Діагностика Chlamydia trachomatis методом полімеразної ланцюгової реакції Дорожнеча, тривалість і трудомісткість мікробіологічного виділення хламідій в культурі істотно ускладнює використання цієї процедури в рутинній лабораторній діагностиці. У літературі накопичений великий клініко-лабораторний досвід з використання методу ПЛР для виявлення хламідій трахоматіс. Особливу увагу при його використанні слід приділяти, без сумніву, питань правильної інтерпретації одержуваних результатів. Екстремально високі показники чутливості і специфічності ПЛР роблять цю методику в чому революційної в лабораторній діагностиці. Основними мішенями при виявленні хламідій трахоматіс є нуклеотидна послідовність видоспецифической кріптіческой плазміди, послідовність головного білка внутрішньої мембрани, рибосомальні гени. Дана реакція являє собою багаторазово повторювані цикли синтезу (ампліфікацію) специфічної області ДНК-мішені в присутності термостабільної ДНК-полімерази, дезоксинуклеотидтрифосфатов, відповідного сольового буфера і олігонуклеотидних запалів-праймерів, що визначають межі ампліфікується ділянки. Кожен цикл складається з трьох стадій з різними температурними режимами. На першій стадії при 94 ° С відбувається розділення кіл ДНК, потім при 56-58 ° С - приєднання (відпал) праймерів до комплементарним послідовностей на ДНК-мішені, і при температурі 72 ° С перебігає синтез нових ланцюгів ДНК шляхом добудови ланцюгів праймерів у напрямку 5 '-3'. У кожному циклі відбувається подвоєння числа копій ампліфікується ділянки, що дозволяє за 25-40 циклів напрацювати фрагмент ДНК, обмежений парою вибраних праймерів, в кількості, достатній для її детекції за допомогою електрофорезу або альтернативними йому технологіями У порівнянні з широко застосовуються імунологічними тестами ПЛР-діагностика має низку переваг: -Високої і регульованої специфічністю, зумовленою лише нуклеотидної послідовністю, яка застосовується в даній діагностичній системі; -Високою чутливістю, що дозволяє діагносціровать не тільки гострі, а й латентні інфекції (можливе виявлення навіть поодиноких бактерій або вірусів); -Хімічне подібність всіх нуклеїнових кислот дозволяє розробляти універсальні процедури для виявлення різних інфекційних агентів, -Можливістю ідентифікації збудника протягом 4,5-5 годин.
Доставка біоматеріалу в ПЛР-лабораторію проводиться в холодовому термоконтейнері або термосі з льодом. Важливою відмітною особливістю ПЛР-діагностики є відносно низька вартість обладнання для проведення аналізу, що поєднується з універсальністю методу, що дозволяє виявляти весь спектр клінічно актуальних інфекційних агентів.
ПЛР-лабораторія повинна бути розділена на зони (кімнати). Слід мати не менше двох кімнат -Пре-ПЛР-приміщення, де проводиться обробка клінічних зразків, виділення ДНК, приготування реакційної суміші для ПЛР та постановка ПЛР (за наявності умов два останні етапи рекомендується також проводити в додатковому окремому приміщенні), у цих приміщеннях забороняється проводити всі інші види робіт з інфекційними агентами (мікробіологічний аналіз, ІФА, інші діагностичні тести), ПЛР-діагностика яких проводиться в даній лабораторії. -Пост-ПЛР-приміщення, де проводиться детекція продуктів ампліфікації, в ПЛР-приміщенні допускається використовувати інші методи детекції інфекцій, діагностика яких проводиться в даній лабораторії. Кімнату детекції продуктів ампліфікації (пост-ПЛР-приміщення) слід розташовувати якомога далі від пре-ПЛР-приміщень. Слід виключити рух повітряного потоку з пост-ПЛР-приміщення в пре-ПЛР-приміщення. У кімнаті приготування реакційної суміші і в кімнаті обробки клінічних зразків повинні бути встановлені ультрафіолетові лампи, робочі поверхні в лабораторії повинні оброблятися дезінфікуючими розчинами. Показання для діагностики С. trachomatis методом ПЛР 1. Гостра фаза захворювання 2. Хронічна фаза захворювання 3. Встановлення етіології хронічного інфекційного процесу урогенітального тракту. 4. Вагітність з обтяженим акушерським анамнезом. 5 Безпліддя неясного генезу. 6. Контроль ефективності проведеного антибактеріального лікування. У разі виявлення фрагмента ДНК хламідії трахоматіс після курсу хіміотерапії слід провести культуральну діагностику для виключення "хибнопозитивного з клінічної точки зору результату". Якщо проведення культуральної діагностики неможливо, то необхідно через 5-6 тижнів (повне оновлення епітеліального покриву сечостатевих шляхів) провести повторне дослідження методом ПЛР. 7. Виявлення хламідії у ВІЛ-інфікованих осіб, хворих на туберкульоз, вірусний гепатит і з вторинними імунодефіцитними станами (онкологічні хворі після курсів хіміо-і променевої терапії, трансплантації кісткового мозку, які отримують імуносупресивну терапію). У 1991 році компанія Хоффман-ла Рош ЛТД отримала від компанії Cetus права і патенти на використання ПЛР. У цьому ж році була створена Roche Molecular Systems, що займається виключно питаннями розвитку та вдосконалення ПЛР. У 1992 році були впроваджені перші стандартизовані тест-системи для клінічної ПЛР-діагностики AMPLICOR Chlamydia trachomatis, а в 1993 році розпочато виробництво цих тест систем. Численні проведені дослідження показали високу чутливість і специфічність даного набору. Це дозволило отримати даної тест-системі сертифікат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 році. У 1995 році з'явився новий набір AMPLICOR Chlamydia trachomatis / Neisseria gonorrhoeae для одночасної їх детекції в одній пробірці. У тесті використані біотінілірованние праймери (СР24/СР27) з кріптіческой плазміди С. trachomatis. Чутливість тесту складає 10 копій / мл, специфічність 99,6%. Тест-система включає: набір для збору та транспортування зразків, набір для виділення ДНК з цервікальних, уретральних зразків і сечі, набір для ампліфікації та детекції. Всі набори стандартизовані, повністю готові до використання, мають внутрішній контроль, систему захисту від контамінації. Науково-виробничою фірмою "Літех" при НДІ фізико-хімічної медицини МОЗ РФ випускається набір реагентів "Полімік" у вигляді трьох окремих наборів для визначення відповідно Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Кожен набір "Полімік" комплектується окремим набором для виділення ДНК з біопроб. Інструкція по застосуванню набору реагентів рекомендована до затвердження експертною комісією Комітету з нової медичної техніки МОЗ РФ (протокол No 3 від 18.03.96 р.) і затверджена Міністерством охорони здоров'я РФ 17.05.96 р. (ТУ 9398-405-17253567-96). До складу реакційної суміші набору "Полімік" входить внутрішній контроль (рекомбінантна плазміда, що містить фрагмент-вставку розміром 308 н.п.). Цей компонент дозволяє контролювати процес проходження реакції ампліфікації, а також тестувати наявність у пробах речовин, що пригнічують ПЛР. Смуга, відповідна внутрішнього контролю, повинна проявлятися як у позитивному і в негативному контролях, так і у всіх тестованих пробах. При виділенні ДНК із біопроби ("Набір для виділення ДНК") використовується метод екстракції ДНК з клітин хламідій за допомогою гуанідину тіоціанат і зв'язування вивільняються нуклеїнових кислот з частинками крупнопористого скла. Це дозволяє оптимізувати умови виділення і підготовки проб для ампліфікації, а також зменшити кількість маніпуляцій із зразком. При цьому всі маніпуляції проводяться в одній пробірці. Вихід хромосомної ДНК становить 70-80% за результатами визначення числа колонієутворюючих одиниць клітин Acholeplasma laidlawii (штам мікоплазм, взятий в якості стандарту) як у випадку чистої культури, так і при додаванні цих клітин до клінічного матеріалу, який не містить визначених інфекційних агентів. Після завершення ПЛР продукти ампліфікації фракционируют методом електрофорезу в 1,5% агарозному гелі. Аналіз результатів діагностики 1. У позитивному контрольному зразку для хламідій виявляється смуга розміром 501 н.п. 2. У негативному контрольному зразку смуга, відповідна фрагментами геному хламідій, має бути відсутня. Поява смуги в негативному контролі свідчить про контамінації компонентів набору. 3. В аналізованій пробі відсутність смуги строго на рівні відповідного контролю свідчить про відсутність збудника в пробі, наявність смуги, відповідної за електрофоретичною рухливості позитивного контролю, свідчить про наявність хламідій в клінічній пробі. 4. У всіх зразках виявляється смуга оранжево-червоного кольору, відповідна внутрішнього контролю розміром 308 н.п. Отримані результати можна документувати фотографуванням гелів з використанням оранжевого або інтерференційного (594 нм) світлофільтра. При використанні відеосистеми "Gel-doc" можливо документування результатів електрофорезу у вигляді комп'ютерного файлу, доступного будь-якій програмі "Windows". Набір "Полімік" слід зберігати при температурі - 18-20 ° С протягом усього терміну придатності (6 місяців). Допускається, зберігання і транспортування набору при температурі не вище 0 ° градусів не більше однієї доби. За станом на третій квартал 1999 р. Міністерством охорони здоров'я Росії крім набору "Полімік" дозволені наступні діагностичні набори для виявлення хламідій трахоматіс методом ПЛР в якості виробів медичного призначення: набір реагентів ампліфікаціонний для визначення ДНК хламідій (Хламідія-Амплі-тест) ТУ 9398-402-18137053-96 виробництва АТ "ВНЦМДЛ", Москва; набір реактивів для виявлення нуклеотидних послідовностей хламідія трахоматіс методом ПЛР (Хлам Ам) ТУ "9398-403-29032954-96 виробництва ЗАТ" Впровадження систем у медицину ". Москва, набір реагентів для виявлення ДНК хламідій трахоматіс методом ПЛР (Хлам-Ген) ТУ 9398-412-46482062-97 виробництва НПФ "ДНК-технологія", Москва. | 