Структура і склад біологічних мембран

2. Історичний нарис

3. Морфологія мембран

3.1 Дифракція рентгенівських променів

3.2 Електронна мікроскопія

4. Виділення мембран

4.1 Руйнування клітин

4.2 Поділ мембран

4.3 Критерії чистоти мембранних фракцій

1. Роль мембран і їх різноманітність

Мембрани відіграють ключову роль як у структурній організації, так і у функціонуванні всіх клітин - прокаріотичних та еукаріотичних, рослинних і тварин. Мембрани формують внутрішньоклітинні компартменти, з їх допомогою відбувається розділення вмісту компартментов і навколишнього їхнього середовища. Але якщо б це була єдина функція мембран, вони не були б для нас настільки цікаві. Мембрани не тільки розділяють клітку на окремі компартменти, але і беруть участь у регуляції всіх зв'язків і взаємодій, що здійснюються між зовнішньою і внутрішньою сторонами цих компартментов. Це може виявлятися у вигляді фізичного перенесення іонів або молекул через мембрану або у формі передачі інформації за допомогою конформаційних змін, індукованих в мембранних компонентах. Крім того, з мембранами пов'язані багато клітинні ферменти. Деякі з них каталізують трансмембранні реакції, коли реагенти знаходяться по різні сторони мембрани або коли каталітичний акт супроводжується транспортом молекул. Інші ферменти утворюють своєрідні комплекси, які здійснюють ланцюг послідовних перетворень, причому завдяки тому, що ці ферменти розташовуються в площині мембрани, підвищується ефективність всього процесу. Є ферменти, які, діючи на мембранозв'язані субстрати, беруть участь тим самим у біосинтезі мембран. За участю мембран в тій чи іншій мірі здійснюється більшість життєво важливих клітинних функцій, наприклад протікають такі різні процеси, як реплікація прокаріотичної ДНК, біосинтез білків і їх секреція, біоенергетичні процеси та функціонування систем гормонального відповіді.

Дані, отримані при вивченні клітин ссавців методом електронної мікроскопії, свідчать про наявність широко розвиненої мережі внутрішньоклітинних мембранних утворень, яка займає значну частину внутрішнього об'єму клітини. Зараз вже не викликає сумнівів, що основні принципи структурної організації всіх цих мембран по суті однакові. Більш того, ці принципи дотримуються також і у випадку мембран рослинних і бактеріальних клітин. Основні закономірності, встановлені Робертсоном у кінці 1950-х рр.., Дозволяють нам переносити результати, отримані при дослідженні однієї мембранної системи, на інші системи. Природно, врахування специфіки тут необхідний, оскільки, як це не парадоксально звучить, однією з найхарактерніших особливостей мембран є їх надзвичайна різноманітність. Таке розмаїття зумовлено передусім різноманітністю білків, присутніх в кожній мембрані, і способів їх взаємодії один з одним і з компонентами цитоплазми. Ці взаємодії в кінцевому рахунку проявляються в специфічній морфології мембранних утворень і можуть бути пов'язані з латеральної гетерогенністю тієї чи іншої мембрани. Таким чином, основне завдання полягає в тому, щоб, спираючись на загальні уявлення про структуру та функції мембран, виявити молекулярно-біологічні основи їх структурного та функціонального розмаїття.

Успіхів у дослідженні мембран вдалося досягти завдяки порівняльному вивченню мембран з безлічі різноманітних організмів. Бактеріальні клітини мають досить просту зовнішню оболонку, що містить одну або дві мембрани, які можна модифікувати генетично або шляхом зміни умов росту клітин. Віруси з оболонкою впроваджуються в клітини тварин завдяки злиттю з плазматичною мембраною останніх і вивільняються з клітки-хазяїна, отпочковиваясь від неї. Вивчення дозрівання вірусних білків дозволяє дізнатися багато нового про процеси біосинтезу мембранних білків.

Еукаріотичні клітини містять різні мембранні орга-Неллі, причому кожна мембрана унікальна за своїм складом, особливостям структурної організації і за характером виконуваних функцій. Для того щоб зрозуміти мотиви досліджень, описаних у наступних розділах, необхідно отримати деякі загальні уявлення про біологічні функції різних мембранних систем. На рис.1.1 схематично зображені мембрани, зазвичай представлені в тваринній і рослинній клітинах. Зауважимо, що зовнішній вигляд органел неоднаковий у клітинах різного типу. Крім того, деякі клітини, наприклад палички сітківки, а також клітини скелетних м'язів, мають високоспеціалізовані мембрани, виконують унікальні функції.

Плазматична мембрана. Плазматична мембрана утворює кордон, на якій здійснюється контакт клітини з її оточенням.

Вона містить спеціалізовані компоненти, які беруть участь у міжклітинних контактах і взаємодіях, в системах гормонального відповіді і транспорту як малих, так і великих молекул з клітки і всередину її. Однак і сама плазматична мембрана складається із спеціалізованих ділянок, які мають різне оточення. На рис.1.2 зображені апікальний і базолатеральной ділянки плазматичної мембрани гепатоцитів і поляризованих епітеліальних клітин. Апикальная мембрана контактує з будь-якою внутрішньоклітинним середовищем. Так, у гепатоцитів вона звернена в просвіт жовчних канальців, а у епітеліальних клітин кишечника - у просвіт шлунково-кишкового тракту.

Вона може мати спеціалізовані структури, наприклад мікроворсинки; останні в деяких всмоктувальних клітинах утворюють щеточную облямівку. Мікроворсинки значно збільшують площу поверхні мембрани, в результаті чого підвищується ефективність мембранного транспорту. Базолатеральную мембрана знаходиться в контакті з іншими клітинами або звернена в просвіт кровоносних судин. Латеральна і синусоїдні мембрани гепатоцитів розрізняються як по своїй морфології, так і біохімічно.

Базолатеральную мембрана гепатоцитів має також спеціалізовані структури, відповідальні за міжклітинну адгезію і транспорт. Щільні контакти герметизують область дотику клітин і запобігають перемішування вмісту жовчних канальців і кровоносних судин.

Щілинні контакти містять безліч регулярно розташованих пор, які дозволяють невеликим молекулам проходити через плазматичні мембрани двох дотичних клітин. Електронно-мікроскопічні і біохімічні дослідження виявили характерні деталі молекулярної організації цих пір, показавши, що кожна з них містить гексагонально упаковані білкові субодиниці.

Десмосоми також забезпечують клітинну адгезію і беруть участь у взаємодії плазматичної мембрани з елементами цитоскелету.

Апікальний, латеральний і синусоїдні ділянки плазматичної мембрани розрізняються морфологічно і мають унікальний склад і функції. Якщо клітини зруйнувати в м'яких умовах, то можна виділити й очистити фракції, що відповідають цим ділянкам плазматичної мембрани. Як на молекулярному рівні забезпечується в клітині існування таких спеціалізованих доменів, поки неясно, хоча відомо, що не всі їхні компоненти здатні вільно дифундувати між доменами.

Ядерна мембрана. Ядерна оболонка клітини, що знаходиться в інтерфазі, на електронних мікрофотографіях має вигляд двох елементарних мембран з вузьким просвітом між ними, званим перинуклеарних простором. Ця мембрана відбувається з ендоплазматичного ретикулуму і, мабуть, нерозривно пов'язана з ним. Найбільш характерними морфологічними ознаками є порообразние структури. Вони мають діаметр близько 600 А і складаються з морфологічно чітко виявляються компонентів, що утворюють октагональную грати. У тому місці, де розташовані ці структури, внутрішня і зовнішня ядерні мембрани виглядають злилися. Вважають, що пори дозволяють комплексам мРНК-білок переходити з ядра в цитоплазму, а регуляторних білків переміщатися у зворотному напрямку, з цитоплазми в ядро. Біохімічні дані про ядерну оболонці вельми нечисленні.

Ендоплазматичний ретикулум. Це складна сітка цістернообразних або трубчастих структур, яка займає значну частину внутрішнього обсягу звичайної тваринної клітини. Основна роль ЕР полягає в тому, що він служить місцем біосинтезу білків, які потім секретуються, включаються в лізосоми або в плазматичну мембрану. Потенційно небезпечні для клітини гідролітичні ферменти, які повинні секретуватися або накопичуватися в лізосомах, піддаються в ЕР процесингу до зрілої форми. З ЕР часто бувають пов'язані рибосоми, в результаті чого на електронних мікрофотографіях він виглядає шорстким. Складні процеси, в ході яких здійснюється синтез білків, їх перетворення у зрілу форму і спрямована доставка до місця призначення, описані в гл.10.

Області ЕР, що не містять рибосом, називаються гладким ЕР. Тут здійснюється біосинтез стеролів, протікають реакції детоксикації і відбувається десатурація жирних кислот. и Р450. Всі ці процеси входять в складну, узгоджену систему транспорту електронів, що здійснюється за участю цитохромів bs і Р450.

Апарат Гольджі. Ця органела складається з мережі сплощені мішків, зібраних в стопки. Основна його функція полягає в посттрансляційної модифікації глікопротеїнів, синтезованих в ЕПР і призначених для секреції, включення в плазматичну мембрану або доставки в лізосоми. Ці органели містять глікозідази і глікозилтрансферази, які вступають в дію послідовно, у міру того як білок, що піддається процесингу, переміщається від початку апарату Гольджі до його кінця. Фактично апарат Гольджі складається із сукупності окремих мембран, що цистерни. Ці мембрани, які можна виділити, характеризуються певним набором ферментів. Механізми транспорту мембран і секретується білків через апарат Гольджі розглянуті в гл.10.

Лізосоми. Ці органели відповідальні за деградацію макромолекул і містять ряд гідролітичних ферментів, таких, як протеази і ліпази. Речовини, захоплені клітиною шляхом ендо-або фагоцитозу, які необхідно розщепити, доставляються в лізосоми за допомогою везикул. У лізосомах відбувається також розщеплення клітинних компонентів у ході їх звичайного кругообігу. Як здійснюються синтез лізосомних ферментів, їх маркування для доставки в лізосоми і подальший транспорт - вивчено досить добре. Ці процеси розглядаються в гл.10.

Пероксисоми. Ці органели містять окисні ферменти, які беруть участь у деградації малих молекул, таких, як амінокислоти, ксантин і, особливо, жирні кислоти. Їх назва пов'язана з присутністю в них каталази, яка розкладає перекису, які утворюються як побічні продукти при реакціях окислення.

Мітохондрії. или сукцинат, образуется АТР. У цих органелах здійснюється окисне фосфорилювання, внаслідок чого в ході окислення субстратів, таких, як NADH або сукцинат, утворюється АТР. Мітохондрії утворені двома мембранами, розділеними деяким проміжком. Внутрішня область мітохондрій називається матриксом. Внутрішня мембрана утворює складки у вигляді перегородок, званих кристами, і містить ферменти, які беруть участь у транспорті електронів і синтезі АТР. У гл.6 обговорюються роль дифузії в площині мембрани компонентів ланцюга електронного транспорту і її функціональне значення. Питання, пов'язані з синтезом білків мітохондрій, який відбувається в цитоплазмі, і з їх доставкою в один з мітохондріальних компартментов або в одну з мембран, розглядаються в гл.10.

Хлоропласти. Це органели, що містять фотосинтетичний апарат. Вони мають зовнішню оболонку, утворену двома мембранами, і внутрішню область - строму. У стромі знаходяться тилакоїдних мембрани, де локалізовано компоненти системи фотосинтезу. На окремих ділянках тилакоїдних мембрани щільно упаковані в стопки, а на інших звернені безпосередньо до стромі. Склад плотноупакованной і звернених у строму доменів тилакоїдних мембрани різний, що вказує на латеральну гетерогенність цієї мембрани. Ензимологія фотосинтезуючої ланцюга електронного транспорту обговорюється в разд.6.6.

Слід підкреслити, що при вивченні кожної з мембран, згаданих вище, а також і інших спеціалізованих мембран з клітин тварин, рослин чи бактерій виникає цілий комплекс важливих і цікавих питань, які потребують свого вирішення, і відкриваються широкі можливості для біохімічних досліджень. Інші мембранні системи, що представляють інтерес в цьому відношенні, будуть описані в наступних розділах книги.

2. Історичний нарис

Той факт, що плазматична мембрана, що оточує клітини, являє собою цілком певну структуру, був усвідомлений у середині XIX століття.

Під кінець цього століття Овертон звернув увагу на кореляцію між швидкістю, з якою невеликі молекули проникають у рослинні клітини, і їх коефіцієнтом розподілу між маслом і водою; це привело його до думки про ліпідної природі мембран. У 1925 р. Гортер і Грендель припустили, що ліпіди в мембрані еритроцитів утворюють біомолекулярних шар. Ця ідея виникла на основі результатів елегантного і простого експерименту.

Ліпіди еритроцитів екстрагували ацетоном і потім у кюветі Ленгмюра отримували з них тонку плівку на поверхні води.

За допомогою поплавця стискали шар ліпідних молекул на межі поділу вода-повітря до тих пір, поки цей шар не починав чинити опір подальшому стиску; це явище було пояснено утворенням плотноупакованной мономолекулярної ліпідної плівки. Вимірювання площі, займаної ліпідами, та порівняння її з площею поверхні еритроцитів, з яких ці ліпіди були екстрагувати, дали співвідношення 2:

1. Звідси був зроблений висновок, що мембрана еритроцитів складається з ліпідних молекул, розташованих у два шари.

Мабуть, цей висновок Гортера і Грендель виявився правильним тільки завдяки взаємній компенсації помилок, проте в історичному плані ця робота мала велике значення, оскільки з тих пір концепція ліпідного бішару як структурної основи біологічних мембран стала домінуючою і на самому ділі виявилася вірною.

Концепція бімолекулярний ліпідної мембрани отримала подальший розвиток у запропонованій у 1935 р. моделі Девсона-Даніелла, або моделі "сендвіча", в якій передбачалося, що білки покривають поверхню ліпідного бішару. Це була надзвичайно вдала модель, і протягом наступних 30 років численні експериментальні дані, особливо отримані за допомогою дифракції рентгенівських променів та електронної мікроскопії, повністю підтвердили її адекватність. Однак тоді ж виявилося, що мембрани виконують величезну безліч функцій, і щоб пояснити цей феномен, вихідна модель Девсона-Даніелла неодноразово піддавалася модифікаціям.

Швидкий прогрес в мембранології, в результаті якого сформувалися сучасні уявлення, був досягнутий в значній мірі завдяки успіхам у вивченні властивостей мембранних білків. Електронно-мікроскопічні дослідження із застосуванням методу заморожування-сколювання показали, що в мембрани вбудовані глобулярні частинки. Тим часом біохімікам за допомогою детергентів вдалося диссоциировать мембрани до стану функціонально активних "часток". Дані спектральних досліджень вказували, що для мембранних білків характерний високий вміст а-спіралей і що вони, ймовірно, утворюють глобули, а не розподілені у вигляді моношару на поверхні ліпідного бішару. Неполярні властивості мембранних білків наводили на думку про наявність гідрофобних контактів між білками і внутрішньої неполярної областю ліпідного бішару. Тоді ж були розроблені методи, що дозволили виявити плинність ліпідного бішару. Сінгер і Ніколсон звели докупи всі ці ідеї, створивши рідинно-мозаїчну модель. У рамках цієї моделі мембрана представляється як текучий фосфоліпідний бішар, у який занурені вільно диффундирующие білки. Колишня модель Девсона-Даніелла була статичною і успішно пояснювала що були в той час структурні дані, отримані з досить низьким дозволом. У той же час починаючи з 1970 р. велика увага стала приділятися вивченню динамічних властивостей та їх взаємозв'язку з мембранними функціями. В останні роки рідинно-мозаїчна модель теж зазнала модифікації, і цей процес буде продовжуватися. Зокрема, тепер стало ясно, що не всі мембранні білки вільно дифундують в рідкому ліпідному бішарі. менов в самой мембране. Є дані про існування латеральних до-j менів в самій мембрані. Ретельно вивчається також роль цитоскелету. Стає дедалі очевиднішим, що деякі ділянки мембран, мабуть, відрізняються за своєю структурою від класичного ліпідного бішару. Проте в найближчому майбутньому рідинно-мозаїчна модель в її різних модифікаціях буде служити в якості концептуальної основи для багатьох мембранних досліджень.

3. Морфологія мембран

Важливу роль у з'ясуванні морфології мембран зіграли два методи: дифракція рентгенівських променів та електронна мікроскопія. Саме з їх допомогою була підтверджена правильність біслойную моделі. Проте слід мати на увазі, що при з'ясуванні детальної картини молекулярної організації мембран обидва цих методу стикаються з низкою обмежень.

3.1 Дифракція рентгенівських променів

При дослідженні високоупорядоченних кристалічних зразків за допомогою методу дифракції рентгенівських променів вдається отримати інформацію про структуру з високою роздільною здатністю. У разі ж малоупорядоченних препаратів можливості цього методу обмежені. Деякі спеціалізовані мембранні системи вже мають регулярну структуру, і тому їх можна вивчати рентгено-структурними методами. Прикладом такого роду є мієлінова оболонка периферичних нервових волокон; вона представляє собою мембрану, яка, багаторазово обертаючись навколо аксона, формує регулярну систему з концентричних мембранних структур. Дослідження дифракції рентгенівських променів на мієліну, проведені ще в 30-х рр.., Підтверджують адекватність біслойную моделі мембран. До такого ж висновку приводить і вивчення зовнішнього сегмента паличок сітківки хребетних, які являють собою природні впорядковані мембранні системи, а також штучно впорядкованих систем, які утворюються при коллапсірованіі в умовах центрифугування мембранних везикул, отриманих з мітохондрій та еритроцитів. У всіх цих випадках спостерігалося схожий розподіл електронної щільності в мембрані, показане на рис.1.4

Для інтерпретації рентгеноструктурних даних необхідно визначити не тільки інтенсивності рефлексів, а й їх фази. У разі регулярно упакованих мембранних систем завдання значно спрощується, оскільки ці системи складаються з повторюваних елементів з центральною симетрією.

Отримані дані показують, що структура всіх мембран схожа: вони мають гідрофобну внутрішню область з низькою електронної щільністю і два шари полярних угруповань з високою електронної щільністю. Рентгеноструктурні дані, отримані для різних мембран, різняться лише незначно, незважаючи на великі розходження в змісті в них білка. Хоча рентгеноструктурні дані дозволяють отримати деяку інформацію про те, як розташована в мембрані основна маса мембранних білків, в цілому метод рентгеноструктурного аналізу не дає детальної молекулярної картини.

Уілкінс і ін відзначили в 1971 р., що метод дифракції рентгенівських променів можна використовувати і для вивчення водних дисперсій мембран і фосфоліпідів. При цьому рефлекси, породжувані полярними областями на обох сторонах бішару, дозволяють знайти його товщину, рівну відстані між полярними голівками, а по рефлексам, породжуваним впорядкованими вуглеводневими ланцюгами, можна визначити відстань між цими ланцюгами. І в цьому випадку мембранні препарати, отримані з різних джерел, дали подібну дифракційну картину, що підтверджує універсальність біслойную моделі.

Неможливість отримання за допомогою методу дифракції детальної молекулярної картини обмежує застосування цього методу для вивчення біологічних мембран. Однак він може бути дуже корисний при дослідженні упорядкованих ліпідно-водних систем.

3.2 Електронна мікроскопія

Просвітчаста електронна мікроскопія тонких зрізів мієліну, а фактично і всіх інших мембран, виявляє характерну тришарову структуру, що складається з двох електроноплотних смуг, розділених проміжком близько 80 А. Така картина виходить значною мірою в результаті обробки препаратів четирехокісі осмію, звичайно застосовується в цьому методі. Робертсон назвав спостережувану структуру "унітарної", щоб підкреслити її універсальність, і хоча молекулярні механізми прокрашивания мембран осміем невідомі, ця структура розглядалася як підтвердження справедливості біслойную моделі мембрани. Ясно, однак, що при підготовці препаратів для просвічує електронної мікроскопії мембрани можуть піддаватися несприятливих впливів. Зокрема, відомо, що обробка четирехокісі осмію призводить до значної втрати білка з еритроцитарної мембрани. І хоча спостерігається при цьому тришарова структура в деякій мірі відображає організацію біслойних мембран, більш детальні відомості щодо локалізації білків цим методом отримати не вдається.

Деяку інформацію про розташування мембранних білків дали нові методи, що стали тепер вже "класичними", - методи заморожування-сколювання і заморожування-травлення. У цих випадках препарати швидко заморожують, не піддаючи їх при цьому яких-небудь ушкоджує впливів, як при одержанні тонких зрізів. Процес підготовки препарату включає наступні операції.

Після заморожування зразок, що представляє собою суспензію клітин або мембран, сколюють за допомогою ножа при низькій температурі в глибокому вакуумі. Виникаючі при деформуючих зусилля приводять до утворення зрізу, що проходить через зразок. Виявилося, що, коли площина зрізу проходить через мембрану, остання розколюється переважно за своєю серединної області і розщеплюється на дві половинки. У результаті на утворилися площинах відколу оголюється внутрішня область мембрани.

При необхідності зразок піддають травленню - проводять звичайну сублімацію льоду у вакуумі. Це дозволяє краще візуалізувати поверхневі структури клітинних мембран.

Після цього отримують так звану репліку з оголеної поверхні. Саме цю репліку і вивчають під електронним мікроскопом. Для отримання репліки спочатку напилюють на зразок платину під кутом близько 45 °, щоб виявити топологічні характеристики препарату. Потім платинової репліці надають механічну міцність, нанісши на неї шар вуглецю. Після цього препарат відтають, репліка спливає, і її виловлюють за допомогою спеціальної сіточки.

Найбільш характерні структури, які спостерігаються при вивченні мембран методом заморожування-сколювання, - це численні внутрімембранние частинки діаметром від 80 до 100 А, що лежать у площині мембранних сколів. Зазвичай вони розташовані хаотично, але іноді утворюють групи. Численні дослідження показали, що ці частинки, можливо, є мембранними білками. Цікаво, що при електронній мікроскопії тонких зрізів подібні структури не виявляються. Репліки, отримані від двох половинок розщепленої мембрани, не завжди бувають топологічно комплементарними. Це означає, що деякі частинки пов'язані тільки з однією з половин мембрани. Дані, отримані методом заморожування-сколювання, широко використовувалися Сінгером і Ніколсоном при створенні рідинно-мозаїчної моделі мембран, оскільки вони переконливо показували, що глобулярні білки перебувають не тільки на поверхні мембрани, але і всередині бішару.

На рис.1.6 наведена електронна мікрофотографія препарату протеоліпосом, реконструйованих з яєчного фосфатидилхоліну та нефракціонованого препарату білка смуги 3 з мембрани еритроцитів людини; препарат отриманий методом заморожування - сколювання.

Білок смуги 3 є основним білковим компонентом мембрани еритроцитів і, як відомо, здійснює перенесення аніонів. Якщо фосфоліпідних везикули не містять цього білка, то отримані препарати заморожених відколів мають гладку поверхню.

При вбудовуванні білка смуги 3 вфосфоліпідну везикули на відколах з'являються внутрімембранние частки, практично неможливо відрізнити від частинок, які спостерігаються в мембранах еритроцитів. Більш того, при рН 5,5 частинки, що спостерігаються в мембрані еритроцитів, агрегує, причому ця агрегація здійснюється в результаті взаємодії білка смуги 3 з двома іншими білками, спектрином і актином.

Останні є компонентами цитоскелету, що знаходяться на внутрішній поверхні еритроцитарної мембрани. Аналогічним чином поводиться і реконструйована система, що складається з білка смуги 3 та фосфатидилхоліну, при цьому агрегація частинок спостерігається у присутності спектрина і актину при рН 5,5, але не при рН 7,6.

Ці дані ще більше зміцнили уявлення про мембранних білках як про глобулярних частинках, вільно переміщаються в площині мембрани. Цікаво, що статичні мікрофотографії препаратів, отриманих методом заморожування-сколювання, допомогли дослідникам у вивченні динамічних властивостей мембран. Як ми побачимо, в мембранах є багато білків, які не можуть вільно плавати в "ліпідному море".

4. Виділення мембран

Протягом останніх трьох десятиліть ставало все більш очевидно, що величезна більшість клітинних функцій здійснюється за безпосередньої участі мембран.

І рослинні, і тварини клітини розділені на відсіки, причому багато цитоплазматичні органели, як було показано в разд.1.1, мають мембранну природу.

Крім органел, характерних для більшості клітин, є і спеціалізовані мембранні системи, такі, як саркоплазматический ретикулум м'язових клітин, мієлінова оболонка периферичних нервових волокон, тилакоїдних мембрани хлоропластів і мембрани дисків в паличках сітківки. У прокаріотів також є мембрани, хоча і не настільки розвинені, як у еукаріотичних.

, имеют лишь цитоплазматическую мембрану, а грамотрицательные, такие, как Escherichia coli , - еще и наружную, расположенную поверх тонкой пептидогликановой клеточной стенки. Грампозитивні бактерії, наприклад Bacillus subtilis, мають лише цитоплазматичну мембрану, а грамнегативні, такі, як Escherichia coli, - ще й зовнішню, розташовану поверх тонкої пептідоглікановой клітинної стінки.

У клітинах прокаріотів виявлено також деякі спеціалізовані органели. Деякі віруси, патогенні для тварин, наприклад віруси з оболонкою, мають справжнісіньку мембрану, причому такі мембрани виявилися надзвичайно цікавими для вивчення.

Дослідження мембран, як правило, пов'язане з їх очищенням, при цьому для кожного типу мембран характерні свої умови препаративного виділення.

Так, якщо має дослідити плазматичну мембрану будь-яких клітин, то спочатку необхідно виділити ці клітини з тканини. Потім потрібно підібрати оптимальні умови руйнування клітин та відділення мембран, що представляють інтерес, від інших клітинних компонентів. Особливої ​​уваги заслуговують критерії чистоти виділених мембран.

4.1 Руйнування клітин

Бажано вибирати таку методику, яка дозволяє ефективно зруйнувати самі клітини при збереженні структури мембран, що підлягають виділенню. Для багатьох тварин клітин можна використовувати таку відносно м'яку процедуру, як гомогенізація в гомогенизаторах Даунса або Поттера-Елвехейма зі скляними стінками і тефлоновим товкачиком. При цьому клітини руйнуються за рахунок зсувних зусиль, що виникають при продавлюванні суспензії через вузький зазор між тефлоновим товкачиком і скляною стінкою гомогенізатора. При такій обробці "зривається" плазматична мембрана і руйнуються зв'язки між різними органелами при збереженні цілісності самих органел. За допомогою такої процедури можна також відокремити один від одного спеціалізовані ділянки плазматичної мембрани, наприклад ба-золатеральную або апикальную області мембрани епітеліальних клітин. Бажано працювати в умовах, коли цілісність органел зберігається, щоб звести до мінімуму можливість вивільнення гідролітичних ферментів і полегшити наступні операції з розділення мембран.

Для руйнування клітин, що мають стінку, потрібні більш жорсткі методи. Іноді перед руйнуванням клітин їх спочатку обробляють ферментами, що розщеплюють компоненти клітинної стінки, щоб полегшити її подальше руйнування. используют обработку буфером трис-ЭДТА и лизоцимом. Так, наприклад, для руйнування клітин Є. coli використовують обробку буфером трис-ЕДТА і лізоцимом. Більш жорсткі прийоми передбачають розтирання клітин, обробку їх ультразвуком і екструзію. Розтирання зазвичай проводять в присутності різних абразивних матеріалів - піску, окису алюмінію або скляних кульок. Малі обсяги матеріалу можна розтирати в ступці з допомогою маточки, але для великих обсягів слід використовувати спеціальні механічні пристосування. Бактеріальні клітини часто руйнують за допомогою ультразвуку. Вважають, що в цьому випадку руйнування відбувається під дією зсувних зусиль, що виникають у результаті кавітації. Такі ж зусилля виникають при продавлюванні суспензії клітин через невеликий отвір, наприклад при руйнуванні клітин за допомогою преса Френча. Існує багато різновидів перерахованих методів, і їхній вибір залежить від особливостей тієї мембранної системи, яка підлягає вивченню.

Слід зазначити, що одержувані при руйнуванні клітин мембранні фрагменти зазвичай спонтанно утворюють везикули. Як приклад можна навести:

1) мікросоми, одержувані з плазматичної мембрани, ендоплазматичного ретикулума або спеціалізованих систем, таких, як саркоплазматичний мембрана;

2) субмітохондріальние частки з внутрішньої мітохондріальної мембрани;

3) сінаптосоми, які утворюються при відриві нервових закінчень в області синаптичних контактів;

. 4) бактеріальні мембранні везикули, які утворюються з плазматичної мембрани Є. coli. Везикули утворюються і з інших мембранних систем, наприклад з мембран апарату Гольджі. Їх розмір в більшості випадків сильно залежить від методу руйнування клітин. Це особливо важливо, оскільки розміри везикул в значній мірі визначають швидкість їх седиментації при центрифугуванні та їх поведінка на наступних стадіях очищення мембран. Деякі мембрани не утворюють везикул, зокрема мембрани бічних поверхонь стичних один з одним тварин клітин. При руйнуванні таких клітин відбувається відрив пари суміжних мембранних фрагментів, утримує разом областю контакту. Наявність таких контактів запобігає замикання фрагментів у везикули, тому мембрани виділяються у вигляді пластин або лентообразние структур.

Велике значення при руйнуванні клітин має також правильний вибір середовища. Наприклад, щоб зберегти замкнутість мембранних органел, слід використовувати таке середовище, яке ізоосмотічна їх внутрішнього вмісту. Найчастіше для цього використовують розчин сахарози в концентрації 0,25-0,30 М. У ряді випадків краще використовувати сорбітол і манітол. Слід зазначити, що збереження ізотонічності грає важливу роль і на подальших стадіях препаративного виділення інтактних органел.

4.2 Поділ мембран

В даний час для поділу мембран найчастіше застосовують центрифугування. Мембранні частинки можна розділити по швидкості їх седиментації або за плавучої щільності. , а второй - изопикническим центрифугированием, и разделение происходит в условиях равновесной плотности. Перший метод називається зональним центрифугуванням, і поділ відбувається у відповідності зі значеннями S, а другий - ізопікніческім центрифугуванням, і поділ відбувається в умовах рівноважної щільності. На практиці звичайно застосовують якийсь гібрид цих двох методів. - g ". На ріс.1.7 показано становище деяких субклітинних одиниць на коордінантной площині "S - g".

По осі абсцис відкладені коефіцієнти седиментації частинок, а по осі ординат - щільність.

для разных фракций. Принцип поділу за швидкості седиментації можна легко усвідомити, порівнявши значення S для різних фракцій. , т.е. Наприклад, ядра мають відносно високі значення S, тобто швидкість їх седиментації значно вище, ніж у більшості інших субклітинних органел. Ядра можна вибірково осадити центрифугуванням клітинного гомогенату, при цьому всі інші органели залишаться в надосадової рідини. У той же час гладкий і шорсткий ендоплазматичний ретикулум не вдається розділити з допомогою зонального центрифугування.

Для виділення різних мембранних фракцій з клітинного гомогенату часто використовують відмінності в їх щільності. З цією метою проводять центрифугування в градієнті щільності. Частіше за все для створення градієнта щільності використовують сахарозу, однак цей метод має серйозні недоліки. Щоб отримати щільність, необхідну для розділення різних мембранних фракцій, необхідно готувати розчини з високою концентрацією сахарози, які володіють високою в'язкістю і до того ж є гіпертонічно. Внесення субклітинних органел у гіпертонічно розчин сахарози призводить до їх дегідратації, а подальше доведення розчину до ізотонічних умов часто супроводжується лізисом і пошкодженням органел. Інша проблема полягає в тому, що багато мембранні органели проникні для сахарози. Це також може призвести до осмотичного руйнування органел. Проникнення сахарози в колективні мембранні органели може змінити їх ефективну щільність.

Таблиця 1.1. Фізичні часом все частіше використовують інші середовища для створення градієнта щільності. Деякі з цих середовищ перераховані в табл.1.1

Щоб вирішити ці проблеми, останнім властивості градієнтних середовищ.

1. Фіколл. Високомолекулярний гідрофільний полімер сахарози, який можна використовувати для отримання розчинів С'Плотностью аж до 1,2 г / мл. Основна його перевага полягає в низькому осмотическом тиску розчинів у порівнянні з розчинами з еквівалентною концентрацією сахарози. Завдяки цьому можна створювати розчини, ізотонічние у всьому діапазоні концентрацій завдяки додатковому включенню в середу сахарози або прийнятних з фізіологічної точки зору солей. Недоліками є висока в'язкість одержуваних розчинів і суттєво нелінійна залежність в'язкості і осмолярності від концентрації.

2. Метрізамід. Трііодзамещенний бензамида глюкози Розчини метрізаміда мають велику щільність, ніж растори фіколл при тих же концентраціях. Основною перевагою розчинів метрізаміда є їх дуже низька в'язкість, що дозволяє прискорити разделеніе.35%-ний розчин метрізаміда має майже фізіологічну осмолярність, так що більшу частину операцій в ході поділу мембран можна проводити, не піддаючи їх дії гіпертонічно розчинів. Метрізоат натрію - родинне метрізаміду з'єднання з близькими властивостями, з тією лише відмінністю, що його розчин є ізотонічним при концентрації близько 20%. Метрізоат натрію ис-товують перш за все для виділення інтактних клітин. Найкоденз також є похідним трііодбензойной кислоти, але має три гідрофільні бічні ланцюги. При центрифугуванні він швидко утворює свій власний градієнт щільності; використовується для виділення субклітинних органел.

Перколл. Колоїдна суспензія силікагелю, часточки якого вкриті полівінілпіролідоном. Це покриття послаблює токсичний вплив силікагелю. Основною перевагою перколла є те, що він не проникає через біологічні мембрани, а його розчини мають низьку в'язкість і низьку осмолярність. Внаслідок великого розміру часток центрифугування розчину перколла при помірних швидкостях призводить до формування градієнта щільності. Тому поділ зазвичай відбувається дуже швидко. Середа, використовувана для центрифугування, може бути ізотонічной по всьому об'єму завдяки включенню в неї солей або сахарози. Не складає праці створити пологий градієнт, що дозволяє проводити дуже ефективне розділення мембранних фракцій з їх плавучої щільності.

Сорбітол і манітол. Ці речовини іноді використовують замість сахарози, оскільки вони, судячи з опублікованими даними, проникають через деякі біологічні мембрани гірше, ніж сахароза.

Зауважимо, що гліцерин не використовується для створення градієнта щільності, оскільки з його допомогою не вдається досягти досить високих значень щільності. , используют только тогда, когда необходимы растворы с высокой плотностью. Солі лужних металів, наприклад CsCl, використовують тільки тоді, коли необхідні розчини з високою щільністю. Але при цьому слід мати на увазі, що в концентраціях, необхідних для створення рівноважної щільності, ці солі часто надають шкідливу дію на мембранні органели.

Для виділення мембран з клітинних гомогенатов використовуються і інші методи, хоча і не так часто, як центрифугування.

1. Фазовий розподіл. У цьому випадку поділ мембранних частинок відбувається відповідно до їх поверхневими властивостями. З цією метою формують два змішуються шару водних розчинів різних водорозчинних полімерів. Як приклад можна навести суміші поліетіленглікольдекстран і декстранфіколл. Мембранні частинки поділяються відповідно до їх спорідненістю до цих фаз. Останні можна підбирати так, щоб розділяти мембрани по їх поверхневого заряду або гідрофобності.

Безперервний електрофорез у вільному потоці. У цьому випадку поділ часток відбувається відповідно до їх електричним зарядом. Розділяється препарат безперервно вводять в тонкий шар буфера, який стікає по вертикальній стінці. При цьому перпендикулярно напрямку потоку прикладають електричне поле. Таким чином, електрофоретичного розділення частинок відбувається упоперек стікає буфера, який збирається на дні камери у вигляді окремих фракцій.

Афінна адсорбція. Поділ грунтується на біоспеціфіческом взаємодії між мембранними компонентами і твердою фазою. З відкриттям моноклональних антитіл з'явилася можливість створення препаративних методик, заснованих на використанні специфічних антигенних компонентів для виділення мембран. Отримані антитіла можна ковалентно приєднувати до твердого носію і з їх допомогою здійснювати специфічне зв'язування відповідних мембран. Найчастіше цей метод використовується для виділення мембранних білків. Одна з виникаючих тут проблем пов'язана з підбором таких умов елюювання мембран, які не викликали б денатурації білків.

Метод, заснований на використанні мікрогранул силікагелю. Зазвичай на частку плазматичних мембран припадає не більше 1 ° 7о загальної маси всіх мембран еукаріотичних клітин. Тому виділення абсолютно чистих плазматичних мембран пов'язане з великими труднощами. Один із підходів, який розроблений спеціально для виділення плазматичних мембран, заснований на використанні катіонізованих мікрогранул селикагель. Ці гранули міцно адсорбуються на зовнішній поверхні плазматичної мембрани інтактних клітин, і фракція плазматичних мембран, пов'язаних з гранулами, легко відділяється у градієнті щільності сахарози від інших мембран за рахунок більш високої щільності гранул. Особливістю цього методу є те, що в одержуваному препараті плазматична мембрана своєю внутрішньою поверхнею звернена в розчин.

4.3 Критерії чистоти мембранних фракцій

Мабуть, найбільш об'єктивним критерієм чистоти виділеної мембранної фракції є присутність в ній будь-яких унікального компонента, який міститься тільки в цій мембрані або є в ній переважаючим. Зазвичай такими компонентами служать ферменти, які в даному випадку називають маркерами. Список маркерних ферментів, які використовуються для контролю чистоти мембранних фракцій, наведено в табл.1.2 При визначенні активності ферменту слід брати до уваги, що він може знаходитися в латентній формі, наприклад завдяки тому, що локалізується на внутрішній поверхні виділяються мембранних везикул. Інші проблеми, пов'язані з оцінкою чистоти виділених мембран, розглянуті в огляді. Слід зазначити, що рекомендовані методи в більшості випадків досить добре відпрацьовані і стандартизовані.

У ряді випадків більш зручними мембранними маркерами є не ферменти, а специфічні рецептори лектинів, гормонів, токсинів або антитіл. Якщо досліджувані системи добре охарактеризовані, то про чистоту мембранної фракції можна судити з її білковим складом, який визначається за допомогою електрофорезу в поліак-ріламідном гелі в присутності додецилсульфату натрію. Наприклад, зовнішня мембрана грамнегативних бактерій має характерний набір поліпептидів, яких немає в цитоплазматичній мембрані.

Таблиця 1.2 Маркери, використовувані для контролю чистоти мембранних фракцій, що виділяються з клітин ссавців "

До іншими критеріями, за якими можна судити про чистоту мембран, належать їх морфологія, що виявляється за допомогою електронної мікроскопії, і особливості хімічного складу. Наприклад, фракції, що представляють плазматичну мембрану, апарат Гольджі або мітохондрії, можна ідентифікувати за її морфології. У деяких випадках препарат характеризують за вмістом у ньому холестерину. Наприклад, в мембранах мітохондрії міститься набагато менше холестерину, ніж у мембранах апарату Гольджі і плазматичних мембранах.