РЕФЕРАТ
Ферменти
Ферменти - біологічні каталізатори, майже всі ферменти є білками (хоча нещодавно з'ясувалося, що деякі реакції каталізують РНК, а не білки). Речовини, які беруть участь у реакції, яку каталізує фермент, називаються субстратами. Від звичайних каталізаторів ферменти відрізняє кілька особливостей.
По-перше, ферменти мають дуже високу специфічність: вони дізнаються такі невеликі відмінності в структурі речовин, як наявність зайвої-СН2-групи, вміють розрізняти цис-і транс-ізомери, D - і L-ізомери. Деякі ферменти, однак, мають не дуже суворої специфічністю - так, фермент шлункового соку пепсин розщеплює пептидні зв'язки, утворені як ароматичними, так і кислими амінокислотами (зауважимо, що для виконання біологічної функції пепсину і не потрібна висока специфічність: навпаки, чим більше різних пептидних зв'язків він розщепити, тим краще перетравиться їжа в шлунку).
По-друге, ферменти мають надзвичайно високою ефективністю, значно перевершує ефективність звичайних каталізаторів. Так, одна молекула ферменту каталази, що прискорює розкладання перекису водню на воду і кисень, встигає розщепити 200 000 молекул субстрату за одну секунду.
По-третє, ферменти втрачають свою активність при підвищенні температури. Ми говорили в уроці 5, що при високих температурах білки піддаються денатурації: вони втрачають свою природну конформацію і вже не можуть виконувати біологічні функції.
Нарешті, по-четверте, багато хто (хоча і не всі) ферменти піддаються регуляції - залежно від потреб клітини і організму їх активність може зростати, а може і зменшуватися.
Ферменти давно використовуються в медицині. Так, в багатьох клініках проводять вимірювання активності різних форм ферментів лактатдегідрогенази і трансамінази - їх співвідношення змінюється при таких хворобах як інфаркт міокарда, ураження печінки, м'язові дистрофії; фермент стрептокиназу лікарі застосовують для розсмоктування тромбів; ферменти трипсин і коллагеназа використовуються для розсмоктування рубців. У біотехнології ферменти застосовуються ще ширше. Амілаза, що розщеплює крохмаль, використовується в пивоварній, хлібопекарської (полегшує переробку крохмалю дріжджами), текстильної та шкіряної промисловості (мовить м'якенькі сировина). Різні протеази, що розщеплюють білки, застосовують у харчовій (роблять старе м'ясо більш м'яким, згортають молоко в сироварінні) і шкіряної промисловості. У харчовій промисловості використовуються інвертаза (розщеплює сахарозу), глюкоізомераза (ізомеризується глюкозу в більш солодку фруктозу), трансглютамінази (зшиває білки, покращуючи структуру продукту), ліпази (розщеплюють ліпіди, застосовуються для отримання більш цінних харчових жирів), пектінметілестераза (освітлює фруктові соки) і т.д. Протеази і ліпази часто додають у пральні порошки для кращого видалення бруду.
Ділянка молекули ферменту, який безпосередньо взаємодіє з субстратом, називається активним центром ферменту. В активному центрі можна виділити дві області: субстрат-зв'язуючий ділянку і каталітичний ділянку. Субстрат-зв'язуючий ділянку визначає специфічність впізнавання ферментом свого субстрату, а каталітичний безпосередньо виробляє хімічне перетворення субстрату в продукт. В активному центрі виявляються зближеними амінокислотні залишки, далеко віддалені один від одного в первинній структурі. Активний центр займає невелику частину від всієї білкової глобули ферменту, всі інші амінокислоти потрібні для підтримки амінокислотних залишків активного центру в потрібному положенні.
Висока специфічність ферментів пояснюється тим, що субстрат підходить до їх активного центру як ключ до замка.
У молекулі субстрату можуть бути позитивно і негативно заряджені групи, поляризовані групи з частковими зарядами, а також гідрофобні зони. Відповідно, в субстрат-зв'язує ділянці активного центру навпроти позитивно заряджених груп субстрату будуть розташовуватися негативно заряджені групи ферменту, навпаки негативно заряджених - позитивно заряджені, а навпаки гідрофобних фрагментів субстрату - гідрофобні амінокислотні залишки. Таким чином, зв'язування ферменту із субстратом відбувається завдяки іонним, водневим і гідрофобним взаємодіям.
В даний час детально вивчено механізм роботи далеко не всіх ферментів. Одним з найбільш вивчених є фермент підшлункової залози α-хімотрипсин, що розщеплює білки їжі в дванадцятипалої кишці та тонкому кишечнику. Він гідролізує пептидні зв'язки, розташовані близько ароматичних амінокислот субстрату. У каталітичному ділянці активного центру α-хімотрипсину знаходяться три амінокислотних залишку: серин, гістидин і аспарагінова кислота. У третинної структурі ферменту вони тісно прилягають один одному, але в первинній структурі розташовані далеко: гістидин є 57-й амінокислотою з N-кінця, аспартат - 102-й, серин - 195-й.
На початку процесу каталізу в активний центр ферменту заходить субстрат, для нас важлива одна-єдина пептидний зв'язок в його молекулі (етап 1 на малюнку). Поява субстрату викликає переміщення іона Н + від серину на гістидин, а що утворився аніон серину негайно атакує карбонільних атом вуглецю в пептидного зв'язку субстрату (етап 2 на малюнку). Утворюється дуже короткоживучих проміжних з'єднання, в якому атом вуглецю субстрату пов'язаний з двома атомами кисню, одним атомом азоту і одні атомом вуглецю. Це сполука швидко розпадається, причому одна його половинка залишається ковалентно пов'язаної із залишком серину, а інша забирає іон Н + від гістидину і стає повністю вільною (етап 3 на малюнку). Таке ковалентное з'єднання ферменту до частини субстрату називається ацил-фермент. Потім частина субстрату з вільною аміногрупою йде з активного центру (етап 4 на малюнку). Для завершення реакції необхідно гідролізувати ацил-фермент, і в активний центр хімотрипсину приходить молекула води (етап 5 на малюнку). Знову утворюється короткоживучий проміжний комплекс, в якому атом вуглецю субстрату пов'язаний з трьома атомами кисню і одні атомом вуглецю (етап 6 на малюнку). Цей комплекс також швидко розпадається, при цьому ковалентний зв'язок між залишком субстрату і ферменту розривається (етап 7 на малюнку). Нарешті, залишок субстрату залишає активний центр ферменту, і він повертається в початковий стан (етап 8 на малюнку). У результаті реакція гідролізу пептидного зв'язку протікає через безліч проміжних етапів. Без ферменту реакція йде дуже повільно, а кожна з проміжних стадій, що протікають в активному центрі ферменту, йде швидко, в результаті фермент різко прискорює протікання реакції.
Швидкість хімічної реакції - це зміна концентрації продукту в одиницю часу. Ще в 1913 році Міхаеліс і Ментен вивели рівняння залежності швидкості найпростішої ферментативної реакції S → P від концентрації субстрату. Щоб краще зрозуміти біохімічну основу цього математичного рівняння, уявімо собі умови протікання ферментативної реакції, коли субстрату дуже мало. Більшість молекул ферменту при цьому не пов'язано з субстратом, вони "бродять без роботи", і швидкість реакції мала. Якщо підвищувати концентрацію субстрату, то швидкість реакції зростає майже лінійно. Але нескінченно швидкість реакції підвищуватися не може: при дуже великій концентрації субстрату всі молекули ферменту виявляться пов'язані з ним - весь фермент перейде в фермент-субстратної комплекс. Швидкість реакції вже не буде рости при підвищенні концентрації, і крива швидкості буде прагнути до асимптота. Математично це рівняння виглядає так:
де V - швидкість реакції, [S] - концентрація субстрату, Vмакс - максимальна швидкість реакції, що досягається при нескінченній концентрації субстрату, Kм - константа Міхаеліс.
Швидкість ферментативної реакції може бути уповільнена спеціальними речовинами - інгібіторами. Деякі інгібітори ферментів - смертельні отрути для людини, тоді як інші є цінними ліками. До таких ліків відносяться, наприклад, сульфаніламідні препарати. Багатьом видам хвороботворних бактерій для зростання необхідна пара-амінобензойна кислота H2N-C6H4-COOH. Вони використовують її для синтезу більш складної сполуки - фолієвої кислоти, важливого вітаміну. Сульфаніламід H2N-C6H4-SO3H (побутова назва - стрептоцид) і його похідні схожі на пара-амінобензойную кислоту, вони зв'язуються з ферментом, що бере участь у синтезі фолієвої кислоти, займаючи субстрат-зв'язуючий ділянку активного центру. Але вони не можуть вступити в реакцію, яку каталізує фермент, а просто сидять в активному центрі і не дають вступити в реакцію істинному субстрату - пара-амінобензойної кислоті. У результаті бактерія не може синтезувати необхідну їй вітамін. Людина не має цього ферменту, він повинен отримувати фолієву кислоту з їжею, тому для людини сульфаніламідні препарати нешкідливі (проте вони пригнічують корисну мікрофлору кишечника, так що приймати їх треба тільки за призначенням лікаря).
Сульфаніламід як би конкурує з пара-амінобензойної кислотою за активний центр ферменту, тому такі інгібітори отримали назву конкурентних. У присутності конкурентних інгібіторів Vмакс не змінюється - адже при дуже великій концентрації субстрат "переможе" у конкуренції з інгібітором. Інший клас інгібіторів - неконкурентні - пов'язуються не з активним центром ферменту, а з іншим його ділянкою. Вони не впливають на зв'язування субстрату, але зменшують максимальну швидкість, змінюючи конформацію молекули ферменту. І конкурентні, і неконкурентні інгібітори зв'язуються з ферментом оборотно.
Існує ще один клас інгібіторів - незворотні. Вони ковалентно зв'язуються з молекулою ферменту. Так, антибіотик пеніцилін необоротно зв'язується з мікробним ферментом глікопептид-транспептидаз, синтезуючим муреин (див. урок 3), і порушує синтез клітинної стінки. Цілий ряд потужних нервово-паралітичний бойових отруйних речовин (зарин, зоман, V-гази) необоротно інгібують фермент ацетилхолін-естераз, необхідний для розслаблення скелетних м'язів. У результаті отруєння цими речовинами дихання стає неможливим через спазм дихальних м'язів, і настає смерть - смертельна доза для людини речовини VX складає всього 0,0004 р.
У клітці активність багатьох ферментів регулюється. Одним з найбільш поширених механізмів регуляції активності ферментів є аллостеріческій регуляція. У ферментів, регульованих таким способом, окрім активного центру є ще один дуже важливу ділянку - аллостеріческій центр. Він оборотно зв'язує спеціальні регулятори, зазвичай це невеликі молекули масою менше 1 кілодальтон. Після зв'язування регулятора конформація всієї білкової глобули змінюється, і фермент змінює ефективність своєї роботи.
Одні аллостеріческій регулятори інгібують активність ферменту, тоді як інші активують її. Деякі ферменти мають кілька аллостеріческій центрів.
Аллостеріческій регуляція часто використовується в обміні речовин для інгібування кінцевим продуктом. Уявіть собі, що в організмі синтезується деяка речовина Z, концентрацію якого необхідно підтримувати на постійному рівні. Ця речовина синтезується з попередника А в кілька стадій:
A → B → C → D → Z.
Перший фермент цього шляху, що перетворює A → B, аллостеріческій інгібується кінцевим продуктом Z. Якщо концентрація Z підвищиться вище норми, то активність перших ферменту в ланцюзі реакцій виявиться пригнобленої, вироблення продукту скоротиться, і його концентрація незабаром знизиться до норми. Якщо ж концентрація Z сильно знизиться, то аллостеріческого інгібування ферменту зникне, він запрацює в повну силу, і незабаром концентрація продукту відновиться до нормального рівня.
Інший спосіб регулювання - кооперативность - схожа за механізмом на аллостерію. Розберемо явище кооперативності на прикладі гемоглобіну - хоча цей кисень-зв'язуючий білок і не є ферментом, принципи залишаються тими ж. Графік залежності насичення гемоглобіну від парціального тиску кисню має S-подібну форму і сильно відрізняється від кривої Міхаеліс. При низькій концентрації кисню графік насичення гемоглобіну йде дуже полого. При збільшенні концентрації він круто злітає вгору: білок, що зв'язує кисень у відповідності з рівнянням Міхаеліс, не зміг би забезпечити таку крутизну. Нарешті, остання ділянка цієї кривої асимптотично наближається до повного насичення.
Таке незвичайне поведінка пояснюється просто. Гемоглобін складається з чотирьох субодиниць, кожна з яких здатна пов'язувати молекулу О2. При дуже низькій концентрації кисню все субодиниці гемоглобіну знаходяться у вільному стані. Якщо концентрацію О2 трохи підвищити, то спершу його скріплення піде з великими труднощами. Однак коли перша субодиниця все-таки зв'яже кисень, то її конформація зміниться, і це зміна передасться на сусідні субодиниці. Вони будуть зв'язувати кисень легше, ніж перша, і крива зв'язування стрімко піде вгору. Таке підвищення спорідненості до субстрату в інших субодиниць після зв'язування його першої субодиницею називається позитивною кооперативності. Механізм цього явища полягає в тому, що зміна конформації однієї субодиниці білка викликає зміна просторової структури всієї білкової молекули.
Фізіологічне значення цієї властивості гемоглобіну величезна. Парціальний тиск кисню в крові, що виходить з легких, становить близько 100 мм рт. ст., в цих умовах гемоглобін насичений на 98%. У тканинної рідини, що омиває капіляри, парціальний тиск О2 може знизитися до 20 мм рт. ст., в цих умовах гемоглобін буде насичений киснем на 32%. У підсумку 66% (98% - 32%) від загальної кількості гемоглобіну бере участь в переносі кисню. Якщо би перенесення кисню здійснював якийсь уявний білок, що не володіє кооперативних, то при зміні парціального тиску з 100 мм рт. ст.д.о 20 мм рт. ст. він змінив би свою насиченість киснем тільки на 38%. Таким чином, кооперативность підвищує ефективність роботи гемоглобіну приблизно в 1,7 рази.
Ще одним дуже важливим механізмом регуляції активності білків є ковалентний модифікація. Білки можуть піддаватися різним хімічним змінам. Дуже поширений обмежений протеоліз білкових молекул. Багато травні ферменти синтезуються у формі довгих попередників. Так, підшлункова залоза секретує у просвіт дванадцятипалої кишки не активні ферменти трипсин і хімотрипсин, а їх попередники - трипсиноген і химотрипсиноген. Трипсиноген довше трипсину на 6 амінокислотних залишків з N-кінця. Фермент кишечника ентеропептідаза відщеплює цей зайвий пептид і перетворює неактивний трипсиноген в активний трипсин.
Багато білкові гормони також синтезуються у вигляді більш довгих попередників. Так, на рибосомах підшлункової залози синтезується попередник гормону інсуліну - проінсулін. Відщеплення зайвих амінокислот та освіта зрілого інсуліну відбувається у секреторних везикулах клітин підшлункової залози.
Обмежений протеоліз грає важливу роль в регуляції згортання крові. Для утворення кров'яного згустку необхідно, щоб розчинний білок фібриноген перетворився в нерозчинний фібрин. Цей процес стає можливим після обмеженого протеолізу фібрину спеціальним ферментом - тромбіном. Сам тромбін теж утворюється з неактивного попередника - протромбіну - за допомогою обмеженого протеолізу. Активація згортання крові - дуже складний процес, що включає в себе цілий каскад послідовно діючих протеаз.
Запуск найпершої протеази відбувається при пошкодженні стінки кровоносної судини. Існує два механізми активації цього каскаду реакцій. При внутрішньому механізмі одна з неактивних протеаз вступає в контакт з білком сполучної тканини колагеном (що можливо лише при пошкодженні стінки судини), її конформація змінюється, вона переходить в активну форму і запускає весь наступний каскад реакцій. При зовнішньому механізмі інша неактивна протеаза з'єднується з одним з білків, вивільнюваним з пошкоджених клітин стінки кровоносної судини, і також переходить в активну форму.
Іншим поширеним видом ковалентного модифікації є фосфорилювання білків - приєднання залишку фосфорної кислоти з молекули АТФ до одного з амінокислотних залишків білкової глобули. Цілий ряд гормонів роблять свій фізіологічну дію через фосфорилювання відповідних білків. Розглянемо дію двох з них - адреналіну і глюкагону. Обидва гормону викликають підвищення концентрації глюкози в крові. Ефективність їх дії вражаюча: одна молекула гормону викликає викид у кров до 100 мільйонів молекул глюкози.
Глюкоза запасається в клітинах людини у вигляді полімеру - глікогену (див. урок 3). Фермент глікогенфосфоріліза каталізує розпад глікогену до глюкозо-6-фосфату, який потім перетворюється на глюкозу, а вільна глюкоза надходить у кров. Самою повільною реакцією є перша, глікогенфосфорілазная, вона і обмежує швидкість всього процесу. У спокійному стані потреба організму в глюкозі значно менше, ніж при стресі або інтенсивної м'язової навантаженні, тому в нормі фермент глікогенфосфорілаза малоактивний, а під дією адреналіну і глюкагону різко активується.
На поверхні мембрани клітин печінки, які запасають глікоген, є білки-рецептори, здатні зв'язувати гормон. Кожному гормону відповідають свої рецептори. Зв'язування гормону з рецептором відбувається за рахунок нековалентних взаємодій (електростатичних, водневих, гідрофобних). Як тільки адреналін зв'яжеться з рецептором, конформація рецептора зміниться, і він робиться здатним активувати особливий мембранний фермент - аденілатциклазу. Рецептор, не пов'язаний з гормоном, не може активувати цей фермент (насправді активація аденілатциклази протікає набагато складніше, ніж описано тут).
Фермент аденилатциклаза каталізує реакцію перетворення АТФ в циклічний аденозинмонофосфат (цАМФ) - найважливіший внутрішньоклітинний регулятор багатьох біохімічних процесів. цАМФ шляхом дифузії йде в цитоплазму і аллостеріческій активує спеціальний фермент протеинкиназу. Протеїнкінази називають ферменти, які переносять залишок фосфату від АТФ на білок-мішень: Б-ОН + АТФ → Б-ОРО3Н-+ АДФ, де Б - білок-мішень. У клітці є безліч різних протеїнкіназ, кожна з них специфічно фосфорилирует тільки свої білки-субстрати і не діє на інші. Деякі протенікінази приєднують фосфат до залишків серину і треоніну, інші ж до залишків тирозину. цАМФ активує одну-єдину з них, яка так і називається: цАМФ-залежна протеїнкіназа; вона фосфорилирует свої мішені по залишках серину і треоніну.
Серед білків-мішеней цАМФ-залежної протеїнкінази є особливий фермент - кіназа фосфорілази. У нефосфорілірованном стані вона неактивна, а в фосфорильованій - активна. Кіназа фосфорілази, як виявляється з назви, сама фосфорилирует білок-мішень. Цією мішенню є фермент глікогенфосфорілаза. Після фосфорилювання глікогенфосфорілаза переходить з малоактивною в високоактивну форму, і розщеплює глікоген.
Рис.6. Каскад ферментів, що активується адреналіном і приводить до звільнення глюкози. Червоним кольором позначено неактивні форми ферментів, жовтим - активні. Блакитними стрілками позначена активація ферментів шляхом фосфорилювання
Значне посилення слабкого гормонального сигналу досягається за рахунок багатоступеневості процесу, причому на кожній наступній стадії в роботу каскаду вступає все більша і більша кількість білка.
Весь цей каскад активується під дією адреналіну за лічені секунди. Повернення компонентів системи в початковий стан після припинення подачі адреналіну відбувається за допомогою ферментів, відщеплюється фосфат з молекул білків - протеїнфосфатаз. цАМФ ж розщеплюється ферментом фосфодієстеразою.
У різних клітинах цАМФ-залежна протеїнкіназа фосфорилирует різні білки-мішені, і фізіологічний відповідь виходить різний. Через цАМФ діють, крім адреналіну і глюкагону, такі гормони гіпофіза як адренокортикотропний, тиреотропний і гонадотропний; антидіуретичний гормон, що перешкоджає виведенню води з організму; тканинної гормон простагландин Е2, що сприяє розвитку запальної реакції.
Деякі протеїнкінази фосфорилируют в білках-мішень не серин і треонін, а тирозин. Багато хто з цих тирозинових протеїнкіназ є рецепторами особливих білків - чинників зростання (їх ще іноді називають "гормонами клітинного ділення"). Одним з таких білків є соматомедину С. гіпофізарний гормон росту робить свій фізіологічну дію опосередковано: він стимулює виділення печінкою соматомедину С. Цей білок активує поділ клітин сполучної тканини фібробластів, зростання м'язової тканини, ріст хрящів. Іншим речовиною, що прискорює поділ клітин, є фактор росту епідермісу. Він у великих кількостях міститься в слині, так що тварини зализують рани не тільки з-за бактерицидної дії слини, а й тому, що вона прискорює ріст пошкодженого епітелію. Рецептори обох названих чинників зростання є тирозинових протеїнкінази.
Після активації тирозинових протеїнкіназ включається каскад реакцій, що приводить до запуску подвоєння ДНК, а потім і клітинного поділу. У ракових клітинах порушується регуляція цих процесів. Деякі пухлинні клітини починають самі виділяти фактори росту, які активують їх же власне ставлення. В інших злоякісно перероджених клітин відбуваються мутації в генах рецепторів факторів зростання, і в результаті вони стають активними без жодного зовнішнього сигналу. У результаті клітина починає безконтрольно ділиться, і утворюється ракова пухлина. Деякі сучасні протипухлинні лікарські препарати (Ерлотиніб, Іматініб) специфічно пригнічують ферментативну активність таких "оскаженілих рецепторів" і гальмують ріст пухлини.
Ферменти
Ферменти - біологічні каталізатори, майже всі ферменти є білками (хоча нещодавно з'ясувалося, що деякі реакції каталізують РНК, а не білки). Речовини, які беруть участь у реакції, яку каталізує фермент, називаються субстратами. Від звичайних каталізаторів ферменти відрізняє кілька особливостей.
По-перше, ферменти мають дуже високу специфічність: вони дізнаються такі невеликі відмінності в структурі речовин, як наявність зайвої-СН2-групи, вміють розрізняти цис-і транс-ізомери, D - і L-ізомери. Деякі ферменти, однак, мають не дуже суворої специфічністю - так, фермент шлункового соку пепсин розщеплює пептидні зв'язки, утворені як ароматичними, так і кислими амінокислотами (зауважимо, що для виконання біологічної функції пепсину і не потрібна висока специфічність: навпаки, чим більше різних пептидних зв'язків він розщепити, тим краще перетравиться їжа в шлунку).
По-друге, ферменти мають надзвичайно високою ефективністю, значно перевершує ефективність звичайних каталізаторів. Так, одна молекула ферменту каталази, що прискорює розкладання перекису водню на воду і кисень, встигає розщепити 200 000 молекул субстрату за одну секунду.
По-третє, ферменти втрачають свою активність при підвищенні температури. Ми говорили в уроці 5, що при високих температурах білки піддаються денатурації: вони втрачають свою природну конформацію і вже не можуть виконувати біологічні функції.
Нарешті, по-четверте, багато хто (хоча і не всі) ферменти піддаються регуляції - залежно від потреб клітини і організму їх активність може зростати, а може і зменшуватися.
Ферменти давно використовуються в медицині. Так, в багатьох клініках проводять вимірювання активності різних форм ферментів лактатдегідрогенази і трансамінази - їх співвідношення змінюється при таких хворобах як інфаркт міокарда, ураження печінки, м'язові дистрофії; фермент стрептокиназу лікарі застосовують для розсмоктування тромбів; ферменти трипсин і коллагеназа використовуються для розсмоктування рубців. У біотехнології ферменти застосовуються ще ширше. Амілаза, що розщеплює крохмаль, використовується в пивоварній, хлібопекарської (полегшує переробку крохмалю дріжджами), текстильної та шкіряної промисловості (мовить м'якенькі сировина). Різні протеази, що розщеплюють білки, застосовують у харчовій (роблять старе м'ясо більш м'яким, згортають молоко в сироварінні) і шкіряної промисловості. У харчовій промисловості використовуються інвертаза (розщеплює сахарозу), глюкоізомераза (ізомеризується глюкозу в більш солодку фруктозу), трансглютамінази (зшиває білки, покращуючи структуру продукту), ліпази (розщеплюють ліпіди, застосовуються для отримання більш цінних харчових жирів), пектінметілестераза (освітлює фруктові соки) і т.д. Протеази і ліпази часто додають у пральні порошки для кращого видалення бруду.
Ділянка молекули ферменту, який безпосередньо взаємодіє з субстратом, називається активним центром ферменту. В активному центрі можна виділити дві області: субстрат-зв'язуючий ділянку і каталітичний ділянку. Субстрат-зв'язуючий ділянку визначає специфічність впізнавання ферментом свого субстрату, а каталітичний безпосередньо виробляє хімічне перетворення субстрату в продукт. В активному центрі виявляються зближеними амінокислотні залишки, далеко віддалені один від одного в первинній структурі. Активний центр займає невелику частину від всієї білкової глобули ферменту, всі інші амінокислоти потрібні для підтримки амінокислотних залишків активного центру в потрібному положенні.
Висока специфічність ферментів пояснюється тим, що субстрат підходить до їх активного центру як ключ до замка.
У молекулі субстрату можуть бути позитивно і негативно заряджені групи, поляризовані групи з частковими зарядами, а також гідрофобні зони. Відповідно, в субстрат-зв'язує ділянці активного центру навпроти позитивно заряджених груп субстрату будуть розташовуватися негативно заряджені групи ферменту, навпаки негативно заряджених - позитивно заряджені, а навпаки гідрофобних фрагментів субстрату - гідрофобні амінокислотні залишки. Таким чином, зв'язування ферменту із субстратом відбувається завдяки іонним, водневим і гідрофобним взаємодіям.
В даний час детально вивчено механізм роботи далеко не всіх ферментів. Одним з найбільш вивчених є фермент підшлункової залози α-хімотрипсин, що розщеплює білки їжі в дванадцятипалої кишці та тонкому кишечнику. Він гідролізує пептидні зв'язки, розташовані близько ароматичних амінокислот субстрату. У каталітичному ділянці активного центру α-хімотрипсину знаходяться три амінокислотних залишку: серин, гістидин і аспарагінова кислота. У третинної структурі ферменту вони тісно прилягають один одному, але в первинній структурі розташовані далеко: гістидин є 57-й амінокислотою з N-кінця, аспартат - 102-й, серин - 195-й.
На початку процесу каталізу в активний центр ферменту заходить субстрат, для нас важлива одна-єдина пептидний зв'язок в його молекулі (етап 1 на малюнку). Поява субстрату викликає переміщення іона Н + від серину на гістидин, а що утворився аніон серину негайно атакує карбонільних атом вуглецю в пептидного зв'язку субстрату (етап 2 на малюнку). Утворюється дуже короткоживучих проміжних з'єднання, в якому атом вуглецю субстрату пов'язаний з двома атомами кисню, одним атомом азоту і одні атомом вуглецю. Це сполука швидко розпадається, причому одна його половинка залишається ковалентно пов'язаної із залишком серину, а інша забирає іон Н + від гістидину і стає повністю вільною (етап 3 на малюнку). Таке ковалентное з'єднання ферменту до частини субстрату називається ацил-фермент. Потім частина субстрату з вільною аміногрупою йде з активного центру (етап 4 на малюнку). Для завершення реакції необхідно гідролізувати ацил-фермент, і в активний центр хімотрипсину приходить молекула води (етап 5 на малюнку). Знову утворюється короткоживучий проміжний комплекс, в якому атом вуглецю субстрату пов'язаний з трьома атомами кисню і одні атомом вуглецю (етап 6 на малюнку). Цей комплекс також швидко розпадається, при цьому ковалентний зв'язок між залишком субстрату і ферменту розривається (етап 7 на малюнку). Нарешті, залишок субстрату залишає активний центр ферменту, і він повертається в початковий стан (етап 8 на малюнку). У результаті реакція гідролізу пептидного зв'язку протікає через безліч проміжних етапів. Без ферменту реакція йде дуже повільно, а кожна з проміжних стадій, що протікають в активному центрі ферменту, йде швидко, в результаті фермент різко прискорює протікання реакції.
Швидкість хімічної реакції - це зміна концентрації продукту в одиницю часу. Ще в 1913 році Міхаеліс і Ментен вивели рівняння залежності швидкості найпростішої ферментативної реакції S → P від концентрації субстрату. Щоб краще зрозуміти біохімічну основу цього математичного рівняння, уявімо собі умови протікання ферментативної реакції, коли субстрату дуже мало. Більшість молекул ферменту при цьому не пов'язано з субстратом, вони "бродять без роботи", і швидкість реакції мала. Якщо підвищувати концентрацію субстрату, то швидкість реакції зростає майже лінійно. Але нескінченно швидкість реакції підвищуватися не може: при дуже великій концентрації субстрату всі молекули ферменту виявляться пов'язані з ним - весь фермент перейде в фермент-субстратної комплекс. Швидкість реакції вже не буде рости при підвищенні концентрації, і крива швидкості буде прагнути до асимптота. Математично це рівняння виглядає так:
де V - швидкість реакції, [S] - концентрація субстрату, Vмакс - максимальна швидкість реакції, що досягається при нескінченній концентрації субстрату, Kм - константа Міхаеліс.
Швидкість ферментативної реакції може бути уповільнена спеціальними речовинами - інгібіторами. Деякі інгібітори ферментів - смертельні отрути для людини, тоді як інші є цінними ліками. До таких ліків відносяться, наприклад, сульфаніламідні препарати. Багатьом видам хвороботворних бактерій для зростання необхідна пара-амінобензойна кислота H2N-C6H4-COOH. Вони використовують її для синтезу більш складної сполуки - фолієвої кислоти, важливого вітаміну. Сульфаніламід H2N-C6H4-SO3H (побутова назва - стрептоцид) і його похідні схожі на пара-амінобензойную кислоту, вони зв'язуються з ферментом, що бере участь у синтезі фолієвої кислоти, займаючи субстрат-зв'язуючий ділянку активного центру. Але вони не можуть вступити в реакцію, яку каталізує фермент, а просто сидять в активному центрі і не дають вступити в реакцію істинному субстрату - пара-амінобензойної кислоті. У результаті бактерія не може синтезувати необхідну їй вітамін. Людина не має цього ферменту, він повинен отримувати фолієву кислоту з їжею, тому для людини сульфаніламідні препарати нешкідливі (проте вони пригнічують корисну мікрофлору кишечника, так що приймати їх треба тільки за призначенням лікаря).
Сульфаніламід як би конкурує з пара-амінобензойної кислотою за активний центр ферменту, тому такі інгібітори отримали назву конкурентних. У присутності конкурентних інгібіторів Vмакс не змінюється - адже при дуже великій концентрації субстрат "переможе" у конкуренції з інгібітором. Інший клас інгібіторів - неконкурентні - пов'язуються не з активним центром ферменту, а з іншим його ділянкою. Вони не впливають на зв'язування субстрату, але зменшують максимальну швидкість, змінюючи конформацію молекули ферменту. І конкурентні, і неконкурентні інгібітори зв'язуються з ферментом оборотно.
Існує ще один клас інгібіторів - незворотні. Вони ковалентно зв'язуються з молекулою ферменту. Так, антибіотик пеніцилін необоротно зв'язується з мікробним ферментом глікопептид-транспептидаз, синтезуючим муреин (див. урок 3), і порушує синтез клітинної стінки. Цілий ряд потужних нервово-паралітичний бойових отруйних речовин (зарин, зоман, V-гази) необоротно інгібують фермент ацетилхолін-естераз, необхідний для розслаблення скелетних м'язів. У результаті отруєння цими речовинами дихання стає неможливим через спазм дихальних м'язів, і настає смерть - смертельна доза для людини речовини VX складає всього 0,0004 р.
У клітці активність багатьох ферментів регулюється. Одним з найбільш поширених механізмів регуляції активності ферментів є аллостеріческій регуляція. У ферментів, регульованих таким способом, окрім активного центру є ще один дуже важливу ділянку - аллостеріческій центр. Він оборотно зв'язує спеціальні регулятори, зазвичай це невеликі молекули масою менше 1 кілодальтон. Після зв'язування регулятора конформація всієї білкової глобули змінюється, і фермент змінює ефективність своєї роботи.
Одні аллостеріческій регулятори інгібують активність ферменту, тоді як інші активують її. Деякі ферменти мають кілька аллостеріческій центрів.
Аллостеріческій регуляція часто використовується в обміні речовин для інгібування кінцевим продуктом. Уявіть собі, що в організмі синтезується деяка речовина Z, концентрацію якого необхідно підтримувати на постійному рівні. Ця речовина синтезується з попередника А в кілька стадій:
A → B → C → D → Z.
Перший фермент цього шляху, що перетворює A → B, аллостеріческій інгібується кінцевим продуктом Z. Якщо концентрація Z підвищиться вище норми, то активність перших ферменту в ланцюзі реакцій виявиться пригнобленої, вироблення продукту скоротиться, і його концентрація незабаром знизиться до норми. Якщо ж концентрація Z сильно знизиться, то аллостеріческого інгібування ферменту зникне, він запрацює в повну силу, і незабаром концентрація продукту відновиться до нормального рівня.
Інший спосіб регулювання - кооперативность - схожа за механізмом на аллостерію. Розберемо явище кооперативності на прикладі гемоглобіну - хоча цей кисень-зв'язуючий білок і не є ферментом, принципи залишаються тими ж. Графік залежності насичення гемоглобіну від парціального тиску кисню має S-подібну форму і сильно відрізняється від кривої Міхаеліс. При низькій концентрації кисню графік насичення гемоглобіну йде дуже полого. При збільшенні концентрації він круто злітає вгору: білок, що зв'язує кисень у відповідності з рівнянням Міхаеліс, не зміг би забезпечити таку крутизну. Нарешті, остання ділянка цієї кривої асимптотично наближається до повного насичення.
Таке незвичайне поведінка пояснюється просто. Гемоглобін складається з чотирьох субодиниць, кожна з яких здатна пов'язувати молекулу О2. При дуже низькій концентрації кисню все субодиниці гемоглобіну знаходяться у вільному стані. Якщо концентрацію О2 трохи підвищити, то спершу його скріплення піде з великими труднощами. Однак коли перша субодиниця все-таки зв'яже кисень, то її конформація зміниться, і це зміна передасться на сусідні субодиниці. Вони будуть зв'язувати кисень легше, ніж перша, і крива зв'язування стрімко піде вгору. Таке підвищення спорідненості до субстрату в інших субодиниць після зв'язування його першої субодиницею називається позитивною кооперативності. Механізм цього явища полягає в тому, що зміна конформації однієї субодиниці білка викликає зміна просторової структури всієї білкової молекули.
Фізіологічне значення цієї властивості гемоглобіну величезна. Парціальний тиск кисню в крові, що виходить з легких, становить близько 100 мм рт. ст., в цих умовах гемоглобін насичений на 98%. У тканинної рідини, що омиває капіляри, парціальний тиск О2 може знизитися до 20 мм рт. ст., в цих умовах гемоглобін буде насичений киснем на 32%. У підсумку 66% (98% - 32%) від загальної кількості гемоглобіну бере участь в переносі кисню. Якщо би перенесення кисню здійснював якийсь уявний білок, що не володіє кооперативних, то при зміні парціального тиску з 100 мм рт. ст.д.о 20 мм рт. ст. він змінив би свою насиченість киснем тільки на 38%. Таким чином, кооперативность підвищує ефективність роботи гемоглобіну приблизно в 1,7 рази.
Ще одним дуже важливим механізмом регуляції активності білків є ковалентний модифікація. Білки можуть піддаватися різним хімічним змінам. Дуже поширений обмежений протеоліз білкових молекул. Багато травні ферменти синтезуються у формі довгих попередників. Так, підшлункова залоза секретує у просвіт дванадцятипалої кишки не активні ферменти трипсин і хімотрипсин, а їх попередники - трипсиноген і химотрипсиноген. Трипсиноген довше трипсину на 6 амінокислотних залишків з N-кінця. Фермент кишечника ентеропептідаза відщеплює цей зайвий пептид і перетворює неактивний трипсиноген в активний трипсин.
Багато білкові гормони також синтезуються у вигляді більш довгих попередників. Так, на рибосомах підшлункової залози синтезується попередник гормону інсуліну - проінсулін. Відщеплення зайвих амінокислот та освіта зрілого інсуліну відбувається у секреторних везикулах клітин підшлункової залози.
Обмежений протеоліз грає важливу роль в регуляції згортання крові. Для утворення кров'яного згустку необхідно, щоб розчинний білок фібриноген перетворився в нерозчинний фібрин. Цей процес стає можливим після обмеженого протеолізу фібрину спеціальним ферментом - тромбіном. Сам тромбін теж утворюється з неактивного попередника - протромбіну - за допомогою обмеженого протеолізу. Активація згортання крові - дуже складний процес, що включає в себе цілий каскад послідовно діючих протеаз.
Запуск найпершої протеази відбувається при пошкодженні стінки кровоносної судини. Існує два механізми активації цього каскаду реакцій. При внутрішньому механізмі одна з неактивних протеаз вступає в контакт з білком сполучної тканини колагеном (що можливо лише при пошкодженні стінки судини), її конформація змінюється, вона переходить в активну форму і запускає весь наступний каскад реакцій. При зовнішньому механізмі інша неактивна протеаза з'єднується з одним з білків, вивільнюваним з пошкоджених клітин стінки кровоносної судини, і також переходить в активну форму.
Іншим поширеним видом ковалентного модифікації є фосфорилювання білків - приєднання залишку фосфорної кислоти з молекули АТФ до одного з амінокислотних залишків білкової глобули. Цілий ряд гормонів роблять свій фізіологічну дію через фосфорилювання відповідних білків. Розглянемо дію двох з них - адреналіну і глюкагону. Обидва гормону викликають підвищення концентрації глюкози в крові. Ефективність їх дії вражаюча: одна молекула гормону викликає викид у кров до 100 мільйонів молекул глюкози.
Глюкоза запасається в клітинах людини у вигляді полімеру - глікогену (див. урок 3). Фермент глікогенфосфоріліза каталізує розпад глікогену до глюкозо-6-фосфату, який потім перетворюється на глюкозу, а вільна глюкоза надходить у кров. Самою повільною реакцією є перша, глікогенфосфорілазная, вона і обмежує швидкість всього процесу. У спокійному стані потреба організму в глюкозі значно менше, ніж при стресі або інтенсивної м'язової навантаженні, тому в нормі фермент глікогенфосфорілаза малоактивний, а під дією адреналіну і глюкагону різко активується.
На поверхні мембрани клітин печінки, які запасають глікоген, є білки-рецептори, здатні зв'язувати гормон. Кожному гормону відповідають свої рецептори. Зв'язування гормону з рецептором відбувається за рахунок нековалентних взаємодій (електростатичних, водневих, гідрофобних). Як тільки адреналін зв'яжеться з рецептором, конформація рецептора зміниться, і він робиться здатним активувати особливий мембранний фермент - аденілатциклазу. Рецептор, не пов'язаний з гормоном, не може активувати цей фермент (насправді активація аденілатциклази протікає набагато складніше, ніж описано тут).
Фермент аденилатциклаза каталізує реакцію перетворення АТФ в циклічний аденозинмонофосфат (цАМФ) - найважливіший внутрішньоклітинний регулятор багатьох біохімічних процесів. цАМФ шляхом дифузії йде в цитоплазму і аллостеріческій активує спеціальний фермент протеинкиназу. Протеїнкінази називають ферменти, які переносять залишок фосфату від АТФ на білок-мішень: Б-ОН + АТФ → Б-ОРО3Н-+ АДФ, де Б - білок-мішень. У клітці є безліч різних протеїнкіназ, кожна з них специфічно фосфорилирует тільки свої білки-субстрати і не діє на інші. Деякі протенікінази приєднують фосфат до залишків серину і треоніну, інші ж до залишків тирозину. цАМФ активує одну-єдину з них, яка так і називається: цАМФ-залежна протеїнкіназа; вона фосфорилирует свої мішені по залишках серину і треоніну.
Серед білків-мішеней цАМФ-залежної протеїнкінази є особливий фермент - кіназа фосфорілази. У нефосфорілірованном стані вона неактивна, а в фосфорильованій - активна. Кіназа фосфорілази, як виявляється з назви, сама фосфорилирует білок-мішень. Цією мішенню є фермент глікогенфосфорілаза. Після фосфорилювання глікогенфосфорілаза переходить з малоактивною в високоактивну форму, і розщеплює глікоген.
Рис.6. Каскад ферментів, що активується адреналіном і приводить до звільнення глюкози. Червоним кольором позначено неактивні форми ферментів, жовтим - активні. Блакитними стрілками позначена активація ферментів шляхом фосфорилювання
Значне посилення слабкого гормонального сигналу досягається за рахунок багатоступеневості процесу, причому на кожній наступній стадії в роботу каскаду вступає все більша і більша кількість білка.
Весь цей каскад активується під дією адреналіну за лічені секунди. Повернення компонентів системи в початковий стан після припинення подачі адреналіну відбувається за допомогою ферментів, відщеплюється фосфат з молекул білків - протеїнфосфатаз. цАМФ ж розщеплюється ферментом фосфодієстеразою.
У різних клітинах цАМФ-залежна протеїнкіназа фосфорилирует різні білки-мішені, і фізіологічний відповідь виходить різний. Через цАМФ діють, крім адреналіну і глюкагону, такі гормони гіпофіза як адренокортикотропний, тиреотропний і гонадотропний; антидіуретичний гормон, що перешкоджає виведенню води з організму; тканинної гормон простагландин Е2, що сприяє розвитку запальної реакції.
Деякі протеїнкінази фосфорилируют в білках-мішень не серин і треонін, а тирозин. Багато хто з цих тирозинових протеїнкіназ є рецепторами особливих білків - чинників зростання (їх ще іноді називають "гормонами клітинного ділення"). Одним з таких білків є соматомедину С. гіпофізарний гормон росту робить свій фізіологічну дію опосередковано: він стимулює виділення печінкою соматомедину С. Цей білок активує поділ клітин сполучної тканини фібробластів, зростання м'язової тканини, ріст хрящів. Іншим речовиною, що прискорює поділ клітин, є фактор росту епідермісу. Він у великих кількостях міститься в слині, так що тварини зализують рани не тільки з-за бактерицидної дії слини, а й тому, що вона прискорює ріст пошкодженого епітелію. Рецептори обох названих чинників зростання є тирозинових протеїнкінази.
Після активації тирозинових протеїнкіназ включається каскад реакцій, що приводить до запуску подвоєння ДНК, а потім і клітинного поділу. У ракових клітинах порушується регуляція цих процесів. Деякі пухлинні клітини починають самі виділяти фактори росту, які активують їх же власне ставлення. В інших злоякісно перероджених клітин відбуваються мутації в генах рецепторів факторів зростання, і в результаті вони стають активними без жодного зовнішнього сигналу. У результаті клітина починає безконтрольно ділиться, і утворюється ракова пухлина. Деякі сучасні протипухлинні лікарські препарати (Ерлотиніб, Іматініб) специфічно пригнічують ферментативну активність таких "оскаженілих рецепторів" і гальмують ріст пухлини.