"Хроматографічне розділення вуглеводів"
ШЛЯХИ РОЗВИТКУ Хроматографічні АНАЛІЗУ ТА МОЖЛИВОСТІ Класифікація хроматографічних методів
За останні роки в розвитку теорії та практики хроматографії є певні успіхи. Теорія хроматографії отримала успішний розвиток в роботах радянських вчених С.Є. Бреслер, А.А. Жуховицького, В.В. Рачинського, С.3. Рогінского, Г.В. Самсонова, О.М. Тодеса і М.М. Туницькому.
Проте теорія хроматографії потребує подальше поглиблене розвитку, особливо в напрямку передбачення оптимальних умов розділення складних сумішей в окремих конкретних випадках, а також і щодо врахування особливостей сорбентів і носіїв. Для вирішення складних диференціальних рівнянь в даний час можна застосовувати комп'ютерні методи, що дозволяє значно просунутися в області теорії хроматографії, звільняючи дослідників від необхідності застосування наближених методів рішення. Недостатньо розвивається також теорія залежності адсорбції і розподілу речовин від їх хімічної будови. У цьому напрямку були досягнуті успіхи у роботах А.В. Кисельова, акад. П.А. Ребіндера.
П.А. Ребіндер вивів також правило зрівнювання полярностей, що має важливе значення для хроматографії. Хроматографічні процеси на шпальтах і в товщі паперу до певної міри примикають до галузі фізико-механічних процесів фільтрації істинних і колоїдних розчинів, фільтрації і сорбції макромолекул, міцел, емульсій і суспензій.
Метод хроматографічного аналізу являє собою один з видів фізико-хімічного аналізу, який відрізняється від інших видів аналізу в тій же мірі, в якій, наприклад, ваговий аналіз від об'ємного.
Характерною рисою хроматографічного методу є розподіл поділюваних речовин між двома несмешивающимися фазами, що приводить до поділу компонентів даної суміші. При цьому одна фаза може бути твердою, а інша газоподібним чи рідким, або ж обидві фази можуть бути рідкими і містяться на будь-які носії.
Речовини, які полягають в суміші, що розділяється, в процесі хроматографічного розділення переміщуються з однієї фази в іншу.
Процес хроматографічного розділення суміші речовин полягає в просторово-різному розподілі кожного компонента даної суміші між двома фазами, з наступним повним поділом суміші шляхом застосування операції вимивання чи витіснення виділяється речовини або одержання осаду. Причиною такого поділу є розходження у взаємодії кожного з компонентів цієї суміші речовин, що знаходяться в першій фазі (розчинник), з другою фазою, званої сорбентом (твердим або рідким), або з осадителем, вміщеним на носії.
Теоретично можна чекати двох способів здійснення хроматографічного процесу:
1) рідка або газоподібна фаза проходить через нерухому тверду фазу (через колонку або мембрану);
2) твердий сорбент у вигляді зерен або мембрани переміщається в нерухомій рідкої або газовій фазі, що піддається поділу.
Таким чином, потрібно враховувати не тільки рух рідини чи газу через колонку сорбенту або носія, але і можливість руху сорбенту або носія через нерухому рідина або газ. Ймовірно, можуть бути запропоновані ще деякі варіанти хроматографічних розділень, не вкладаються в ці типи розділень.
В основному хроматографія є методом кількісного розподілу і визначення компонентів складної суміші. Це її цільове призначення. Тому зусилля теорії хроматографії повинні бути спрямовані на досягнення найбільших успіхів у вирішенні цього завдання, шляхом з'ясування оптимальних умов розділення.
Формулювання особливостей хроматографічного процесу має передбачати не тільки первинний розподіл, а й наступне промивання хроматограми («прояв» по термінології М. С. Кольори), що забезпечує найбільш повне розділення компонентів даної суміші. Запропоноване формулювання загальних особливостей хроматографічного процесу звертає увагу не тільки на причину розділення, але і враховує характерні відмінності процесів розділення.
У реальному процесі хроматографії часто поєднуються різні види сорбції, наприклад молекулярна та іонообмінна.
Перша істотна особливість хроматографічних процесів - це багаторазове повторення актів сорбції - десорбції, іонного обміну або розподілу між фазами і динамічний характер цих процесів.
Друга особливість - наявність великої поверхні сорбенту і великою поглинальною ємності.
Адсорбційної хроматографії застосовується або промивання або витіснення, в розподільній хроматографії - тільки промивання, в іонообмінної - тільки витіснення. Необхідно вказати, що безпосереднє отримання зон чистих речовин в осадовій хроматографії пояснюється тим, що операція прояви або витіснення замінюється процесом виділення речовини в осад, тобто утворенням нової, віддиференціювати фази; поки не закінчиться виділення осаду одного складу, не почнеться виділення осаду іншого складу (Приклад: дві різні кристалічні модифікації иодида ртуті утворюються на осадових хроматограмма роздільно, так як вони мають різну розчинність).
На практиці важко здійснити в чистому вигляді лише молекулярну, тільки полярну або тільки гомеополярную сорбції. Вони завжди поєднуються в реальному хроматографічному процесі. Треба брати до уваги особливості сорбентів та носіїв, враховуючи, що не існує несорбірующіх носіїв, і що різні механізми хроматографічного процесу протікають одночасно і паралельно.
У світлі висловлених міркувань дуже цікава робота В. І, Парамонова з співробітниками, що запропонувала вивчати стан речовини в розчині методом вихідних кривих. Цим методом вдалося довести одночасне існування в розчині досліджуваного хімічного елемента - катіонів, аніонів, колоїдних частинок і нейтральних молекул. При цьому застосовувалися також і інші методи дослідження, як, наприклад, ультрафільтрованіе, діаліз, електродіаліз.
У роботі В.А. Алесковского описаний метод потопаючих частинок, застосовуваний для аналізу дуже розбавлених розчинів і представляють приклад руху сорбенту через товщу розчину.
Різні прийоми хроматографії в даний час отримують все більше застосування, як методи хімічного аналізу. Особливо приємно те, що хроматографія відкриває нові можливості систематичного або дробового бессероводородного методу аналізу.
Різні види хроматографічних процесів можуть бути зіставлені на такій схемі (табл. 1).
У 1951 р. Стрейна запропонував розрізняти чотири види хроматографії (табл. 2).
Поряд з цим Стрейна дав також класифікацію рухомий рідкої фази, яка застосовується в різних видах хроматографічних процесів (табл. 3).
Методи розподільної та іонообмінної хроматографії доцільно зіставити з іншими методами аналізу, наприклад з такими, як мікрокрісталлоскопіческій, краплинний, дробовий та ін
Розподіл хроматографії на молекулярну, іонообмінну, розподільну, осадову й інші її види можна порівняти з підрозділом кількісного об'ємного аналізу на методи нейтралізації, окиснення-відновлення, осадження та комплексоутворення. Сучасна хроматографія виявилася придатною як для якісних, так і для кількісних визначень. / 1 /
Терміни та визначення
Сорбент - тверда речовина, рідина або їх суміші, здатні поглинати або утримувати гази, пари або розчинені речовини і використовувані в хроматографії в якості нерухомої фази.
Адсорбент - твердий сорбент, концентрує на своїй поверхні гази, пари або розчинені речовини. Адсорбентом заповнена хроматографічна колонка, в якій, у свою чергу, відбувається розділення суміші речовин на окремі компоненти.
Сорбат - компонент аналізованої суміші, внесеної до хроматографічну колонку.
Елюент - розчинник або суміш розчинників, призначена для прокачування аналізованої суміші через хроматографічну колонку (рухома фаза).
ЕЛЮАТ - розчин, що виходить з хроматографічної колонки.
Хроматограмі - графічний результат хроматографічного процесу. Хроматограмою (з точки зору апаратурного оформлення) можна назвати залежність відгуку детектора хроматографа від часу при проходженні елюата через осередок детектора. Хромато грама складається з ряду піків, кожен з яких при повному поділі відповідає одному компоненту аналізованої проби (рис.2). Площа або висота піку повинна бути пропорційна концентрації компонента в елюате.
Хроматографічної системи складається з хроматографічної колонки, заповненої певним адсорбентом, через яку при певній температурі прокачується елюент певного складу. ЧАС УТРИМУВАННЯ РЕЧОВИНИ - час перебування досліджуваної речовини в хроматографі. На практиці час утримування визначають від моменту введення проби речовини в хроматограф до моменту реєстрації максимуму сигналу детектора. Кожна речовина при одних і тих же хроматографічних умовах має свій час утримування.
ЧАС УТРИМУВАННЯ НЕСОРБІРУЕМОГО РЕЧОВИНИ-час утримування речовини, яка не адсорбується (не утримується) адсорбентом.
Рис. 1 хроматограмма.
А - амплітуда відгуку детектора,
Т - час, хв.,
tRi - часи утримування хроматографічних піків,
t'R1-виправлені часи утримування,
tM - час утримування несорбіруемого речовини.
Вуглеводи
Вуглеводи - один з основних компонентів клітин і тканин живих організмів, забезпечують всі живі клітини енергією (глюкоза і її запасні форми - крохмаль, глікоген), беруть участь у захисних реакціях організму (імунітет). З харчових продуктів найбільш багаті вуглеводами овочі, фрукти, борошняні вироби (крупи, овочі, фрукти і боби). Їжа людини складається приблизно на 70% з вуглеводів. Вуглеводи використовуються в якості ліків (гепарин, серцеві глікозиди, деякі антибіотики). Підвищений вміст деяких вуглеводів в крові та сечі служить важливим діагностичним ознакою окремих захворювань (цукровий діабет). Добова потреба людини у вуглеводах складає 400-450 м.
Вуглеводи входять до складу клітин і тканин всіх рослинних і тваринних організмів і за масою складають основну частину органічної речовини на Землі. На частку вуглеводів припадає близько 80% сухої речовини рослин і близько 20% тварин. Рослини синтезують вуглеводи з неорганічних сполук - вуглекислого газу і води. Вуглеводи є дуже поширеними природними сполуками, входять до складу рослин і живих організмів. У рослинах вони утворюються в результаті фотосинтезу:
Вуглеводи відносяться до тієї групи органічних сполук, найважливішими представниками якої є цукориди, крохмаль, целюлоза і камеді (гуммі). Вуглеводи є основним джерелом енергії для підтримки всіх функцій організму, в особливості діяльності мозку, і необхідні для метаболізму всіх інших поживних речовин. Вуглеводи синтезуються всіма зеленими рослинами, і в організмі людини або засвоюються безпосередньо, або відкладаються у вигляді глікогену. Крім того, вуглеводи можуть формуватися в самому організмі з деяких амінокислот і гліцероловой складової жирів. / 2 /
Вуглеводи - органічні сполуки, склад яких зазвичай виражається загальною формулою Сn (Н2О) m (n і m> 4). / 2 /
Відомі також сполуки, пов'язані з вуглеводів, склад яких не відповідає загальній формулі, наприклад цукор Рамноза С6Н1205.
Вуглеводи зазвичай поділяють на моносахариди, олігосахариди (продукти конденсації двох або декількох молекул моносахаридів) і полісахариди. Серед олігосахаридів найбільше значення мають дисахариди (діози) - продукти конденсації двох молекул моносахаридів. / 2 /
Моносахариди
Моносахариди - тверді речовини, легко розчинні у воді, погано - у спирті і зовсім нерозчинні в ефірі. Водні розчини мають нейтральну реакцію на лакмус. Більшість моносахаридів мають солодкий смак, проте меншим, ніж буряковий цукор. Моносахариди виявляють властивості спиртів і карбонільних сполук. (Приклади: глюкоза, фруктоза). / 2 /
Дисахариди
Дисахариди (біози) при гідролізі утворюють два однакових або різних моносахариду. Для встановлення будови дисахаридів необхідно знати: з яких моносахаридів він побудований, яка конфігурація аномерних центрів у цих моносахаридів ( - або -), які розміри циклу (фураноза або піраноза) і за участю яких гідроксилів пов'язані дві молекули моносахариду. Дисахариди поділяються на дві групи: відновлюють (мальтоза) і невідновлювані (сахароза). / 2 /
Полісахариди
Полісахаридами, або полиозами, називаються вуглеводи, молекула яких при гідролізі розпадається з утворенням молекул моносахаридів (як відомо, нездатних гидролизоваться). Таким чином, схематично полісахариди можна представити як ангідрідоподобние сполуки, що утворюються при виділенні води з декількох молекул моносахаридів:
ВСТУП: ХРОМАТОГРАФІЯ
Хроматографія (від грец. Chroma, родовий відмінок chromatos - колір, фарба), фізико-хімічний метод розділення і аналізу сумішей, заснований на розподілі їх компонентів між двома фазами - нерухомої і рухомої (елюент), що протікає через нерухому.
Історична довідка. Метод розроблений в 1903 М. Кольором, який показав, що при пропусканні суміші рослинних пігментів через шар безбарвного сорбенту індивідуальні речовини містяться у вигляді окремих забарвлених зон. Отриманий таким чином пошарово пофарбований стовпчик сорбенту Колір назвав хроматограмою, а метод - хроматографією. Згодом термін "хроматограмма" стали відносити до різних способів фіксації результатів багатьох видів хроматографії. Однак аж до 40-х рр.. хроматографія не отримала належного розвитку. Лише в 1941 А. Мартін і Р. Сінг відкрили метод розподільної хроматографії і показали його широкі можливості для дослідження білків і вуглеводів. У 50-і рр.. Мартін і американський вчений А. Джеймс розробили метод газо-рідинної хроматографії.
ШЛЯХИ РОЗВИТКУ Хроматографічні АНАЛІЗУ ТА МОЖЛИВОСТІ Класифікація хроматографічних методів
За останні роки в розвитку теорії та практики хроматографії є певні успіхи. Теорія хроматографії отримала успішний розвиток в роботах радянських вчених С.Є. Бреслер, А.А. Жуховицького, В.В. Рачинського, С.3. Рогінского, Г.В. Самсонова, О.М. Тодеса і М.М. Туницькому.
Проте теорія хроматографії потребує подальше поглиблене розвитку, особливо в напрямку передбачення оптимальних умов розділення складних сумішей в окремих конкретних випадках, а також і щодо врахування особливостей сорбентів і носіїв. Для вирішення складних диференціальних рівнянь в даний час можна застосовувати комп'ютерні методи, що дозволяє значно просунутися в області теорії хроматографії, звільняючи дослідників від необхідності застосування наближених методів рішення. Недостатньо розвивається також теорія залежності адсорбції і розподілу речовин від їх хімічної будови. У цьому напрямку були досягнуті успіхи у роботах А.В. Кисельова, акад. П.А. Ребіндера.
П.А. Ребіндер вивів також правило зрівнювання полярностей, що має важливе значення для хроматографії. Хроматографічні процеси на шпальтах і в товщі паперу до певної міри примикають до галузі фізико-механічних процесів фільтрації істинних і колоїдних розчинів, фільтрації і сорбції макромолекул, міцел, емульсій і суспензій.
Метод хроматографічного аналізу являє собою один з видів фізико-хімічного аналізу, який відрізняється від інших видів аналізу в тій же мірі, в якій, наприклад, ваговий аналіз від об'ємного.
Характерною рисою хроматографічного методу є розподіл поділюваних речовин між двома несмешивающимися фазами, що приводить до поділу компонентів даної суміші. При цьому одна фаза може бути твердою, а інша газоподібним чи рідким, або ж обидві фази можуть бути рідкими і містяться на будь-які носії.
Речовини, які полягають в суміші, що розділяється, в процесі хроматографічного розділення переміщуються з однієї фази в іншу.
Процес хроматографічного розділення суміші речовин полягає в просторово-різному розподілі кожного компонента даної суміші між двома фазами, з наступним повним поділом суміші шляхом застосування операції вимивання чи витіснення виділяється речовини або одержання осаду. Причиною такого поділу є розходження у взаємодії кожного з компонентів цієї суміші речовин, що знаходяться в першій фазі (розчинник), з другою фазою, званої сорбентом (твердим або рідким), або з осадителем, вміщеним на носії.
Теоретично можна чекати двох способів здійснення хроматографічного процесу:
1) рідка або газоподібна фаза проходить через нерухому тверду фазу (через колонку або мембрану);
2) твердий сорбент у вигляді зерен або мембрани переміщається в нерухомій рідкої або газовій фазі, що піддається поділу.
Таким чином, потрібно враховувати не тільки рух рідини чи газу через колонку сорбенту або носія, але і можливість руху сорбенту або носія через нерухому рідина або газ. Ймовірно, можуть бути запропоновані ще деякі варіанти хроматографічних розділень, не вкладаються в ці типи розділень.
В основному хроматографія є методом кількісного розподілу і визначення компонентів складної суміші. Це її цільове призначення. Тому зусилля теорії хроматографії повинні бути спрямовані на досягнення найбільших успіхів у вирішенні цього завдання, шляхом з'ясування оптимальних умов розділення.
Формулювання особливостей хроматографічного процесу має передбачати не тільки первинний розподіл, а й наступне промивання хроматограми («прояв» по термінології М. С. Кольори), що забезпечує найбільш повне розділення компонентів даної суміші. Запропоноване формулювання загальних особливостей хроматографічного процесу звертає увагу не тільки на причину розділення, але і враховує характерні відмінності процесів розділення.
У реальному процесі хроматографії часто поєднуються різні види сорбції, наприклад молекулярна та іонообмінна.
Перша істотна особливість хроматографічних процесів - це багаторазове повторення актів сорбції - десорбції, іонного обміну або розподілу між фазами і динамічний характер цих процесів.
Друга особливість - наявність великої поверхні сорбенту і великою поглинальною ємності.
Адсорбційної хроматографії застосовується або промивання або витіснення, в розподільній хроматографії - тільки промивання, в іонообмінної - тільки витіснення. Необхідно вказати, що безпосереднє отримання зон чистих речовин в осадовій хроматографії пояснюється тим, що операція прояви або витіснення замінюється процесом виділення речовини в осад, тобто утворенням нової, віддиференціювати фази; поки не закінчиться виділення осаду одного складу, не почнеться виділення осаду іншого складу (Приклад: дві різні кристалічні модифікації иодида ртуті утворюються на осадових хроматограмма роздільно, так як вони мають різну розчинність).
На практиці важко здійснити в чистому вигляді лише молекулярну, тільки полярну або тільки гомеополярную сорбції. Вони завжди поєднуються в реальному хроматографічному процесі. Треба брати до уваги особливості сорбентів та носіїв, враховуючи, що не існує несорбірующіх носіїв, і що різні механізми хроматографічного процесу протікають одночасно і паралельно.
У світлі висловлених міркувань дуже цікава робота В. І, Парамонова з співробітниками, що запропонувала вивчати стан речовини в розчині методом вихідних кривих. Цим методом вдалося довести одночасне існування в розчині досліджуваного хімічного елемента - катіонів, аніонів, колоїдних частинок і нейтральних молекул. При цьому застосовувалися також і інші методи дослідження, як, наприклад, ультрафільтрованіе, діаліз, електродіаліз.
У роботі В.А. Алесковского описаний метод потопаючих частинок, застосовуваний для аналізу дуже розбавлених розчинів і представляють приклад руху сорбенту через товщу розчину.
Різні прийоми хроматографії в даний час отримують все більше застосування, як методи хімічного аналізу. Особливо приємно те, що хроматографія відкриває нові можливості систематичного або дробового бессероводородного методу аналізу.
Різні види хроматографічних процесів можуть бути зіставлені на такій схемі (табл. 1).
| Вид хроматографії | Адсорбційна | Іонообмінна | Розподільна | Осадова Окислювально-відновна Комплексообразовательная |
| Діючі сили | Молекулярні | Молекулярні | Іонні | Іонні Перехід електронів Гомеополярние зв'язку |
| Агрегатний стан сорбуючою фази | Тверда | Рідка | Тверда | Рідка |
| Нерухома хроматографії-ючий фаза | Поверхнево-активна тверда фаза | Іонообмінна смола або пермутіт | Пов'язані гелі або рідини | Хімічно реакційно-здатні в-ва |
| Вид хроматографії | Адсорбційна хроматографія | Іонографія, радіоіонографія | Розподіливши-кові хроматографія | Хеміхроматографія |
| Вид розчинника рідкої рухомої фази | Аполярние розчинники (неіонізірубщіе) | Іонізуючі полярні розчинники | Розчинники, що мають спорідненість до сорбенту | Розчинники, що реагують з розчиненим речовиною |
| Вид хроматографії | Хроматографія аполярних розчинених в-в | Іоною обмін і ЕЛЕКТРОМІГРАЦІЯ | Аналіз витісненням | Утворення нових сполук з різними коефіцієнтами розподілу і зарядами, шляхом комплексоутворення |
Розподіл хроматографії на молекулярну, іонообмінну, розподільну, осадову й інші її види можна порівняти з підрозділом кількісного об'ємного аналізу на методи нейтралізації, окиснення-відновлення, осадження та комплексоутворення. Сучасна хроматографія виявилася придатною як для якісних, так і для кількісних визначень. / 1 /
Терміни та визначення
Сорбент - тверда речовина, рідина або їх суміші, здатні поглинати або утримувати гази, пари або розчинені речовини і використовувані в хроматографії в якості нерухомої фази.
Адсорбент - твердий сорбент, концентрує на своїй поверхні гази, пари або розчинені речовини. Адсорбентом заповнена хроматографічна колонка, в якій, у свою чергу, відбувається розділення суміші речовин на окремі компоненти.
Сорбат - компонент аналізованої суміші, внесеної до хроматографічну колонку.
Елюент - розчинник або суміш розчинників, призначена для прокачування аналізованої суміші через хроматографічну колонку (рухома фаза).
ЕЛЮАТ - розчин, що виходить з хроматографічної колонки.
Хроматограмі - графічний результат хроматографічного процесу. Хроматограмою (з точки зору апаратурного оформлення) можна назвати залежність відгуку детектора хроматографа від часу при проходженні елюата через осередок детектора. Хромато грама складається з ряду піків, кожен з яких при повному поділі відповідає одному компоненту аналізованої проби (рис.2). Площа або висота піку повинна бути пропорційна концентрації компонента в елюате.
Хроматографічної системи складається з хроматографічної колонки, заповненої певним адсорбентом, через яку при певній температурі прокачується елюент певного складу. ЧАС УТРИМУВАННЯ РЕЧОВИНИ - час перебування досліджуваної речовини в хроматографі. На практиці час утримування визначають від моменту введення проби речовини в хроматограф до моменту реєстрації максимуму сигналу детектора. Кожна речовина при одних і тих же хроматографічних умовах має свій час утримування.
ЧАС УТРИМУВАННЯ НЕСОРБІРУЕМОГО РЕЧОВИНИ-час утримування речовини, яка не адсорбується (не утримується) адсорбентом.
Рис. 1 хроматограмма.
А - амплітуда відгуку детектора,
Т - час, хв.,
tRi - часи утримування хроматографічних піків,
t'R1-виправлені часи утримування,
tM - час утримування несорбіруемого речовини.
Вуглеводи
Вуглеводи - один з основних компонентів клітин і тканин живих організмів, забезпечують всі живі клітини енергією (глюкоза і її запасні форми - крохмаль, глікоген), беруть участь у захисних реакціях організму (імунітет). З харчових продуктів найбільш багаті вуглеводами овочі, фрукти, борошняні вироби (крупи, овочі, фрукти і боби). Їжа людини складається приблизно на 70% з вуглеводів. Вуглеводи використовуються в якості ліків (гепарин, серцеві глікозиди, деякі антибіотики). Підвищений вміст деяких вуглеводів в крові та сечі служить важливим діагностичним ознакою окремих захворювань (цукровий діабет). Добова потреба людини у вуглеводах складає 400-450 м.
Вуглеводи входять до складу клітин і тканин всіх рослинних і тваринних організмів і за масою складають основну частину органічної речовини на Землі. На частку вуглеводів припадає близько 80% сухої речовини рослин і близько 20% тварин. Рослини синтезують вуглеводи з неорганічних сполук - вуглекислого газу і води. Вуглеводи є дуже поширеними природними сполуками, входять до складу рослин і живих організмів. У рослинах вони утворюються в результаті фотосинтезу:
Вуглеводи відносяться до тієї групи органічних сполук, найважливішими представниками якої є цукориди, крохмаль, целюлоза і камеді (гуммі). Вуглеводи є основним джерелом енергії для підтримки всіх функцій організму, в особливості діяльності мозку, і необхідні для метаболізму всіх інших поживних речовин. Вуглеводи синтезуються всіма зеленими рослинами, і в організмі людини або засвоюються безпосередньо, або відкладаються у вигляді глікогену. Крім того, вуглеводи можуть формуватися в самому організмі з деяких амінокислот і гліцероловой складової жирів. / 2 /
Вуглеводи - органічні сполуки, склад яких зазвичай виражається загальною формулою Сn (Н2О) m (n і m> 4). / 2 /
Відомі також сполуки, пов'язані з вуглеводів, склад яких не відповідає загальній формулі, наприклад цукор Рамноза С6Н1205.
Вуглеводи зазвичай поділяють на моносахариди, олігосахариди (продукти конденсації двох або декількох молекул моносахаридів) і полісахариди. Серед олігосахаридів найбільше значення мають дисахариди (діози) - продукти конденсації двох молекул моносахаридів. / 2 /
Моносахариди
Моносахариди - тверді речовини, легко розчинні у воді, погано - у спирті і зовсім нерозчинні в ефірі. Водні розчини мають нейтральну реакцію на лакмус. Більшість моносахаридів мають солодкий смак, проте меншим, ніж буряковий цукор. Моносахариди виявляють властивості спиртів і карбонільних сполук. (Приклади: глюкоза, фруктоза). / 2 /
Дисахариди
Дисахариди (біози) при гідролізі утворюють два однакових або різних моносахариду. Для встановлення будови дисахаридів необхідно знати: з яких моносахаридів він побудований, яка конфігурація аномерних центрів у цих моносахаридів ( - або -), які розміри циклу (фураноза або піраноза) і за участю яких гідроксилів пов'язані дві молекули моносахариду. Дисахариди поділяються на дві групи: відновлюють (мальтоза) і невідновлювані (сахароза). / 2 /
Полісахариди
Полісахаридами, або полиозами, називаються вуглеводи, молекула яких при гідролізі розпадається з утворенням молекул моносахаридів (як відомо, нездатних гидролизоваться). Таким чином, схематично полісахариди можна представити як ангідрідоподобние сполуки, що утворюються при виділенні води з декількох молекул моносахаридів:
п молекул моносахаридів-(n-1) Н2О à1 молекула полісахариду
У залежності від молекулярної маси і властивостей полісахариди ділять на дві групи:
1. Олігосахариди (від грецького слова олігос - деякий) - низькомолекулярні полісахариди, молекула яких при гідролізі утворює невелике число молекул моносахаридів. Вони розчиняються у воді, здатні кристалізуватися, часто мають, подібно моносахаридам, солодким смаком.
2. Вищі полісахариди - високомолекулярні речовини, мало розчинні або зовсім нерастворімиев воді, в більшості випадків не кристалізуються і не мають солодкий смак. Чіткої межі між олігосахариди і вищими полиозами не існує - всі вони представляють собою безперервний ряд полімерогомологов з поступово збільшується ступенем полімеризації. Зазвичай до олігосахариду відносять полісахариди зі ступенем полімеризації до 8-10.
Поділ полісахаридів на групи олігосахаридів та вищих поліоза виправдане не тільки з позицій оцінки їх молекулярної маси і зазначених відмінностей властивостей, але і з позиції техніки їх дослідження. Якщо при вивченні олігосахаридів застосовуються звичайні класичні методи органічної хімії, то при дослідженні вищих поліоза крім названих методів використовуються і прийоми роботи з високополімера. (Приклади: крохмаль, целюлоза). / 3 /
У залежності від молекулярної маси і властивостей полісахариди ділять на дві групи:
1. Олігосахариди (від грецького слова олігос - деякий) - низькомолекулярні полісахариди, молекула яких при гідролізі утворює невелике число молекул моносахаридів. Вони розчиняються у воді, здатні кристалізуватися, часто мають, подібно моносахаридам, солодким смаком.
2. Вищі полісахариди - високомолекулярні речовини, мало розчинні або зовсім нерастворімиев воді, в більшості випадків не кристалізуються і не мають солодкий смак. Чіткої межі між олігосахариди і вищими полиозами не існує - всі вони представляють собою безперервний ряд полімерогомологов з поступово збільшується ступенем полімеризації. Зазвичай до олігосахариду відносять полісахариди зі ступенем полімеризації до 8-10.
Поділ полісахаридів на групи олігосахаридів та вищих поліоза виправдане не тільки з позицій оцінки їх молекулярної маси і зазначених відмінностей властивостей, але і з позиції техніки їх дослідження. Якщо при вивченні олігосахаридів застосовуються звичайні класичні методи органічної хімії, то при дослідженні вищих поліоза крім названих методів використовуються і прийоми роботи з високополімера. (Приклади: крохмаль, целюлоза). / 3 /
ВИДІЛЕННЯ І ОЧИЩЕННЯ ВУГЛЕВОДІВ / 3 /
Виділення та очищення вищих поліоза і углеводсодержащих біополімерів представляє собою виключно важке завдання. У природних умовах ці сполуки знаходяться у вигляді складних сумішей з низькомолекулярними речовинами, молекулами невуглеводних природи, нарешті, з іншими високополімерний вуглеводами. Труднощі зростають у зв'язку з тим, що, будучи вельми лабільними речовинами, полісахариди під впливом навіть слабких впливів легко піддаються різним змінам: часто відбуваються їх деполімеризація, окислення та інші зміни. Факторами, що викликають такі зміни, крім застосовуваних реагентів (зазвичай лужної або кислої природи) є кисень повітря (у зв'язку з цим іноді виділення доводиться вести в атмосфері азоту), ферменти, що знаходяться в клітці, часто пов'язані з самими полісахаридами (як, наприклад, фесфорілаза і амілаза, пов'язані з гранулами крохмалю).
Хроматографічного розділення / 4 /
Основні принципи фізичного поділу
З поділом речовин доводиться стикатися при кожному хімічному синтезі, і воно є звичайною стадією аналізу. Як правило, поділ має передувати ідентифікації речовини.
Поділ відносно просто, якщо окремі компоненти суміші знаходяться в різних фазах. У цьому випадку воно може бути досягнуто фільтрацією, осадженням, центрифугуванням і т. д. Навпаки, якщо кілька речовин знаходяться в одній фазі, то потрібно домагатися або утворення нової фази шляхом хімічного перетворення (наприклад, переведення в осад), або застосовувати фізичні методи розділення .
Фізичні методи розділення засновані на використанні кінетичних явищ або фазових рівноваг. Фазові рівноваги лежать в основі таких методів розділення, як дистиляція, сублімація, кристалізація, екстракція і адсорбція з газоподібним чи рідкої фази. У цих процесах молекули поділюваних речовин переходять через межу розділу фаз в обох напрямках, причому вони прагнуть до такого стану розподілу, при якому, незважаючи на триваюче молекулярний рух через кордон, в кожній з фаз встановлюється постійна концентрація складових речовин.
В інших методах розділення, де використовуються кінетичні явища (наприклад, при молекулярної дистиляції або діалізі), навпаки, відбувається перенесення речовини через поверхню розділу фаз щонайменше за рахунок одного сорту молекул і тільки в одному напрямі, тому що перейшли через кордон молекули віддаляються від неї. Такі методи поділу мають незначну ефективність.
Якщо колективні компоненти мало розрізняються відносно властивостей, вирішальних для обраного методу (наприклад, тиск пари, розчинність, що адсорбуються або розмір молекул), то концентрування речовини практично не відбувається. У цьому випадку достатнього поділу можна досягти шляхом багаторазового використання елементарного акту поділу. Наочним прикладом такого процесу може служити багаторазова екстракція. При дистиляції в ректифікаційної колоні з насадкою або тарілками також здійснюється ряд послідовних рівноважних станів між рідиною і парою. Збільшення числа елементарних актів поділу обмежується вимогами, які пред'являються до часу поділу, розмірами апаратури і відповідно до витрати речовин. Крім того, високого збагачення однієї з рівноважних фаз бажаним компонентом досягають тільки для простих (не вище потрійних) систем. У разі багатокомпонентних сумішей поряд з чистими речовинами завжди виходять змішані фракції.
Основний принцип хроматографічного розділення
Значне підвищення ступеня поділу можливо, якщо ефект, викликаний повторним встановленням фазових рівноваг, накладається на розділяє ефект, обумовлений кінетичними явищами. У даному випадку уловлювання та видалення молекул, що виходять з поверхні розділу фаз (з нерухомої фази), здійснюється завдяки постійному руху однієї з фаз (а саме рухомої фази). Вихідні з нерухомої фази молекули, як і при фазовому рівновазі, потрапляють до неї знову, проте при досить швидкому русі рухомої фази вони не досягають колишнього елемента обсягу нерухомої фази, а потрапляють в найближчий елемент обсягу в напрямку потоку.
Висока ефективність розділення може бути досягнута тільки завдяки частим фазових переходів, тому нерухома і рухома фази повинні мати більшу поверхню дотику, а зовнішні умови повинні бути вибрані так, щоб молекули поділюваних речовин були здатні до швидкого обміну між двома фазами. Так як ефективність розділення знижується внаслідок дифузійних явищ, то обидві фази усюди повинні мати невелику товщину шару, а потік рухомої фази повинен бути ламінарним.
Ці вимоги в першому наближенні найпростіше здійснюються, наприклад, якщо рухома фаза відбувається під дією перепаду тиску в трубці, наповненою дрібно роздробленим сорбентом як нерухомої фази. Така трубка, наповнена сорбентом, називається хроматографічної колонкою (подібно ректифікаційної колонці в разі дистиляції). Належна до поділу суміш вводиться в рухому фазу і разом з нею вступає у колонку. Там кожен з компонентів суміші прагне розподілитися між рухомою фазою і сорбентом в певному відношенні, відповідному його адсорбуються. Однак ще до того, як такий розподіл встигне відбутися, деяка частина компонента в рухомій фазі просунеться далі і на іншому елементі поверхні нерухомої фази повинно виникнути вже нове співвідношення концентрації. Істинне рівновагу між двома фазами досягається в тим меншою мірою, чим більше швидкість рухомої фази. Так як компоненти суміші, поглинені в даний момент сорбентом, не беруть участь в русі рухомої фази, то кожному з них для проходження колонки в загальному потрібно більше часу, ніж для будь-якої з молекул рухомої фази. Поділ суміші досягається, якщо компоненти суміші володіють різними коефіцієнтами розподілу між обома фазами, тобто якщо нерухома фаза по-різному перешкоджає їх проходженню по колонці.
Поділ речовин, засноване на цьому принципі, називають хроматографією (що при буквальному перекладі на російську означає «цветопісаніе»). Перше хроматографічне розділення провів російський ботанік Колір (1903 р.), який розділив цим способом хлорофіл на окремі забарвлені компоненти.
В даний час хроматографія застосовується з багатьма методичними змінами, які мають одну спільну основу: поділ відбувається внаслідок частого переходу молекул окремих компонентів суміші між двома фазами, з яких одна є нерухомою фазою з розвиненою поверхнею, а друга фаза (рухома) переміщається щодо неї. Завдяки різному розподілу поділюваних речовин між нерухомою і рухомою фазами вони відчувають різне уповільнення в своєму русі вздовж колонки.
РІЗНІ ВИДИ хроматографічного розділення
Рухома і нерухома фази можуть бути утворені різними речовинами. В залежності від їх властивостей і види впливу на колективні речовини різняться і види хроматографії. Рухома фаза, природно, повинна бути утворена тільки речовинами малої в'язкості - газами або малов'язкими рідинами, причому хроматографія з газоподібним чи рідким рухомими фазами має зовсім різне експериментальне оформлення і розрізняється по елементарних процесів.
З цією обставиною пов'язане поділ хроматографії на два основних види. По агрегатному стані рухомої фази розрізняють газову хроматографію і рідинну хроматографію.
Рідка рухома фаза у вертикальній колонці може протікати під дією власної ваги. Оскільки швидкість дифузії поділюваних речовин в рідині невелика в порівнянні зі швидкістю дифузії в газі, то рідку рухливу фазу необхідно пропускати через колонку повільно. Це тягне за собою збільшення тривалості аналізу, але дозволяє також збільшити діаметр колонки і кількість проби без втрати ефективності поділу. Навпаки висока швидкість дифузії в разі газоподібної рухомої фази дозволяє збільшити швидкість потоку цієї фази (можна працювати з колонками з довжиною більше 10м) і зменшити кількість проби і діаметр колонки. У цих умовах може бути досягнута значно більш висока ефективність розділення, ніж у випадку рідкої рухомої фази, так званої розділяє рідини. Це явище аналогічно екстракції, при якій також здійснюється розподільне рівновагу.
Перевага розподільної хроматографії полягає, по-перше, в тому, що рідких нерухомих фаз з різними властивостями набагато більше, ніж адсорбентів, і, по-друге, в тому, що в даному випадку нерухома фаза має гомогенної поверхнею, тоді як поверхня навіть найкращих адсорбентів містить різні центри підвищеної адсорбційної здатності. Ця неоднорідність поверхні адсорбенту перешкоджає рівномірної адсорбції або десорбції, знижуючи тим самим ефективність розділення колонки і, крім того, роблячи майже неможливим поділ сильно адсорбованих речовин. У разі рідкої нерухомої фази, навпаки, сильно адсорбуються речовини можуть бути розділені без праці. Так як є нерухомі фази самої різної полярності, то в даний час хроматографія може бути застосована практично до всіх речовин, оскільки вони в якійсь мірі розчиняються і летючі. Щоб здійснити хроматографічне розділення пари речовин, достатньо мати відповідну нерухому фазу, в якій дані компоненти мали б різну растворімость.Хотя розподільна хроматографія була відкрита як метод рідинної хроматографії, переваги її повністю проявилися тільки при використанні в газовій хроматографії, для якої характерні висока розділяє здатність, мала величина проб і широка область температур. Ідея розподільної хроматографії з газоподібної рухомою фазою була висловлена ще Мартіном і Сінгом в 1941 р., але експериментально розвинена тільки Джеймсом і Мартіном в 1952 р.
Для спеціальних цілей поділу представляє інтерес такий вид розподільної хроматографії, при якому використовується різна здатність компонентів до оборотного комплексообразованию з нерухомою фазою або з доданим до неї речовиною. Цей вид хроматографії (хроматографія, заснована на комплексоутворенні) робить можливим селективне розділення індивідуальних речовин або класів сполук.
Як показали Кремер і Мюллер (1951p), при застосуванні адсорбентів в якості нерухомої фази в деяких випадках перехід речовини відбувається не між рухомою фазою і адсорбентом, а між рухомою фазою і адсорбційним шаром, що покриває адсорбент (хроматографія з використанням адсорбційних шарів). Розеліус (1957) домігся поділу інертних газів на адсорбційному шарі з двоокису вуглецю. Отже, нерухомою фазою в даному випадку був газ.
Описані види хроматографії майже всі експериментально здійснені як з газоподібної, так і з рідкої рухомими фазами. Доцільно прийняти такі їх назви: розподільна газова хроматографія, газоадсорбціонная хроматографія на молекулярних ситах, адсорбційно-рідинна хроматографія, обмінно-рідинна хроматографія.
На практиці спостерігаються численні проміжні види хроматографії. Хроматографія, заснована на комплексоутворенні, завжди пов'язується з розподільною хроматографією, тому що комплексоутворювач знаходиться в рідині. Між адсорбційної і розподільної хроматографії не існує різкого розмежування. З одного боку, на поверхні носія, як покритою, так і не покритій рідиною, може мати місце адсорбція, з іншого - адсорбційну хроматографію можна частково наблизити до розподільної шляхом модифікації адсорбентів. Прикладом цього може служити хроматографія на адсорбційних шарах. Нарешті, при низьких температурах колонок може проявитися адсорбція на поверхні рідкої нерухомої фази.
Чітке розмежування окремих видів хроматографії, очевидно, неможливо. Десті (1957) запропонував у зв'язку з цим класифікацію лише на основі агрегатного стану обох фаз:
хроматографія газ - рідина (ГЖХ),
хроматографія газ - тверде тіло (ГТХ),
хроматографія рідина - рідина (ЖЖХ),
хроматографія рідина - тверде тіло (ЖТХ).
Принцип дії рідинного хроматографа
Рис. 2 Схема рідинного хроматографа.
Будь-рідинної хроматограф складається з наступних частин:
1 - насос;
2 - вузол введення проби;
3 - хроматографічна колонка;
4 - детектор;
5 - реєстратор (самописець, інтегратор або комп'ютер);
6 - термостат колонок;
7 - вузол підготовки елюента з ємностями для елюента;
8 - злив елюата або колектор фракцій.
Принцип дії хроматографа полягає в наступному: розчин аналізованої суміші за допомогою ВУЗЛА ВВЕДЕННЯ ПРОБИ вводиться у верхню частину хроматографічної КОЛОНКИ. З допомогу НАСОСА аналізована суміш прокачується елюентом через хромотографіческую колонку, в якій відбувається поділ аналізованої суміші на окремі речовини (компоненти). Випливає з колонки ЕЛЮАТ, що містить окремі компоненти аналізованої суміші, детектируется Детектор, свідчення якого реєструються Реєстратором.
Рис.3. Схема газохроматографічної установки.
1 - балон зі стисненим газом-носієм; 2 - вентиль, 3 - регулятор і вимірювач швидкості газу-носія; 4 - дозатор;, 5 - проба; 6 - хроматографічна колонка; 7 - детектор; 8 - вихід газу; 9 - харчування детектора ; 10 - перетворювач сигналів; 11 - стрічковий самописець; 12 - терморегулятор; 13 - термостат.
ПРИКЛАДИ хроматографічного розділення ВУГЛЕВОДІВ
1. Хроматографія на колонках з вугіллям / 5 /
Колонкової хроматографії на вугіллі була вперше описана в 1950 г.Уістлером і Дерсу. Вони використовували цей метод для поділу вуглеводів на класи залежно від ступеня їх полімеризації, тобто моносахариди, дисахариди, трісахаріди і т. д.
Згідно з працею, поділ проводилося як ступеневу елюювання вуглеводів водним спиртом з колонки, що містить суміш вугілля з цілить. Цей метод набув поширення і особливо широко застосовувався для поділу серії гомологічних олігосахаридів. Однак поділу більш складних сумішей, наприклад олігосахаридів одного і того ж класу, необхідно градієнтне елюювання.
Хроматографія на колонках з вугіллям придатна не тільки для поділу олігосахаридів, вона також застосовувалася для поділу кислих вуглеводів, багатоатомних спиртів і їх ацетатів, олігосахаридів, що містять аміноцукри, і метилових ефірів цукрів. У кожному разі хроматографія на вугільних колонках, мабуть, перевершує всі інші методи, тому що дозволяє домогтися бажаного розділення, а проте, якщо потрібно розділити складну суміш, звичайно необхідно попереднє градієнтне елюювання. Новий метод поділу дисахаридів був опублікований в 1955 р.; він заснований на здатності деяких дисахаридів утворювати в м'яких умовах метілфуранозіди. Ці метілглюкозіди абсорбуються сильніше вільних цукрів.
Хроматографія на вугільній колонці зручна ще й тим, що вугільна колонка має високу ємність, а це дозволяє кількісно виділити компоненти і розділити великі кількості матеріалу. На ефективність розділення не впливає присутність неорганічних солей або ступінь розведення розчину цукру. У лабораторіях деяких дослідників для дезактивації вугілля застосовувалася концентрована соляна кислота. Елм, Вільямс і Тізеліус насичували вугілля стеаринової кислотою (1% кислоти в 96%-ном спирті). Попередня дезактивація або насичення збільшує повернення введених в колонку речовин майже до 100%, дозволяє елюіровать сильно адсорбуватися вищі олігосахариди і покращує дозвіл зон. Щоб виключити мала кількість розчиненого неорганічного речовини, що вноситься з наповнювачем, зазначені автори часто вважали зручним готувати колонки без цілить. Якщо виключити цілить проведення операцій значно спрощується в тому випадку, коли разом цілить застосовують вугілля двох ступенів подрібнення: суміш крупнозернистого вугілля і звичайного Дарко G-60.
МЕТОДИКА. (Описано застосування колонки, що містить тільки вугілля.). Рівні вагові частини вугілля Дарко G-60 і цілить № 535 змішують у сухому вигляді, до суміші додають воду і отриману рідку пасту поміщають в скляну хроматографічну колонку, закриту знизу скляній ватою. Через колонку повільно, по краплях пропускають концентровану соляну кислоту, щоб дезактивувати вугілля і відмити сліди заліза і золи. Після цього через колонку пропускають дистильовану воду до отримання нейтрального елюата. Для зменшення тривалості операцій на цій і всіх подальших стадіях можна застосовувати відсмоктування.
Цукру вводять в колонку у вигляді водного зазвичай 1-10%-ного розчину. Для ефективного поділу на кожен грам суміші цукрів беруть 150 мл суміші вугілля і цілить. Поділ цукрів можна проводити як ступінчастим, так і градієнтним елюювання. Наприклад, суміш, яка містить по 1 г d-глюкози, мальтози і рафінози, була розділена в колонці 3,4 X 17,0 см послідовним елюювання 800 мл води, 1500 мл 5%-ного спирту і 700 мл 15%-ного спирту.
Для того, щоб позбавитися від розчиненого неорганічного речовини, що неминуче супроводжує в целіте, зазвичай застосовують два методи. Так як неорганічне речовина стає відносно мало розчинним, після того як воно було висушене, досліджуваний зразок випарюють насухо, змішують з невеликою кількістю води і фільтрують. Таку операцію повторюють тричі, і цього зазвичай достатньо для видалення неорганічної речовини. Інший спосіб полягає в наступному: до водного розчину додають метиловий або етиловий спирт, суміш нагрівають до 60 ° і випав сиплеся осад видаляють фільтруванням.
2. Хроматографія на колонці з целюлозою / 5 /
Розподільна хроматографія була вперше застосована для поділу вуглеводів в 1949 р. З тих пір цей метод широко використовується в препаративної хімії вуглеводів. Область застосування цього методу в хімії вуглеводів настільки велика, що немає необхідності розглядати приватні приклади його використання.
МЕТОДИКА. В якості колонок можна використовувати звичайні хроматографічні трубки. Успіх будь-якого поділу на розподільній колонці з целюлозою залежить від чіткості меж зон і об'ємного поділу між зонами. Чіткість кордонів зростає, якщо діаметр колонки зменшується. Об'ємне поділ між зонами поліпшується при зростанні висоти колонки. Але в міру того як висота колонки зростає і зменшується її діаметр, зменшується і кількість матеріалу, який можна розділити на колонці, зростає капілярний опір і зменшується швидкість потоку рідини, орошающей колонку. Емпірично знайдено, що співвідношення висоти і діаметра колонки має дорівнювати 9:1. Кількість речовини, яке можна ввести в колонку, залежить від легкості поділу компонентів. Завантаження для кожного індивідуального компонента приблизно пропорційна величині його.
Наповнення колонки є найбільш важливою при проведенні хроматографії на целюлозі. На фарфоровий фільтрувальний диск, який служить дном звичайної хроматографічної колонки, спочатку розміщують або шматочки фільтрувального паперу, або скляне волокно. Після цього в колонку завантажують промитий водою і висушений стандартний порошок целюлози. Для заповнення колонки можна застосовувати сухий порошок целюлози, суспензію целюлози. Для приготування суспензії зазвичай використовують ацетон. Порошок целюлози змішують з ацетоном у гомогонізаторе Уорінг до тих пір, поки не вийде однорідна суспензія середньої консистенції. Отриману суспензію переносять у скляну трубку. Ацетон стікає через дно трубки, а суспензію повільно перемішують скляною паличкою якраз над лінією осідання для рівномірного заповнення трубки і щоб попередити утворення тріщин. Хроматографічна трубка весь час повинна бути майже доверху заповнена суспензією. Коли колонка заповнена на потрібну висоту, ацетону дають стекти, ретельно стежать за тим, щоб не оголювалася поверхню целюлози. Зверху на шар целюлози поміщають шматочок пористої фільтрувального паперу. Після цього колонку протягом декількох днів ретельно промивають розчинником, який буде застосовуватися для зрошення колонки при хроматографування. Колонка повинна бути завжди заповнена рідиною, так як, якщо вона стече або випарується, обсяг целюлози може зменшитись і біля стінок трубки можуть утворитися зазори. Коли розчинник проходить через колонку, частинки целюлози поглинають воду і розбухають, утворюючи щільний шар. Щільність заповнення визначається консистенцією застосовуваної суспензії. Якщо суспензія занадто рідка, набивка буде дуже щільною і можливе часткове фракціонування целюлози за розмірами частинок.
Якщо потрібно приготувати колонку для хроматографування з більшою швидкістю потоку, при заповненні її замість ацетону можна застосувати більш в'язкий розчинник н-бутанол. Для колонок з менш щільної набиванням деякі дослідники вважають за краще готувати суспензію на тому ж розчиннику, який буде застосовуватися для колонки при хроматографування.
При роботі з препаративних колонками, зокрема з колонками значної висоти, в тих випадках, коли бажано збільшити швидкість течії розчину, краще застосовувати надмірний тиск. Застосування вакууму в останньому випадку часто призводить до зменшення кількості розчинника в нижній частині стовпчика і подальшого порушення поділу в цій зоні.
Рівномірність заповнення колонки можна перевірити, пропускаючи через неї розчин барвника, наприклад метилротом, в розчиннику, який буде застосовуватися. Для цього розчинника дають стекти з верху колонки, після чого додають з медичної крапельниці приготований розчин барвника, рівномірно розподіляючи його по поверхні целюлози, а потім вимивають розчинником, повертаючи на місце резервуар з розчинником, як тільки пофарбована зона почне рухатися вниз вздовж колонки. Якщо барвник рухається вздовж колонки як горизонтальна пофарбована зона, колонка заповнена рівномірно і придатна до вживання. Якщо пофарбована зона рухається нерівно, колонка заповнена неправильно і її потрібно заповнити знову.
Найбільш зручні розчинники для колонки визначаються за допомогою хроматографії на папері. Більшість розчинників, що застосовуються в хроматографії на папері, можна використовувати для колонки при хроматографування на целюлозі. Однак мурашина кислота, якщо її застосовувати протягом тривалого часу для колонки з целюлозою, викликає деструкцію целюлози і колонка стає неприйнятною для подальшої роботи. Крім того, мурашину кислоту важко видалити з елюата, тому застосування її слід уникати.
Якщо використовуваний розчинник містить кислоту (наприклад, оцтову) або заснування (наприклад, піридин), їх слід видалити з ілюата, перш ніж почати упарювання останнього, щоб уникнути змін виділяються цукрів або їх похідних. З цією метою елюат зазвичай струшують ділильної воронки з рівним об'ємом води, а потім водний шар екстрагують ефіром протягом кількох годин у екстракторі. Ця методика не може бути застосована до таких похідних цукрів, як, наприклад, метилові ефіри, і в цих випадках для видалення кислот і підстав потрібні особливі методи.
Всі органічні розчинники, які застосовуються для колонок при хроматографування на целюлозі, перед вживанням слід перегнати, щоб уникнути появи масел і смол при подальшому концентруванні фракцій.
Колонку слід поміщати в кімнаті з постійною температурою - зазвичай 20-25 °, хоча іноді необхідна і більш висока температура, тому що при цьому зростає швидкість потоку і можна використовувати більш високі концентрації реагентів. Необхідно уникати коливань температури, так як зниження температури може призвести до виділення води з розчину і порушити розділення. Ця обставина особливо істотно при застосуванні в якості розчинника н-бутанолу, насиченого водою.
Зразок, вільний від неорганічних солеобразние речовин розчиняють у мінімальній кількості води (фіксуючи її обсяг). До розчину додають сухий порошок целюлози в такій кількості, щоб порошок був зволожений, і до отриманої суміші додають додаткову кількість органічних компонентів елюента. Отриману суспензію поміщають в колонку поверх шару целюлози. Після того як зразок трохи осяде, поверх нього обережно поміщають шар сухого порошку целюлози товщиною 2,5 см, накривають гуртком з пористої фільтрувального паперу і починають пропускати розчинник для колонки.
Відбір фракцій проводиться за допомогою різних автоматично колекторів; вони працюють за принципом вимірювання ваги, обсягу фракцій або часу елюювання.
Компоненти можна визначити за допомогою різних загальних кольорових реакцій. Гарделл застосовував побудову концентраційних кривих елюата і порівнював їх з аналогічними кривими, одержаними для стандартних розчинів цукру в тому ж самому розчиннику.
Найбільш простий якісної пробою, мабуть, є крапельна проба: на фільтрувальний папір поміщають краплю елюата і обробляють папір лужним розчином нітрату срібла.
У багатьох випадках бажано поміщати краплі випливає елюата на хроматографічну папір і проявляти її звичайним способом.
3. Тонкошарова хроматографія / 6 /
3.1. ЯКІСНА Тонкошарові ХРОМАТОГРАФІЯ САХАРОВ
Якісний аналіз сумішей методом ТШХ дозволяє визначити
а) число компонентів в аналізованому зразку
б) рухливість кожного компонента щодо фронту розчинника.
При якісній тонкошарової хроматографії необхідно враховувати наступні положення:
- При підвищенні температури поділ, як правило, погіршується. Вплив температури не настільки велике, як у паперовій хроматографії, але, якщо виявляє суміш містить легколетучие розчинники, склад її може змінитися.
- Оптимальна товщина шару сорбенту дорівнює приблизно 0,25 мм.
- Невеликий вміст води в сорбенті відіграє велику роль тільки при поділі похідних вуглеводів в неполярних розчинниках.
Тонкошарова хроматографія (ТШХ) у тому вигляді, в якому вона відома зараз вперше була описана Шталем 1958 р., а в 1961 р. з'явилося перше повідомлення про застосування ТШХ для поділу вуглеводів. Починаючи з цього часу ТШХ широко використовується для ідентифікації вуглеводів, у тому числі незаміщених моно-і олігосахаридів і різних похідних цукрів і складних ефірів, циклічних ацеталей та інших похідних. Тонкошарова хроматографія має ряд переваг перед паперовою хроматографією:
1. Аналіз займає настільки мало часу, що результат стає відомим вже через кілька хвилин, це робить ТШХ зручним методом під час стеження за ходом реакції.
2. ТШХ можна використовувати для розділення як вільних цукрів, так і їх похідних. 3.Метод характеризується високою роздільною здатністю, наприклад дозволяє розділити похідний аномеров з молекулярною вагою аж до 1500.
4. Для виявлення плям можна використовувати різні реагенти, так як застосовуються неорганічні сорбенти набагато міцніше паперу.
5. Для аналізу можна брати великі кількості речовин, що полегшує виявлення мінорних компонентів суміші.
МЕТОДИКА (загальні принципи)
Частіше за все для поділу вуглеводів використовують силікагель G, силікагель Н, окис алюмінію, кизельгур G і целюлозу. Слабокислий силікагель зазвичай застосовується при вивченні похідних цукрів. Якщо на силікагелі не вдається досягти хорошого дозволу основних або нейтральних цукрів та їх похідних, використовують окис алюмінію - більш активний, ніж силікагель, сорбент, який має основні властивості. Кизельгур і целюлозу, які є нейтральними носіями, доцільно застосовувати, для аналізу вільних цукрів.
Розмір використовуваних платівок залежить від мети аналізу. Якщо ТШХ використовується для контролю за ходом хімічної реакції, зручні предметні скла мікроскопа. Однак для якісного аналізу краще всього користуватися пластинками розмір ром 20X20X0, 3 см. Перед нанесенням шару платівки ретельно миють з пральним порошком, споліскують дистильованою водою; і протирають насухо тканиною без ворсу. Якщо пластинки вкриті жиром, необхідно попередньо обробити їх хромпиком або яким-небудь гарячим миючим засобом.
Відомо кілька способів нанесення шару: намазування, поливання, занурення і обприскування. Найбільш вживаних методи:
Обприскування. На три підставки (25x30 см) поміщають 120 предметних стекол. Суспензію 20 г силікагелю G в 50 мл дистильованої води ретельно струшують протягом 1 хв, виливають у круглодонну колбу ємністю 250 мл і за допомогою пульверизатора при повільному струмі повітря наносять шар на платівки. Платівки з нанесеним шаром сушать 10 хв на повітрі, потім досушують і активують, витримуючи 30 хв при 130 ° С. Готові до вживання пластинки зберігають на підставці в ексикаторі.
Намазування. Суспензію 30 г силікагелю Н в 80 мл дистильованої води наносять на п'ять (20x20X0, 3 см) чистих скляних пластинок шаром товщиною 0,25 мм; якщо розмір платівок менше, їх беруть відповідно більше. У деяких типах апаратів для нанесення шару (аплікатори) пластинки притискаються до нижньої поверхні напрямних рейок надутій камерою. Тому можна користуватися пластинками зі звичайного віконного скла подвійної товщини, тому що навіть на стеклах різної товщини шар буде однаковим. Платівки з нанесеним шаром витримують при кімнатній температурі 2 год, після чого активують 2 год при 130 ° С. Активність сорбенту визначається температурою і часом активації-при зниженні температури або зменшенні тривалості активації активність знижується. Краї платівки вирівнюють шпателем. У зв'язку з тим що вологе повітря кімнати знижує активність сорбенту, пластинки або зберігають в ексикаторі, або перед вживанням прогрівають 30 хв при 130 ° С і відразу ж охолоджують.
Спеціальні добавки до сорбентам (імпрегнування) поліпшують поділ сумішей вуглеводів. У ряді випадків доцільно замість дистильованої води застосовувати розчини ацетату натрію, борної кислоти або двузамещенного фосфату натрію.
Для нанесення зразка на платівку, як правило, використовують мікропіпетки, микрошприца або капіляри. На платівки більшого розміру накладають шаблон з прозорої пластмаси з прорізаними отворами і 1-3 плями 1%-ного розчину наносять з інтервалом в 1,5 см на відстані 1,5 см від нижнього краю і 3,0 см від бічних країв пластинки. Для гарного розділення необхідно, щоб діаметр плями був якомога менше (<3 мм), тому використовувані розчинники повинні бути легколетучим.
Суміші, що складаються з двох або трьох розчинників різної полярності, часто дають кращу картину поділу, ніж чисті розчинники. Вибір проявника залежить від полярності досліджуваних цукрів. Так, для незаміщених вуглеводів хорошим проявником є суміш н-бутанол - оцтова кислота - ефір - вода (9:6:3:1 за обсягом), а для похідних вуглеводів - суміші петролейного ефіру (30-60 ° С) і ацетону (у різних співвідношеннях). Щоб відтворюваність результатів була досить хорошою, рекомендується брати перегнані розчинники і свіжоприготовані системи проявителей.
Прояв. У хроматографічну камеру наливають відповідний проявник шаром товщиною 0,5-1,0 см. Через нього пропускають смугу фільтрувального паперу ватман № 1, яку прикріплюють до бічних стінок камери. Камеру герметично закривають кришкою з затискачами і залишають на 30 хв для насичення. Повне насичення камери парами проявника необхідно для отримання відтворюваних результатів. Якщо в системі встановлено легколетучие розчинник, камеру можна помістити в лазню з льодом. Коли фронт розчинника на платівці досягне висоти 10-15 см, кришку знімають і відзначають положення фронту і лише після цього виймають платівку. У деяких випадках, щоб поліпшити поділ компонентів, тривалість прояви збільшують або проводять дворазове або триразове прояв з висушуванням платівки між ними або дворазове прояв в перпендикулярних напрямках (двовимірна хроматографія). Тривалість прояви визначається характером розчинника: для прояву пластинки розміром 20x20 см неполярними розчинниками достатньо 20-30 хв, тоді як при прояві полярними розчинниками, що містять воду, необхідно 1-2 ч.
Після висушування платівки можна приступати до виявлення плям.
Методи виявлення, не викликають деструкції аналізованих речовин.
Якщо компоненти-суміші пофарбовані (що, як правило, не характерний для вуглеводів), їх легко виявити візуально. Деякі похідні цукрів виявляють по флуоресценції в ультрафіолетовому світлі. Якщо самі речовини не флуоресціюють, до сорбенту можна додати флуоресцентний індикатор, наприклад суміш силікату і сульфіду цинку, або скористатися комерційним сорбентом, вже містить індикатор - суміш марганцю та активованого силікату цинку. У цьому випадку цукру проявляються в УФ-світлі у вигляді темних плям на світному тлі. Йод, родамін В, бромтимоловий синій, 2 ', 7'-діхлорфлуоресцеін, вода - реагенти, що дозволяють виявити цукру, не руйнуючи їх.
Методи виявлення, викликають деструкцію аналізованих речовин.
Всі реагенти, використовувані для виявлення компонентів цукрів на паперових хроматограмма (крім реагентів, що вимагають промивання хроматограм), придатні і для тонкошарової хроматографії.
Крім того, в ТШХ можна використовувати і такі реагенти, як концентрована сірчана кислота. При прожарюванні платівки, оббризканою кислотою, цукру обвуглюються. Як правило, платівку слабо обприскують 5-50%-ним розчином сірчаної кислоти у воді або спирті і нагрівають 10 хв при 130 ° С. При подібній обробці колір сорбенту не змінюється.
Для виявлення вуглеводів використовуються також реагенти, що дають кольорові реакції з цукрами і їх похідними:
1) анісовий альдегід + сірчана кислота;
2) нафторезорцін + сірчана кислота
3) нафторезорцін + фосфорна кислота (кетози дають червоне забарвлення, альдози - синє);
4) азотнокисле срібло + підставу;
5) кислий анілінфталат;
6) про-амінодіфеніл + ортофосфорна кислота;
7) дифениламин + анілін + фосфорна кислота;
8) п-анізідінфталат або хлоргідрат н-анізідіна (гексози дають зелене забарвлення; пентози - фіолетово-червоне; 6-дезоксігексози - жовто-зелене; уроновие кислоти - коричневе);
9) сечовина + фосфорна або соляна кислота;
10) хлористий 2,3,5-тріфенілтетразолій;
11) біхромат калію + сірчана кислота;
12) азотнокисле залізо (III) + солянокислий гідроксиламін;
13) перманганат калію + їдкий натр;
14) карбазол + сірчана кислота;
15) дімедон + ортофосфорна кислота (кетози дають сіро-зелене забарвлення);
16) фенол + сірчана кислота;
17) тимол + сірчана кислота;
і багато інших.
3.2. КІЛЬКІСНИХ Тонкошарові ХРОМАТОГРАФІЯ
Тонкошарова хроматографія знаходить все більше застосування для кількісного визначення вуглеводів. Цей метод надзвичайно корисний при вивченні кінетики реакцій, дослідженні їх механізму та визначенні виходу продуктів, однак він застосовний лише для аналізу сумішей, компоненти яких можна повністю розділити. Способи кількісного визначення ділять на дві великі групи:
а) пряме визначення (встановлення кількості речовини безпосередньо на платівці);
б) непряме визначення (елюювання плям речовини з подальшим аналізом елюата фізичними методами).
Для прямого визначення використовуються денситометрія і радіометрія елюатов. Обидві групи методів вимагають побудови калібрувальних кривих, що пов'язують концентрацію компонента з інтенсивністю забарвлення, ступенем поглинання або рівнем радіоактивності з'єднання.
Якщо на кожному етапі аналізу дотримуються всі запобіжні заходи, точність описаних нижче методів складає 3-5%. Вимірювання інтенсивності забарвлення цукру або продуктів його розпаду безпосередньо на хроматограмі проводиться методом денситометрії. З огляду на те, що самі цукру не пофарбовані, їх обробляють реактивом, що викликає появу пофарбованого плями на тлі шару сорбенту. Колір останнього, як правило, не змінюється (білий). Якщо сорбент все-таки забарвлюється, необхідно, щоб фарбування було. Плями повинні мати чітко окреслені межі і не повинні вицвітати. Даллас, а також Шеллард і Алам докладно розглянули фактори, що впливають на точність і відтворюваність результатів аналізу
Щоб оцінити вміст цукрів у зразку, можна також сфотографувати хроматограму (або зробити фотокопію) і, розрізавши повчань знімок на смуги, просканувати їх на денситометрі.
Цукру, що несуть радіоактивну мітку, кількісно визначають безпосередньо на хроматограмі за допомогою лічильника радіоактивності або радіоавтографіческім методом шляхом денситометричного сканування рентгенівського знімка хроматограми.
Після вимивання цукру проводять або пряму оцінку його кількості, або попередньо обробляють його відповідним реактивом, а потім вимірюють поглинання в УФ-або видимому світлі. Труднощі виникають у тих випадках, коли з сорбенту елюіруются сторонні речовини, що заважають вимірюванню поглинання. Щоб виключити можливі помилки, необхідно тим же способом іследовать елюат зразка сорбенту, взятого на рівні плями.
Цукру, що несуть радіоактивну мітку, кількісно визначають у елюате за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника. Висока точність оцінки досягається навіть у тих випадку, коли сорбент (~ 0,1 г) потрапляє в ампулу лічильника (15 мл).
МЕТОДИКА
ПРЯМЕ денситометрических ВИЗНАЧЕННЯ САХАРОВ (на прикладі використання кукурудзяного патоки). Аналіз проводиться на скляних пластинках з шаром силікагелю товщиною 0,5 мм. Платівки використовуються відразу після отримання. Зразки кукурудзяної патоки з відомим вмістом твердого залишку розбавляють водою до концентрації ~ 1% (з цього залишку). За допомогою шприца на 25 мкл, забезпеченого дозатором, отриманий розчин наносять на пластинку смугами шириною 6 мм, що містять від 5 до 90 мкг твердої речовини. Щоб смуги були вузькими, їх підсушують струмом теплого повітря. (Якщо зразок розчиняють в будь-якому органічному розчиннику, розчин при підсушуванні може «повзти» по зовнішній стороні голки шприца, що призводить до втрати речовини при нанесенні). На кожній платівці поміщається 12 смуг: 6 - контрольного сиропу і 6 - аналізованого.
Платівку виявляють у відповідній системі розчинників при ~ 25 ° С; фронт розчинника повинен піднятися на 12 см від стартової лінії. Мальтоолігосахаріди аж до декасахаріда можна поділити в системі етилацетат-метанол-вода (37:40:23 за обсягом), однак цей проявник ефективний лише для платівок з силікагелем F-254.
Кілька змінивши склад проявника, його можна застосовувати і з іншими сорбентами.
Платівку висушують в струмі теплого повітря, обприскують 50%-ної сірчаної кислотою і прожарюють при 120 ° С для виявлення плям. Щоб отримані результати були відтворюваними, платівка має бути рівномірно обприскати дрібними крапельками розпилюється рідини.
Кількісну оцінку складу суміші проводять методом трансмісійної денситометрії на денситометрі, забезпеченому самописцем і інтегратором для визначення площі кожного піку.
Платівку сканують у горизонтальному напрямку так, що спочатку реєструються всі моносахариди, потім дисахариди і т. д. Для визначення площ піків можна також використовувати планіметр. Кількість кожного компонента визначають по відношенню до відповідного цукру в стандартному зразку шляхом порівняння площ піків. У даному випадку необхідність у використанні фільтра до лампи денситометра відсутня.
При використанні в якості проявника суміші (3:4:2 за об'ємом) етилацетат - метанол - вода, яка дозволяє отримати чіткий поділ вищих цукрів, розглянутий метод забезпечує високу точність результатів (табл.4).
Таблиця 4. Склад кукурудзяної патоки
певний методом паперової та тонкошарової хроматографії
| Сахариди,% | |||||||||
| моно | ді | три | тетра | пента | гекса | гепта | окта | нона + вищі | |
| Звичайна патока (43 екв. Глюкози) | |||||||||
| БХ | 20,5 | 15,4 | 11,3 | 9,8 | 7,7 | 6,0 | 4,7 | 3,9 | 21,5 |
| ТШХ | 20,1 | 14,6 | 11, | 8,6 | 7,2 | 5,4 | 4,9 | 3,4 | 23,9 |
| Станд. відхилення для ТШХ | 0,7 | 0,51 | 0,40 | 0,30 | 0,37 | 0,35 | 0,11 | 0,20 | 0,41 |
| Патока з низьким вмістом глюкози і високим вмістом мальтози (43 екв. Глюкози) | |||||||||
| БХ | 6,8 | 34,4 | 17,2 | 9,4 | 2,3 | 2,6 | 2,4 | 4,0 | 20,0 |
| ТШХ | 7,3 | 35,1 | 17,5 | 8,5 | 2,5 | 2,4 | 2,0 | 2,8 | 21,6 |
| Станд. відхилення для ТШХ | 1,25 | 4,36 | 3,10 | 0,66 | 0,70 | 1,10 | 0,77 | 0,65 | 1,33 |
| Патока з високим вмістом глюкози і мальтози (70 екв. Глюкози) | |||||||||
| БХ | 41,1 | 41,4 | 3,2 | 4,8 | 3,8 | 1,8 | 2,4 | - | 1,6 |
| ТШХ | 40,8 | 42,1 | 3,5 | 3,1 | 2,7 | 1,5 | 2,4 | - | 3,1 |
| Станд. відхилення для ТШХ | 1,25 | 1,62 | 1,28 | 0,65 | 0,26 | 0,37 | 0,78 | - | 0,32 |
4. Препаративна Тонкошарові ХРОМАТОГРАФІЯ
Препаративні поділ 0,05-1 г речовин методом ТШХ стає можливим при застосуванні товстого шару сорбенту (0,5-5 мм). Цей метод використовується для виділення індивідуальних цукрів у кількостях, достатніх для дослідження їх властивостей. У порівнянні з колоночной хроматографією препаративна ТШХ має низку переваг:
а) великою швидкістю поділу;
б) малою кількістю проявника;
в) легкістю підбору відповідного проявника шляхом пробних поділів на маленьких пластинках;
г) чіткістю зон і простотою їх виявлення;
д) легкістю елюювання сполук.
У препаративної ТШХ застосовуються ті ж сорбенти, що і в якісній ТШХ. Для виділення вуглеводів найчастіше використовують силікагель, целюлозу, кизельгур і глинозем. Як правило, оптимальна товщина шару складає 1-2 мм. Було показано, що додаток до сорбенту різних складних ефірів целюлози низького ступеня заміщення, а також додавання метанолу до суспензії сорбенту перед нанесенням його на платівку дозволяють уникнути появи тріщин. Однак якщо сорбент містить флуоресцентний індикатор, додавання метанолу призводить до нерівномірного фарбування тла. У тих випадках, коли в сорбенті присутні домішки, що заважають вимивання речовин, перед виготовленням суспензії необхідно промити сорбент хлороформом.
Зразок можна нанести на платівку декількома способами. Найчастіше поділювану суміш наносять у вигляді концентрованого розчину за допомогою мікропіпеток і капілярів з тонким кінцем або шприців. Кількість суміші залежить від розміру пластинки, товщини шару, типу сорбенту (наприклад, для мікрокристалічної целюлози 0,05 г / мм). Ширина смуги нанесеного зразка не повинна перевищувати 0,5 см. Якщо ж вона занадто велика, в ряді випадків доцільно сконцентрувати речовину на відстані 1 см від лінії старту шляхом короткочасного прояви платівки в розчиннику, в якому розчиняються всі компоненти суміші.
Систему розчинників для прояву вибирають на підставі попередніх даних по розділенню методом якісної ТШХ. Кількість повторних проявів залежить від рухливості компонентів суміші. Якщо хроматографування проводиться на силікагелі або окису алюмінію, зазвичай достатньо одноразового прояви, в той час як у випадку мікрокристалічної целюлози часто потрібно багаторазове прояв.
ТРАСУВАННЯ. Для встановлення положення зон на хроматограмі запропоновано ряд методів:
а) обприскування платівки реагентами, не руйнують цукрів, наприклад йодом, родаміном В, бромтимолового синім, 2 /, 7/-діхлорфлуоресцеіном або водою;
б) додаток до сорбенту флуоресцентних індикаторів і виявлення зон в ультрафіолетовому світлі;
в) обприскування частині шару, перенесеного з хроматограми на липку стрічку або пластинку, реагентами, що викликають деструкцію цукрів;
г) обприскування частині пластинки деструктивними реагентами, наприклад сірчаної кислотою (попередньо більшу частину хроматограми захищають).
Останній метод застосовується рідко, тому що, по-перше, при цьому втрачається значна кількість речовини, а по-друге, як правило, доводиться прожарювати платівку.
Після того, як становище зон встановлено, їх зіскоблюють з платівки шпателем або збирають «вакуум-очисником». Можна також елюіровать з'єднання з хроматограми на фільтрувальний папір. Далі до сорбенту додають розчинник і осад відокремлюють фільтруванням або центрифугуванням. Для екстракції речовини можна користуватися апаратом Сокслета. По можливості слід уникати вживання полярних розчинників, оскільки деякі сорбенти в них розчиняються.
Поділ цукрів методом препаративної ТШХ розглядається на прикладі розділення суміші аномерних метил-2 ,3,6-три-О-бензил-4-О-етил-a, bD-глюкопіранозідов.
МЕТОДИКА
ПРИГОТУВАННЯ ПЛАСТИНКИ. Суспензію 25 г силікагелю Н в 66 мл дистильованої води перемішують у склянці скляною паличкою протягом 5 хв (до отримання однорідної маси) і виливають на чисту пластинку розміром 20х20 см. Тримаючи платівку в руках, нахиляють її в різні боки так, щоб суспензія рівномірно розподілилася по всій поверхні. Платівку спочатку поміщають на горизонтальну підставку і витримують 2 год при 25 ° С, а потім переносять на підставку для зберігання, де вона сушиться приблизно 12 год на повітрі. Платівку активують 2 год при 130 ° С і повільно охолоджують до ~ 25 ° С. Після того як краю шару вирівняні шпателем, можна наносити зразок. Товщина шару сорбенту 2 мм.
НАНЕСЕННЯ ЗРАЗКА. У кінчик піпетки поміщають тонкий ватяний тампон таким чином, щоб частина його (3-5 мм) залишалася зовні. Розчин 0,3-0,5 г суміші аномерних метил-2 ,3,6-три-O-бензил-4-O-етил-D-глюкопіранозідов в 1-2 мл хлороформу засмоктують у піпетку і наносять у вигляді смуги на платівку на відстані 2 см від її нижнього краю і 3 см від бічних країв. Щоб смуга вийшла вузької (0,5 см), необхідно між нанесеннями дати хлороформу випаруватися.
При поділі сумішей розглянутого типу в центрі платівки, поки вона ще не висохла, чітко видно дві смуги, розташовані на відстані 1 см. Ці смуги, що відповідають a-і bD-глікозидів, видно також на сухій платівці у довгохвильовому УФ-світлі.
Виявлені зони збирають з платівки, використовуючи «вакуум-очищувач». Останній являє собою скляну трубку діаметром 25 мм; на одному кінці трубки є отвір діаметром 6 мм, через яке засмоктується сорбент. Інший кінець трубки приєднаний до вакуум-насоса. Для вловлювання сорбенту в трубку поміщають шматок скляної вати. До потрапив у трубку сорбенту додають хлороформ (20 мл), осад фільтрують і промивають 20 мл хлороформу. Фільтрат упарюють при зниженому тиску і залишок повторно розчиняють в хлороформі, щоб видалити всі сліди сорбенту. З нижньої зони виділяють у вигляді безбарвного сиропу метил-2 ,3,6-три-О-бензил-4-О-етил-aD-глюкопіранозід.
З верхньої зони виділяють метил-2 ,3,6-три-O-бензил-4-O-етил-bD-глюкопіранозід.
5. Розподільної хроматографії на Іонообмінна смола
Вперше поділ вуглеводів методом розподільної хроматографії на іонообмінних смолах в сумішах розчинників різної полярності було описано в 1952 р. В останні роки метод був значно вдосконалений. Як елюента при поділі цукрів та їх похідних найбільш придатний водний спирт, і далі мова буде йти тільки про це елюент.
Одним з основних факторів, що обумовлюють сорбцію цукрів точно так само, як і інших полярних неелектролітів у даному виді хроматографії, є неоднакове розподіл компонентів елюірующей суміші між смолою і зовнішнім розчином. У разі водного спирту відносна кількість води в нерухомій фазі вище, ніж в рухливій, і цим пояснюється той факт, що смолою переважно утримуються полярні речовини. На склад рухомої і нерухомої фаз істотно впливає також взаємодія смола - розчинник та смола - розчинена речовина. При
зміні протівоіона порядок елюювання деяких цукрів може змінитися.
Коефіцієнти розподілу речовин зростають зі збільшенням концентрації спирту і зменшуються з підвищенням температури. За рідкісним винятком, коефіцієнти розподілу зростають зі збільшенням числа гідроксильних груп у молекулі. Введення в молекулу неполярних груп, наприклад метильних, призводить до зменшення коефіцієнта розподілу. Величина останнього залежить також від положення заступників.
У табл.5 наведені коефіцієнти розподілу ряду вільних цукрів.
Розподільна хроматографія на іонообмінних смолах була з успіхом застосована для поділу моно-і олігосахаридів, альдітов і похідних цукрів, що не містять йоногенних угруповань, наприклад глікозидів і частково метильованих цукрів. Цей метод можна використовувати як в аналітичних, так і в препаративних цілях.
Таблиця 5. Коефіцієнти об'ємного розподілу (Dv) деяких моносахаридів і ангідросахаров при різних температурах та концентраціях спирту
На рис.4 наведена принципова схема приладу, що використовується для поділу цукрів. Елюент (спирт - вода) поміщають в колбу Маріотта і обезгажівают кип'ятінням, щоб запобігти появі бульбашок повітря в колонці. За колбою розташована відкрита градуйована трубка, зазвичай заповнена елюентом. Швидкість руху елюента в системі регулюють, перекриваючи вихідний отвір колби. Елюент подається в колонку поршневим насосом з нержавіючої сталі який поміщають нижче інших апаратів системи елюювання ..
Рис. 4 Апаратура для проведення хроматографічного розділення і автоматичного аналізу цукрів орціновим методом.
Тиск вимірюють манометром Бурдона, забезпеченим переривником. Останній відключає насос і нагрівач, якщо тиск в системі перевищує норму (80 атм) і також якщо воно падає через витік рідини. Аналіз можна проводити на колонках, що мають пористу дно і тефлонове ущільнення на верхньому кінці колонки. Якщо робота ведеться при високому тиску, не рекомендується користуватися колонками зі скляними фланцями. Замість них можна використовувати скляні трубки з приклеєними епоксидної смолою муфтами з полівінілхлориду.
Щоб у колонці підтримувалася необхідна температура (70-90 ° С), по сорочці колонки циркулює вода з термостата. Підвищення температури колонки призводить до звуження зон вимиваючих речовин і зниження робочого тиску.
Смоли, що застосовуються в розподільній хроматографії, представляють собою сильноосновними аніоніти або сильнокислому катіоніти, основу яких становить сополімер стиролу і дівінілбензол. В аналітичних колонках, діаметр яких дорівнює 2-6 мм, а швидкості елюювання високі (8-20 мл-см-2хв-1), рекомендується використовувати дрібнозернисті смоли з розміром частинок 8-13 або 10-15 мкм. Для препаратівнго поділу цукрів на широких колонках (діаметр 12-25 мм) і при меншій швидкості елюювання можна застосовувати більш грубі смоли.
Колонку промивають елюентом до тих пір, поки не утворюється однорідний шар іоніту. Після цього розчинник, що знаходиться над шаром смоли, відсмоктують, в колонку переносять нову порцію суспензії і операцію повторюють. Перед хроматографічним поділом заповнену колонку приводять у стан рівноваги з елюентом даного складу, промиваючи її елюентом не менше 16 год
Аналізується система. Визначення цукрів і їх різних похідних в елюате зручно проводити автоматично орціновим методом. Розчин реагентів зберігають у сулії з темного скла, звідки він і подається в систему за допомогою поршневого насоса. Між насосом і трійником, в якому відбувається змішання елюата з розчином барвника, розташований пристрій для гасіння (демпфірування) пульсацій тиску (рис. 4). Суміш елюата з розчином барвника пропускають через змійовик довжиною 20 м і діаметром 1,2 мм, занурений в термостатіруемую полігликолевою лазню (100 ° С). Час перебування суміші в змійовику близько 10 хв. Інтенсивність забарвлення розчину визначається спектрофотометрично при 420 нм проточних кюветах з l 2-15 мм. Зручно користуватися системою з двох послідовно з'єднаних кювет різної довжини: якщо на більш довгою кюветі самописець «зашкалює», вимірювання проводять на більш короткій кюветі. На колонці діаметром 4 мм вдається розділити і проаналізувати від 2 до 20 мкг речовин. На шпальтах меншого чи більшого діаметра можна проаналізувати відповідно менша або більша кількість суміші.
Перевагою вищеописаної схеми аналізу є висока точність кількісного визначення і відсутність необхідності в частому побудові калібрувальних кривих (при сталості умов аналізу). Якщо вдасться досягти повного розділення компонентів, відхилення від середнього значення в двох аналогічних аналізах становить 1енее 1%. Проте весь елюат витрачається за одне визначення, і тому не вдається провести додаткове дослідження фракцій.
Якщо проводиться препаративні поділ або якщо проведені дослідження вимагають повторного поділу і додаткових аналізів компонентів суміші, то для поділу потоку елюата та введення розчинів реагентів слід використовувати перистальтичний насос. Така схема аналізу (рис. 5) відрізняється більшою гнучкістю, проте недоліком її є більш низька точність кількісних визначень у зв'язку з тим, що сполучні трубки насоса швидко зношуються і їх доводиться міняти через 14 днів.
Рис. 5. Двоканальний аналізатор для одночасного визначення відновлюють цукрів і альдітов.
М-зміщувача; Р1 і Р2 - гасителі пульсації; L - флуоресцентна лампа трубки; А - орціонний канал: 16-ти% водний розчин орціона, 60% сірчана кислота; В - перйодатом-формальгідний канал: 0,015 Мметаперіодат натрію, що містить 5 мл конц . соляної кислоти на літр
На рис.5 наведена схема аналізу з застосуванням перистальтичного насоса. Елюат ділиться на три потоки і одночасно аналізується орціновим (А) і перйодатом-формальдегідні (В) методами. Третій потік подається на колектор фракцій або відкидається. У елюате додатково визначають зміст відновлюють цукрів перйодатного або ферріціанідним методом. Виділені ациклічні альдіти аналізуються автоматично перйодатом-формальдегідні методом. У кислому середовищі вони окислюються перйодатом з утворенням формальдегіду, який визначають до реакції з пентандіоном-2, 4 у розчині ацетату амонію. Надлишок перйодатом попередньо відновлюють арсенита. В умовах аналізу при окисленні більшості альдітов утворюється з високим виходом формальдегід, в той час як при окисленні більшої частини альдоз формальдегід утворюється лише в незначних, насилу детектіруемих кількостях. Виняток складає D-фруктоза, її можна досить точно визначити цим методом. Перйодатом-формальдегідегідний метод в сукупності з орціновим використовується для аналізу складних сумішей цукрів і альдітов. Точність його порівнянна з точністю орцінового методу.
6. ВИКОРИСТАННЯ хроматографії на папері ДЛЯ КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ САХАРОВ в рослинному матеріалі
Останнім часом хроматографію на папері все частіше починають використовувати в якості самостійного кількісного методу. При цьому вельми широке поширення набуває кількісна хроматографія вуглеводів: моно-, ді-і олігосахаридів, а також продуктів гідролізу крохмалю, целюлози та інших полімерів. Кількісне визначення індивідуальних речовин, поділюваних на хроматограмі, проводиться різними способами. Існує ряд методів, за допомогою яких можна визначити концентрацію розділених речовин безпосередньо на папері. Це методи: візуальне порівняння (напівкількісний), вимірювання площі плям, вимірювання інтенсивності забарвлення плям, визначення максимальної щільності забарвлення плям. У разі роботи з радіоактивними речовинами можна легко встановити активність цих сполук за допомогою лічильника Гейгера - Мюллера.
Однак більш широко застосовуваним і, мабуть, найбільш точним є елюювання окремих сполук з подальшим колоріметрірованіем або визначенням поглинання в ультрафіолетовій області. При роботі з радіоактивними речовинами можна робити вимірювання загальної або питомої активності елюіруемого речовини.
Точність методів кількісного хроматографічного аналізу дорівнює 10%.
7. Газорідинної хроматографії ТРІМЕТІЛСІЛІЛЬНИХ ПОХІДНИХ САХАРОВ
Газорідинна хроматографія (ГЖХ) тріметілсілілових ефірів (ТМС) похідних вуглеводів являє собою добре відпрацьований метод, який протягом ряду років використовується для аналізу складних сумішей цукрів, таких, як кукурудзяна патока або в загальному випадку гідролізати полісахаридів. З вдосконаленням методів сілілірованія створювалася нова хроматографічна апаратура і вишукувалися нові рідкі фази. Все це дозволило не тільки поліпшити поділ складних сумішей цукрів, але й розширити сферу застосування ГЖХ аж до поділу гептасахарідов. Бробст і Лотт розробили метод, що дозволяє проводити аналіз зразків, що містять невеликі кількості води, і, використовуючи його, змогли визначити олігосахаридних складу кукурудзяної патоки аж до тетрасахарідов. Пізніше як сілілірующего агента став використовуватися N-(тріметілсіліл) імідазол і суміш його з піридином, що стала комерційним реактивом. Показано, що даний реактив володіє хорошими розчинювальними властивостями і може використовуватися для сілілірованія вологих зразків цукрів.
Цей метод не тільки допускає наявність у зразку до 40 мг води, але й істотно збільшує стійкість тріметілсілілових ефірів, так як в суміші присутній великий надлишок реагенту. Тому стандартна калібрувальна суміш стійка протягом декількох місяців, що вельми важливо для зберігання контрольних зразків рідкісних олігосахаридів.
8. Газорідинної хроматографії метильованих САХАРОВ
Газорідинна хроматографія являє собою надійний і широко поширений метод якісного та кількісного аналізу цукрів. Поділ методом ГЖХ метилових ефірів цукрів та їх похідних набуло особливо велике значення при дослідженні структури оліго-і полісахаридів. Відновлюючі метиловані цукру не можна вивчати методом ГЖХ в першу чергу тому, що вони міцно сорбуються на нерухомій фазі або носіях, і їх, як правило, переводять у метілглікозіди. Останні або безпосередньо аналізують на газовому хроматографі, або, якщо час утримування метілглікозідов занадто велике, попередньо ацетилює або сіліліруют.
Іноді роздільна здатність колонки недостатня для поділу аномеров пиранозной і фуранозних форм деяких метильованих глікозидів або їх похідних. У такому випадку метиловані цукру аналізують у вигляді ацетатів або тріметілсілілових ефірів альдітов.
Як було встановлено, детектори дають різний відгук на різні метиловані цукру, що містяться в однакових концентраціях. Однак поки не відомо, чи є це наслідком особливостей, властивих детекторам, або наслідком втрат деяких компонентів при підготовці зразка до аналізу і переважної сорбції їх на колонці. Тверді правила вибору колонки ще не вироблені. Тим не менш вивчення літературних даних показує, що більшість дослідників вважають за краще полярні фази, які, мабуть, дають кращу дозвіл всіх типів похідних метильованих цукрів. Зазвичай час утримування з'єднання висловлюють по відношенню до часу утримування стандарту. Це дозволяє уникнути розбіжностей, що спостерігаються для абсолютних значень часу утримування та обумовлених нестандартністю умов аналізу. Результати визначення відносного часу утримування на одній і тій же колонці відтворюються з точністю до ± 2%, а на різних колонках з однаковими нерухомими фазами - з точністю до ± 5%.
Час утримування багатьох похідних вуглеводів досить велике, що призводить до поганого поділу сумішей, обумовлює низьку концентрацію елюіруемих компонентів у газі-носії, і в підсумку призводить до збільшення помилки при визначенні вмісту компонентів у сумішах. Тому при проведенні поділу метильованих цукрів бажано підбирати такі похідні і такі умови роботи, при яких всі компоненти суміші елюіровалісь б з колонки протягом 70-90 хв з моменту їх введення. Якщо детектування не супроводжується руйнуванням цукрів, їх можна збирати на виході з хроматографа.
Висновок
Хроматографічні методи при поділі і очищенню полісахаридів, так само як і в інших областях хімії природних сполук, грають винятково важливу роль. Однак внаслідок своєрідності полісахаридів далеко не всі різновиди хроматографії використовуються в рівній мірі. Наявність навіть в очищених полісахаридах набору полімерогомологов з близькою хроматографічної рухливістю і близькими сорбційними властивостями, їх колоїдний характер, а також схильності до асоціацій - все це обумовлює малу ефективність таких видів хроматографії, як паперова, розподільча та адсорбційна хроматографія.
Разом з тим іонообмінна хроматографія має виключно важливе значення при поділі і очищенню полісахаридів.
Широко застосовуються ДЕАЕ-целюлоза і ектеолацеллюлоза дозволяють легко відокремити нейтральні і кислі полісахариди: нейтральні зазвичай не затримуються або мало затримуються на названих аніонітах, кислі, в залежності від своєї природи, більш-менш міцно утримуються і елюіруются розчинами солей, буферними розчинами або лугами. На аніонітах поділяються різні кислі полісахариди в залежності від ступеня їх кислотності. Застосування ДЕАЕ-целюлози в боратного формі дозволяє розділяти і нейтральні полісахариди. Нещодавно були розділені нейтральні полісахариди (глікоген) за допомогою ДЕАЕ-целюлози на фракції, що відрізняються величиною частинок. / 3 /
Для розділення цукрів застосовуються такі методи:
1. Хроматографія на колонках з вугіллям застосовується для розділення вуглеводів на класи залежно від ступеня їх полімеризації (моносахариди, дисахариди, трісахаріди т. д.).
2. Хроматографія на колонці з целюлозою має широку область застосування, що немає необхідності розглядати приватні приклади його використання.
3. Якісна тонкошарова хроматографія застосовується для розділення вуглеводів, у тому числі незаміщених моно-і олігосахаридів і різних похідних цукрів і складних ефірів, циклічних ацеталей та ін
4. Кількісна тонкошарова хроматографія цукрів може застосовуватися у випадку сумішей, компоненти яких можна повністю розділити
5. Препаративна тонкошарова хроматографія цукрів використовується для розділення суміші аномерних цукрів (метил-2 ,3,6-три-О-бензил-4-О-етил-a, bD-глюкопіранозідов).
6. Газорідинна хроматографія використовується для поділу тріметілсілільних похідних цукрів, метильованих цукрів.
Зі своєї теоретичної роботи я можу зробити такі висновки:
- Для ідентифікації олігосахаридів найкращим методом вважається паперова хроматографія
- Для поділу цукрів найкращим методом вважається тонкошарова хроматографія.
Список використаних джерел:
1. Чмутов К.В. Хроматографія, її теорія і застосування. - М.: Видавництво Академії наук СРСР-1960.
2. Хомченко Г.П. Хімія для вступників до вузів: Учеб. посібник. 2-е вид.,-М.: В. ш., 1995р.
3. Степаненко Б.М. Хімія та біохімія вуглеводів (полісахариди): Учеб. посібник для вузів. - М.: Вищ. школа, 1978р.
4. Жуховіцкій А.А. Керівництво з газової хроматографії. - М.: Світ, 1969.
5. Кочетков Н.К. Методи хімії вуглеводів. - М.: Світ, 1967р.
6. Хорлін А. Я. Методи дослідження вуглеводів .- М.: Світ, 1975
5. Розподільної хроматографії на Іонообмінна смола
Вперше поділ вуглеводів методом розподільної хроматографії на іонообмінних смолах в сумішах розчинників різної полярності було описано в 1952 р. В останні роки метод був значно вдосконалений. Як елюента при поділі цукрів та їх похідних найбільш придатний водний спирт, і далі мова буде йти тільки про це елюент.
Одним з основних факторів, що обумовлюють сорбцію цукрів точно так само, як і інших полярних неелектролітів у даному виді хроматографії, є неоднакове розподіл компонентів елюірующей суміші між смолою і зовнішнім розчином. У разі водного спирту відносна кількість води в нерухомій фазі вище, ніж в рухливій, і цим пояснюється той факт, що смолою переважно утримуються полярні речовини. На склад рухомої і нерухомої фаз істотно впливає також взаємодія смола - розчинник та смола - розчинена речовина. При
зміні протівоіона порядок елюювання деяких цукрів може змінитися.
Коефіцієнти розподілу речовин зростають зі збільшенням концентрації спирту і зменшуються з підвищенням температури. За рідкісним винятком, коефіцієнти розподілу зростають зі збільшенням числа гідроксильних груп у молекулі. Введення в молекулу неполярних груп, наприклад метильних, призводить до зменшення коефіцієнта розподілу. Величина останнього залежить також від положення заступників.
У табл.5 наведені коефіцієнти розподілу ряду вільних цукрів.
Розподільна хроматографія на іонообмінних смолах була з успіхом застосована для поділу моно-і олігосахаридів, альдітов і похідних цукрів, що не містять йоногенних угруповань, наприклад глікозидів і частково метильованих цукрів. Цей метод можна використовувати як в аналітичних, так і в препаративних цілях.
Таблиця 5. Коефіцієнти об'ємного розподілу (Dv) деяких моносахаридів і ангідросахаров при різних температурах та концентраціях спирту
| Сахара | Пориста смола (SO42-) 75 ° С | Смола малої Ємності (SO42-) 75 ° С | Дауекс (SO42-) 90 ° С | Дауекс (Li +) 75 ° С | Амберліт IR-120 (Li +) | ||
| 75 ° С | 100 ° С | ||||||
| Концентрація етанолу,% | |||||||
| 88 | 86 | 90 | 86 | 92,4 | 92,4 | ||
| Ерітроза | 3,08 | 1,9 | |||||
| Треоза | 3,84 | 1,4 | |||||
| Рибоза | 6,55 | 4,06 | 5,80 | 4,98 | 4,0 | 3,1 | |
| Арабіноза | 10,1 | 6,26 | 9,79 | 7,56 | 3,8 | 3,0 | |
| Ксилоза | 12,5 | 7,38 | 12,1 | 9,19 | 2,7 | 3,0 | 2,4 |
| Фруктоза | 13,5 | 8,04 | 13,8 | 10,3 | 5,6 | 4,3 | |
| Сорбоза | 8,93 | 15,6 | 11,0 | 4,6 | 3,7 | ||
| Маноза | 16,4 | 9,37 | 16,9 | 11,8 | 5,3 | 4,4 | |
| Галактоза | 23,4 | 13,0 | 24,4 | 16,1 | 7 Травень | 6,8 | 5,3 |
| Глюкоза | 28,1 | 14,9 | 29,5 | 19,5 | 4 серпня | 5,4 | 4,4 |
| Альтроза | 16,6 | 2 квітня | |||||
| Рамноза | 4,75 | 2,80 | 4,11 | 3,54 | 1.4 | 1,2 | |
| Фукоза | 3,25 | 4,96 | 4,19 | 2,4 | 1,8 | ||
Рис. 4 Апаратура для проведення хроматографічного розділення і автоматичного аналізу цукрів орціновим методом.
Тиск вимірюють манометром Бурдона, забезпеченим переривником. Останній відключає насос і нагрівач, якщо тиск в системі перевищує норму (80 атм) і також якщо воно падає через витік рідини. Аналіз можна проводити на колонках, що мають пористу дно і тефлонове ущільнення на верхньому кінці колонки. Якщо робота ведеться при високому тиску, не рекомендується користуватися колонками зі скляними фланцями. Замість них можна використовувати скляні трубки з приклеєними епоксидної смолою муфтами з полівінілхлориду.
Щоб у колонці підтримувалася необхідна температура (70-90 ° С), по сорочці колонки циркулює вода з термостата. Підвищення температури колонки призводить до звуження зон вимиваючих речовин і зниження робочого тиску.
Смоли, що застосовуються в розподільній хроматографії, представляють собою сильноосновними аніоніти або сильнокислому катіоніти, основу яких становить сополімер стиролу і дівінілбензол. В аналітичних колонках, діаметр яких дорівнює 2-6 мм, а швидкості елюювання високі (8-20 мл-см-2хв-1), рекомендується використовувати дрібнозернисті смоли з розміром частинок 8-13 або 10-15 мкм. Для препаратівнго поділу цукрів на широких колонках (діаметр 12-25 мм) і при меншій швидкості елюювання можна застосовувати більш грубі смоли.
Колонку промивають елюентом до тих пір, поки не утворюється однорідний шар іоніту. Після цього розчинник, що знаходиться над шаром смоли, відсмоктують, в колонку переносять нову порцію суспензії і операцію повторюють. Перед хроматографічним поділом заповнену колонку приводять у стан рівноваги з елюентом даного складу, промиваючи її елюентом не менше 16 год
Аналізується система. Визначення цукрів і їх різних похідних в елюате зручно проводити автоматично орціновим методом. Розчин реагентів зберігають у сулії з темного скла, звідки він і подається в систему за допомогою поршневого насоса. Між насосом і трійником, в якому відбувається змішання елюата з розчином барвника, розташований пристрій для гасіння (демпфірування) пульсацій тиску (рис. 4). Суміш елюата з розчином барвника пропускають через змійовик довжиною 20 м і діаметром 1,2 мм, занурений в термостатіруемую полігликолевою лазню (100 ° С). Час перебування суміші в змійовику близько 10 хв. Інтенсивність забарвлення розчину визначається спектрофотометрично при 420 нм проточних кюветах з l 2-15 мм. Зручно користуватися системою з двох послідовно з'єднаних кювет різної довжини: якщо на більш довгою кюветі самописець «зашкалює», вимірювання проводять на більш короткій кюветі. На колонці діаметром 4 мм вдається розділити і проаналізувати від 2 до 20 мкг речовин. На шпальтах меншого чи більшого діаметра можна проаналізувати відповідно менша або більша кількість суміші.
Перевагою вищеописаної схеми аналізу є висока точність кількісного визначення і відсутність необхідності в частому побудові калібрувальних кривих (при сталості умов аналізу). Якщо вдасться досягти повного розділення компонентів, відхилення від середнього значення в двох аналогічних аналізах становить 1енее 1%. Проте весь елюат витрачається за одне визначення, і тому не вдається провести додаткове дослідження фракцій.
Якщо проводиться препаративні поділ або якщо проведені дослідження вимагають повторного поділу і додаткових аналізів компонентів суміші, то для поділу потоку елюата та введення розчинів реагентів слід використовувати перистальтичний насос. Така схема аналізу (рис. 5) відрізняється більшою гнучкістю, проте недоліком її є більш низька точність кількісних визначень у зв'язку з тим, що сполучні трубки насоса швидко зношуються і їх доводиться міняти через 14 днів.
Рис. 5. Двоканальний аналізатор для одночасного визначення відновлюють цукрів і альдітов.
М-зміщувача; Р1 і Р2 - гасителі пульсації; L - флуоресцентна лампа трубки; А - орціонний канал: 16-ти% водний розчин орціона, 60% сірчана кислота; В - перйодатом-формальгідний канал: 0,015 Мметаперіодат натрію, що містить 5 мл конц . соляної кислоти на літр
На рис.5 наведена схема аналізу з застосуванням перистальтичного насоса. Елюат ділиться на три потоки і одночасно аналізується орціновим (А) і перйодатом-формальдегідні (В) методами. Третій потік подається на колектор фракцій або відкидається. У елюате додатково визначають зміст відновлюють цукрів перйодатного або ферріціанідним методом. Виділені ациклічні альдіти аналізуються автоматично перйодатом-формальдегідні методом. У кислому середовищі вони окислюються перйодатом з утворенням формальдегіду, який визначають до реакції з пентандіоном-2, 4 у розчині ацетату амонію. Надлишок перйодатом попередньо відновлюють арсенита. В умовах аналізу при окисленні більшості альдітов утворюється з високим виходом формальдегід, в той час як при окисленні більшої частини альдоз формальдегід утворюється лише в незначних, насилу детектіруемих кількостях. Виняток складає D-фруктоза, її можна досить точно визначити цим методом. Перйодатом-формальдегідегідний метод в сукупності з орціновим використовується для аналізу складних сумішей цукрів і альдітов. Точність його порівнянна з точністю орцінового методу.
6. ВИКОРИСТАННЯ хроматографії на папері ДЛЯ КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ САХАРОВ в рослинному матеріалі
Останнім часом хроматографію на папері все частіше починають використовувати в якості самостійного кількісного методу. При цьому вельми широке поширення набуває кількісна хроматографія вуглеводів: моно-, ді-і олігосахаридів, а також продуктів гідролізу крохмалю, целюлози та інших полімерів. Кількісне визначення індивідуальних речовин, поділюваних на хроматограмі, проводиться різними способами. Існує ряд методів, за допомогою яких можна визначити концентрацію розділених речовин безпосередньо на папері. Це методи: візуальне порівняння (напівкількісний), вимірювання площі плям, вимірювання інтенсивності забарвлення плям, визначення максимальної щільності забарвлення плям. У разі роботи з радіоактивними речовинами можна легко встановити активність цих сполук за допомогою лічильника Гейгера - Мюллера.
Однак більш широко застосовуваним і, мабуть, найбільш точним є елюювання окремих сполук з подальшим колоріметрірованіем або визначенням поглинання в ультрафіолетовій області. При роботі з радіоактивними речовинами можна робити вимірювання загальної або питомої активності елюіруемого речовини.
Точність методів кількісного хроматографічного аналізу дорівнює 10%.
7. Газорідинної хроматографії ТРІМЕТІЛСІЛІЛЬНИХ ПОХІДНИХ САХАРОВ
Газорідинна хроматографія (ГЖХ) тріметілсілілових ефірів (ТМС) похідних вуглеводів являє собою добре відпрацьований метод, який протягом ряду років використовується для аналізу складних сумішей цукрів, таких, як кукурудзяна патока або в загальному випадку гідролізати полісахаридів. З вдосконаленням методів сілілірованія створювалася нова хроматографічна апаратура і вишукувалися нові рідкі фази. Все це дозволило не тільки поліпшити поділ складних сумішей цукрів, але й розширити сферу застосування ГЖХ аж до поділу гептасахарідов. Бробст і Лотт розробили метод, що дозволяє проводити аналіз зразків, що містять невеликі кількості води, і, використовуючи його, змогли визначити олігосахаридних складу кукурудзяної патоки аж до тетрасахарідов. Пізніше як сілілірующего агента став використовуватися N-(тріметілсіліл) імідазол і суміш його з піридином, що стала комерційним реактивом. Показано, що даний реактив володіє хорошими розчинювальними властивостями і може використовуватися для сілілірованія вологих зразків цукрів.
Цей метод не тільки допускає наявність у зразку до 40 мг води, але й істотно збільшує стійкість тріметілсілілових ефірів, так як в суміші присутній великий надлишок реагенту. Тому стандартна калібрувальна суміш стійка протягом декількох місяців, що вельми важливо для зберігання контрольних зразків рідкісних олігосахаридів.
8. Газорідинної хроматографії метильованих САХАРОВ
Газорідинна хроматографія являє собою надійний і широко поширений метод якісного та кількісного аналізу цукрів. Поділ методом ГЖХ метилових ефірів цукрів та їх похідних набуло особливо велике значення при дослідженні структури оліго-і полісахаридів. Відновлюючі метиловані цукру не можна вивчати методом ГЖХ в першу чергу тому, що вони міцно сорбуються на нерухомій фазі або носіях, і їх, як правило, переводять у метілглікозіди. Останні або безпосередньо аналізують на газовому хроматографі, або, якщо час утримування метілглікозідов занадто велике, попередньо ацетилює або сіліліруют.
Іноді роздільна здатність колонки недостатня для поділу аномеров пиранозной і фуранозних форм деяких метильованих глікозидів або їх похідних. У такому випадку метиловані цукру аналізують у вигляді ацетатів або тріметілсілілових ефірів альдітов.
Як було встановлено, детектори дають різний відгук на різні метиловані цукру, що містяться в однакових концентраціях. Однак поки не відомо, чи є це наслідком особливостей, властивих детекторам, або наслідком втрат деяких компонентів при підготовці зразка до аналізу і переважної сорбції їх на колонці. Тверді правила вибору колонки ще не вироблені. Тим не менш вивчення літературних даних показує, що більшість дослідників вважають за краще полярні фази, які, мабуть, дають кращу дозвіл всіх типів похідних метильованих цукрів. Зазвичай час утримування з'єднання висловлюють по відношенню до часу утримування стандарту. Це дозволяє уникнути розбіжностей, що спостерігаються для абсолютних значень часу утримування та обумовлених нестандартністю умов аналізу. Результати визначення відносного часу утримування на одній і тій же колонці відтворюються з точністю до ± 2%, а на різних колонках з однаковими нерухомими фазами - з точністю до ± 5%.
Час утримування багатьох похідних вуглеводів досить велике, що призводить до поганого поділу сумішей, обумовлює низьку концентрацію елюіруемих компонентів у газі-носії, і в підсумку призводить до збільшення помилки при визначенні вмісту компонентів у сумішах. Тому при проведенні поділу метильованих цукрів бажано підбирати такі похідні і такі умови роботи, при яких всі компоненти суміші елюіровалісь б з колонки протягом 70-90 хв з моменту їх введення. Якщо детектування не супроводжується руйнуванням цукрів, їх можна збирати на виході з хроматографа.
Висновок
Хроматографічні методи при поділі і очищенню полісахаридів, так само як і в інших областях хімії природних сполук, грають винятково важливу роль. Однак внаслідок своєрідності полісахаридів далеко не всі різновиди хроматографії використовуються в рівній мірі. Наявність навіть в очищених полісахаридах набору полімерогомологов з близькою хроматографічної рухливістю і близькими сорбційними властивостями, їх колоїдний характер, а також схильності до асоціацій - все це обумовлює малу ефективність таких видів хроматографії, як паперова, розподільча та адсорбційна хроматографія.
Разом з тим іонообмінна хроматографія має виключно важливе значення при поділі і очищенню полісахаридів.
Широко застосовуються ДЕАЕ-целюлоза і ектеолацеллюлоза дозволяють легко відокремити нейтральні і кислі полісахариди: нейтральні зазвичай не затримуються або мало затримуються на названих аніонітах, кислі, в залежності від своєї природи, більш-менш міцно утримуються і елюіруются розчинами солей, буферними розчинами або лугами. На аніонітах поділяються різні кислі полісахариди в залежності від ступеня їх кислотності. Застосування ДЕАЕ-целюлози в боратного формі дозволяє розділяти і нейтральні полісахариди. Нещодавно були розділені нейтральні полісахариди (глікоген) за допомогою ДЕАЕ-целюлози на фракції, що відрізняються величиною частинок. / 3 /
Для розділення цукрів застосовуються такі методи:
1. Хроматографія на колонках з вугіллям застосовується для розділення вуглеводів на класи залежно від ступеня їх полімеризації (моносахариди, дисахариди, трісахаріди т. д.).
2. Хроматографія на колонці з целюлозою має широку область застосування, що немає необхідності розглядати приватні приклади його використання.
3. Якісна тонкошарова хроматографія застосовується для розділення вуглеводів, у тому числі незаміщених моно-і олігосахаридів і різних похідних цукрів і складних ефірів, циклічних ацеталей та ін
4. Кількісна тонкошарова хроматографія цукрів може застосовуватися у випадку сумішей, компоненти яких можна повністю розділити
5. Препаративна тонкошарова хроматографія цукрів використовується для розділення суміші аномерних цукрів (метил-2 ,3,6-три-О-бензил-4-О-етил-a, bD-глюкопіранозідов).
6. Газорідинна хроматографія використовується для поділу тріметілсілільних похідних цукрів, метильованих цукрів.
Зі своєї теоретичної роботи я можу зробити такі висновки:
- Для ідентифікації олігосахаридів найкращим методом вважається паперова хроматографія
- Для поділу цукрів найкращим методом вважається тонкошарова хроматографія.
Список використаних джерел:
1. Чмутов К.В. Хроматографія, її теорія і застосування. - М.: Видавництво Академії наук СРСР-1960.
2. Хомченко Г.П. Хімія для вступників до вузів: Учеб. посібник. 2-е вид.,-М.: В. ш., 1995р.
3. Степаненко Б.М. Хімія та біохімія вуглеводів (полісахариди): Учеб. посібник для вузів. - М.: Вищ. школа, 1978р.
4. Жуховіцкій А.А. Керівництво з газової хроматографії. - М.: Світ, 1969.
5. Кочетков Н.К. Методи хімії вуглеводів. - М.: Світ, 1967р.
6. Хорлін А. Я. Методи дослідження вуглеводів .- М.: Світ, 1975