Ім'я файлу: реферат безпалова.docx
Розширення: docx
Розмір: 125кб.
Дата: 16.05.2020
Пов'язані файли:
Referat LEV.docx

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ УКРАЇНИ

«КИЇВСЬКИЙ ПОЛІТЕХНІЧНИЙ ІНСТИТУТ ІМ.І.СІКОРСЬКОГО»

ФАКУЛЬТЕТ БІОМЕДИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

КАФЕДРА БІОМЕДИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ


РЕФЕРАТ

з дисципліни «Основи біомедичної інженерії-3. Медичні біотехнології»

за напрямом підготовки 6.051402 Біомедична інженерія

на тему: «Біотехнологічне отримання інтерферону»





Робота захищена з оцінкою

________ (кількість балів)
__________
Виконав: студент групи БМ-72

Левченко Д.А.

Перевірив: к.б.н., доцент

кафедри БМІ

Беспалова О. Я.
__________

Київ – 2019

ЗМІСТ




ВСТУП


Інтерферон є одним із сучасних засобів терапії та профілактики вірусних захворювань. Процес отримання інтерферону є не тільки дуже важливим для медицини, а й технологічно складним. Найголовнішою характеристикою отриманого препарату, крім йому властивих, є якість. Лікарські препарати повинні бути не тільки ефективні у використанні, але також і безпечні для людини, тому процес виробництва інтерферону повинен бути організований з чітким дотриманням технології..

Об’єктом дослідження даної роботи є інтерферон – біологічно активний білок, який відносять до класу цитокінів. Інтерферон продукується клітинами організму у відповідь на вірусну хворобу. Він забезпечує противірусний захист організму, володіє протизапальною, імуномоделюючою, протипухлинною, радіопротективною та антиміотичною дією. Предметом дослідження є технології виробництва інтерферонів.

Метою є огляд найпоширеніших технологій виробництва інтерферону, їх аналіз та порівняння, зіставлення рівнів продуктивності методів, їх трудомісткість.

ОСНОВНА ЧАСТИНА


Виробництво інтерферону

  1. ВИРОБНИЦТВО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ІТНЕРФЕРОНУ

За цією технологією можна отримати 1мкг інтерферону з 1л донорської крові, що становить одну дозу.

Цей метод добування інтерферону є першим із запропонованих. Він базується на використанні донорської крові, і був запропонований К.Кантеллом в 1977 році. При цьому лейкоцити інкубуються разом із вірусом (наприклад, вірус Сендай або вірус хвороби Ньюкасла), а в якості компонента поживного середовища слугує сироватка крові людини або бика (іноді – казеїн молока). Далі суміш очищують за допомогою хроматографічних методів і отримують достатньо концентрований препарат інтерферону.

В якості клітин-продуцентів інтерферону використовують лейкоцити людини, виділені з донорської крові, лейкоцитарної або еритроцитної маси. Для індукції інтерферону використовується вірус хвороби Ньюкасла, штам «Н», у вигляді неочищеної алантоїсної рідини із вірусом.

Для отримання великих кількостей ІФН використовують шестиденні одношарові культури клітин курячого ембріона або культивовані лейкоцити крові людини, заражені певним видом вірусу. Іншими словами, для отримання ІФН створюють певну систему вірус-клітина.

Весь технологічний процес проводять в колбах, матрацах або бутелях. Регламентом не передбачено очищення інтерферону від баластних білків. Як показує практика роботи підприємств і товариств із великим об’ємом випуску препарату, діючий Регламент більш прийнятний при виготовленні інтерферону в малих кількостях.

Підприємства, які перероблюють за день від 30 до 100 л донорської крові та таку ж кількість суспензії лейкоцитів на інших етапах технологічного процесу, першими виявили недоліки отримання інтерферону в матрацах, колбах або бутелях. Цими недоліками є дуже велика трудомісткість, багатостадійність технології, великий об’єм ручної праці, відсутність можливості автоматизації окремих технологічних процесів.

При веденні в матрацах або бутелях стадії праймингу, індукції та біосинтезу інтерферону, враховуючи відсутність автоматичного контролю та підтримання температурних параметрів суспензії, призводить до отримання інтерферону з різною противірусною активністю, що в свою чергу відбивається на собівартості та рентабельності препарату.

Іншим недоліком даної технології є відсутність стадії очищення інтерферону від чужорідних антигенів (тобто, вірусного індуктора, білків алантоїсної рідини, включаючи овальбумін). Присутність чужорідних антигенів в інтерфероні для ректального використання може викликати сенсибілізацію організму до цих антигенів, особливо до овальбуміну.

Після відкриття в 80-х роках лімфотропних вірусів, в тому числі вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), що викликає синдром набутого імунодефіциту людини (СНІД) та можливе зараження людей через кров або препарат, виготовлений з такої крові, гостро поставило питання про введення стадії очистки і додаткових методів інактивації можливих вірусів-контамінантів в нативному ЧЛІ для назального використання.

Існуючі методи очистки інтерферону є достатньо трудомісткими і мало придатні для очистки великих об’ємів інтерферону. Так, наприклад, в технології виготовлення препарату інтерферону для ін’єкцій використовують багатоетапну процедуру осаджування білків роданідом калію з фракціонуванням в етанолі, контролюючи при цьому рН. Метод при 1000-кратній концентрації ЧЛІ дозволяє в 100 разів його очищувати з 60% виходом кінцевого продукту.

Інший відомий метод очистки інтерферону від домішок – використання імуносорбції. Інтерферон специфічно адсорбували з суміші білків на імуносорбенті, з іммобілізованими антиінтерфероновими імуноглобулінами, із подальшим елююванням. Був описаний метод очистки інтерферону шляхом його осаджування сульфатом амонію із подальшим розчиненням осаду в 2-8 М сечовині і далі гель-фільтрацією на колонці з гелем Акрилекс II-60.

Інші дослідники осаджували інтерферон трихлороцтвою кислотою і проводили хроматографію розчиненого осаду на колонці з Сефадексом G-100.

Однак, усі вказані методи дозволяють отримувати високочисті препарати інтерферону з достатньо високим виходом за противірусною активністю, але із втратами інших біологічно активних білків, які продукуються лейкоцитами на стадії біосинтезу інтерферону.

Іншим недоліком є те, що достатньо важко в промисловому масштабі проводити роботи з хроматографічним обладнанням при великому об’ємі виробництва інтерферону.

Слід також зазначити, що традиційні шляхи очищення від контамінуючих домішок, включаючи алантоїсні білки, які видаляють на стадії готового препарату, є достатньо трудомісткими, технічно складними, тривалими та недоречні для виробництва у великому масштабі.

Даним способом виробляють такі препарати: Інтерферон, Інтерлок. Їх призначають для лікування вірусних захворювань, лейкозу, злоякісної меланоми, раку нирок, карциноїдного синдрому (Інтерферон), вірусних захворювань очей, гепатитів (Інтерлок).

Інтерферон-β виготовляють шляхом суперпродукції фібробластів людини стимулятором у присутності інгібіторів обмінних процесів. Препарат має противірусну, імуномодулюючу дію та протипухлинну активність. Призначається при виявленні хронічних вірусних інфекцій в офтальмології, гінекології та урології, дерматології, гематології, онкології.

При тривалому прийомі інтерферону в організмі виробляються антитіла до інтерферону, що робить його нездатним до боротьби з вірусами. Причина цих явищ криється в наявності альбуміну в препаратах на основі інтерферону.

Альбумін отримують з крові, тому існує ризик (хоч і мінімальний) зараження гепатитом та іншими хворобами, що передаються через кров.


  1. ВИРОБНИЦТВО РЕКОМБІНАНТНОГО ІНТЕРФКРОНУ

Радикальним рішенням стало вирішення проблеми добування інтерферону використовуючи методи генної інженерії. Зокрема, гени інтерферону вдалося еспресувати в різних клітинах, наприклад, в клітинах бактерій, дріжджів та ссавців.

В наш час інтерферон отримують переважно з використанням генно-інженерних штамів Escherichia coli, з 1л культури кишкової палички отримують близько тисячі доз продукту.

2.1 Технологія виготовлення рекомбінантного α-1 інтерферону

Для виготовлення рекомбінантного α-1 інтерферону використовують штам дріжджів Pichia pastoris KM71 [31].

Для отримання штаму дріжджів Pichia pastoris – продуцента α-1 інтерферону людини, клітини дріжджів штаму PS99 трансформують плазмідою pHIN.

Клітини дріжджів вирощують в 100 мл середовища YEPD при 30°С до набуття культурою оптичної густини, відповідній 2-4 од. поглинання при довжині хвилі 600 нм. Клітини двічі промивають стерильною водою, після чого суспендують в 0,3 мл 100мМ розчину ацетату літію та інкубують при 30°С на протязі 30 хв. До 50 мкл отриманої суспензії клітин додають 0,1-1 мкг плазмідної ДНК, 50 мкг ДНК сперми лосося, спершу денатурованої нагріванням (10 хв при 100°С) і 0,3 мл розчину 100 мМ ацетату літію, що містить 40% ПЕГ 4000. Далі пробу інкубують 30 хв при 30°С і 20 хв при 42°С, занурюють на 15 с в крижану баню і центрифугують 10 с при 10000 об./хв. Клітини суспендують в 1 мл стерильної води та висівають на тверде середовище SC. Клони трансформантів виростають через 2-3 доби. Вирощені клони пересівають на чашки із середовищем SC, що містить 2% глюкозу, окремими колоніями, потім відбивають на середовище ММ (1,34% Yeast Nitrogen Base (“Difco”, USA), 0,5% метанолу, 2% агару (“Difco”, USA) для відбору трансформантів, не зростаючих на середовищі з метанолом, що свідчить про інтеграцію чужорідного гену в локус АОХІ (фенотип Met-).

По закінченню процесу культивування видаляють клітини дріжджів за допомогою центрифугування при 6-7 тис. об./хв на протязі 15 хвилин, при +4°С. Всі наступні дії здійснюють при температурі +4°С. Надосадову рідину пропускають через нітроцелюлозний фільтр з діаметром пор 0,45 мкм (Millpore Inc.).

Отриманий таким чином фільтрат концентрують на ультрафільтраційній установці УПЛ-0,6 із використанням мембрани АР-0,2-15ПА (НПК «Біотест»), яка відсікає сполуки із молекулярною масою менше 15 кДа, на цій стадії відбувається видалення низькомолекулярних компонентів середовища і зменшення вихідного об’єму до 100-200 мл.

Далі проводять сольове осадження цільового білку, доводячи насичення сульфату амонію до 60%. Осад цільового білку збирають центрифугуванням при 12-14 тис. об./хв на протязі 20 хвиин. Отриманий осад розчиняють в 50 мМ амоній-ацетатному буфері (рН 5,5), що містить 2 мМ ЕДТА, 0,05% Твін-20, і наносять на колонку, яка містить 1000 мл Сефакрилу HR 100, збалансованого таким самим буфером. Перші 350 мл відкидали, фракції, що містять цільовий білок, об’єднують.

Отриманий таким чином елюат титрують 10% аміаком до рН 7,0 і наносять на колонку, що містить 50 мл ДЕАЕ-целюлозу, збалансовану 50 мМ амоній-ацетатним буфером (рН 7,0), який містить 2 мМ ЕДТА, 0,05% Твін-20. Відмивають колонку послідовно 100 мл збалансовуючим буфером і 100 мл збалансовуючим буфером, який містить 0,1 М хлориду натрію. Елюювання проводять градієнтом концентрації хлористого натрію від 0,1 М до 1,0 М в 50 мМ амоній-ацетатному буфері (рН 5,5), який містить 2 мМ ЕДТА, 0,05% Твін-20.

Електрофорез в редукуючих умовах показує, що молекулярна маса отриманого білку становить приблизно 20 кДа. За даною схемою очистки можна отримати препарат інтерферону α-1b, з вмістом домішок не більше 5%. Питома активність становить 0,3-1,0×108 МЕ/мг. Активність препарату змінюється в залежності від терапевтичної форми та композиції (табл.2.1.1) Середній вихід з 1л культури становить 7-9 мг.
Таблиця 2.2.1. Вплив складу препарату на активність α-1b інтерферону

pH

ЕДТА, мг/мл

Твін-20, мг/мл

Вихідна активність препарату, МЕ/мл

Активність препарату через 6 міс. зберігання при +4°С, МЕ/мл

Збереження активності, %

Рідка форма

5,5

0,5

0,5

(11,0±0,8)×106

(9,5±0,6)×106

86,3

5,5

0,5

2,5

(10,8±0,8)×106

(9,1±0,8)×106

84,2

5,5

0,5

5,0

(10,6±0,8)×106

(8,9±0,7)×106

84,0

5,5

0,8

0,5

(11,1±0,8)×106

(10,7±0,8)×106

96,4

5,5

0,8

2,5

(10,4±0,8)×106

(9,9±0,8)×106

95,1

5,5

0,8

5,0

(10,8±0,8)×106

(10,3±0,8)×106

95,2

5,5

1,5

0,5

(11,3±0,8)×106

(10,7±0,7)×106

95,1

5,5

1,5

2,5

(10,6±0,8)×106

(10,0±0,8)×106

94,0

5,5

1,5

5,0

(10,5±0,8)×106

(9,8±0,7)×106

93,6

6,7

0,8

0,5

(11,0±0,8)×106

(9,8±0,6)×105

89,1

7,8

0,8

0,5

(10,7±0,8)×106

(8,3±0,6)×105

77,5

Суха ліофілізована форма

5,5

0,8

0,5

(9,8±0,9)×106

(9,3±0,7)×106

95,1

6,7

0,8

0,5

(10,3±0,6)×106

(8,6±0,8)×106

83,6

7,8

0,8

0,5

(9,9±0,6)×106

(7,7±0,9)×106

77,8


2.2 Технологія виробництва рекомбінантного β-1 інтерферону

Інтерферон β людини або фібробластний інтерферон секретується, в основному, фібробластами і є глікопротеїном із молекулярною масою 20 кДа. Його структура позначається як ІФН- β-1а. Пептидна частина ІФН- β-1а представлена 166 амінокислотними залишками. Молекула містить вільну сульфгідрильну групу цистеїну в положенні Cys16 і один внутрішньомолекулярний дисульфідний зв'язок в положенні Cys30-Cys140.

Рекомбінантний інтерферон β, який отримують в бактеріальній системі, являє собою неглікозильований білок, що має заміну цистеїну в положенні 16 на серин (рис.2.2.1). Така заміна позбавляє проблеми утворення димерів за рахунок неправильного замикання дисульфідних зв’язків. Така структура фібробластного інтерферону має назву ІФН-β-1b.


Рис. 2.2.1 Послідовність амінокислот в ІФН-β-1b
Створення штама-продуцента людського інтерферону β-1b дозволило отримувати біологічно активний білок в кількості, необхідній як для проведення різноманітних структурно-функціональних досліджень, так і для використання в медичній практиці.

Рекомбінантний ІФН-β-1b людини отримують в нерозчинній формі у вигляді тілець включення. У порівнянні з розчинною формою, експресія білку у вигляді тілець включення має ряд переваг – нерозчинні агрегати білку не проявляють токсичної дії, практично не атакуються протеазами, та з високим виходом виділяються центрифугуванням.

До 150 г тілець включення рекомбінантного ІФН-β-1b людини приливають 1000 мл розчину, який містить 0,3 % трифтороцтвої кислоти (ТФО). Після цього тільця включення гомогенізують в блендері із швидкістю 800 об./хв на протязі 1 хвилини, переносять в стакан з магнітною мішалкою і залишають перемішуватися протягом 1 години при температурі 4°С. Далі отриману суспензію центрифугують при 4°С протягом 40 хвилин на швидкості 10000 об./хв. Отриманий осад переносять в блендер, заливають 1,0 л розчину 1-пропанол:вода (1:1) з додаванням 0,3% ТФО, гомогенізують зі швидкістю 800 об./хв протягом 1 хвилини, охолоджують розчин при -20°С протягом 20-30 хвилин і ставлять перемішуватися при 4°С на 1-2 години.

Отриманий екстракт центрифугують при 4°С протягом 40 хвилин на швидкості 10000 об./хв. Потім отриманий супернатант фільтрують через скловолокно і розбавляють розчином, що містить 0,3 % ТФО до концентрації 1-пропанола 20 %.

На наступному етапі екстракт білку наносять на обернено-фазову колонку DAU-100 (розмір колонки 10×10 см) (YMC Co., LTD, Japan), наповнену сорбентом GEL-Butyl C4 (YMC Co., LTD, Japan) і збалансовану розчином, який містить 0,1 % ТФО і 20 % 1-пропанол. Навантаження на сорбент може досягати 40 мл сумарного білку на 1 мл носія. Після нанесення розчину білку, колонку промивають початковим розчином ТФО і 1-пропанолу до отримання на спектрофотометрі значень, що дорівнюють значенням базової лінії при довжині хвилі 280 нм. Сорбовані білки піддають елююванню в градієнті концентрації 1-пропанолу (від 20 % до 50 %) при довжині хвилі 280 нм. Фракції, що містять цільовий білок за результатами аналізу на обернено-фазній колонці, об’єднують. З об’єднаної фракції, зібраної з обернено-фазної колонки, осаджують білок додаванням рівного об’єму буферного розчину, який містить 50 мМ Na2HPO4, і доведенням рН отриманого розчину до 6,0.

Потім суспензію білку центрифугують з використанням центрифуги за 4°С протягом 30 хвилин на швидкості 14000 об./хв. Отриманий осад розмішують в 400 мл такому самому буферному розчині і знов центрифугують за аналогічних умов.

Далі осад наносять на колонку BPG 200/500 (розмір колонки 20×30 см) (JE Healthcare, USA), заповнену гелем Sephadex G-25 Fine (JE Healthcare, USA) та збалансовують розчином 10 мМ NaOH. Елюювання проводять в ізократичному режимі при довжині хвилі 280 нм. Із фракції, зібраної з колонки, осаджують білок шляхом внесення дигідрофосфату натрію до сумарної концентрації реактиву в розчині 50 мМ і доведеням рН розчину до 6,0 і проводять центрифугування суспензії білку з використанням центрифуги при 4°С протягом 30 хвилин за швидкості 14000 об./хв.

Отриманий осад гомогенізують в буферному розчині, який містить 100 мМ NaH2PO4, pH 4,2 і прогрівають до 65°С, додають рівний об’єм заздалегідь нагрітого до 65°С 75% розчину фенола у воді. Проводять інкубацію на протязі 20 хвилин в термошейкері при 65°С. Потім реакційну суміш охолоджують до 10°С, домагаючись повного розшарування фаз, та видаляють водну фазу за допомогою водоструминного насосу.

Отриманий розчин білку в фенолі розводять в 6,5 разів 30 % етиловим спиртом, додають ТФО до 0,1 % і наносять на обернено-фазну колонку DAU-50 (розмір колонки 5×20 см) (YMC Co., LTD, Japan), заповнену сорбентом С18 (YMC Co., LTD, Japan) та збалансовану розчином, який містить 0,1 % ТФО та 20 % 1-пропанолу. Навантаження на сорбент може досягати 40 мг сумарного білку на 1 мл носія. Після нанесення розчину білку, колонку промивають початковим розчином ТФО і 1-пропанолу до показання спектрофотометром значень, рівних значенням базової лінії за довжини хвилі 280 нм. Сорбовані білки піддають елююванню в градієнті концентрації 1-пропанолу (від 20 % до 50 %) за довжини хвилі 280 нм. Фракції, що містять цільовий білок за результатами аналізу на обернено-фазній колонці С18, об’єднують.

Розчин цільового білку наносять на колонку BPG 200/500 (розмір колонки 20×30 см) (JE Healthcare, USA), заповнену гелем Sephadex G-25 Fine (JE Healthcare, USA) та збалансовану розчином 10 мМ NaOH. Елюювання проводять в ізократичному режимі за довжини хвилі 280 нм. В отриманій фракції білку визначають концентрацію за допомогою обернено-фазної хроматографії на колонці С18.

Вихід готового продукту з 1 г цільового білку, отриманого при екстракції на першому етапі з тілець включення, становить 0,3 цільового білку. Чистота білку не менше 98 %. Матеріальний баланс промислового процесу очищення ІФН-β-1b вказаний в табл. 2.2.1.
Таблиця 2.2.1. Матеріальний баланс основних стадій промислового процесу очистки ІФН-β-1b

Стадії очистки ІФН-β-1b

Вихід ІФН-β-1b, г

Вихід ІФН-β-1b, %

Хроматографічна чистота ІФН-β-1b, %

Вміст

Білків E. coli нг/мгбілку

Ендотоксинів Од./мгбілку

Екстракція білку з 150 г тілець включення

5

100

60-70

>100

>250

ВЕРХ на С4, YMC

4

80

65-75

90-100

50-250

Розчинення білку в 1% лаураті натрію

4

80

Ренатурація

2,8

70

Очистка білку фенолом

2,5

50

70-75

20-60

2-5

ВЕРХ на С18, YMC

1,4

28

96-98

5-10

≤1


Основним терапевтичним ефектом ІФН-β-1b противірусна та імуномоделююча активність, зниження частоти загострення розсіяного склерозу з ремітуючим протіканням на одну третину і зменшення кількості нових ділянок ураження головного мозку. Крім того, знижується частота загострень при вторинно-прогресуючому протіканні розсіяного склерозу і зменшується вираженість атрофії головного мозку. Препарати на основі ІФН- β-1b відомі під назвами: Екставіа, Бетаферон, Авонекс та ін.


ВИСНОВКИ


Інтерферони – група низькомолекулярних білків, які володіють рядом спільних біологічних властивостей, головною з яких є здатність при контакті з клітинами викликати в них стійкість до вірусних інфекцій. Інтерферони хребетних і, також, людини розділяють на три групи: α-, або лейкоцитарні, β-, або фібробластні, та γ- , або імунні (продукуються Т-лімфоцитами).

Інтерферони викликають стан несприйнятливості до широкого спектра вірусних інфекцій, що індукується у всіх клітинах, які мають рецептори до інтерферонів. Вони індукують як локальні, так і системні противірусні реакції в інших клітинах. Крім того, інтерферони володіють ще двома важливими властивостями: пригнічують поліферацію клітин (і, таким чином, потенційно є протипухлинним засобом) і модулюють імунну систему.

За використання лейкоцитарної технології виготовлення інтерферону, створюють певну систему вірус-клітина крові (лейкоцити або фібробласти). При цьому лейкоцити інкубуються разом із вірусом (наприклад, вірус Сендай або вірус хвороби Ньюкасла), а в якості компонента поживного середовища слугує сироватка крові людини або бика (іноді – казеїн молока). Далі суміш очищують за допомогою хроматографічних методів і отримують достатньо концентрований препарат інтерферон. За цією технологією можна отримати 1мкг інтерферону з 1л донорської крові, що становить одну дозу. Недоліком даної технології є проблема очищення інтерферону від чужорідних антигенів (тобто, вірусного індуктора, білків алантоїсної рідини, включаючи овальбумін).

Субстанція інтерферону α-2 виготовляється за рекомбінантною технологією переважно шляхом біосинтезу штаму Escherichia coli, у який вбудовано ген інтерферону людини. Вектором для проходження трансформації бактеріального геному є бактеріофаг, або плазміда. Процес виготовлення й очищення інтерферону в плазмідній технології складається з таких стадій: формування клітинної біомаси, її дезінтеграція; розчинення «тілець включення» шляхом денатурації білкових структур за допомогою сечовини або гуанідинхлориду; ренатурація денатурованих молекул інтерферону; очищення. З 1л культури кишкової палички отримують близько тисячі доз продукту. З використанням плазмідної технології також ампліфікують ген інтерферону в клітинах дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

N-кінцевим амінокислотним залишком природного ІФН-α2 є цистеїн, який зв’язаний дисульфідним зв’язком із 98 цистеїном білка. Також у певної частини молекул рекомбінантних ІФН-α2, що виділяють з клітин Escherichia coli, на N-кінці залишається додатковий залишок метіоніну (формілметіоніну), що робить рекомбінантних ІФН-α2 модифікованим білком. Надлишковий N-кінцевий метіонін може впливати на стабільність та імуногенність білків, а також в більшості випадків призводить до втрати їх біологічної активності. Тому в роботі був розглянутий спосіб видалення N-кінцевого метіоніну. Фармакокінетичні характеристики рекомбінантного немодифікованого (стандартного) ІФН не дозволяє підтримувати постійним його рівень у плазмі, що частково пояснює недостатньо високий терапевтичний ефект. З огляду на це, також було розглянуто технологію виготовлення модифікованого рекомбінантного інтерферону α-2 людини.

Для виготовлення рекомбінантного α-1 інтерферону використовують штам дріжджів Pichia pastoris KM71.

Рекомбінантний інтерферон β, який отримують в бактеріальній системі, являє собою неглікозильований білок, що має заміну цистеїну в положенні 16 на серин. Рекомбінантний ІФН-β-1b людини отримують в нерозчинній формі у вигляді тілець включення. У порівнянні з розчинною формою, експресія білку у вигляді тілець включення має ряд переваг – нерозчинні агрегати білку не проявляють токсичної дії, практично не атакуються протеазами, та з високим виходом виділяються центрифугуванням. Вихід готового продукту з 1 г цільового білку, отриманого при екстракції на першому етапі з тілець включення, становить 0,3 цільового білку. Чистота білку не менше 98 %.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ


  1. Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 2 Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов / В.Г. Дебабов, В.А. Лившиц. – М.: Высш. шк., 1988..

2. Колешко, О.И. Микробиология с основами вирусологии: учебник / О.И. Колешко, Т.В. Завезенова – Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1999.

3. Елинов, Н.П. Основы биотехнологии. Для студентов институтов; аспирантов и практических работников. / Н.П. Елинов. – СПБ: Изд-во «Наука», 1995.

4. Овчинников, Ю.А. Биоорганическая химия. / Ю.А. Овчинников. – М.: Просвещение, 1987..

5. Губський, Ю.І. Біологічна хімія: підручник. / Ю.І. Губський. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000.

6. Гаркава, К.Г. Біотехнологія. Вступ до фаху: навч.посіб./ К.Г. Гаркава, Л.О. Косоголова, О.В. Карпов, Л.С. Ястремська. – К.: НАУ, 2012. – 296 с.

7. Биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ. / под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. – М.: Мир, 1988.

8. Burmester, Gerd-Ruediger. Color Atlas of Immunology / Gerd-Ruediger Burmester, Antonio Pezzutto, Timo Ulrichs, Alexandra Aicher. – Stuttgart-New York: Thieme, 2003. 9. Wood, P. Understanding immunology (Second edition) / Peter Wood. – Harlow: Pearson Education Limited, 2006.
скачати

© Усі права захищені
написати до нас