Стафілококи Виявлення резистентності до метициліну та інших b-лактамних антибіотиків методом скринінгу

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Кафедра клінічної фармакології та антимікробної хіміотерапії Смоленської державної медичної академії


Контактна адреса: Дехніч Андрій Володимирович

214019, Смоленськ, а / я 5, Факс: (0812) 61-12-94

andrei@microbiology.ru


УДК 615.33.015.8.07


Виявлення резистентності до метициліну та інших b-лактамних антибіотиків методом скринінгу


З моменту появи в 70-х роках метіціллінорезістентних стафілококи і перш за все метіціллінорезістентних штами Staphylococcus aureus (MRSA) є одними з провідних збудників нозокоміальних інфекцій. Частота MRSA у структурі стафілококових інфекцій в останні роки різко зросла у всьому світі, наприклад, в США з 2% в 1975 р. до 35% в 1996 р.

Резистентність стафілококів до оксациліну (метициліну) може бути зумовлена ​​трьома основними механізмами:

  • продукцією додаткового пеніцилін білка (ПСБ) - ПСБ-2а (ферменту, який бере участь у синтезі клітинної стінки), кодованого хромосомальних геном mecА - класична, або істинна резистентність до метициліну (оксациліну);

  • інактивацію внаслідок гіперпродукції бета лактамаз;

  • модифікацію нормальних ПСБ.


З клінічної точки зору, важливо диференціювати штами з класичної (mecА-обумовленої) резистентністю від штамів з двома іншими редковстречающіміся механізмами резистентності, які зумовлюють низький або прикордонний рівень стійкості. Це пов'язано з тим, що при інфекціях, викликаних штамами з mecA-обумовленої резистентністю, терапія бета-лактамними антибіотиками (пеніцилінами, цефалоспоринами, карбапенемамі) буде неефективна.

Крім того, ці штами часто бувають резистентні практично до всіх інших класів антибіотиків за винятком глікопептидів (ванкоміцин, тейкопланін). Фенотипічні характеристики, які можуть допомогти диференціювати три перерахованих механізму резистентності, викладені в таблиці.


ТИПИ резистентні до метициліну (оксациліну) у стафілококів


Штами з класичним типом резистентності можуть у свою чергу бути гомо-або гетерогенними за типом експресії стійкості. При гомогенному типі експресії практично всі мікробні клітини виявляють резистентність в стандартних in vitro тестах, в той час як при гетерогенному типі тільки невелика частина клітин проявляє резистентність фенотипічно. Нерідко лише 1 з 10-100 млн клітин в популяції з наявністю гена mecА експресують резистентність, що обумовлює одержання прикордонних результатів при визначенні чутливості до оксациліну (МПК - 2-8 мг / л). Резистентність, обумовлена ​​гіперпродукцією b-лактамаз і мутацією нормальних ПСБ, також приводить до отримання прикордонних значень МПК. Проте резистентність до оксациліну, обумовлена ​​гіперпродукцією b-лактамаз, легко відрізняється від класичної резистентності за її оборотності при використанні інгібіторів b-лактамаз.

На відміну від штамів з класичною резистентністю гіперпродуценти b-лактамаз і штами з мутаціями нормальних ПСБ зазвичай не мають множинної резистентності до інших антибіотиків.

Наявність класичної резистентності найбільш легко визначити методом скринінгу, так як зростання мікробних клітин з некласичними типами резистентності зазвичай ингибируются.

Для визначення чутливості використовується оксацилін зважаючи на його більш високої стабільності при зберіганні в порівнянні з метициліну.


ПРИНЦИП

Для ідентифікації резистентності до оксациліну (метициліну) у стафілококів необхідне дотримання наступних умов:

  • додавання 4% NaCl в агар з оксациліном (pH 7,2-7,4, тому що при більш низькому pH збільшується число помилково негативні результати);

  • температура інкубації 35 o С;

  • тривалість інкубації 24 годин для S.aureus і 48 год - для коагулазоотріцательних стафілококів;

  • стандартизоване число мікроорганізмів.


МІКРООРГАНІЗМИ

Чистий культура Staphylococcus spp., Інкубувати протягом 18-24 год на кров'яному агарі.


МАТЕРІАЛИ

  1. Агар Мюллера-Хінтон з додаванням 4% NaCl (4 г на 100 мл середовища) та 6 мг / л оксациліну (0,6 мг на 100 мл середовища). Агар Мюллера-Хінтон зберігається при температурі 2-8oС, готується згідно прописи на етикетці, 4% NaCl додається до автоклавування.

  2. Субстанція оксациліну з відомою активністю попередньо розчиняється у стерильній дистильованій воді (розрахунок концентрації оксациліну проводять з урахуванням його активності) і додається в охолоджений на водяній бані до 48-50oС агар Мюллера-Хінтон. Приготований агар розливається по чашках з товщиною шару 3-4 мм (на чашку діаметром 100 мм - 25 мл). Готові чашки з середовищем зберігаються в пластикових пакетах при температурі 4-8oС не більше 5 діб.

  3. Для контролю зростання необхідно також приготувати чашки з агаром, що містить 4% NaCl, але без антибіотика.

  4. Кров'яний агар з чистою культурою стафілокока, інкубувати протягом 18 -24 год

  5. Стерильний фізіологічний розчин.

  6. Стандарт мутності 0,5 за Мак-Фарланду.

  7. Стерильні тампони або микропипетка (10 мкл).

  8. Термостат з температурою інкубування 35 o С.


КОНТРОЛЬ ЯКОСТІ


Дослідження проводять при обов'язковому контролі зростання досліджуваних культур на агарі Мюллера-Хінтон з 4% NaCl без оксациліну (культуру наносять так само, як на агар з оксациліном).

Контрольні штами:

S.aureus ATCC 38591 - резистентний;

S.aureus ATCC 29213 - чутливий.


ПОСТАНОВКА ТЕСТУ


Приготування інокулюму. Бактеріальну суспензію стафілокока готують з декількох колоній з однаковою морфологією на стерильному фізіологічному розчині (3 мл) і доводять до каламутності 0,5 за Мак-Фарланду (1,5 · 108 КУО / мл).


Інокуляція. Метод I (мікропіпеткою):

  1. приготувати розведення 1:100 стандартного інокулюму 0,5 за Мак-Фарланду для отримання бактеріальної суспензії, що містить 1,5 · 106 КУО / мл (наприклад, додати 0,1 мл стандартної суспензії до 9,9 мл стерильного фізіологічного розчину);

  2. за допомогою мікропіпетки нанести краплю (10 мкл) розведеною стандартної суспензії на поверхню агару з оксаціл лином.


Метод II (за допомогою тампона):

  1. занурити стерильний ватний тампон у пробірку зі стандартизованою суспензією (0,5 за Мак-Фарланду), потім віджати надлишок вологи об стінку пробірки;

  2. торкнутися тампоном поверхні агару з оксациліном.


ІНКУБАЦІЯ. Штами S.aureus инкубируются при температурі 35oС протягом повних 24 год, а коагулазо (-) стафілококів - протягом 48 ч.

Примітка. Середа АГВ не може бути рекомендована для постановки тесту в зв'язку з високою частотою хибнопозитивних результатів.


ОБЛІК РЕЗУЛЬТАТУ


Інтерпретація:

  • поява видимого росту більше 1 колонії на місці нанесення культури означає стійкість даного штаму до оксациліну (метициліну);

  • при відсутності росту на місці нанесення культури досліджуваний штам враховується як чутливий до метициліну (оксациліну).

  • при сумнівних результатах, а також для штамів, виділених у хворих з клінічно неефективною терапією і у хворих з серйозними інфекціями, необхідно провести розгорнуте дослідження з визначенням МПК до оксациліну і гена mecA.


Подання результату:


  • S.aureus або коагулазо (-) стафілокок (S.epidermidis), чутливий до метициліну (оксациліну);

  • S.aureus або коагулазо (-) стафілокок (S.epidermidis), резистентний до метициліну (MRSA або MRSE).


Метициліну (оксациліну) резистентні стафілококи повинні розцінюватися як резистентні до всіх b-лактамів - пеніцилінів, цефалоспоринів, карбапенемам, комбінаціям пеніцилінів з інгібіторами b-лактамаз. Крім того, серед метіціллінорезістентних стафілококів дуже часто спостерігається асоційована резистентність до інших антибіотиків - аміноглікозидів, макролідів, хінолонів, тетрациклінів.


ОБМЕЖЕННЯ МЕТОДУ


  1. Скринінг на агарі з оксациліном призначений для фенотипического визначення штамів, що мають ген mecA. Однак штами з іншими типами резистентності іноді можуть давати хибнопозитивний результат.

  2. Метод скринінгу для виявлення резистентності до оксациліну (метициліну) менш надійний у коагулазо (-) стафілококів, ніж у S.aureus.

Примітка. Оксацилін в порівнянні з метициліну менш стабільний до дії стафілококових b-лактамаз, що може призвести до отримання більшої кількості хибнопозитивних результатів, ніж при використанні метициллина. У той же час метицилін в порівнянні з оксациліном значно менш стабільний при зберіганні, що й обмежує його застосування.


ВАНКОМІЦІНОРЕЗІСТЕНТНИЙ Staphylococcus aureus


Про можливість появи ванкоміцінорезістентних штамів S.aureus стали замислюватися близько 10 років тому після спільнота ний про появу резистентності до ванкоміцину у ентерококів.


Перше повідомлення про виділення метіціллінорезістентних S.aureus зі зниженою чутливістю до ванкоміцину (МПК 8 мг / л) з клінічного матеріалу з'явилося в 1996 р.


Незважаючи на значення МПК до ванкоміцину, відповідне діапазону помірної резистентності, даний штам був зареєстрований як VRSA (ванкоміцінорезістентний S.aureus) через клінічної неефективності ванкоміцину. У цього штаму не було знайдено жодного з раніше відомих механізмів резистентності до ванкоміцину; відзначено тільки збільшення товщини клітинної стінки і концентрації пеніцилін-зв'язуючих білків 2 і 2а.


Далі одне за одним пішли повідомлення про виділення з клінічного матеріалу штамів S.aureus з МПК до ванкоміцину 8 мг / л, позначених як VISA (S.aureus зі зниженою чутливістю до ванкоміцину).


У результаті поглибленого дослідження ванкоміцінорезістентності у MRSA при скринінгу більш ніж 2000 штамів з різних стаціонарів було виявлено від 1 до 25% (!) Штамів з гетерогенною (індуцибельної) резистентністю до ванкоміцину, експресують її з частотою близько 1 клітки на 1 млн. Такі штами можуть бути предше ственнікамі VRSA.


Фахівці поки не прийшли до згоди, який термін використовувати: VRSA або VISA. Це пов'язано з тим, що, незважаючи на значення МПК, відповідні діапазону помірної резистентності, в наявності клінічна неефективність ванкоміцину при терапії VRSA-і VISA-інфекцій.


Багато фахівців пропонують свої методи скринінгу ванкоміцінорезістентності у стафілококів. Однак загальноприйняті стандарти ще не розроблені.


Таким чином, надзвичайно важливою є розробка методів лабораторної діагностики та моніторингу ванкоміцінорезістентності, особливо у пацієнтів, які отримують або отримували ванкоміцин / тейкопланін, і при неефективності цієї терапії.


Слід розробити методики контролю за VRSA-інфекціями. Для попередження розповсюдження VRSA необхідно ізолювати хворих і носіїв S.aureus. Крім того, застосування антибіотиків має передбачати зниження числа необгрунтованих призначень ванкоміцину.


У Росії поки не описано жодного штаму S.aureus зі зниженою чутливістю до ванкоміцину. Найімовірніше це пов'язано з рідкісним використанням ванкоміцину в клінічній практиці.

Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Медицина | Реферат
21.5кб. | скачати


Схожі роботи:
Розвязання задач графічним методом методом потенціалів методом множників Лангранжа та симплекс-методом
Стафілококи
Визначення рівня природної резистентності та оцінці імунного статусу риб
Використання тестової панелі GastroPanel при скринінгу діагностиці і профілактиці ряду захворювань
Стафілококи Стафілококкагар - суха живильне середовище для виділення стафілококів
Розвязання рівнянь методом оберненої матриці та методом Гауса
Виробництво антибіотиків
Лікарські форми антибіотиків
Застосування антибіотиків у хірургії
© Усі права захищені
написати до нас