Звіт на тему:
Дослідження впливу температури та рН середовища на амілолітичну здатність ферментніх препаратів
Підготувала студентка
Групи ЕК-2-4
Улізько Галина
Київ 2020
Зміст
1. Вступ: загальна характеристика амілолітичних ферментів, їх значення та залежність їх дії від зовнішніх факторів;
2. Літературний огляд:
2.1. Будова, властивості та механізм дії амілолітичних ферментів;
2.2. Одержання амілолітичних ферментів у промисловості;
2.3. Використання амілолітичних ферментів у різних галузях господарства;
3. Матеріали та методи досліджень:
3.1. Опис субстратів (будова, властивості), на які діють амілолітичні ферменти;
3.2. Опис методики визначення активності амілаз;
4. Експериментальна частина: Дослідження впливу температури (або рН) середовища на амілолітичну здатність ферментніх препаратів;
Зазначити умови проведення досліджень, результати досліджень, розрахунки амілолітичної активності, побудувати графік залежності амілолітичної активності від температури (чи рН) середовища, визначити оптимальну температуру (чи рН) та описати графік, вказавши як змінюється активність ферменту (на скільки % чи разів відбувається збільшення чи зменшення активності із зміною температури чи рН середовища до таки-то значень).
5. Висновки;
6. Використана література;
1. Вступ: загальна характеристика амілолітичних ферментів, їх значення та залежність їх дії від зовнішніх факторів.
До групи амілолітичних ферментів відносяться наведені нижче і деякі інші ферменти:
КФ 3.2.1.1 α-Амілаза
КФ 3.2.1.2 β-Амілаза
КФ 3.2.1.3 Глюкоамілаза
КФ 3.2.1.41 Пуллуланаза
КФ 3.2.1.68 Ізоамілази
КФ 3.2.1.20 α-глюкозидази
КФ 3.2.1.11 Декстраназа
КФ 2.4.1.19 Амілаза Bacillus macerans
Будучи каталізаторами, ферменти прискорюють як пряму, так і зворотну реакції, тому, наприклад, ліази здатні каталізувати і зворотну реакцію - приєднання по подвійним зв'язкам.
Ферменти являють собою біокаталізатори білкової природи. Каталізуючи переважна більшість біохімічних реакцій в організмі, ферменти регулюють обмін речовин і енергії, граючи тим самим важливу роль у всіх процесах життєдіяльності. Всі функціональні прояви живих організмів (дихання, м'язова скорочення, передача нервового імпульсу, розмноження і т.д.) забезпечуються дією ферментних систем. Сукупністю ферментних реакцій, що каталізуються, є синтез, розпад та інші перетворення білків, жирів, вуглеводів, нуклеїнових кислот, гормонів та інших сполук.
Активність ферментів визначається їх тривимірної структурою. Як і всі білки, ферменти синтезуються у вигляді лінійного ланцюжка амінокислот, яка згортається певним чином. Кожна послідовність амінокислот згортається особливим чином, і виходить молекула (білкова глобула) має унікальні властивості. Кілька білкових ланцюгів можуть об'єднуватися в білковий комплекс. Третинна структура білків руйнується при нагріванні або дії деяких хімічних речовин.
Вплив температури.
Чутливість до зміни температури, є одним з характерних властивостей ферментів.
Оптимальною температурою для дії більшості ферментів є 37 - 45 ° С. При низьких температурах (0 ° або нижче) ферменти, як правило, не денатуруються, хоча активність їх падає майже до нуля.
Вплив рН середовища.
Ферменти вкрай чутливі до зміни концентрації водневих іонів. При цьому змінюється ступінь іонізації функціональних груп в бічних радикалах амінокислотних залишків, особливо в активному центрі ферменту, що призводить до зміни конформації білкової макромолекули. Зміна рН впливає також на ступінь зв'язування ферменту з субстратом. Як і температурна залежність, рН-залежність швидкості ферментативної реакції має колоколообразную форму.
Вплив рН на утворення фермент-субстратного комплексу, крім іонізації функціональних угруповань ферменту, може робити істотний вплив на певні групи субстрату, що також впливає на швидкість реакції.
Вплив концентрації субстрату.
Якщо концентрацію ферментів залишити постійною, змінюючи тільки кількість субстрату, то графік швидкості ферментативної реакції описують гіперболою.
При даній концентрації ферменту швидкість ферментативної реакції збільшується із підвищенням концентрації субстрату, але наступає момент, коли наступне збільшення концентрації субстрату не впливає на зростання швидкості, оскільки при високих концентраціях субстрату активні центри молекул ферменту виявляються практично насиченими. Таким чином, скільки б не було надлишкового субстрату, він з’єднається з ферментом лише тоді, коли утворений раніше фермент-субстратний комплекс дисоціює на продукт та вільний фермент. Отже, концентрація ферменту є лімітуючим фактором в утворенні продукту.
2. Літературний огляд:
2.1. Будова, властивості та механізм дії амілолітичних ферментів
Амілази бувають двох типів: ендо і екзоамілази. Чітко вираженої ендоамілазой є α-амілаза, здатна до розриву внутрішньомолекулярних зв'язків у полімерних ланцюгах субстрату. Глюкоамилаза і β-амілаза є екзоамілазамі, тобто ферментами, що атакують субстрат з нередуцирующего кінця.
Реакції, що каталізуються амілазами, мають дві стадії: коротку предстаціонарную і тривалу - стаціонарну. Під час першої стадії ендоамілаза швидко зменшує молекулярну масу субстрату, утворюючи суміш лінійних та розгалужених олігосахаридів. Другий етап реакції триває, поки продукти гідролізу не перестануть забарвлюватися йодом; він протікає значно повільніше і залежить від індивідуальних властивостей ферменту та його природи.
α-Амілаза (1,4-α-D-глюканглюканогідролаза) є ендоамілазой, що викликає гідролітичні розщеплення α-1,4-глікозидних зв'язків всередині полімерного субстрату. Це водорозчинний білок, що володіє властивостями глобуліну і має молекулярну масу 45-60 кДа. Всі α-амілази відносяться до металлоензім, зміст в них Са коливається від 1 до 30 г-атом / 1 г-моль ферменту. Повне видалення Са призводить до інактивації ферменту. Глутамінова і аспарагінова кислоти становлять 25 мас. % від маси білка. Залежно від виду мікроорганізму властивості α-амілаз можуть сильно відрізнятися не тільки за механізмом впливу на субстрат і по кінцевим продуктам, але і за оптимальними умовами для прояву максимальної активності. Присутність в промислових препаратах протеїназ знижує каталітичну активність α-амілази. В результаті впливу α-амілази на перших стадіях в гідролізаті накопичуються декстрини, потім з'являються неокрашені йодом тетра-і трімальтоза, які дуже повільно гідролізуються α-амілазою до ди- і моносахаридів.
β-Амілаза (1,4-α-D-глюканмальтогідролаза) є екзоферменти кінцевого дії, яка проявляє спорідненість до передостанній 1,4-зв'язку з нередуцирующего кінця лінійного ділянки амілози і амілопектину. Продукт реакції - мальтоза - має β-конфігурацію. Гідроліз йде по лінійної ланцюга тільки до α-1,6-зв'язків. При гідролізі крохмалю утворюється 54-58% мальтози і 42-46% високомолекулярних декстринів (β-декстринів). β-Амілази виявляють більшу стабільність за відсутності іонів Са. Фермент може складатися з однієї або чотирьох субодиниць, містить SH-групи та чутливий до дії важких металів. Властивості β-амілаз залежать від джерел їх виділення. Для отримання мальтози з крохмалю використовують бактеріальні β-амілази.
Глюкоамілаза (1,4-α-D-глюканглюкогідролаза) широко поширена в природі. Вона синтезується багатьма мікроорганізмами і утворюється в тваринних тканинах. У літературі фермент відомий під різними назвами: амілоглюкозідаза, γ -амилаза, лізосомальних α-глюкозидази, кисла мальтаза, матулаза, екзо- α-1,4-глюкозидази. Глюкоамілаза каталізує послідовне відщеплення кінцевих залишків α-D-глюкози з нередукуючих кінців субстрату. Цей фермент проявляє екзогенний механізм впливу на субстрат. Багато глюкоамілази володіють також здатністю гідролізувати α-1,6-глюкозидні зв'язку. Однак це відбувається в тому випадку, коли за α-1,6-зв'язком слідує α-1,4-зв'язок, тому декстран ними НЕ гідролізують. Глюкоамілаза значно швидше гидролізует полімерний субстрат, ніж оліго-і дисахариди. Майже всі глюкоамілази є глікопротеїдами, що містять від 5 до 35% вуглеводів, які складаються з оліго-, ди-і моносахаридів.
Фермент пуллуланаза (пуллулан-6-глюканогідролаза) раніше був відомий під назвами: R-фермент, гранична декстриназа або амілопектин-6-глюканогідролаза. Пуллуланаза, як і α-амілаза, є ендогенним ферментом, але на відміну від неї здатна невпорядковано гідролізувати α-1,6-зв'язку в пуллулане, амілопектину, глікогені і граничних декстринах, одержуваних при спільному впливі на крохмаль і глікоген α- і β- амілаз. Якщо між двома α-1,6-зв'язками розташовано більше трьох залишків глюкози, то розрив α-1,6-зв'язку йде значно повільніше, тому амілопектин гідролізується пуллуланаза гірше інших розгалужених полісахаридів. Найчастішим відщеплювальним фрагментом є мальтотріоза. Пуллуланаза з різних джерел мають різні властивості.
Ізоамілази (глікоген-6-глюканогідролаза), або дебранчінг-фермент, гідролізує α-1,6-зв'язку в розгалужених полісахаридах, таких як амілопектин, глікоген, β-граничні декстрини. Відмінною особливістю ізоамілази в порівнянні з пуллуланаза є те, що вона не здатна гідролізувати пуллулан і слабо діє на граничні β-декстрини. Бактеріальна ізоамілази розщеплює α-1,6-зв'язку в глікогені повністю, а пуллуланаза діє на цей субстрат слабо. Ізоамілази утворюють багато мікроорганізмів, такі як B. amyloliquefacie, Cytophaga, Streptomyces, Pseudomonas amyloderamosa, Saccharomyces cerevisiae та ін., Ферменти яких мають здатність гідролізувати субстрат при рН від 3,5 до 6,5 і температурах від 25 до 53 ° С. Ізоамілази не стабілізується кальцієм, за винятком ферменту з Cytophaga. Молекулярна маса ізоамілази коливається від 90 до 120 кДа.
α-Глюкозидази (α-D-глюкозідглюкогідролаза) має здатність гідролізувати α-1,4-зв'язку від нередукуючого кінця субстрату з відщеплення залишку глюкози. Фермент проявляє найбільшу спорідненість до низькомолекулярних субстратів, легко гідролізує мальтозу, олігосахариди, а полісахариди гідролізують повільно або зовсім не гідролізує. α-глюкозидази об'єднує групу ферментів і має ряд інших назв: мальтаза, глюкоінвертаза, глюкозідосахараза. Властивості ферментів, які продукуються різними мікроорганізмами, можуть значно відрізнятися. Фермент має здатність до перенесення α-D-глюкозільних залишків на відповідні акцептори, часто з утворенням α-1,6-зв'язків.
Декстраназа (1,6-α-D-глюкан-6-глюканогідролаза) каталізує розщеплення α-1,6-зв'язків в бактеріальному полісахаридs декстранамs. Серед продуцентів декcтраназ слід зазначити B. subtilis, B. megaterium, Lactobacillus befidus, Streptococcus mutans, Bravibacterium fuscum, Pseudomonas UQM-733, різні грунтові бактерії, а також численні види мікроскопічних грибів роду Penicilium, Aspergillus і Fusarium.
Декстранази мають молекулярну масу від 35 до 71 кДа; вони є слабокислими білками. Ізоелектрична точка для всіх грибних декстраназ лежить в діапазоні від 4,0 до 4,6. Для більшості бактеріальних декстраназ оптимальна температура каталітичної дії 35-37 ° С; для грибних продуцентів температура трохи вище - 55-60 ° С. Оптимальне значення рН коливається в залежності від виду продуцента від 4,4 до 7,5. За допомогою ендодекстраназ можна отримувати з декстрану кровозамінники необхідної молекулярної маси; їх також використовують в стоматології для зняття зубних бляшок, що складаються з декстраноподібних глюканов.
Амілаза B. macerans [1,4-α-D-глюкан-4-α- (1,4-α-глюкан) трансфераза (циклізующая)] вперше була знайдена в культурі B. macerans. Вона циклизує частина ланцюга 1,4-α-глюкана шляхом утворення 1,4-α-глюкозидного зв'язку. Робоча назва цього ферменту - ціклодекстрінглюканотрансфераза (ЦГТ-аза). При впливі на крохмаль і аналогічні субстрати утворюються циклічні нередукуючі декстрини (декстрини Шардінгера) різних розмірів.
Субстратами для дії амілаз є крохмаль, що складається з амілози і амілопектину, і глікоген.
Крохмаль – рослинній полісахарид з дуже складною будовою. Містить 13-30% амілози і 70-85% амілопектину. Обидва компоненти неоднорідні, їх молекулярна маса коливається в широких межах і залежить від природи крохмалю.
При вивченні механізму дії амілолітичних ферментів є певні складності, і перш за все вони полягають у тому, що субстрат - крохмаль - неоднорідний і має різні характеристики за ступенем полімеризації глікозидного ланцюга і кількості розгалужень.
Реакції, що каталізується амілазами, мають дві стадії: коротку передстаціонарну і тривалу стаціонарну. Під час першої стадії ендоамілаза швидко зменшує молекулярну масу субстрату, утворюючи суміш лінійних та розгалужених олігосахаридів. Другий етап реакції триває, поки продукти гідролізу не перестануть забарвлюватися йодом; він протікає значно повільніше і залежить від індивідуальних властивостей ферменту та його природи. Тому кінцеві продукти гідролізу а-амілазами можуть бути різними. Перша стадія впливу ферменту на субстрат хоча і носить неупорядкований характер, має для всіх видів амілаз схожий механізм.
Існує дві гіпотези про механізм дії екзоамілаз на субстрат. Перша гіпотеза припускає, що, впливаючи на субстрат по одноланцюжкові або «молніеобразному» механізму, екзоамілаза утворює фермент-субстратний комплекс із захопленням нередукуючого кінця ланцюга.
Подальше просування ферменту з цього ланцюга відбувається до повного її гідролізу. За другою гіпотезою (б- і глюкоамілаза діють на субстрат шляхом механізму множинної атаки, тобто фермент утворює комплекс з молекулою субстрату, потім через кілька етапів цей комплекс розпадається і фермент зв'язується з новою молекулою субстрату. Іншими словами, при множинної атаці відбувається щось середнє між неврегульованим механізмом і одноланцюжкові, «молніеобразной» атакою. Для повного гідролізу з цього механізму одна молекула субстрату повинна утворювати багато разів фермент-субстратні комплекси. При цьому можливий гідроліз декількох зв'язків в одному каталітичному акті.
Механізм впливу амілаз на субстрат може бути розглянуто з не-скількох позицій:
1) вид що розривається зв'язку (б -1,4 або б-1,6);
2) тип впливу на субстрат (ендо- або екзо-);
3) вплив на швидкість гідролізу ступеня полімеризації субстрату;
4) можливість гідролізу олігоcахаридів;
5) здатність ферменту до множинної атаці субстрату.
Наявність ознак амілаз, відображених в 3 і 4 позиції, при дії на лінійні субстрати може свідчити про існування у цих ферментів подцентровой структури. Ймовірно, активний центр амілази може складатися з декількох підцентру, кожен з яких може вступати в контакти з глюкозних залишком. Енергія взаємодії (А;), виражена в одиницях вільної енергії (кДж / моль), визначає подцентровое спорідненість ферменту до субстрату. Це спорідненість індивідуально і може бути як позитивним, так і негативним. Ймовірність існування підцентрових структур амілаз допомагає встановити будову активного центру амілаз, дає чітке пояснення субстратної специфічності, але не дає пояснень механізму гідролізу розгалужений субстратів.
2.2. Одержання амілолітичних ферментів у промисловості
Існує два способи культивування мікроорганізмів - продуцентів ферментів: поверхневий і глибинний.
Перший спосіб, який застосовується для культивування мікроскопічних грибів, характеризується розвитком міцелію на поверхні твердого або рідкого субстрату. На рідкому субстраті утворюється плівка міцелію, яка продукує не тільки амілолітичні ферменти, але й органічні кислоти, що їх інактивують, тому використовують тверді субстрати з розвиненою поверхнею - пшеничні висівки, дробину барди, картопляну мезгу та ін. Максимальна активність ферментів досягається при культивуванні грибів на пшеничних висівках. Дробина барди бідна живильними речовинами, і активність ферментів у культурах грибів, вирощених на ній, в 4-5 разів нижче, ніж на висівках. Зріла культура грибів внаслідок обволікання часток висівок міцелієм має вигляд щільної войлокоподібної маси. При поверхневому культивуванні пшеничні висівки повинні бути зволожені і простерилізовано. У стерильних умовах готують посівну культуру, але вирощують гриби в нестерильних умовах у кюветах, які встановлюються в негерметичних ростильних камерах. Теплоту, що виділяється в процесі росту грибів, видаляють продування через ростильну камеру стерильного кондиціонованого повітря.
Поверхневий спосіб вирощування мікроскопічних грибів має ряд переваг. Так як під час росту гриба висівки не перемішуються, сторонні мікроорганізми не розповсюджується по всій їхній масі і викликають лише незначне місцеве інфікування, яке, як правило, не впливає на активність ферментів. Це, однак, не виключає необхідності ретельної стерилізації повітря, середовища і обладнання. Культуру на висівках висушують до вмісту вологи 10 ... 11%. У такому вигляді вона може зберігатися тривалий час без значної втрати активності. Це дозволяє організувати централізоване постачання спиртових заводів сухий культурою мікроскопічних грибів, що є одним з переваг поверхневого способу вирощування.
Недолік поверхневого способу - необхідність встановлення безлічі кювет, роботу з якими важко механізувати. Собівартість культури гриба-продуцента висока, причому в основному через витрати великої кількості ручної праці. Механізація процесу вирощування можлива шляхом забудівлі безперервнодіючих установок або бескюветних апаратів з вертикальним товстим шаром живильного середовища та інтенсивним продування повітря через цей шар.
Глибинну культуру мікроорганізмів вирощують на рідкому поживному середовищі при енергійної аерації в герметично закритих апаратах та в стерильних умовах. Процес повністю механізований. Стерильність глибинної культури мікроорганізма - продуцента ферментів позитивно відбивається на результатах зброджування сусла дріжджами.
Культура, що виросла в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні, представляє собою корж із набряклих часток середовища, щільно пов'язаних міцелієм, що зрісся. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм. Культуру висушують до 10-12% вологості при температурах не вище 40оС, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній та спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.
Отримання амілолітичних ферментних препаратів з глибинних культур мікроорганізмів
Для отримання амілолітичних ферментних препаратів у нашій країні переважно використовується глибинний спосіб культивування. У цьому випадку мікроорганізми вирощуються в рідкому поживному середовищі. Технічно більш досконалий, ніж поверхневий, так як легко піддається автоматизації та механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні, зазвичай, значно нижче, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.
Підготовка живильного середовища: головним джерелом вуглецю для всіх продуцентів б-амілази є крохмаль різного походження, який вводиться в середу в клейстерізованому стані. Може використовуватися і крохмалевмісну сировину. Біосинтез б-амілази протікає більш інтенсивно, якщо крохмаль частково гідролізувати, не допускаючи накопичення в середовищі низькомолекулярних вуглеводів наприклад гідролізат крохмалю. Склад живильного середовища може включати й інші різні вуглеводвмісні речовини: гідролізат крохмалю, кукурудзяної муки, кормових дріжджів, лужний екстракт кукурудзяної муки. Неорганічні речовини: (NH4) 2HPO4, CaCl2, MgSO4, KCl. Деякі компоненти попередньо подрібнюють, відварюють або гідролітично розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для приготування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня обсіменіння об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації та апарати. Повітря очищається до і після аерування. До - тому що містить частинки пилу органічної та неорганічної природи, після - тоу що несе клітини продуцента.
Одержання посівного матеріалу: для засіву живильного середовища матеріал готують також глибинним методом. Вид його залежить від продуцента: для грибів це міцеліальна вегетативна маса, для бактерій - молода зростаюча культура на початковій стадії спороутворення. Одержання посівного матеріалу полягає в збільшенні маси продуцента в 3-4 стадії. Обсяг посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується лише вегетативно, він різко зростає (до 5-20%). Якщо ж відбувається рясне спороношення - скорочується до 1%.
Посівний матеріал як на окремих стадіях, так і готовий піддають ретельному мікробіологічний контроль. Він не повинен бути інфікований сторонньою мікрофлорою, в ньому має міститися певна кількість спор або клітин на одиницю маси, генетично закладені в ньому властивості продукувати ферменти повинні стійко зберігатися.
Біосинтез ферментів в глибинній культурі протікає протягом 2-4 діб при безперервної подачі повітря і перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах можуть гальмувати зростання біомаси продуцента, тому часто свіжа середу або деякі її компоненти вводяться в ферментер на стадії активного зростання. Температурний оптимум знаходиться в інтервалі 22-32оС. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості утворилися метаболітів і концентрації клітин. Дані надходять в комп'ютер, який визначає стратегію корекції процесу і автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкращу якість продуктів.
Відомі наступні різновидності глибинного культивування: періодичний, безперервно-циклічний і безперервно-проточний.
1. Періодичний спосіб характеризується незмінність живильного середовища в ферментера, склад якої в процесі розвитку поступово змінюється. Процес протікає постадійно: у ферментер набирають живильне середовище і задають посівний матеріал; після розмноження мікроорганізмів і накопичення продуктів їх обміну зрілу культуру вивантажують, а все обладнання, комунікації та запірні пристрої пормивають, а потім стерилізують парою.
2. При безперервноциклічному способі мікроорганізми, розташовані на нерухомої насадці у ферментері, омиваються середовищем, що протікає в замкнутому контурі, до повного споживання ними поживних речовин. Після цього зрілу культуру вивантажують, починаючи з останнього, апарати промивають, стерилізують і цикл повторюють з останнього голів ¬ ного ферментера. Багата поживними речовинами середу під час такої циклічної ферментації поступово виснажується; за часом перебування середовища в зоні реакції цей процес більш тривалий, ніж періодичний.
3. Безперервно-проточний спосіб культивування мікроорганізмів більш досконалий. Суть його полягає в тому, що мікробна популяція розвивається в проточному поживному середовищі. Спосіб має два різновиди: гомогенно-неперерваним і градієнтні-безперервний. У першому випадку вирощування ведуть в одному ферментері; при ретельному перемішування середовища та аерації забезпечується однакове стан культури в усьому об'ємі рідини. У ферментер при цьому не безперервно надходить свіжа середи, а з нього також безупинно випливає надлишок зрілої культуральної рідини.
4. Градієнтні-безперервне культивування здійснюють в батареї ферментера, з'єднаних переточні трубами. Середовище, що засівають, з великим вмістом вуглеводів і інших інгридіентів безупинно перетікає з одного ферментера в інший і також безперервно витікає у вигляді готової культури.
Безперервним культивуванням у проточних середовищах можна вирощувати мікроорганізми в умовах, оптимальних для їх стадії розвитку. При цьому такі важливі фактори, як концентрація поживних речовин, кількість продуктів обміну, рН, вміст розчиненого кисню, різко змінюються при періодичному способі культивування, підтримуються по стояли на заданому рівні або змінюються по розробленній програмі.
Виділити: У міцелії тридобовий культури зазвичай залишається не більше 15% ферментів. Решта виділяються в навколишнє клітини рідку середу. У цьому випадку препарати ферментів виділяють з фільтратів після відділення біомаси.
Концентрування: для отримання ферментних препаратів з індексом Г3х фільтрат або культуру концентрують, після чого суміш направляється на сушіння. Глибинні культури мікроскопічних грибів в рідкому вигляді не можуть зберігатися тривалий термін без втрати активності, перевозити їх на великі відстані внаслідок значного вмісту в них води (до 85 ... 90%) також економічно не завжди виправдано. Тому при організації постачання культурою спиртових заводів доцільно її попередньо концентрувати.
Концентрування культур можна здійснювати на вакуум-випарних установках з отриманням сиропів при температурах, що забезпечують збереження ферментів, або на розпилювальних сушарках з отриманням порошкоподібного ферментного препарату. Однак ці способи супроводжуються значними втратами активності (до 50%) і тому не знайшли поширення на спиртових заводах. Починаючи з сімдесятих років у ВНІІПрБТ був розроблений і впроваджений на Мічурінському експериментальному заводі спосіб концентрування глибинних культур ультрафільтрації.
Спосіб заснований на проведенні процесу фільтрації через ряд напівпроникних мембран, в результаті чого ферменти та інші високомолекулярні речовини затримуються або виводяться з апарату у вигляді ультраконцентрату (концентрованого сиропу). Вода і частина низькомолекулярних речовин (пермеат) проходять через мембрани і також видаляються.
Втрати активності при ультрафільтрації складають до 15% в перерахунку на первинну активність вихідної висвітленої культуральної рідини.
При використанні концентрованих препаратів на стадії оцукрювання застосовують звичайне обладнання для фармакотерапевтичної групи ферментних оцукрюючих матеріалів.
Очищення: для отримання очищених ферментних препаратів використовують традиційні методи, що дозволяє більш ніж у 30 разів підвищити активність препарату. Для відділення амілаз від супутніх ферментів використовується адсорбція домішок на глинистих матеріалах, зокрема на бентоніт. Одним із прийомів очищення термостабільним амілаз від протеаз є термоінактівація останніх. Також використовуються методи біоспеціфіческой хроматографії на природних і синтетичних сорбентах.
Сушка: висушування препарату повинне здійснюватися за температури на вході в розпилюючи сушарку не вище 100-120 ° С, на виході - не більше 50-60 °С. При сушці і концентрування велике значення має правильний вибір стабілізатора ферменту. Введення стабілізаторів у присутності наповнювачів (перліту та каоліну) в процесі розпилювального сушіння дозволяє практично повністю запобігти теплову інактивацію ферментів.
Отримання амілолітичних ферментних препаратів з поверхневих культур мікроорганізмів
При поверхневому методі культура росте на поверхні твердої зволоженою живильного середовища. Міцелій повністю обволікає і досить міцно скріплює тверді частинки субстрату, з якого отримують поживні речовини. Оскільки для дихання клітини використовують кисень, то середу повинна бути пухкої, а шар культури-продуцента невеликим.
Підготовка живильного середовища: середовищем для вирощування продуцентів є пшеничні висівки з додаванням до 25% солодових паростків, зволожених водою, подкисленной 0,1 н. розчином сірчаної або соляної кислоти. Вихід готової культури складає звичайно 70-80 мас. % Від маси середовища. Пшеничні висівки - джерело необхідних поживних і ростових речовин. Крім того, вони створюють необхідну структуру середовища. Для підвищення активності ферментів до висівками можна додавати буряковий жом, соєвий шрот, крохмаль, рослинні відходи. Стерилізують середу гострим паром при помішуванні (температура - 105-140 С, час 60-90 хвилин). Після цього середу засівають і розкладають рівним шаром у стерильних кюветах. Кювети поміщають в растільние камери.
Одержання посівного матеріалу: продуцентами б-амілази і глюкоамілази найчастіше є бактерії B.subtilis і B.amilosolvents. Вирощування виробничої культури відбувається зазвичай в асептичних умовах, але середовище та кювети необхідно простерилізувати. Перед кожним новим завантаженням також необхідна стерилізація устаткування. Переваги поверхневої культури: значно більш висока кінцева концентрація ферменту на одиницю масу середовища (при оцукрювання крохмалю 5 кг поверхневої культури замінюють 100 кг культуральної рідини), поверхнева культура відносно легко висушується, легко переводиться в товарну форму.
Посівний матеріал може бути трьох видів:
- культура, що виросла на твердому живильному середовищі;
- споровий матеріал;
- міцеліальних культура, вирощена глибинним способом.
В три етапи отримують і посівну культуру. Спочатку музейну культуру продуцента пересівають на 1 - 1.5 г зволожених стерильних пшеничних висівок в пробірку і вирощують в термостаті до рясного спорообразованія. Другий етап - аналогічно, але в колбах, третій - у судинах з 500 г середовища.
Виробниче культивування: режими вирощування залежать від фізіології продуцента. Культивують протягом 36-48 годин. Зростання ділиться на три періоди, приблизно рівних за часом. Спочатку відбувається набухання конідій і їх проростання (температура не нижче 28 є С), потім зростання міцелію у вигляді гармата сірувато-білого кольору (необхідно виводити виділяється тепло) та освіта конідій. Для створення сприятливих умов росту і розвитку продуцента необхідна аерація і підтримання оптимальної вологості (55-70%).
Виросла в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні культура представляє корж із набряклих часток середовища, щільно пов'язаних зрослися міцелієм. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм.
Виділення та очищення: процес очищення починається з водної екстракції при 20-25 ° С з відбором 20-22% розчину; середня концентрація СВ в екстрактах - 11-14%. Екстракт може бути використаний для отримання очищених препаратів шляхом осадження ферментів органічними розчинниками або солями. Амілази випадають в осад майже повністю (93-96%) при концентрації етанолу в розчині 69-72%, ацетону - 60-62 і ізопропанол - 54-55%. Як правило, екстраген - вода. При цьому в розчин переходять цукру, продукти гідролізу пектинових речовин і целюлози. Стадію виділення і очищення завершує сушка.
Сушка: культуру висушують до 10-12% вологості при температурах не вище 40 є С, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній та спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.
Стандартизація: стандартизація ферментного препарату - доведення активності ферменту до стандартної, що відповідає вимогам ГОСТ. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі - крохмаль, лактоза та ін.
1 2