляються з ферментірів.
Як сировину використовують мелясу і гідролізати крохмалю, при цьому концентрація цукрів у вихідному середовищі залежно від характеру бродіння становить близько 5 − 20%.
Використовують відновлені форми азоту, сульфати або фосфати амонію, а також солод і кукурудзяний екстракт як джерело факторів росту.
Оцтова кислота (СН3СООН) − широко використовується в харчовій, хімічної, мікробіологічної промисловості, в медицині.
Одержання оцтової кислоти з спиртовмісних рідин було відомо більше 10 тис. років тому. У ті часи древні греки і римляни використовували оцет як освіжаючий напій і отримували, головним чином, залишаючи вино відкритим.
У великих масштабах оцет довго отримували в пласких відкритих бочках, в яких плівка бактерій плавала на поверхні.
У XIX столітті поверхневі процеси стали замінювати більш ефективними. Так, був розроблений процес в струменевому генераторі.
В середині ХХ століття з'явилися глибинні процеси
ферментації. Удосконалений генератор Фрінгса використовується в даний час.
Отримання оцтової кислоти
- Оцтовокисле бродіння засноване на здатності оцтовокислих бактерій окисляти спирт киснем повітря за участю алкогольдегідрогенази в оцтову кислоту: СН3СН2ОН + О2 → СН3СООН + Н2О, при цьому з 1 молю етанолу утворюється моль оцтової кислоти, а з 1 л 12 об. % спирту виходить 12.4 вагових відсотків оцтової кислоти.
Даний процес можуть реалізувати багато бактерії, але в промислових технологіях для отримання оцту використовують оцтовокислі бактерії роду Acetobacter, інтерес представляють також бактерії Gluconobacter.
- В даний час процес реалізують як поверхневим, так і глибинним способом. Поверхневий режим протікає в струменевих генераторах, наповнених деревною стружкою, об'ємом до 60 м3.
- Початковий поживний розчин з бактеріями розпилюють по поверхні стружок, і він стікає, збираючись в нижній частині апарату.
- Після цього рідину відбирають і знову закачують у верхню частину апарату. Процедуру повторюють 3-4 рази, в результаті протягом 3-х діб до 90% спирту трансформується в ацетат.
- Цей старий спосіб протікає більш ефективно і рівномірно в генераторах Фрінгса з автоматичною підтримкою температури і примусовою подачею повітря. За такою технологією виробляють до 400 млн л оцтової кислоти на рік.
Сучасні промислові процеси отримання оцту реалізують в глибинній культурі в спеціальних аераційних апаратах з термостабілізацією і механічною системою піногасіння.
- Швидкість аерації 3.4 м3/м3 год., обертання ротора 1500 об./хв., температура 30°С.
- Вихідна інокулюєма суміш містить етанол і оцтову кислоту, відповідно, близько 5 і 7%; кінцева концентрація оцту через 1.5 доби становить 12-13%.
- Процес − напівпроточний, відливний-доливний.
- При глибинної ферментації вихід продукту на 1 м3 в 10 разів вище у порівнянні з поверхневою ферментацією.
Кожні 30-35 годин до 60% культури замінюють на свіже сусло.
До початку 90-х рр. таким чином виробляли до 715 млн. літрів 10% оцтової кислоти на рік.
Розроблено та реалізовано ефективний безперервний спосіб отримання оцтової кислоти в комплексі послідовно працюючих ферментерів (до 5 апаратів).
Температура культивування становить 28°С для Acetobacter. Найкращою сировиною для процесу є етиловий спирт, отриманий з зерно-картопляної сировини, при його концентрації близько 10 %.
Оптимум рН для розвитку бактерій становить близько 3. При збільшенні вмісту оцтової кислоти в культурі понад 8% ріст бактерій сповільнюється, при 12-14% припиняється. Тому процес проводять в комплексі послідовно з'єднаних апаратів.
Перший виконує роль інокулятора, тому в нього безперервно подають свіже середовище і підтримують умови, оптимальні для швидкого утворення біомаси бактерий.
Культура з першого апарату надходить в другій апарат і далі в наступні, при цьому транспортування культуральної рідини здійснюється повітрям.
У кожному апараті умови ферментації стабілізуються відповідно до вимог процесу ферментації, при поступовому зниженні температури середовища від 28°С в першому апараті до 25°С − в останньому.
- Режим аерації також змінюється, від 0.4 до 0.15 м3/м3 хв.
- Концентрація спирту з другого по четвертий апарат стабілізується на необхідному рівні подачею в них середовища з 40% етанолом.
- З останнього апарату виводиться культуральна рідина з вмістом ацетату не нижче 9.0 і не вище 9.3%.
- Вихід кислоти становить до 90 кг з 100 л безводного спирту.
- На постферментаційній стадії після відділення бактеріальної біомаси розчин оцту фільтрують, звільняючи від частинок, і далі піддають пастеризації.
- Для підвищення концентрації вихідні розчини виморожують до 20-30%.
- Подальше концентрування до отримання крижаної оцтової кислоти (98.0-99.8%), проводять методом перегонки.
Пропіонова кислота (СН3СН2СООН)
синтезується грам- позитивними
пропіоновокислими бактеріями
(Propionibacterium),
використовується в
хіміко-фармацевтичної промисловості, при отриманні косметичних засобів, як фунгіцид для збереження зерна.
Хімізм утворення пропіонової кислоти полягає в наступному: піровіноградна кислота за участю біотину і вуглекислоти карбоксилюється в щавлевооцтову, яка через яблучну і фумарову кислоти відновлюється до бурштинової кислоти.
Янтарна кислота за участю АТФ і КоА перетворюється в сукцинил-КоА, останній під впливом -КоА-ізомерази і за участю коферменту В12 перетворюється в-КоА.
Рис. 13.36. Технологическая схема получения пропионовой кислоты: Е-1, Е-2, Е-3, Е-4, Е-5, Е-6 — емкости; ПК-1 — компрессор синтез-газа;
Т-1, Т-2 — подогреватели; Р-1, Р-2 — реакторы синтеза; Х-1, Х-2 — холодильники;
С-1, С-2, С-3 — сепараторы; ПК-2 — компрессор подачи этилена и СО;
ПК-3 — компрессор подачи воздуха; Р-3 — реактор декобальтизации;
К-1, К-2, К-3, К-4, К-5 — ректификационные колонны
- В результаті карбоксилювання-КоА (ферменту) розщеплюється з утворенням вільного КоА і пропіонової кислоти.
- Отримують пропіонову кислоту в глибинній аеробній культурі на середовищах, що містять (%): цукру 2, органічний азот 0.4 (джерело дріжджовий екстракт), солі молочної кислоти.
Серед промислових штамів-продуцентів − бактерії Pr. аrabinosum, Pr. shermanii, Pr. rubrum і ін.
Як субстрат бродіння бактерії використовують різні цукри (лактозу, глюкозу, мальтозу, цукрозу, органічні кислоти − яблучну і молочну).
Процес реалізується за 12 діб при 30°С і рН 6.8-7.2; при цьому понад 70% цукрів трансформується в органічні кислоти, на утворення вуглекислоти витрачається менше 20% вуглецевого субстрату.
Отримання ітаконової кислоти
Ітаконова кислота (С5Н6О4) − ненасичена двухосновна кислота; її утворення пліснявими грибами відкрив в 1931 р. Кіношита.
Дана кислота − важливий проміжний продукт для отримання соєвого молока.
Ітаконова кислота утворює сополімери з ефірами та іншими мономерами, тому використовується при виробництві синтетичних волокон і смол, ряду адгезивних засобів, ПАР, барвників та інших складних органічних сполук.
Отримання ітаконової кислоти здійснюють поверхневим і глибинним методами ферментації. Як продуценти використовують відселектовані грибні культури (Aspergillus itaconicus, Asp. terreus).
Синтез ітаконової кислоти пов'язаний з реакціями циклу Кребса; її вихідним продуктом є цис-аконітова кислота, яка при декарбоксилюванні в результаті переміщення електронів і переходу подвійного зв'язку з положення 2.3 в положення 3.4 перетворюється в ітаконову кислоту
CH2 — COOH CH2
Ι СО2 ΙΙ
C — COOH → C — COOH
ΙΙ
CH — COOH CH2 — COOH
- Процес аналогічний процесам отримання лимонної кислоти.
- Середовища містять високі концентрації цукрів, зазвичай використовують мелясу, при дефіциті фосфору і заліза.
- Особливістю процесу отримання даної кислоти є висока потреба продуцента в солях цинку, магнію і міді.
- При поверхневій ферментації протягом 10-12 діб утворюється близько 60% продукту в перерахунку на цукор, частка цільової кислоти в суміші (синтезуються також бурштинова, щавлева і фумарова кислоти) − понад 90%.
- Вміст ітаконової кислоти досягає 15-20%, остаточна концентрація цукрів не перевищує 0.6%.
На відміну від лимонної, ітаконовоа кислота − токсичний продукт, при її концентрації близько 7% ріст продуцента пригнічується, і швидкість продукції кислоти знижується.
Токсичність ітаконової кислоти нейтралізують дробовими добавками гідроксиамонію, рН середовища при цьому стабілізується на рівні 3.5-3.8.
При глибинної ферментації кінцева концентрація ітаконової кислоти нижче, 4-6%.
Товарний продукт − кристалічна ітаконова кислота 92% вмісту, решта − волога (3-6%) та інші кислоти (1-3%).
Отримання глюконової кислоти
Глюконова кислота — одноосновна пентокислота, яка одержується при ферментативному окисленні глюкози за участю глюкозооксидази.
Глюконова кислота має широке застосування. Комплексоутворювач з металами — глюконат натрію, застосовують при виробництві миючих засобів;
кальцій, залізо і калійні солі глюконової кислоти широко використовують в медицині і харчовій промисловості.
Продуценти глюконової кислоти — гриби (Penicillium, Aspergillus).
- Ферментацію в промислових масштабах здійснюють поверхневими глибинними способами; використовують середовища з високим (до 30-35%) вмістом глюкози, в складі середовищ — сульфат магнію, фосфат калію, використовують джерело азоту, а також вуглекислий кальцій.
- Процес завершується при остаточної концентрації цукру близько 1%.
- Готовий продукт — кристалічні солі (глюконати).
Отримання фумарової кислоти
Фумарова кислота — транс-ізомер
етилен-дикарбонової кислоти:
HC- COOH
ΙΙ
HOOC- CH
використовується при виробництві синтетичних смол, фарб, лаків.
Смоли фумарової кислоти застосовують для виробництва друкарських фарб.
Магнієві та натрієві солі фумарової кислоти використовують в медицині.
Фумарова кислота є також метаболітом циклу трикарбонових кислот і присутня у всіх живих клітинах, однак рідко виводиться в середовище
Продуцентом даної кислоти є різні гриби (Penicillium, Aspergillus, Rhizopus), останні найбільш активні.
Середовища для отримання фумарової кислоти містять глюкозу в концентрації 5-10%, фактор, що лімітує — азот, цинк.
Ферментація реалізується в умовах інтенсивної аерації поверхневим або глибинним способом.
При цьому в ході ферментації проводять нейтралізацію середовища вуглекислим кальцієм або розчинами лугів. Максимальний вихід кислоти — 58% від спожитої глюкози.
- Біотехнологічні методи отримання органічних кислот постійно вдосконалюються. Нещодавно в Японії розроблений спосіб отримання 2-кетоглюконової кислоти на основі біосинтезу бактерій Pseudomonas, вихід кислоти досягає 90% від використаного цукру.
- Розроблена технологія отримання щавлевої кислоти на середовищах з цукрами на основі грибів A. ozyzae. На основі селектованих штамів дріжджів (Candida lipolytica) створені технології одержання лимонної і ізолімонної кислот.
- Спеціально відселектовані штами дріжджів роду Candida синтезують на середовищах з нормальними парафинами фумарову, яблучну, бурштинову кислоти.
- Процес на даної сировині постійного складу більш стабільний, ніж на комплексних природних середовищах на основі меляси; також спрощується стадія виділення і очищення готового продукту.
Дякую
за увагу!