За сучасними уявленнями фотосинтетичний кисень виділяється з води. Є ряд сполук, аналогів H2O, взаємодіючих з водоокислюючий комплексом. Серед них особливий інтерес представляє пероксид водню в зв'язку з його можливою участю у фотосинтетичних виділення O2. Існують припущення про H2O2 як проміжний продукт окислення H2O і навіть як про вихідний субстраті-донорі електронів. У деяких ціанобактерій і водоростей виділення O2 припиняється в анаеробних умовах. Дослідження ролі H2O2в фотосинтетичної виділення O2 представляються перспективними.
According to current views, the photosynthetic oxygen is evolved from the water. There is a number of compounds, of the H2O analogues, interacting with the water-oxidizing complex. Among these compounds, of particular interest is hydrogen peroxide as a possible participant in photosynthetic O2 evolution. There are the assumptions of H2O2 as an intermediate in H2O oxidation and, moreover, as the starting electron donor substrate. In several cyanobacteria and algae, O2 evolution in the light is ceased under the anaerobic conditions. The elucidation of the H2O2 role looks promising for the studies on photosynthetic O2 evolution.
Фундаментальна проблема біохімії - механізм фотосинтетичного виділення кисню. Проблема не нова, виникла з часів Джозефа Прістлі, який відкрив в 1771 р. фотосинтетичний кисень. Важливість її рішення важко переоцінити: космічна роль зеленого листа за К. А. Тімірязєва полягає у фотосинтезі органічних речовин і молекулярного кисню - субстратів, що забезпечують життєдіяльність хемотрофних організмів. Проблема фотосинтетичного кисню має комплексний характер, дослідження ведуться в багатьох лабораторіях світу. В останні роки у вирішенні проблеми намітився певний прогрес. Поряд з фундаментальністю, проблема має і прикладну перспективу, зокрема, її рішення дозволило б використовувати принципи фотосинтетичного механізму для отримання з води молекулярного водню як енергоносія.
За сучасними уявленнями фотосинтетичний кисень виділяється з води [1]. Фотосистема (ФС) II хлоропластів та ціанобактерій функціонує як H2O: пластохинон-оксидоредуктаз [2]:
H2O → (Mn) 4 → YZ → P680 → Фео → QA → QB QP → QZ (b6f),
де (Mn) 4 - чотирьохядерний Mn-кластер водоокислюючий комплексу (ВОК), YZ - залишок тирозину-161 в поліпептиди D1 фотосистеми II, P680 - реакційний центр ФСII, Фео - проміжний акцептор електронів (феофітин), QA та QB - первинний і вторинний пластохинони, QP - мембранний фонд пластохинона, QZ - ділянка зв'язування пластохинона в b6f-цитохромний комплексі.
Окислення H2O включає чотири одноелектронні стадії, що призводять до послідовного накопичення окисних еквівалентів в Mn-кластері. Відповідно, Mn-кластер може перебувати в п'яти різних окислювально-відновних станах, що позначаються символами S0-S4. Стани S0 і S1стабільни в темряві, S4 перетворюється на S0 зв'язано з виділенням O2, стану S2 і S3 не стійкі і релаксують в темряві в стан S1 за десятки секунд. У темряві співвідношення S1: S0 становить 3-4, тому в умовах імпульсного освітлення, коли кожна світлова спалах викликає один оборот P680, максимальний вихід O2 з H2O спостерігається у відповідь на третій імпульс; на перший імпульс O2 не виділяється.
Дані структурних досліджень дозволяють припустити, що (Mn) 4 представляє собою димер з двох біядерних центрів. Це узгоджується з даними про функціональну неоднорідності чотирьох Mn-центрів (див. [3] і цитовану там літературу). Одна з (Mn) 2-груп, (Mn-Mn) ВОК, утворює каталітичний центр ВОК; інша, (Mn-Mn) C, мабуть, служить регулятором функціональної активності (Mn-Mn) ВОК. Існує ряд сполук, аналогів H2O, взаємодіючих з ВОК. Так, окислення NH2OH і NH2NH2 веде до утворення сверхвосстановления станів (Mn) 4-кластеру - станів S-1 і S-2 [3]: протікають реакції S1 → S-1 і S2 → S-2, які в рамках уявлень про біядерних (Mn) 2-групах можуть відповідати переходах:
і
Особливий інтерес серед аналогів H2O являє пероксид водню. У присутності H2O2 хлоропласти виділяють O2 у відповідь на перший світловий імпульс [4]. Цей результат підтверджений у дослідах з H218O2 [5]. У темноадаптірованних тилакоїди хлоропластів H2O2 викликає перехід S1 → S-1 [4, 5]. При цьому встановлюється співвідношення S0: S-1: S1, близьке до 0:6:4 [5]. Стан S-1 стабільно і не релаксує, щонайменше, протягом 15 хв [5]. Одиночний світловий імпульс викликає перехід S-1/S1 → S0/S2, який ініціює темновую реакцію окислення H2O2 з утворенням O2 [4,5]. Як продемонстровано у дослідах з H218O2, весь O2 виділяється з H2O2 [5], в розрахунку на 1 P680 після одиночної спалахи світла виділяється більше 20 молекул O2. Ця реакція, подібна каталазної реакції, імовірно обумовлена відновленням S2 до S0 допомогою H2O2 (E0 'для O2/H2O2 дорівнює 0,295 В) і подальшим H2O2-залежним окисленням S0 до S2 (E0' для H2O2/H2O дорівнював 1,42 В). Реакції S-станів, які викликаються H2O2, ілюструє схема (за [5]).
Переходи S2 → S1 і S0 S-1 призводять до поступового загасання темнового виділення O2 з H2O.
Є дані про те, що виділення O2 з H2O2 в результаті циклічного переходу S2 → S0 → S2 можливе без попереднього впливу одиночним світловим імпульсом [6-8]. Процес залежить від (Mn) 4, Ca2 + і Cl-[6]. Ці дані, проте, піддані критиці [9]. Зокрема, комплекси ФСII, позбавлені субодиниць ВОК з молекулярної масою 17 і 24 кДа (на яких проводилися досліди [6-8]), за даними роботи [10] при дії H2O2 втрачають Mn, а за даними роботи [8] цілком зберігають його і при цьому характеризуються відсутністю шестисмугового сигналу ЕПР від Mn2 +, що знаходиться у водному оточенні. Стверджується [9], що такий сигнал в умовах кімнатної температури, в яких проводилися вимірювання [8], повинен реєструватися і в зразках з нативним Mn-кластером ВОК. Тилакоїдних мембрани, збіднені Cl-, не здатні до фотоокислення H2O, але виділяють O2 з H2O2 на світлі [11]. Досліди з антибіотиком A23187 (здійснює трансмембранний обмін двовалентних катіонів на 2H +) і дані про дію доданого Mn2 + схилили авторів роботи [11] до припущення про те, що фотоокислення H2O2 в таких мембранах каталізується вільним або лабільно пов'язаним Mn, які виникають у результаті H2O2-залежною деструкції (Mn) 4, що входить до складу ВОК. Доданий Mn2 + підтримує окислення H2O2 в тилакоїдних мембранах, збагачених ФСII і попередньо позбавлених Mn [12].
Таким чином, до теперішнього часу немає ясності з питання, чи потрібен для виділення O2 з H2O2 інтактний ВОК. Або цей процес протікає і після деструкції ВОК? У цьому випадку шляху окислення H2O і H2O2 розходяться, і тоді вивчення розкладання H2O2 в якості підходу для пізнання механізму виділення O2 з H2O втрачає сенс.
Однак є дані, отримані із застосуванням іншого підходу. У певних умовах електрон-донорно гілку ФСII може генерувати H2O2. Освіта H2O2 на світлі викликають ADRY-реагенти (ADRY - від англійського "Acceleration of Deactivation Reactions of the Water-Oxidizing Complex Y", див. [2] в якості огляду) [13] - з'єднання, які, окислюючись, прискорюють дезактивацію S2- і S3-станів з утворенням S1. H2O2 утворюється в вивернутих тилакоїдних мембранах, якщо вони позбавлені 16 - і 23 кДа-поліпептидів ВОК [14]. Процес залежить від доданого Mn2 + і пригнічується ЕДТА. Освітлення мембран, збагачених ФСII в результаті обробки детергентом, теж призводить до утворення H2O2 [15, 16], як припускають автори, в електрон-донорної гілки ФСII.
H2O2, утворений в електрон-донорної гілки ФСII, вивільняється лише при кислотної обробки мембран - при зниженні pH до 1,4 [15]. Зв'язаний H2O2 утворюється на перший спалах світла, на наступні спалахи спостерігаються осциляції з періодом в два такти: на непарні спалаху H2O2 утворюється, а на парні - зникає. Вихід пов'язаного H2O2 становить 0,35 моль на 1 моль P680. Зв'язаний H2O2 утворюється і в мембранах, позбавлених Mn, але без осциляцій на послідовні спалаху світла [15].
Умовою утворення H2O2 за даними роботи [16] є приміщення мембран в гіпотонічну середу з низькою концентрацією сахарози. Якщо в якості акцептора електронів в реакції Хілла використовувати 2,6-діхлорфеноліндофенол (ДФІФ), то кількість фотовосстановленного ДФІФ в розрахунку на електронні еквіваленти більш ніж в 1,5 рази перевищує кількість виділеного O2. Різниця стирається при додаванні каталази [16]. Це свідчить про те, що значна частка електронного транспорту через ФСII має результатом не виділення O2, а освіта H2O2 [16]. Пропонуються два можливих варіанти пояснення отриманих результатів [16]: освіта H2O2 як проміжного продукту на шляху окислення H2O до O2 або як продукту, що виникає в результаті замикання циклу S-станів (S2-або S3-стану Mn-кластеру релаксують відповідно в S0 або S1 з вивільненням H2O2).
Таким чином, і цей підхід не дає однозначних результатів щодо ролі H2O2 в фотоокислення H2O. Більш того, при одноелектронного відновлення O2 компонентами електрон-акцепторних гілок ФСII і ФС утворюється O2-. (Див. [17] і цитовану там літературу). В ізольованих хроматофорах пурпурних бактерій окислюється вторинний хинон, найбільш ймовірно, у формі семіхінона [18, 19]. При обробці хроматофорів детергентами з O2 взаємодіє бактеріофеофітін [20]. У модельних системах киснем окислюються фотозбудження хлорофіл а і бактериохлорофилла а [21, 22]. Комплекси ФСII мають високу активність супероксиддисмутази [17], що каталізує реакцію:
2O2-. + 2H + → H2O2 + O2.
Застосування ще одного підходу, "еволюційного", до проблеми фотосинтетичного кисню представляється перспективним. Еволюційно творцями оксигенного фотосинтезу стали ціанобактерії. Багато хто з них утворюють на світлі H2O2 [23]. Перенесення електронів на O2 з подальшим утворенням H2O2 у ціанобактерії Microcoleus chtonoplastes сягає 40% загального потоку електронів через ФСII [24]. Досліджена Ціанобактерія має високу активність супероксиддисмутази і не містить каталази [24].
В умовах імпульсного освітлення ізольовані тилакоїди Oscillatoria chalybea виділяють O2 у відповідь на першу світлову спалах (див. [25] і цитовану там літературу). Такі ж дані отримані з представниками Synechocystis і Synechococcus. Мас-спектрометричний аналіз показав, що висвітлення мембран O. chalybea у присутності H218O2 або 18O2 в газовій фазі призводить до виділення 18O2. Зроблено висновок про те, що 18O2, доданий в газову фазу, розчиняється у водній фазі, поглинається мембранами і перетворюється на компонент, який окислюється при освітленні з виділенням 18O2. Дані ізотопного розподілу (16O2, 16O18O, 18O2) показують, що кисень виділяється не з H218O, оскільки сигнал 16O18O, який неминуче повинен виникати при окисленні води, невеликий. Отже, 18O2 виділяється з H218O2, що утворюється в результаті темнового поглинання 18O2 з газової фази [25]. Фотоокислення води у O. chalybea теж відбувається, але частка H2O в світлозалежною виділення O2 значно нижче, ніж частка H2O2. В анаеробних умовах вихід O2 на світлі істотно знижується, при цьому придушується виділення O2 з H2O2, але не з H2O [25]. Анаеробіоз інгібує також фотовиделеніе O2 зеленої водорістю Ulva sp. [26].
Таким чином, для фотосинтетичного виділення O2 зазначеними організмами потрібно, щоб у середовищі містився O2, найбільш ймовірно, як субстрат для утворення H2O2. Передбачається, що H2O2 є еволюційним попередником H2O в якості донора електронів для ФСII [25].
Більш того, висунуто припущення [27], що в ході сучасного фотосинтезу O2 виділяється не з H2O, а з H2O2 екзогенного і ендогенного (внутрішньоклітинного) походження.
Процеси освіти H2O2 в атмосфері та природних водоймах, а також у клітинах мікроорганізмів докладно розглянуті в огляді [28]. Відзначимо лише, що згідно з розрахунками [28] на кожен квадратний метр поверхні суші і океанів за рік з опадами випадає ~ 200 г H2O2 [28], до 15% O2, споживаного організмом тварини, перетворюється на H2O2 [29]. Генераторами H2O2 в фотосинтезуючої клітці є тилакоїдних мембрани, мітохондрії, пероксисоми, ендоплазматичний ретикулум. Концентрація H2O2 в водоймах у середньому становить 10-6 М [28]. Для використання у фотосинтезі замало. Тому передбачаються механізми концентрування H2O2 в клітці, наприклад, в результаті транспірації [27]. Нагадаємо, що концентрація CO2 в повітрі теж невелика - 0,03%.
Якщо H2O2 прийняти як еволюційного попередника H2O як донора електронів при фотосинтезі, то для освіти H2O2 був необхідний O2. Чи міг O2 з'явитися в добіогенний період розвитку Землі? Кисень сучасної земної атмосфери на 2,3% важче кисню, що утворюється фотосинтетично [30]. Отже, крім фотосинтезу повинен бути інше джерело O2, що поставляє його в атмосферу. "... Вільний кисень в газовій фазі з'явилася на Землі в давнину, тобто в ранньому докембрії, внаслідок дегазації базальтової магми, подібно до того як з'явилися в атмосфері та інші гази. Більш того, він продовжує надходити з земних надр до теперішнього часу. Магма є тим першим потужним джерелом кисню в природі, який визначає кількість і якість його в атмосфері спільно з що ще трохи пізніше киснем фотосинтетичним "([30], стор 10). Кисень сучасної атмосфери на 30% має фотосинтетичні і на 70% геологічне (із земних надр) походження [30]. За даними мінералогії, як було зазначено В. Н. Вернадським [31], у межах науково вивчених геологічних періодів склад повітря не змінювався.
Розглянуті дані показують, що H2O2, можливо, відіграє важливу роль в системі фотосинтетичного виділення O2, проте ці дані не надаються до однозначної інтерпретації. H2O2 - проміжний продукт окислення H2O або вихідний субстрат-донор електронів? Поки не можна навіть відповісти на питання: H2O2 - це добре чи погано для фотосинтезу? Є дані про згубний дії H2O2. H2O2, що утворюється як в електрон-донорної, так і в електрон-акцепторної гілки ФСII, викликає фотоінгібірованіе ВОК [32].
Таким чином, уявлення про воду як донора електронів і джерелі кисню при фотосинтезі не є однозначним. В останні роки з'явилися дані про участь H2O2 у фотосинтетичних виділення O2. Дослідження в цій області представляються перспективними.
Робота підтримана Російським фондом фундаментальних досліджень (грантом 94-04-12227-а).
Список літератури Самуїлом В.Д. (1993) Біохімія, 58,1481-1485. Самуїлом В.Д., Кіташов А.В. (1996) Біохімія, 61, 404-411. Messinger, J., and Renger, G. (1993) Biochemistry, 32, 9379-9386. Velthuys, B., and Kok, B. (1978) Biochim. Biophys. Acta, 502, 211-221. Mano, J., Takahashi, M., and Asada, K. (1987) Biochemistry, 26, 2495-2501. Frasch, WD, and Mei, R. (1987) Biochim. Biophys. Acta, 891, 8-14. Frasch, WD, and Mei, R. (1987) Biochemistry, 26, 7321 - 7325. Frasch, WD, Mei, R., and Sanders, MA (1988) Biochemistry, 27, 3715-3719. Debus, RJ (1992) Biochim. Biophys. Acta, 1102, 269-352. Ghanotakis, DF, Topper, JN, and Yocum, CF (1984) Biochim. Biophys. Acta, 767, 524-531. Sandusky, PO, and Yocum, CF (1988) Biochim. Biophys. Acta, 936, 149-156. Klimov, VV, Allakhverdiev, SI, Shuvalov, VA, and Krasnovsky, AA (1982) FEBS Lett., 148, 307-312. Sayre, RT, and Homann, PH (1979) Arch. Biochem. Biophys., 196, 525-533. Schroder, WP, and Akerlund, H.-E. (1986) Biochim. Biophys. Acta, 848, 359-363. Ананьєв Г.М., Клімов В.В. (1988) Докл. АН СРСР, 298, 1007-1011. Wydrzynski, T., Angstrom, J., and Vanngard, T. (1989) Biochim. Biophys. Acta, 973, 23-28. Ananyev, G., Renger, G., Wacker, H., and Klimov, VV (1994) Photosynth. Res., 41, 327-338. Remennikov, VG, and Samuilov, VD (1979) Biochim. Biophys. Acta, 546, 220-235. Remennikov, VG, and Samuilov, VD (1979) Arch. Microbiol., 123, 65-71. Ременников В.Г., Самуїлом В.Д. (1980) Докл. АН СРСР, 252, 491-494. Abdourashitova, FD, Barsky, EL, Gusev, MV, Il'ina, MD, Kotova, EA, and Samuilov, VD (1984) Photobiochem. Photobiophys., 8, 133-142. Барський Є.Л., Камілова Ф.Д., Ременников В.Г., Самуї-лов В.Д. (1986) Біофізика, 31, 789-792. Stevens, SE, Patterson, COP, and Myers, J. (1973) J. Phycol., 9, 427-435. Дубінін О.В., Застріжная О.М., Гусєв М.В. (1992) Мікробіологія, 61, 384-389. Bader, KP (1994) Biochim. Biophys. Acta, 1188, 213-219. Popovic, R., Swenson, SI, Colbow, K., Vidaver, WE, and Bruce, D. (1987) Photosynthetica, 21, 165-174. Комісарів Г.Г. (1995) Хім. фізика, 14, 20-28. Штам Є.В., Пурмаль А.П., Скурлатов Ю.І. (1991) Успіхи хімії, 60, 2373-2411. Oshino, N., Jamieson, D., Sugano, T., and Chance, B. (1975) Biochem J., 146, 67-73. Бгати В.І. (1985) Історія кисню земної атмосфери. Надра, Москва. Вернадський В.М. (1955) Ізбр. соч., Т. 2, Вид-во АН СРСР, Москва, с. 448. Bradley, RL, Long, KM, and Frash, WD (1991) FEBS Lett., 286, 209-213.