Способи отримання ферментів

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Зміст

Введення

1. Осадження

1.1 Висалювання

1.2 Зміна температури і рН

1.3 Осадження органічними розчинниками

2. Коагуляція і флокуляція2.1 Цілісні клітини

2.2 Залишки клітин і білки

3. Центрифугування

3.1 Сігма-аналіз

3.2 Центрифуги з роторами трубчастого типу

3.3 Багатокамерні центрифуги

4. Хроматографія

4.1 Адсорбція

4.2 Сорбція-десорбція

5. Електрофорез і центрифугування

5.1 Електрофорез

5.2 Зональна ультрацентрифугирование

6. Оздоблювальні операції

6.1 Знесолення

6.2 Концентрування

6.3 Сушіння

7. Біологічна безпека при промисловому виробництві

7.1 Заходи безпеки

7.2 Контроль навколишнього середовища

7.3 Навчання персоналу та медичний захист

7.4 Обробка відходів

7.5 Безпека і нешкідливість продукту

8. Резюме по процесах виділення

8.1 Виділення позаклітинних ферментів

8.2 Виділення внутрішньоклітинних ферментів

8.3 Безперервне виділення ферментів

8.4 Одночасне виділення позаклітинних і внутрішньоклітинних ферментів

Список використаних джерел

Введення

Екстракти ферментів знаходили своє застосування, ймовірно, ще до того, як стала записуватися історія. Одним із прикладів подібного застосування є соложеніе ячменю та використання отриманого екстракту для розрідження крохмалю. показали, что агент, ответственный за разжижение крахмала, который они назвали диастазой, подвергался разрушению под воздействием кипячения, действовал как катализатор и мог быть сконцентрирован и очищен путем осаждения спиртом. У 1883 р. Рауеп і Persoz показали, що агент, відповідальний за розрідження крохмалю, який вони назвали діастазою, піддавався руйнуванню під впливом кип'ятіння, діяв як каталізатор і міг бути сконцентрований і очищений шляхом осадження спиртом. ввел термин «фермент». Blurnenthal в 1885 г. описал один из первых крупномасштабных процессов экстракции и очистки ферментов применительно к сычужному ферментов. У 1878 р. для найменування подібних агентів Kuhn ввів термін «фермент». Blurnenthal в 1885 р. описав один з перших великомасштабних процесів екстракції і очищення ферментів стосовно сичужний фермент. , Low и Korschun предложили применение бактериальных ферментов в клинической практике. Ще в 1902 р. Emmerich, Low і Korschun запропонували застосування бактеріальних ферментів в клінічній практиці. сообщил о стабилизации солодовой диастазы с помощью сульфата кальция, а в 1915 г. Rohm установил, что белье, подвергаемое стирке, может быть доведено до нужной степени чистоты более легко и при более низкой температуре воды, если его предварительно обработать липазами и протеазами. У 1908 р. Wallenstein повідомив про стабілізацію солодовою діастази за допомогою сульфату кальцію, а в 1915 р. Rohm встановив, що білизна, подвергаемое пранні, може бути доведена до потрібного ступеня чистоти легше і при більш низькій температурі води, якщо його попередньо обробити липазами і протеазами. в кристаллическом виде и была показана его белковая природа. У 1926 р. вперше, фермент уреаза був отриманий Sumner в ​​кристалічному вигляді і була показана його білкова природа. До 1930 року було охарактеризовано близько 80 ферментів, до 1947 р. - приблизно 200, а до 1968 р. - понад 1300. Більшість з відомих ферментів піддавалося виділенню лише кілька разів "і то в незначних кількостях.

Майже всі ферменти, що виділяються в даний час у промислових масштабах, відносяться до позаклітинним, тобто до таких, які виділяються клітинами в навколишнє середовище. Виділення таких ферментів простіше, ніж внутрішньоклітинних. Цільові ферменти, які знаходяться всередині мікробних клітин, не тільки мають властивості, які дуже схожі на властивості багатьох інших внутрішньоклітинних ферментів, але також сильно забруднені різними контоменантами. У багатьох мікроорганізмів внутрішньоклітинні ферменти захищені виключно щільною оболонкою. Однак, незважаючи на це, за останні роки кілька внутрішньоклітинних ферментів почали вироблятися в промислових масштабах. До них, зокрема, відносяться глюкозооксидаза для консервації харчових продуктів, пенициллинацилазой для перетворення антибіотиків і аспарагиназа для можливої ​​терапії ракових захворювань. Хоча процеси виділення внутрішньоклітинних та позаклітинних ферментів суттєво відрізняються один від одного, багато із застосовуваних для цього операцій є загальними. Слід зробити особливий акцент на зазначеній спільності, оскільки саме в цьому напрямку вбачаються найбільші надії на те, що в майбутньому значно більше ферментів стане проводитися промисловістю на одних і тих же технологічних лініях.

Переважна більшість вживаних в даний час ферментів відноситься до внутрішньоклітинним. До тих пір, поки не будуть знайдені штами мікроорганізмів, здатні до виділення таких ферментів у культуральну рідину, головна роль у прогресі виробництва ферментів буде належати технологічної стадії виділення їх з клітин. Є підстави вважати, що в найближче десятиліття багато хто з відомих ферментів зможуть виділятися з мікробних клітин вже в промислових масштабах, що створить стимул для реалізації на практиці ряду процесів біосинтезу та біотрансформації в реакторах з ізольованими біокаталізаторами-ферментами.

1. Осадження

Процес при якому додавання деяких реагентів або зміна умов викликає вихід білка з розчину з утворенням осаду нерозчинних частинок називається преципітацією, або осадженням. У ферментології цей термін не має того специфічного супутнього значення, яке характерно для загальної хімії, де він означає хімічне зв'язування за рахунок обміну зв'язками-містками. Справді, коло методів осадження ферментів надзвичайно широкий. Ці методи простягаються від додавання нейтральних солей і спиртів або зміни рН до специфічного хімічного дії іонів металів і органічних реагентів.

1.1 Висалювання

Терміном «висолювання» називають осадження білків при високій концентрації нейтральних солей. Цей метод є одним з найстаріших і найбільш широко застосовуваних 'при виділенні або фракціонуванні білків. Серед застосовуваних солей перевага віддається сульфату амонію, так як він досить дешевий і має високу розчинність навіть при знижених температурах. При зберіганні сульфат амонію виявляє тенденцію до закислению, а при підвищених значеннях рН - до виділення аміаку. Оскільки сульфат амонію у вищій мірі корозійно здатний щодо металів і бетону серйозну проблему становить нейтралізація його залишків.

Сульфат натрію не має вказаних недоліків, але повинен застосовуватися з метою досягнення адекватної розчинності при температурі 35-40 ° С. Різке зниження розчинності при підвищенні температури дозволяє досить просто забезпечити «відновлення» залишковою солі, але вимагає для цього попереднього нагрівання будь-якого виробничого обладнання та здійснення суворого контролю температури з тим, щоб запобігти передчасній кристалізацію і забивання устаткування, і комунікацій. Спостережуване зниження розчинності білка при підвищенні концентрації солі може бути охарактеризоване рівнянням

де — концентрация соли; - Розчинність білка; с - концентрація солі; — константы, индивидуальные для каждой конкретной белковой системы ( і К - константи, індивідуальні для кожної конкретної білкової системи ( є також функцією температури і рН).

Дане емпіричне рівняння справедливе тільки для конкретного режиму висолювання. 3 и К частично, разделяются друг от друга. При проведении лабораторных экспериментов наблюдали, что усиление перемешивания оказалось выгодным при осуществлении периодического процесса осаждения пектиназы в том отношении, что оно позволяло увеличить скорость всего процесса осаждения и выделения фермента. Воно дає належну основу для проведення в лабораторіях операцій фракціонованого осадження, завдяки яким ферменти з різними значеннями (J 3 і К частково, поділяються один від одного. При проведенні лабораторних експериментів спостерігали, що посилення перемішування виявилося вигідним при здійсненні періодичного процесу осадження пектиназу в тому відношенні , що воно дозволяло збільшити швидкість всього процесу осадження і виділення ферменту.

Все це зменшувало залежність втрат ферменту від тривалості процесів обробки. При використанні сульфату амонію показано, що феномен осадження критично залежить від застосованого методу контактування солі з оброблюваної рідиною.

Періодичне осадження насиченим розчином сульфату амонію підвищувало відсоток насичення, при якому відбувалося висолювання, в порівнянні з випадком, коли застосовувалася та ж сіль, але у твердому стані. Очевидно, що безперервне контактування в потоці солі і білка з подальшим зрівноважуванням буде вести до подальшого зміни положення методу висолювання серед інших методів виділення ферментів.

Для фумарази і спиртової дегідрогенази, які також зазнали вивчення, рівняння швидкості осадження має такий порядок кінетики, який спочатку характеризується досить високими значеннями (до 3,1), але в міру завершення процесу наближається до одиниці. Освіта твердої фази завершувалося приблизно після 4-хвилинної експозиції. Формування осаду супроводжувалося його ресуспендірованіем. Останній процес характеризувався рівнянням швидкості першого порядку. Таким чином, різниця між точкою завершення осадження і кінцевим рівновагою було еквівалентно приблизно 4,5% від насичення.

1.2 Зміна температури і рН

Залежність величини з рівняння від температури і рН означає, по суті, що зміна розчинності може бути досягнуто або шляхом підтримання сталості іонної сили розчину або ж шляхом варіювання температурою або рН. Більшість білків виявляє нормальне збільшення розчинності при підвищенні температури. Завдяки тому, що для ферментів спостерігається також звичайна залежність розчинності від температури, температурні впливи не часто застосовуються для інтенсифікації процесу фракціонування осадження. Однак відмінності у стабільності ферментів при підвищених температурах виражені досить чітко. Тому загальноприйнятою процедурою для них служить селективна теплова денатурація, яка веде до необоротного осадженню. Причинами, по яких така методика користується успіхом у промисловців, є її простота і відсутність необхідності мати спеціальний, часто досить дорогою реагент. Однак даний метод вимагає строгого контролю, щоб уникнути втрат продукту. Крім того, заростання теплообмінників денатурованим білком може зробити метод важко реалізованим.

Зміна рН також привертає увагу як промисловий метод фракціонованого осадження, оскільки вартість реагентів в цьому випадку невелика. Наявність широкого розмаїття співвідношень між основними і кислими групами в молекулах різних ферментів зумовлює широкий діапазон значень рН, при яких ферменти характеризуються ізоелектричної властивостями або мають кульової заряд. Це узгоджується з теорією розчинності, так як у зазначеній точці спостерігається найнижча ефективна полярність, і фермент виявляє низьку розчинність в полярній водному середовищі.

и другие исследователи, проводившие эксперименты с выделением пролил- t - PHK синтетазы из сои с применением Phaseolus Принциповою труднощами у використанні діффepeнціaльнoгo осадження під впливом зміни рН є те, що діапазон рН, в якому багато ферментів залишаються ще стабільними, досить вузький. Dunnill і інші дослідники, що проводили експерименти з виділенням пролив-t - PHK синтетази із сої із застосуванням Phaseolus , попытались осуществить периодическое фракционирующее осаждение с помощью уксусной кислоты. aureus, спробували здійснити періодичне фракционируют осадження за допомогою оцтової кислоти. Було встановлено, що при рН 5,0 основна частина білка переходила в осад, однак для перекладу в осад синтетази оптимум рН знаходиться на рівні 4,2. Через те, що стабільність ферменту при низьких значеннях рН різко зменшувалася, процес супроводжувався значними втратами матеріалу. З цієї причини було застосовано безперервне осадження в поєднанні з безперервною сепарацією при використанні дискових центрифуг з періодичної розвантаженням. Це знижує тривалість процесу переробки 25 кг сої з 9,5 до 3 год Масштабування зазначеного процесу можливе без зміни обладнання.

1.3 Осадження органічними розчинниками

Тепер вже цілком виразно відомо, що більшість молекул ферментів мають полярні групи, що є зовнішніми по відношенню до молекули. Додавання органічних розчинників до водних розчинів білків буде знижувати діелектричну постійну суміші, створюючи середовище, яка більше відрізняється від полярної поверхні молекул ферменту. Як засвідчує теорія розчинності, це веде до зниження розчинності білків. Однак, оскільки молекули ферментів мають внутрішні гідрофобні амінокислотні залишки і тому відносно вільно можуть згортатися, то альтернативно додаванню органічних розчинників вони приймають нову, неактивну форму з експонуванням в навколишнє середовище гідрофобних угруповань. Пошкодження таких молекул при зміні їх форми і подальша денатурація тим більше, чим вище температура. Це призводить до необхідності використовувати для фракціонування більшості ферментів за допомогою органічних осадителей низькі температури (часто нижче 0 ° С).

2. Коагуляція і флокуляція

Слово «коагуляція» описує в даному випадку ситуацію, коли дуже дрібні частинки змушені поєднуватися. Довольно долго в этих целях использовали неорганические соли. Заряд на частинках нейтралізується при додаванні полівалентних іонів, що несуть протилежний заряд, внаслідок чого настає їх коалесценція (злипання). Досить довго в цих цілях використовували неорганічні солі. В останні роки набули поширення органічні поліелектроліти.

Терміном «флокуляція» описується освіту значно більше пухких агрегатів, в яких флокулюючих агент виконує роль мостікообразова-теля між частинками. Флокулюючих агенти включають в себе різні природні полімери, такі, як желатину, і велика кількість синтетичних полімерів. Полімери можуть бути електролітами або неелектролітами. Неорганічні іони не можуть викликати флокуляції, хоча вони можуть бути використані для нейтралізації зарядів частинок і в цьому відношенні сприяти флокуляції. коагуляцию и флокуляцию. Органічні поліелектроліти можуть викликати одночасно і коагуляцію і флокуляції. Методи коагуляції і флокуляції застосовують при роботі з цільними мікробними клітинами, залишками клітин після лізису та розчинними білками.

2.1 Цілісні клітини

При виділенні ферментів флокулянт, якщо він присутній в системі, не повинен взаємодіяти з позаклітинними ферментами. При промисловому одержанні позаклітинної протеази з Bacillus успешное применение нашли синтетические полиэлектролиты как вспомогательное средство, облегчающее отделение микробных клеток на фильтр-прессах. subtilis успішне застосування знайшли синтетичні поліелектроліти як допоміжний засіб, що полегшує відділення мікробних клітин на фільтр-пресах. Оскільки флокулянт зв'язується з клітинами, він може при наступному руйнуванні клітин для виділення ферментів увійти в контакт з цими ферментами.

со ставил перечень основных требований, которые должны предъявляться к реагентам, предназначенным для применения в качестве коагулянтов или флокулянтов микробных клеток. Проблемі коагуляції і флокуляції мікробних клітин присвячено дуже мало досліджень, за винятком робіт, спрямованих на вирішення приватних завдань у пивоварінні. Nakamura зі ставив перелік основних вимог, які повинні пред'являтися до реагентів, призначеним для застосування в якості коагулянтів або флокулянтів мікробних клітин. До них відносяться: низька вартість, низька доза застосування і відсутність різкого впливу на зміну рН. Серед неорганічних речовин в якості потенційних коагулянтів було випробувано безліч агентів, включаючи галун, солі заліза і кальцію. Хлорид кальцію (0,1-0,5%) застосовувався з гідроокисом натрію (0,2-0,8%) для того, щоб забезпечити підтримку рН суміші на рівні 8,0-9,5. Ефективним агентом при цьому виявилася гідроокис кальцію, викликає коагуляцію і копреціпітацію (спільне осадження). Кальцій може бути видалений з концентрованої клітинної маси шляхом додавання розведеної кислоти. микроводорослей. Особливо ефективними виявилися титанові солі в концентрації близько 0,01% для дріжджів, бактерій і мікроводоростей. Це пов'язано з чотиривалентний зарядом іона титану.

полиамином и положительно заряженными микроскопическими волокнами алюминия. Була вивчена флокуляція різних бактерій катіонних поліаміном і позитивно зарядженими мікроскопічними волокнами алюмінію. , составляло около одной десятой от того, что требовалось в случае Lactabacillus Кількість алюмінію, потрібного для флокуляції Є. coli, становило близько однієї десятої від того, що було потрібно в разі Lactabacillus . deilbruckii. особенно от фактических усилий сдвига, воздействовавших; на клетки перед флокуляцией. Ефективність флокуляції залежала від температури, фізіологічного «віку» культури, характеру суспендують середовища і особливо від фактичних зусиль зсуву, воздействовавших; на клітини перед флокуляцією.

2.2 Залишки клітин і білки

Отримувані після руйнування мікробних клітин (для виділення внутрішньоклітинних ферментів) залишки клітинної оболонки зазвичай підлягають видаленню з суміші до того, як вона буде піддана фракціонування з метою одержання різних білкових компонентів. Залишки клітин при механічному руйнуванні останніх коливаються в розмірах від декількох мікрон до часток мікрона і тому важко піддаються вилученню з суміші. На допомогу в цьому випадку приходять флокуляція і коагуляція клітинних залишків. Проте вельми істотно, що такі методи обробки суспензій призводять до переведення в нерозчинний стан також і внутрішньоклітинних ферментів. У відношенні седиментації клітинних залишків ефективними коагулянтами виявилися галун. Однак вони переводять білок в нерозчинний стан з утворенням дрібних, повільно осідають, нерозчинних флокул.

Флокуляція або коагуляція ферментів з метою отримання нерозчинних білкових агрегатів представляє собою гідну альтернативу класичним методам осадження, які вимагають високих концентрацій реагентів.

Протягом ряду років з метою виділення позаклітинних ферментів з культуральних рідин використовувалася дубильна кислота. У концентраціях 0,1 -1,0% вона утворює легко фільтрівні опади. Флокули містять досить стійкі ферменти і можуть бути промиті ацетоном для видалення дубильної кислоти. У разі застосування таких носіїв, як крохмаль (2 - 5%), при висушуванні флокул може бути досягнуто 100-кратне збільшення концентрації ферментів. Безпосереднє висушування у відсутності носія забезпечує 500 - кратне збільшення концентрації. Флокули володіють тим недоліком, що важко піддаються розчиненню.

3. Центрифугування

Відділення твердих частинок від рідин представляє собою основну операцію у процесі виділення ферментів. Воно включає виділення клітин з культуральної рідини, видалення клітинних залишків, збір осаду і виділення адсорбентів білка з белоксодержащей надосадової рідини. Загальноприйнято також включати в цю операцію відділення розчинених макромолекул від розчинника за допомогою ультрацентрифугування.



3.1 Сігма-аналіз

Певні труднощі при сепаруванні біологічних частинок центрифугуванням виникають найчастіше з недостатнього розуміння принципів процесу седиментації частинок в гравітаційному полі. при уменьшении вязкости жидкости. Ефективність центрифугування підвищується при збільшенні діаметру частинок, різниці між густиною частинки і рідини і при зменшенні в'язкості рідини. Ефективність також зростає при підвищенні кутовий швидкості, збільшення радіусу центрифугування, збільшення обсягу рідини і зменшення товщини шару рідини, що піддається центрифугированию. Проте біологічні частки характеризуються низькою щільністю і дуже малими розмірами. Вони також можуть перебувати в середовищі, яка завдяки присутності розчинених твердих частинок має високу в'язкість і підвищеною щільністю.

условиях лабораторий указанные неудобства могут быть преодолены путем применения центрифуг с высокой угловой скоростью. В умовах лабораторій зазначені незручності можуть бути подолані шляхом застосування центрифуг з високою кутовою швидкістю. сконцентрированных твердых частиц. В случае центрифуг промышленного типа повышение производительности за счет увеличении радиуса центрифугирования не может быть достигнуто, так как механические напряжения возрастают пропорционально квадрату радиуса. Однак ці центрифуги мають дуже малу продуктивність і працюють періодично з точки зору подачі в них суспензії та вилучення надосадової рідини і сконцентрованих твердих частинок. У разі центрифуг промислового типу підвищення продуктивності за рахунок збільшення радіусу центрифугування не може бути досягнуто, оскільки механічні напруги зростають пропорційно квадрату радіуса. Тому конструкція машини при збільшенні радіуса ротора швидко стає небезпечною для застосування.

Збільшення місткості кошика центрифуги і безперервне пропускання через неї центріфугіруемой рідини обмежує величину безпечної кутовий швидкості. Ця величина також обмежується, якщо твердий осад підлягає розвантаженні безпосередньо в ході операції, оскільки значний вплив на кутову швидкість надає ступінь дебаланса. Виходячи з цих обмежень, промисловість створила низку центрифуг, застосовних до переробки продуктів біологічної природи. Але тільки лише деякі з них виявилися придатними для виділення ферментів, оскільки надзвичайно обмежуючим фактором у цьому відношенні є властивості системи рідина - «тверда» частка. Для сепарації мікробних клітин, залишків тварин і мікробних клітин і різних типів опадів застосовуються головним чином три типи центрифуг: трубчасті, багатокамерні і дискові. Менше, хоча і дуже важливе, застосування знаходять спіральні центрифуги, центрифуги з твердою кошиком і ультрацентрифугу.

3.2 Центрифуги з роторами трубчастого типу

Циліндричний ротор підвішується за допомогою гнучкого валу до що знаходиться в головці центрифуги мотору або повітряної турбіни. Така конструкція знижує нагрівання ротора в порівнянні з тим, що має місце при нижньому розташуванні приводу. Ротор встановлений в підшипниках ковзання з м'якого металу. Для цієї мети зазвичай застосовується латунь, і хоча теоретично контакт між оброблюваної рідиною і підшипниками і даному типі машин не повинен мати місця, тим не менш в тих випадках, коли обробці піддаються розчини сульфату амонію, може відбуватися явна контамінація їх міддю. Підшипники ковзання з сплаву Вууда є в цьому плані щодо надійною альтернативою при більш високій або більш низькій частоті обертання в машинах невеликих масштабів. Ослаблення таких підшипників дає можливість ротору повертатися в центрированное положення під час будь-якого тимчасового розбалансування і забезпечує більш високу частоту обертання в порівнянні з усіма іншими типами центрифуг, за винятком зональних ультрацентрифуг. У разі лабораторної моделі центрифуги Sharpies ( Pennwalt ) с диаметром ротора 4,5 см и частотой вращения 50 ООО об/мин развивается усилие в 62 500 g , а в случае модели 6Р (диаметр ротора 10,8 см, частота вращения 15 500 об/мин) — 14 000 g . IP (Pennwalt) з діаметром ротора 4,5 см і частотою обертання 50 ТОВ об / хв розвивається зусилля в 62 500 g, а у випадку моделі 6Р (діаметр ротора 10,8 см, частота обертання 15 500 об / хв) - 14 000 g. оснащена воздушной турбиной, модель GP приводится в действие с помощью электродвигателя. Модель IP оснащена повітряної турбіною, модель GP приводиться в дію за допомогою електродвигуна.

Рідина перекачується в ротор через донний штуцер, омиваючи при цьому нижні підшипники. За море просування рідини вгору по ротору відбувається седиментація знаходяться в ній твердих частинок на стінках ротора. Звільнена від твердих включень рідина відкидається відцентровою силою з ротора в його верхній частині і збирається в навколишнє ротор чашу. Обидві моделі при обробці суспензій мікробних, тваринних і рослинних клітин, більшості суспензій залишків мікробних клітин, а також суспензій твердих білкових адсорбентів дають прекрасне їх освітлення, а також прекрасне зневоднення отриманих твердих опадів. За допомогою лабораторної моделі можна також відокремити від рідкої фази білкову фракцію, обложену солями або полімерами. Однак відділення неможливо, якщо щільність рідини дуже висока.

Застосування пластикових гільз прискорює видалення осаду в порівнянні з тим, як це відбувається у випадку вилучення з машини самого центріфужного ротора. Час оборотності 15 - 20 хв. Однак кількість накопичується твердого осаду при цьому незначно - близько 4 кг (по вологій масі).

Висновок рідини з центрифуги тягне за собою ціноутворення і генерування аерозолю. Останній може становити небезпеку. Тому всі машини, зайняті у виробництві ферментів, повинні дозволяти здійснювати їх монтаж усередині огороджуючого кожуха. Аерація рідкої фази при розвантаженні центрифуг може пошкоджувати що знаходяться в ній ферменти, особливо коли вони містять активні сульфгідрильні радикали. У цих випадках може виявитися корисним застосування протипінних і захисних щодо сульфгідрильних груп агентів.

Слід мати на увазі, що при вході оброблюваної суспензії в центрифугу дуже висока кутове прискорення може призвести до дезагрегування наявних у ній конгломератів і елементів осаду і, отже, до зменшення ймовірності видалення твердих частинок з рідини. может выносить с собой определенное количество твердых частиц. Коли двигун вимикається, рідина, що залишається в роторі центрифуги, буде випливати з неї через донний штуцер і може виносити з собою певну кількість твердих часток. Тому не слід змішувати цю частину рідини з уже освітленої.

доступные машины, как описанные центрифуги, являются наиболее пригодными и универсальными для разделения жидкой и твердой фаз при получении ферментов в полупромышленных условиях. Незважаючи на зазначені недоліки, такі прості і доступні машини, як описані центрифуги, є найбільш придатними та універсальними для поділу рідкої і твердої фаз при отриманні ферментів в напівпромислових умовах.

3.3 Багатокамерні центрифуги

У машинах відцентрового типу розміри ротора обмежуються механічними зусиллями. Альтернативою центрифуг з роторами великої місткості є багатокамерні центрифуги, у яких серії концентричних камер монтуються всередині і зовні ротора (рис. 3 - б). Складність такого ротора і його жорстке монтування на донному підшипнику вище коробки передач та електродвигуна обмежують можливу частоту його обертання (для ротора діаметром 46 см - 6500 об / хв). Рідина вводиться в центрифугу через центральну трубку, долає зигзагоподібний шлях вгору і вниз між концентрично розташованими камерами і видаляється за допомогою насоса доцентровий дії, розташованого концентрично щодо труби, що підводить оброблювану рідина. Тверді частинки збираються на внутрішніх поверхнях кожної камери, а не осіли у внутрішніх камерах рухаються назовні, де піддаються впливу ще більших седиментаційних сил. Однак для досягнення необхідного ступеня зневоднення осад повинен майже повністю заповнювати весь ротор центрифуги.

проходит через отверстие вблизи центральной оси. У деяких моделях багатокамерних центрифуг, у міру того як ротор уповільнює свій хід, рідина призупиняє рух по камерах і проходить через отвір поблизу центральної осі. В інших моделях рідина видаляється за допомогою сіфонірованія. Але в обох з них твердий осад може бути досить легко вимитий з ротора центрифуги. Тому багатокамерні центрифуги добре підходять для одноразового застосування, коли розмір ротора може бути вибраний досить точно і виходячи з бажаного об'єму партії одержуваного матеріалу. Вони менш годяться для випадків, коли завантаження вихідної суспензії твердою фазою може істотно змінюватися. Розбирання багатокамерних центрифуг - операція досить тривала, оскільки прокладки при розбиранні зберегти дуже важко, твердий осад повинен зіскоблюється зі стінок осаджувальних камер без розбирання машини. Квадратне поперечний переріз ротора центрифуги і її розташування безпосередньо над коробкою передач ускладнюють відвід тепла від електродвигуна і шестерень коробки передач.

Стандартна багатокамерна центрифуга може охолоджуватися за допомогою холодної води, яка подається через розпилювальних голівку, змонтовану над центріфужний кошиком. Однак такий спосіб охолодження не забезпечує відведення тепла від доцентровий розвантажувального насоса, який є другим джерелом генерації тепла (температура піднімається на 15 ° С при продуктивності, не досягає розрахункового значення).

4. Хроматографія

З процесами виділення ферментів в першу чергу пов'язані операції руйнування клітин, екстракції з допомогою розчинників, осадження, сепарації в фазах тверда речовина - рідина. Можливості цих операцій як засобу для фракціонування ферментів у промислових масштабах обмежені. Основна питома вага в процесах фракціонування ферментів припадає на групу операцій, побудованих на феномені різної міграції ферментів. Найбільш важливими із зазначених операцій є хроматографія та пов'язані з нею періодичні операції сорбції-десорбції. Певну роль в якості операцій (методів) диференціальної міграції може грати також електрофорез і зональне ультрацентрифугирование. Періодичні процеси сорбції-десорбції є спеціальним випадком диференціальної міграції, при якому один або декілька компонентів не можуть мігрувати або переміщатися під впливом певної рушійної сили, в той час як інші компоненти до цього здатні. Всі інші методи диференціальної міграції в порівнянні з дистиляцією характеризуються як справді автоматичні каскадні.

множество ступеней очистки материала располагается в определенной последовательности. При каскадних операціях безліч ступенів очищення матеріалу розташовується в певній послідовності. Кожна ступінь здатна забезпечити лише невелика збагачення продукту цільовим компонентом. Але при цьому загальна досягається потужність сепарування може бути значною. Деякі каскадні системи для біологічного сепарації, такі, як протиточні машини, включають автоматичне сполучення дискретних стадій сепарації. Однак у більшості систем, включаючи системи для хроматографії, електрофорезу і ультрацентрифугування, поєднання стадій виробляється безпосередньо в межах загальної системи, а індивідуальні стадії збагачення не можуть бути розділені ні в одному випадку, крім теоретичних викладок. У найбільш сприятливих випадках розділяє здатність каскадних методів, використовуваних при біологічної сепарації, виражена настільки ж сильно, як і при процесах дистиляції, але при очищенні внутрішньоклітинних ферментів вона є критичною з-за великої складності підлягає фракціонування суміші.

Періодичні методи сорбції-десорбції за сепаруючий здібності займають проміжне положення між методами осадження та хроматографії. Проте їх найбільш зручно обговорювати після розгляду можливостей таких процесів з сильно вираженою розділяє здатністю, як процеси хроматографії, т. з. коли механізм процесів сорбції-десорбції вже з'ясовано.

Хроматографія визначається як рівномірна перколяції, тобто фільтрація через адсорбує шар зернистого матеріалу,, рідини, що проходить через колонку, заповнену певним, більш-менш тонко роздробленим речовиною, яка селективно затримує конкретні компоненти рідини. . J . P . Martin , охватывает широкий диапазон селективных методов задержания и элюирования (извлечения из адсорбента) уловленных жидкостей. Це просторове визначення, сформульоване в 1950 р. A. J. P. Martin, охоплює широкий діапазон селективних методів затримання та елюювання (витяги з адсорбенту) уловлених рідин. Для виділення ферментів із застосуванням методів хроматографічної сепарації найбільш важливими представляються їх водні розчини. Нижче будуть розглянуті спільні шляхи селективного затримання ферментів методами хроматографії з тим, щоб на цій основі обговорити проблеми масштабування відповідних процесів.

4.1 Адсорбція

Перші операції хроматографічної сепарації, пов'язані з отриманням низки біохімікаліев, були проведені з застосуванням речовин, які адсорбують їх завдяки силам Ван-дер-Ваальса і просторовому взаємодії. Зазначені сили є найбільш важливими для речовин з де-бовираженной полярністю. У випадку більш полярних речовин серйозна проблема може виникнути у зв'язку з необоротним характером зв'язування всіх компонентів.

При виділенні ферментів застосовується обмежене коло адсорбентів. Широко використовується в лабораторних роботах фосфат кальцію, особливо в кристалічній формі, відомої як гідро-ксілапатіт. Недостатньо досконалі його механічні властивості і обмеженість розміру гранул стримують застосування гід-роксілапатіта в колонах великих масштабів. Проте недавно проведені роботи свідчать про прогрес у даному питанні. При лабораторних роботах в певній мірі застосовується також алюміній, особливо у формі у-алюмогелем. Однак його механічні властивості незадовільні, а плинність виражена вкрай слабо. Для адсорбції білків п рідкісних випадках, але все-таки застосовується діатомітової земля.

Побічна адсорбція білка при застосуванні діатомітової землі як основи шару грунтовки при фільтрації представляє серйозну проблему.

4.2. Фракціонування за допомогою іонного обмена.Раздробленние речовини з іонообмінними властивостями предста-ляють собою найбільш важливі твердофазні продукти для фракціонування ферментів. Широке індустріальне застосування знайшли матеріали, у яких іонообмінні групи приєднані до гідрофобним кістяка, як це має, наприклад, місце у сополимера дівінілстірола. Проте їх застосування до розв'язання задач отримання ферментів обмежується випадками, коли йде мова про стійкі ферментах, які мають невеликі молекули. Ці обмеження обумовлені слаборозвиненою пористістю матеріалів, які мають необхідний розмір пор. До того ж гідрофобні остови молекул полімерів можуть в потенції надавати дестабілізуючий вплив на ферменти. Широко використовуються в лабораторіях іонообмінники на основі целюлозних і декстранових кістяків. Як і у випадку адсорбції, загальноприйнято починати хроматографічне розділення з додавання до системи білка, припускаючи, що деякі або всі компоненти суміші міцно пов'язані один з одним.

4.2 Сорбція-десорбція

Препаративна хроматографія па межі фаз тверде речовина - рідина є найбільш повільну операцію в загальній технологічній схемі виділення ферментів. Хоча цей метод не має рівних за фракционируют здібності, відомо безліч прикладів, коли цією здатністю жертвують заради досягнення більш високої продуктивності. Як було показано для проведення процесів адсорбції, іонного обміну та афінної хроматографії найбільш придатні періодичні методи. Періодичні процеси сорбції-десорбції можуть проводитися або в колонках насадочного типу, або шляхом перемішування адсорбенту з розчином ферменту в апараті ємнісного типу з мішалкою з подальшим застосуванням методу сепарації та відділення твердої фази від рідкої. Вимоги до конструкції насадок колонок у цьому випадку можуть бути менш суворими, ніж у випадку зональної хроматографії, так як в процесах сорбції-десорбції бажано використовувати весь обсяг насадки. Однак і при цьому слід забезпечити поршневе протягом рідини.

Альтернативний метод, що включає стадію відділення твердої фази від рідкої, може бути реалізований різними шляхами. При роботі з щільними гідрофобними гелями осадження в полі сили тяжіння може бути адекватно стадії вторинної промивки. Для гідрофільних носіїв бажано застосування центрифугування або фільтрації. При центрифугуванні можуть використовуватися роторні центрифуги, центрифуги з суцільним ротором або сепаратори. Роторні центрифуги відрізняються обмеженою продуктивністю, а що розливаються на вході в ці машини суспензії зрізують зусилля можуть викликати абразивне пошкодження її компонентів. Ця відмінна здатність до пошкодження притаманна також і застосовуваним іноді спіральним центрифуг. Відповідають умовам процесу розділення фаз високопродуктивні центрифуги з суцільним ротором. Але ідеальними в цьому відношенні є сепаратори, що забезпечують ефективне зневоднення і промивання осаду. Якщо необхідно, можуть бути обладнані автоматичним пристроєм для розвантаження твердої фази за допомогою приводного поршня.

Якщо структура осаду дозволяє, процеси сорбції та десорбції можуть здійснюватися при застосуванні адсорбенту в рухомому роторі. Додатково можливе проведення стадії елюювання, що підвищує ефективність розділення. Однак при здійсненні зазначеної стадії слід дотримуватися особливої ​​обережності, оскільки межповерхностние області між порціями розчинника для елюювання можуть призводити до утворення помилкових профілів процесу елюювання з неупорядкованим розподілом в розчиннику ферментів. Для вирішення проблем, пов'язаних з знесолення в'язких білкових розчинів в насадок колонках, відповідна операція знесолення допомогою гельфільтраціі може проводитися в барабанних центрифугах. Для видалення зовнішньої вологи гель спочатку обробляють при високих частотах обертання центрифуги, а потім при малих частотах обертання в неї вводять білковий розчин. Солі та органічні сполуки з низькою молекулярною масою заповнюють тонкі пори гелю, в той час як білкові молекули викидаються з нього при високих частотах обертання. Утворений осад потім промивають водою.

Виділення та очищення ферментів періодичними методами іонного обміну та адсорбції описані в багатьох патентах та публікаціях. Так, наприклад, описано виділення стрептокінази методом знесолення освітленої культуральної рідини (250 літрів), що містила 40 млн. од. ферменту, за допомогою змішаного катіоно - і аніонообмінником. Отриманий розчин обробляли ДЕАЕ-целюлозою. В іншому прикладі 100 л. сечі людини, яка містить урокиназу, обробляли 1 кг. фосфату целюлози - сильним катіонних іонообмінників основного характеру. Значення рН знижувався з 8 до 3, і розчин фільтрували. Після цього фермент елюіровалі за допомогою 3%-ного аміаку.

5. Електрофорез і центрифугування

5.1 Електрофорез

Терміном «електрофорез» описується процес поділу ферментів на основі диференціальної їх міграції в електричному полі. При проведенні лабораторних робіт у галузі аналітичної біохімії електрофорез являє собою метод, що забезпечує вищий ступінь поділу ферментів на принципах фізико-хімічної сепарації. Тому зазначений метод вивчався перш за все з точки зору препаративної сепарації. Саме для такого призначення створено кілька спеціальних приладів. Однак необхідно мати на увазі, що на електрофоретична рухливість ферментів вирішальним чином впливає низка факторів, вони можуть бути відповідальними за розчаровують результати. По-перше, електрофоретична рухливість макромолекул низька, внаслідок чого відповідна операція поділу характеризується малою швидкістю і дифузія буде приводити до розмивання концентраційних зон, а ферменти - змішуватися з повільно рухомими продуктами електролізу. Рухливість молекул варіює у зворотному відношенні до в'язкості середовища. Якщо відвід тепла від різних ділянок поперечного перерізу сепараційної камери відбувається з різною інтенсивністю, то рухливість молекул по поперечному перетині буде варіювати. Це обумовлено варіаціями температури по поперечному перерізі і залежністю в'язкості від температури. Наявність твердої фази, хоча вона сама по собі і не важлива як об'єкт для виділення, контролює конвекційні обурення потоків у сепараційної камері і викликає гравітаційні руйнування ущільнених зон. Тверда фаза також зменшує рухливість молекул. Ці та інші проблеми ускладнюють застосування методів перепаратівного електрофорезу. Капітальні витрати, пов'язані особливо до оформлення процесів охолодження сепараційної камери, видалення з неї продуктів електролізу та забезпечення безпеки експлуатації, досить високі. Електрофорез може грати певну роль лише в процесах великомасштабного виділення деяких ферментів, особливо при сепарації ферментаційних мультісуб'едініц, які схильні до руйнування у присутності твердої фази і потрібні при хроматографії.

5.2 Зональна ультрацентрифугирование

Центрифугування при дуже високих частотах обертання було розглянуто раніше стосовно сепарації твердих та рідких фаз.

Однак спочатку намічалося як метод високоразделяющей сепарації частинок, що знаходяться в розчині. При використанні для цілей диференціальної міграції ротор ультрацентрифугу заповнювався рідиною певної щільності, і до осі ротора таким чином додавалася деяка кільцева зона. Ця зона піддавалася впливу відцентрових сил, що змушувало частинки різної щільності мігрувати з неї назовні з різними швидкостями. Метод придбав велике значення при очищенні вірусів, які за своєю величиною, загалом, на один порядок більші молекул ферментів. Гравітаційні поля, що вимагаються для розділення молекул ферментів, занадто великі. Тому в даний час очевидно, що використання методу буде і надалі обмежуватися екстремально великими ферментативними комплексами. Крім того, навіть при використанні найбільш придатних за величиною роторів ефективна місткість, центрифуг незначна. Як і у випадку електрофорезу, метод зонального ультрацентрифугирования має ту перевагу, що він не пов'язаний з наявністю в рідині твердої фази. Однак присутні в розчині хімічні речовини, що створюють градієнт щільності, можуть ушкоджувати структуру комплексів ферментів.

6. Оздоблювальні операції

Загальноприйнято до оздоблювальних операцій відносити такі, як стерилізація продукту, зменшення його розмірів у товарному вигляді, таблетування та складання рецептур, а також знесилення ферментів, їх концентрування, висушування, зберігання на складі і контроль чистоти. Хоча ці встановлені кінцеві, або обробні операції передують безпосередньому випуску препаратів у продаж, вони можуть у ряді випадків мати навіть більш важливе значення, ніж власне роботи з очистки ферментів. У всякому разі, для позаклітинних ферментів справа йде саме так. Для ряду практичних застосувань внутрішньоклітинних ферментів фракціонування потрібно лише для того, щоб позбутися від деяких контамінантів. Інші вимоги визначаються виключно прагненням надати продукту, що випускається належну форму і зовнішній вигляд і необхідністю точної і відтворної їх специфічності. Більшість обробних операцій - це скоріше узагальнення результатів практичних традиційних прийомів робіт всередині тієї плі іншої компанії, ніж втілений в натурі підсумок досліджень. Дослідницькі установи зазвичай не цікавить така властивість продукту, як сохраняемость; їх критерій чистоти часто відрізняється від критерію, яким керується виробник.

6.1 Знесолення

Багато ферментні препарати потребують звільнення від неорганічних солей, які надають продуктам неприємний запах і небажані в клінічному відношенні. Знесолення ферментних препаратів може також відігравати важливу роль як проміжна стадія в технологічному процесі виділення хімічно чистих ферментів. Зокрема, ця стадія передує очищення ферментів за допомогою іонообмінної абсорбції. Термін «знесолення» також широко застосовується для опису процесів видалення будь-яких низькомолекулярних сполук з ферментних препаратів за допомогою операцій, які не враховують відмінності між іонами і незарядженими низькомолекулярними сполуками.

Класичний метод видалення з препаратів дрібних іонів з використанням змішаної іонообмінної насадки був застосований до очищення деяких найстійкіших ферментів. Це застосування грунтується на наявності у гідрофобних вуглеводневої-основних іонообмінників пір дуже малого розміру. Такі іонообмінники мають дуже низьку ємність по макромолекулам, але високу ємність по іонам. За допомогою застосування змішаної насадки з катіонних і аніонних іонообмінних смол стає можливим видалити з оброблюваних препаратів як позитивно, так і негативно заряджені іони. На жаль, гідрофобна природа зазначених іонообмінників і формування на їх поверхнях потужних зарядів призводять до можливості денатурації оброблюваних ферментів. Даний метод має значну конкуренцію з боку другого хроматографічного методу - методу гельфільтраціі, який був описаний вище. Можливості цього методу для здійснення, в промислових масштабах операцій видалення з ферментних препаратів різних іонів або дрібних молекул доведені цілком надійно. При цьому неминуче розведення препаратів. У процес втягуються тільки дві фракції, а оскільки гельфільтрація не припускає використання специфічних сорбційних ділянок насадки, вона може проводитися за високого завантаження колонки, що обмежує ступінь розведення. Серйозно ускладнює поділ ферментних препаратів висока в'язкість відповідних розчинів, не меншу проблему становить засмічення гелю білковими матеріалами. -25 с поперечными связями, снимает последнюю проблему, так как он выдерживает очистку с помощью раствора гидроокиси натрия. Однак застосування сефадекса, який представляє собою декстран G -25 з поперечними зв'язками, знімає останню проблему, так як він витримує очищення за допомогою розчину гідроокису натрію.

При видаленні з ферментних препаратів усіх низькомолекулярних сполук важливу роль відіграють два мембранних методу - діаліз і ультрафільтрація. Зазвичай ультрафільтрація буде дозволяти видаляти низькомолекулярні з'єднання по суті з тією ж швидкістю, як і воду. Забезпечивши підживлення води в ультрафільтраційну камеру, можна домогтися досить ефективного видалення із системи й інших молекул, крім молекул води. «Діафільтрація» зазвичай здійснюється при розведенні на першій стадії препарату до необхідного рівня з тим, щоб знизити до мінімуму концентраційну поляризацію.

Теоретично ультрафільтрація перевершує за своїми можливостями діаліз, так як її реалізація не потребує подолання граничної концентрації солі на фільтруючої стороні мембрани. Однак концентрація солі при діалізі може підтримуватися на низькому рівні завдяки швидкому пропускання води через фільтруючу боку мембрани. Для цієї мети може виявитися корисним застосування деіонізованої води, що дозволяє запобігти контамінації мембрани металевими солями при промиванні її протитечією.

Серйозні обмеження, які могли б покладатися на процеси ультрафільтрації концентраційної поляризацією, у разі очищення діалізом не виявлено, хоча це явище не втрачає своєї значущості з точки зору досягнення ефективного перемішування потоку продукту.

Фірми, що випускають оболонки для ковбасних виробів, "як вторинних продуктів виробляють також трубки для діалізу. При цьому в процесі виробництва відповідних мембран в них неминуче залишається певна кількість металевих іонів і сполук, що містять сірку. Металеві іони можуть викликати денатурацію оброблюваних ферментів. Тому мембрани перед їх застосуванням піддаються зазвичай кип'ятінню у кілька разів змінюють порціях води, куди може додаватися етилендіамінтетраоцтової кислоти.

У результаті досліджень процесу ультрафільтрації розроблено нове покоління мікротрубчатих діалізірующей мембран. Мембрани утворюються з великої кількості мікротрубок, що закладаються разом у так званий модуль із загальним входом і загальним виходом. Співвідношення площі поверхні модуля і його обсягу є дуже високим. Конструкція виявилася досить ефективною, якщо не вважати схильності її забивання нерозчинними твердими речовинами. Крім того, виготовлення модулів обходиться досить дешево. Є підстави сподіватися, що висока ефективність діалізірующей мембран подібного роду та їх модульна форма знову пробудять інтерес до практичного застосування процесів діалізу.

Подібно ультрафільтрації, діаліз може призвести до значної втрати активності ферменту, проте малоймовірно, що ця втрата зобов'язана наявності зрізують зусиль. Швидше за все інактивація ферменту при діалізі відбувається через наявність у мембранах якихось контамінантів або міжфазних кордонів, локально обмежують потік матеріалу.

6.2 Концентрування

Концентрування - одна з основних стадій технологічного процесу виділення позаклітинних ферментів. Як оздоблювальна операція концентрування зазвичай здійснюється методами сушки. При виділенні внутрішньоклітинних ферментів часто виявляється необхідним сконцентрувати рідину під час проміжної стадії очищення, оскільки висока розділяє здатність відповідних методів може призводити до надмірного розведення продукту. При низьких рівнях вмісту білка останній має виражену тенденцію до покриття робочої поверхні щільним шаром. Тверді фази, застосовувані в хроматографії, мають особливо великою площею поверхні.

При концентруванні ферментів може використовуватись обладнання, що забезпечує випаровування вологи з матеріалу при знижених температурах, як це вже зроблено стосовно технології виробництва фруктових соків можуть бути використані методи повного осадження або повної адсорбції. Для ізоляції внутрішньоклітинних ферментів розумне застосування відповідної стадії обробки в певні моменти процесу багатостадійної очищення може в ряді випадків дозволить виключити необхідність проведення власне стадії концентрування, яка за своєю суттю повинна розглядатися як непродуктивна. Така побудова процесу особливо важливо у промислових умовах, де концентрування обходиться досить дорого, протікає повільно і може часто приводити до денатурації великих кількостей продукту.

6.3 Сушіння

Для сушіння ферментів можуть з успіхом застосовуватися промислові методи, розроблені стосовно до отримання "харчових і фармацевтичних продуктів. Як і у випадку інших біологічних матеріалів, найбільш стійкі ферменти можуть бути висушені в розпилювальних сушарках або тепловим способом під вакуумом; менш стійкі вимагають сушіння в за мороженому стані (сублімаційна сушіння).

Більшість внутрішньоклітинних ферментів, що надходять у продаж від спеціалізованих компаній у висушеному стані, проводиться методом сублімаційного сушіння. І, як правило, завжди велика спокуса, прийнявши, що всі внутрішньоклітинні ферменти є надзвичайно лабільними, орієнтуватися на їх сушіння толь до сублімацією. Однак справжній стан справ вимагає не приймати подібного необачного рішення без попереднього випробування більш дешевих і простих способів сушіння.

Для отримання сухих препаратів позаклітинних ферментів широко застосовується Розпилювальна сушка. Досягається при цьому ступінь концентрації ферментів наводиться нижче, при обговоренні результатів і подібних продуктів. Класичні випарні апарати корпусного або трубчастого типів або типу падаючої плівки для концентрування ферментів знаходять обмежене застосування через труднощі контролю піноутворення і обростання робочих поверхонь осадом. Можуть бути застосовані пластинчасті теплообмінники. Випарну установку найкраще нагрівати гарячою водою під високим тиском. Концентрування рідини здійснюється безпосередньо із системи, що знаходиться в шарі парів, у міру його розширення з великою швидкістю. Піддаються обробці розчини ферментів повинні мати гомогенну консистенцію, бути добре відфільтрованими і вільними від повітря і великих сторонніх частинок. Для запобігання кавітації слід застосовувати насоси витісняє дії. Температура повинна підтримуватися на рівні 40 ° С або навіть нижче. При типовому процесі розчини ферментів звичайно концентруються в дві стадії: від 8 або 12% вмісту твердих речовин до 35%, а потім - до 65%.

В даний час основним застосуванням ультрафільтрації є концентрування, так як концентраційна поляризація істотно перешкоджає здійсненню багатьох процесів фракціонування з використанням цього методу, хоча у випадку освітлених культуральних рідин він дозволяє видалити з препарату велику частку низькомолекулярних складових частин. (Рівень сконцентрованого білка в позаклітинній культуральної рідини буде зазвичай невисоким, внаслідок чого поляризація буде носити обмежений характер.) Видається, що подібне застосування ультрафільтрації буде швидко прогресувати і розширюватися у міру того, як буде зростати надійність інформації про властивості системи, яка підлягає обробці.

Найбільш важливими операціями концентрування є ті, які визначаються як фракціонування. Зокрема, операції осадження або преципітації та адсорбції служать одночасно і операціями концентрування. Для виділення цільових продуктів з нативних позаклітинних ферментів плі з нативних внутрішньоклітинних ферментних препаратів реальних процесів виділення відповідних препаратів.

Бактеріальна а-амілаза була отримана в сухому стані на вакуумній сушильній установці. При цьому з 5000 л фільтрату культуральної рідини, що зазнає фракціонування спиртом, за 8 год роботи було отримано 73,5 кг продукту. При промисловому виробництві аспарогенази сублімаційним методом було отримано кілька кілограмів готового продукту. Для сушіння ферментних препаратів сублімацією дуже важливо забезпечити максимально повне видалення вологи з оброблюваного матеріалу.

7. Біологічна безпека при промисловому виробництві

Безпека виробництва і застосування є невід'ємними вимогами до будь-якого технологічного процесу. Мірою безпеки на підприємстві служить вміст у повітрі приміщень і на поверхнях будь-яких потенційно небезпечних матеріалів. Об'єктами спостереження при вирішенні проблем виробничої безпеки є як робоче середовище, так і персонал. Тільки при благополучному стані вказаних об'єктів спостереження можна гарантувати, що вжиті заходи ефективні. Сказане рівною мірою відноситься також і до контролю всіх матеріальних потоків, що надходять з підприємства у навколишнє середовище.

7.1 Заходи безпеки

Стандартні ферментатори представляють собою адекватні системи забезпечення техніки безпеки при роботі з будь-якими мікроорганізмами, виключаючи патогенні. Якщо застосовувані мікроорганізми володіють потенційною небезпекою, то в конструкцію ферментаторів слід внести дуже невеликі вдосконалення з тим, щоб повністю ізолювати їх внутрішні простору від навколишнього середовища. У ході культивування основна увага повинна бути приділена обробці виходить з ферментатори повітря, який підлягає або фільтрації, або пропускання через печі-інсінератори. Технологія останніх процесів відпрацьована досить ретельно. Однак, незважаючи на це, несправність яких-небудь елементів або Фиттинг може звести вжиті заходи захисту навколишнього: середовища до нуля. Основні проблеми виникають при вивантаженні культуральної рідини з ферментаторів. При виробництві позаклітинних ферментів вологі мікробні клітини з домішкою допоміжних фільтрувальних порошків або без них зазвичай піддаються автоклавуванню. Клітини, вільні від допоміжних фільтрувальних порошків, можуть, якщо в цьому є необхідність, йти на корм худобі. Рідина, з якої були вилучені тим або 1 іншим шляхом ферменти, продовжує містити певні живильні речовини і тому має значну біологічну потребу в кисні. Як осадителя білків застосовується сульфат амонію, який надає координуючу дію на бетон і на різні метали. Тому рідини, що містять вказане хімічна речовина, зазвичай скидаються на грунт у якості добрив.

Руйнування мікроорганізмів з метою отримання внутрішньоклітинних ферментів висуває нову проблему техніки безпеки. Фрагменти клітинних оболонок, що виходять в результаті механічних впливів на клітини, містять цілу серію біологічно активних матеріалів. , в среду из клеточной оболочки высвобождаются эндотоксины. У разі непатогенних грамнегативних організмів, таких, як Є. coli, в середу з клітинної оболонки вивільняються ендотоксини. Останні при аерозольній аплікації можуть викликати неприємні, хоч і короткочасні симптоми, наприклад нудоту, головний біль і біль у грудній клітці, а також роздратування сечових шляхів. Крім того, ендотоксини зберігаються і в перероблюваних матеріалах протягом усіх стадій фракціонування після руйнування клітин. Біохімічна технологія багато в чому використовує обладнання, розроблене і розробляється для хімічної промисловості. При цьому передбачається, що рівні витоку, допустимі для неорганічних хімічних речовин, можуть також мати місце при високоактивних біологічних матеріалах. Так, зокрема, розглядається питання стосовно більшості промислових центрифуг, що працюють при досить високих частотах обертання роторів. При нестачі цілком скоєних модифікацій центрифуг і в умовах, коли існуючі центрифуги відрізняються високою вартістю, єдино правильним рішенням є монтаж такого обладнання в боксах певного виду, оскільки застосування ламінарних повітряних потоків протягом всієї операції, що йдуть від місця проведення процесу до фільтрів, обходиться дорого, а при реалізації в промислових масштабах недостатньо ефективно. Вимога про роботу операторів у спеціальних пневмокостюми, що живляться повітрям від повітряних комунікацій, зустрічається дуже несхвально, і, крім того, не вирішує проблеми знешкодження виробничих викидів та охорони повітряної навколишнього середовища.

Більшість з відомих боксів безпеки являє собою жорсткі конструкції з нержавіючої сталі, скла і пластиків. Ці конструкції досить дорогі, а самі установки громіздкі. Доступ у ці установки і особливо їх обслуговування скрутні ", а наступні модифікації виробництва можуть легко порушити цілісність і герметичність створених систем. Більш багатообіцяючим є застосування боксів із гнучких плівок, які були раніше розроблені для використання при отриманні тварин-гнотобітов, вільних від мікроорганізмів.

Стінки подібних боксів виконуються з тонкого листового поліетилену або з листового полівінілхлориду. Їх з'єднання виробляється за допомогою електронної зварювання. У потрібних точках боксів можуть розміщуватись (знову-таки за допомогою електронної зварювання) відповідні рукавички і фільтри, а бокси можуть працювати під надлишковим тиском і під розрідженням.

Особливо корисним доповненням до боксів служить спеціальний полукостюм, що закладаються за допомогою електронної зварювання в бічну стінку секції. Він являє собою верхню половину пластікатового костюма із шоломом і плечовими рукавичками. Жилетка полукостюма створює ламінарний потік повітря і сполучена з живильною повітряною лінією; підпір повітря під полукостюмом створює для оператора значну свободу рухів.

Якщо операторові потрібно переміщатися від боксу па великі відстані, то «спідниця» полукостюма може бути зроблена більш довгою, так що утворюється як би тунель, в якому може рухатися оператор. Працюючий може залишати костюм практично миттєво, не побоюючись бути при цьому контамінованих. Виконання ним робочих функцій проводиться в комфортних умовах ламінарного повітряного потоку.

Найбільший недолік боксів є наслідком незручностей, пов'язаних із застосуванням гумових рукавичок. Закладення в бокс більш товстих рукавичок може лише знизити ймовірність контактної контамінації. Але це буде досягнуто ціною втрати легкості маніпуляцій оператором. Однак, якщо основна небезпека при роботі в боксі пов'язана з рухом повітря, то швидка заміна порвали рукавичок буде цілком допустима. Проведення такої операції може бути спрощене, якщо в боксах буде застосовуватися конструкція, розроблена для хірургічних операцій через гнучкі плівки.

7.2 Контроль навколишнього середовища

Аерозолірованние мікроорганізми звичайно фракционируют шляхом застосування щілинних пробовідбірників, в яких знаходяться обертаються чашки Петрі з відповідною живильним середовищем на основі агару. Протягом певного часу над чашками прокачується вимірюваний об'єм повітря. Потім чашки збожеволіють в термостат і знаходяться в ньому за умов, специфічних для розвитку окремих мікроорганізмів. Аналізи повітря за допомогою подібних пробовідбірників повинні здійснюватися при зупинки підприємств і в ході їх роботи з тим, щоб встановити нормальний рівень забрудненості і виявити будь-який витік матеріалу. Після того як були отримані дані про реакції організму на потрапляння в нього порошкоподібних протеолітичних ферментів, стали можливими розробка стандартів безпеки та контроль відповідно до них навколишнього повітря. В даний час аналогічні роботи по стандартизації проводяться стосовно і до інших ферментам у вигляді аерозолів.

7.3 Навчання персоналу та медичний захист

Після інженерних засобів і методів забезпечення безпеки найважливіша роль у безаварійної роботі належить навчанню персоналу правильному поводженню з відповідними матеріалами та обладнанням. Перш за все тут важливо підкреслити необхідність дотримання загальних правил безпечної роботи. Наприклад, на підприємствах по виділенню ферментів застосовуються машини, оснащені потужними електричними двигунами і потребують великих витрат води. У таких умовах вкрай важливо приділяти особливу увагу забезпеченню безпечної електропроводки і електроізоляції. На додаток до зазначеного слід мати на увазі, що висока біологічна активність одержуваних і оброблюваних матеріалів ставить на особливу щабель проблему особистої гігієни працюючого персоналу. На підприємстві слід користуватися чистою захисної спецодягом, не допускаючи роботи персоналу в домашньому одязі. При виході з підприємства кожен працюючий зобов'язаний ретельно вимити руки.

Прийом їжі та куріння всередині виробничих приміщень категорично забороняються.

Бажано, щоб всі, хто працює з великими кількостями: цільових і проміжних продуктів піддавалися первинного медичного огляду і проходили періодичні медичні перевірки. Необхідно організувати справу так, щоб з приводу будь-яких симптомів, не пояснюваних зовнішніми причинами, всі працюючі давали негайну інформацію по службі. Медичні огляди та періодичні перевірки повинні передбачати функціональні дослідження крові та органів дихання, рентген грудної клітки, а при можливості і шкірні проби на алергію. Не виключено, що окремі особи, колись перехворіли на сінну лихоманку або іншими алергічними захворюваннями або мають в роду родичів з подібними захворюваннями, будуть піддаватися при роботах особливому ризику, зокрема у відношенні шкірних подразнень. Підстав для відсторонення таких осіб від участі в роботах дуже мало, але можливість алергії повинна бути роз'яснена їм заздалегідь.

7.4 Обробка відходів

Обов'язок забезпечити безпеку персоналу підприємств повинна супроводжуватися такими ж заходами щодо захисту всіх інших людей від якого б то не було впливу всіх видів відходів, що скидаються з підприємств. Відводиться повітря повинне піддаватися фільтрації і контролюватися на чистоту. Для заміни фільтрів і їх знешкодження повинні бути розроблені безпечні процедури. Тверді відходи підлягають автоклавуванню, а потім зазвичай викидаються на звалище. Обробка рідких відходів частково визначається місцем розташування підприємства. Місцеві інструкції регламентують головним чином такі фактори, як сприятливе біологічне споживання кисню і заходи щодо виключення зі стоків солей, що володіють, наприклад, корозійною дією. Присутність у стічних водах мікробних клітин не обов'язково буде являти собою небезпеку, так як вміст їх у звичайних стічних водах буває досить високим. Однак окремі види або навіть штами мікроорганізмів можуть виявитися небезпечними або незвичайними для побутових стоків даного району. Вплив же на характер стоків і на їхню безпеку (або небезпеку) таких факторів, як внутрішньоклітинні матеріали і ендотоксини, з'ясовано поки тільки частково.

7.5 Безпека і нешкідливість продукту

Стандарти, пов'язані з безпеки та нешкідливості продуктів, різні в різних країнах. Вони грунтуються в більшості випадків па довгострокових спостереженнях за застосуванням тих чи інших продуктів. (препараты, большей частью оцениваемые как безопасные) точно отражает то положение, что конкретный препарат, который в момент своего появления был отнесен к безопасным, в определенное время может оказаться небезопасным. Американський перелік під кодовою назвою GRAS (препарати, більшою частиною оцінювані як безпечні) точно відображає те положення, що конкретний препарат, який у момент своєї появи був віднесений до безпечних, в певний час може виявитися небезпечним. Практичним висновком із законів про безпеку продуктів є той факт, що лише обмежене число мікробіологічних джерел ферментів допускається до застосування в промисловості в тому випадку, якщо одержувані ферментні препарати призначаються для використання у продуктах харчування. допускается вносить только после длительных испытаний соответствующих препаратов. Доповнення до переліку GRAS допускається вносити тільки після тривалих випробувань відповідних препаратів. Це означає, що великі капіталовкладення в розробку того чи іншого продукту доводиться робити без достатніх гарантій того, що цей продукт із нового сировинного джерела буде дозволений до використання.

Принципи побудови безпечних технологічних процесів-в узагальненому вигляді представлені нижче. Відповідальність за безпеку повинна лежати в однаковій мірі на чолі управління даного підприємства і на не що залежить від нього працівника зовнішньої інспекції.

Інженерні заходи

  1. Огорожа підприємства.

  2. Повна ізоляція робочого обладнання від зовнішнього середовища.

3. Контроль повітря загального призначення і окремо повітря, що відходить від робочих установок і з робочих приміщень.

    1. Суворий контроль входу персоналу на підприємство і виходу з нього.

    2. Застосування захисного одягу.

    3. Санобробка і деконтамінація персоналу.

    4. Організація спеціальних зон прийому їжі.

Контроль навколишнього середовища

  1. Регулярне чищення підприємства.

  2. Побудова процесів зі зведенням до мінімуму ризику.

  1. Первинне і періодичні визначення фону повітря.

  2. Первинне і періодичні вимірювання величини повітряних потоків.

  3. Контроль устаткування в ході операцій.

Спостереження за персоналом

  1. Первинні та періодичні диспансерні огляди.

  2. Постійна реєстрація відсутніх і хворих.

  3. Встановлення системи інформації про нещасні випадки та про захворювання.

  4. Постійний зв'язок і взаємодія з медичними працівниками.

8. Резюме по процесах виділення

8.1 Виділення позаклітинних ферментів

Число послідовних технологічних стадій для виділення позаклітинних ферментів зазвичай менше, ніж для внутрішньоклітинних. Однак існує широкий діапазон можливих операцій і рівнів фракціонування. У табл. 1 в узагальненому вигляді представлені деякі альтернативні технологічні стадії, а також наведено кількісні дані про ступінь концентрування продуктів на окремих стадіях і в цілому по процесу. Інтерес представляє в першу чергу ступінь концентрування ферменту з культуральної рідини, а не його чистота. Відносне досконалість кожного процесу і методу, а саме різних методів осадження, процесів сепарації в системі тверде тіло - рідина, концентрування і висушування оцінюється саме за показником системи концентрування.

описал технологию выделения а-амилазы из В. subtilis с выходом 63 % следующим образом: Underkofler описав технологію виділення а-амілази з В. subtilis з виходом 63% наступним чином:

культура. Вихідна культура. на питательном агаре; инкубация при 32 °С; хранение при 0—5°; пересев каждые 2 мес. В. subtilis на живильному агарі; інкубація при 32 ° С; зберігання при 0-5 °; пересівання кожні 2 міс.

колбы. Посівні колби. Колби місткістю 2,2 л, що містять 1 л середовища; інкубація 12 год при 32 ° С па гойдалці з зворотно-поступальним рухом.

180 л среды; 10 ч при 32 °С; давление в емкости 0,2 кгс/см 2 ; подача воздуха 150 л/мин; частота вращения мешалки 150 об/мин. Посівна ємність. 180 л середовища; 10 год при 32 ° С; тиск в ємності 0,2 кгс / см 2; подача повітря 150 л / хв; частота обертання мішалки 150 об / хв.

Комплексная среда в составе: мука соевых бобов 1,85% с содержанием растворимых сухих веществ 0,76%; ферментативный гидролизат казеина 0,65%; лактоза 4,75%; MgS 0 4 -7 H 2 0 0,04%; противопенный агент 0,05%. Ферментація. Комплексна середовище в складі: борошно соєвих бобів 1,85% з вмістом розчинних сухих речовин 0,76%; ферментативний гідролізат казеїну 0,65%; лактоза 4,75%; MgS 0 4 -7 H 2 0 0,04% ; протипінних агент 0,05%. Кількість середовища 5000 л; температура 35 ° С; тиск у ферментаторі 0,3 кгс / см; частота обертання мішалки 170 об / хв; подача повітря 3000 л / хв.

нативного фермента. 5500 л культуральной жидкости (2160 BAU /мл); 2% диатомита к объему культуральной жидкости, вакуумная предфильтрация с подвижным ножом; объем фильтрата с промывной водой 5000 л (2000 BAU /мл). Виділення розчиненого нативного ферменту. 5500 л культуральної рідини (2160 BAU / мл), 2% діятимуть до обсягу культуральної рідини, вакуумна Передфільтрація з рухомим ножем; обсяг фільтрату з промивної водою 5000 л (2000 BAU / мл).

13600* л денатурированного спирта добавлено при перемешивании; после выстаивания декантация надосадочной жидкости; добавлено 4500 л спирта; надосадочная жидкость вновь декантирована. Осадження. 13600 * л денатурованого спирту додано при перемішуванні; після вистоювання декантація надосадової рідини; додано 4500 л спирту; Надосадова рідина знову декантировали.

Сепарація в системі тверда речовина - рідина. помощью пластинчатого и рамного прессов. Высушивание. Вакуумная сушка в течение 8 ч. За допомогою пластинчастого і рамного пресів. Висушування. Вакуумна сушка протягом 8 ч.

Продукт— 73,5 кг (102000 BAU / r ) смешан с 385 кг гипса (16800±5 BAU / r ). Оздоблювальні операції і складання композиції. Продукт-73,5 кг (102000 BAU / r) змішаний з 385 кг гіпсу (16800 ± 5 BAU / r).

Дані більш пізніх розробок в нашому розпорядженні відсутні. Проте не викликає сумніву, що новітні методи флокуляції, ультрафільтрації та висушування зробили свій вплив на побудову відповідних процесів. Типова схема виробництва позаклітинних ферментів показана на рис. 3.

8.2 Виділення внутрішньоклітинних ферментів

У вступі в цю главу зазначалося, що виділення внутрішньоклітинних ферментів вимагає фракціонування дуже складної суміші продуктів у порівнянні з простою обробкою позаклітинної культуральної рідини при отриманні відповідних ферментів. Це фракціонування за останні 50 років закріплено в багатьох конкретних методах обробки. Серед працівників лабораторій вкоренилася тенденція розглядати кожен метод виділення ферментів як унікальний. Безсумнівно справедливо, що кожен фермент відрізняється специфічністю, але думка про те, що для кожного ферменту метод виділення повинен бути обов'язково свій, веде до уповільнення створення технології та окремих її операцій. А фактично аналіз будь-якого набору практичних рецептів для виділення ферментів показує, що широко застосовується в реальних умовах лише відносно невелике число процедур. Безумовно, промислове виділення внутрішньоклітинних ферментів вимагає більшої гнучкості при застосуванні різних методів, ніж виділення позаклітинних ферментів. Тим не менше, і для виділення внутрішньоклітинних ферментів може бути розроблена відносно стабільна технологія і обладнані виробничі лінії. Виділення аспарогенази на промисловому рівні підтверджує подальші можливості вдосконалення цього процесу.

Вместимость встряхиваемых на качалке колб 250 мл, ферментаторов от 400 л до 75,7 м 3 (выход снижается до 70%). Ферментація. Місткість струшує на гойдалці колб 250 мл, ферментаторів від 400 л до 75,7 м 3 (вихід знижується до 70%). Середа - настій пшениці; критичний живильний компонент-амінокислоти; потужність енергії, що підводиться 0,3-0,4 л. с./378, 5 л.

Дисковая центрифуга с соплами (1300 g ), производительность 26.5 л/мин. Виділення клітин. Дискова центрифуга з соплами (1300 g), продуктивність 26.5 л / хв. Концентрування від 6 г / л до 120 г / л (за масою СВ).

Гомогенизатор APV фирмы « Manton Руйнування клітин. Гомогенізатор APV фірми «Manton »,— 2- кратное пропускание (563 кг на см 2 ); при первом пропускании высвобождается 90% фермента, при втором —97%; подъем температуры до 30 °С; охлаждение рассолом. Gaulin », - 2 - кратне пропускання (563 кг на см 2); при першому пропущенні вивільняється 90% ферменту, при другому -97%; підйом температури до 30 ° С; охолодження розсолом.

Добавление 3 3% этанола (пол слои жидкости); удаление твердой фазы под давлением на ротационном фильтре (11,25 м 2 ); за время менее 2 ч получается 7570 л фильтрата. Осаждение фермента. 50 % метанола; пониженные значения рН. Відділення залишків клітин і білка. Додаток 3 3% етанолу (стать шари рідини); видалення твердої фази під тиском на ротаційному фільтрі (11,25 м 2); за час менше 2 год виходить 7570 л фільтрату. Осадження ферменту. 50% метанолу; знижені значення рН.

Фильтр-пресс (1,62 м); добавление кизельгура; ресуспендирование фермента в 946,25 л воды. Переосаждение фермента. 60% метанол. Фільтрація. Фільтр-прес (1,62 м); додавання кизельгуру; ресуспендірованіе ферменту в 946,25 л води. Переосажденіе ферменту. 60% метанол.

С помощью центрифуги Шарплес с трубчатой корзиной. Відділення твердої фази: За допомогою центрифуги Шарплес з трубчастою кошиком.

Путем ультрафильтрации (выход 90 %). Концентрування. Шляхом ультрафільтрації (вихід 90%).

Сефадекс DEAE - A 50 (колонка: диаметр 29,48 см. высота 58.96 см); исходный буфер 0.025М до 0.12М; осаждение фермента; ресуспендирование; хроматография с помощью СМ-целлюлозы (0,11 г белка/г полимера); снижение содержания пирогенных веществ. Хроматографія. Сефадекса DEAE - A 50 (колонка: діаметр 29,48 см. висота 58.96 см); вихідний буфер 0.025М до 0.12М; осадження ферменту; ресуспендірованіе; хроматографія з допомогою СМ-целюлози (0,11 г білка / г полімеру) ; зниження вмісту пірогенних речовин.

С помощью 0,6 объема этанола; рН 5. Кристалізація. За допомогою 0,6 обсягу етанолу, рН 5. Збір осаду за допомогою центрифуги з твердою кошиком.

Обработка углем, стерилизующая фильтрация; обработка маннитолом; сушка сублимацией. Стерилізація. Обробка вугіллям, стерилізуюча фільтрація; обробка маннитолом, сушіння сублімацією.

Вихід. 1 кг кристалічної аспарагінази (30%-загальний вихід); тривалість усього циклу -24 год; численні стадії обробки перед ультрафільтрацією; стерилізація, яка не повністю стосується аспарагінази; ламінарний рух повітря, вода, вільна від пірогенних речовин.

8.3 Безперервне виділення ферментів

При розгляді окремих операцій було показано, що здійснення, наприклад, таких стадій, як осадження, сепарація в системі тверда фаза - рідина, класичними періодичними методами виявляється занадто складним. Масштабування періодичних процесів при неминуче збільшення тривалості процесу часто супроводжується значною втратою активності ферменту. Безперервні операції мають ще те додаткове перевагу, що вони дозволяють використовувати устаткування в незначних масштабах і в цьому відношенні в позитивну сторону відрізняються від періодичних процесів, які, як правило, мають справу з великогабаритним обладнанням. Безперервне виділення ферментів ускладнюється вимогою надійності застосовуваного устаткування і вибору його з таким розрахунком, щоб продуктивності на окремих стадіях процесів були рівні. Вирішення цих проблем може бути значно спрощене завдяки впровадженню невеликих проміжних ємностей, що грають роль буферних, і переведення повністю безперервного режиму в напівбеззупинним.

8.4 Одночасне виділення позаклітинних і внутрішньоклітинних ферментів

Переважна більшість схем виділення ферментів передбачають регенерацію окремих ферментів. У разі позаклітинних ферментів це може бути підтверджено на багатьох прикладах, оскільки практично лише один позаклітинний фермент в суміші різних продуктів має значну концентрацію. Для додаткового отримання внутрішньоклітинних ферментів чи інших внутрішньоклітинних продуктів потрібно зруйнувати клітини і піддати отриману суміш суворому фракціонування. Однак, якщо здійснено виділення хоча б одного внутрішньоклітинного ферменту, до вартості процесу додатково додається вартість руйнування клітин і видалення їх залишків і значно перевершує її вартість осадителей і адсорбентів незалежно від того, скільки ферментів і інших продуктів фактично виділено з клітин. У цьому відношенні корисно проведення аналогії з фракціонуванням нафтових продуктів.

Відомо безліч прикладів одночасного виділення з субстрату ряду тварин ферментів. Особливо добре розроблений процес виділення гликолитических ферментів з м'язової тканини. Остання дуже підходить для цієї мети, оскільки різні ферменти містяться в ній у досить високих концентраціях. Одночасне виділення внутрішньоклітинних мікробних ферментів здійснюється поки вкрай рідко, є менш прямим процесом, вивчення якого почалося, по суті справи, тільки в самий останній час. Є підстави вважати, що афінна хроматографія може істотно полегшити розробку технології одночасного виділення внутрішньоклітинних та позаклітинних мікробних ферментів. Прогресу зазначених досліджень і розробок буде також сприяти розробка більш екс-прессних систем аналітичного контролю, оскільки останній при процесах виділення декількох ферментів є виключно складним, особливо під час розробки цих процесів.

Список використаних джерел

  1. Д. Уонг, Ч. Коонен. Ферментація і технологія ферментів. М: Легка і харчова промисловість, 1983р.

  2. Ред. колегія М. Ф. Гулий. Ферменти в медицині, харчовій промисловості та сільському господарстві. Київ, «Наукова думка», 1968р.

  3. Ред. акад. А.А. Імшенецький. Ферменти мікроорганізмів. М.: «Наука», 1973р.

  4. Ред. Я.М. Варшавського. Ферменти і синтез біополімерів. М.: «Світ», 1967р.

  5. Н.П. Блінов. Основи біотехнології. Для студентів інститутів; аспірантів і практичних працівників. Видавнича фірма «Наука». СПб | 1995р.

  6. В.К. Акименко. Альтернативні оксидази мікроорганізмів. М., Наука, 1989.

  7. Бейлі Дж., Олліс Д. Основи біохімічної інженерії, в 2 частинах. М., Мир, 1989.

  8. . M . A. M. Єгоров., А.П. Осипов., Б.Б. Дзаптіев., Є.М. Гаврилова. Теорія і практика імуноферментного аналізу. М.. Вища школа, 1991р.

  9. Іммобілізовані клітини і ферменти. Методи. Під ред. Дж. Вудворда. М., Мир, 1988


Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Курсова
186.5кб. | скачати


Схожі роботи:
Способи отримання спиртів
Способи отримання алюмінію
Деякі способи отримання спиртів
Способи отримання енергії з відходів
Аудиторські докази способи їх отримання
Заготівлі поняття способи отримання
Нетрадиційні способи та джерела отримання енергії
Альдегіди і кетони загальні відомості і способи отримання
Застосування ферментів у медицині
© Усі права захищені
написати до нас