Специфікація нервової тканини
Регіональна специфікація нервової тканини
У дорослих тварин клітини різних областей нервової системи мають істотні відмінності у своєму фенотипі в залежності від тієї функції, яку вони виконують. Клітини мозочка відрізняються від клітин кори півкуль, і обидва типи клітин - від сітківки. Яким чином відбувається формування таких різних фенотипів клітин у процесі розвитку? Як і в інших клітин, фенотип нейрона визначається тим, які гени він експресуються, що, у свою чергу, контролюється факторами транскрипції, білками, які зв'язуються з регуляторними зонами одного або декількох генів і впливають на процеси їх транскрипції. Розвиток характеризується послідовною і ієрархічної експресією факторів транскрипції, кожен з яких впливає на експресію подальшого і обмежує кінцевий фенотип клітини.
Рис. 1. виде сильно сегментированной структуры.
Розвиток заднього мозку хребетних β вигляді сильно сегментованої структури. (А) Діаграма триденного ембріона курчати, що ілюструє сегментарну організацію ромбомеров (r1-r8) в задньому мозку. (В) Паттерн організації клітин у ромбомерах r1-r7 триденного мозку курчати. Ретикулярні нейрони (ліворуч) і брахіомоторние нейрони (праворуч) утворюють сегментарний повторюваний патерн. Мотонейрони і їх аксони утворюють черепно-мозкові нерви V, VII і IX пари.Дослідженню регіональної специфікації нервової тканини в мозку хребетних значно допомогло те, що були відкриті гомологи генів плодової мухи дрозофіли, які визначають розташування і яка від розташування диференціювання клітин ембріона. Ці гени виявилися схожими з генами хребетних і часто виконують подібні функції. Більшість з цих генів кодує фактори транскрипції.
Рис. 2. Сегментарна експресія генів у ромбомерах з r1 до r8 в задньому мозку хребетних. Сірі смужки вказують ромбомери, в яких відбувається експресія генів; чорні смужки вказують високий рівень експресії. Ранні фактори транскрипції, рецептор тирозинкінази сімейства Eph і його ліганди утворюють сегментарний патерн ромбомеров Сімейство гомеобоксних генів Нох визначає долю клітин у межах кожного ромбомера залежно від сегменту. Дані отримані на ембріонах курчат і
мишей.Гомеотіческіе гени і сегментація
Дивовижними прикладом подібного подібності у функціонуванні генів у настільки різних тварин є результати досліджень заднього мозку хребетних. На відміну від усього іншого мозку хребетних, задній мозок ембріона (rhombencephalon) має чітке сегментарне будову. Кожен сегмент його демонструє загальний патерн нервової диференціювання, однак від сегменту до сегменту диференціювання має свої особливості (рис. 1). Було ідентифіковано кілька генів, патерни експресії яких на ранніх стадіях розвитку корелюють з межами сегментів заднього мозку (рис. 2). Ці гени діляться на дві категорії:
(1) Гени першої категорії грають роль у створенні спільної структури, що складається з повторюваних сегментних одиниць. Деякі гени цієї групи кодують фактори транскрипції (kreisler, Krox-20), інші кодують рецептор тирозинкінази (Sek-l по Sek-4) або його ліганди (Elf-2). (Рецептор тирозинкінази представляє собою трансмембранний білок, у якого внутрішньоклітинний домен, що представляє собою фермент тирозинкіназ, активується при зв'язуванні ліганда з позаклітинним доменом.)
(2) Друга категорія містить гени, які визначають долю кожного сегмента. Ці гени утворюють висококонсервативний сімейство Нох генів.
Властивості Нох генів були вперше описані у дрозофіли, у якої вони регулюють гомеостаз. Гомеотіческіе гени являють собою керуючі гени, які координують експресію багатьох інших генів під час розвитку. Наприклад, мутація гомеотіческіх генів сімейства Нох у дрозофіли призводить до того, що одна частина тіла замінюється іншою; таким чином на місці антени може розвинутися нога. Гомеотіческіе гени містять консервативну послідовність ДНК, гомеобокс. Гомеобокс кодує послідовність з 60 амінокислот, які розпізнають і зв'язуються з певною послідовністю ДНК серії підлеглих генів. Кожен гомеотіческій ген, таким чином, координує експресію великого числа генів, які разом визначають будову одного сегмента ембріона.
Сегментарний патерн експресії генів сімейства Нох спостерігається в задньому мозку курчат і гризунів, що приводить нас до припущення, що Нох гени можуть грати роль гомеотіческіх керуючих генів, що регулюють процеси розвитку хребетних і створення певних структур щодо рострокаудальной осі в певних областях заднього мозку ембріона. Дані, отримані при допомозі трансплантації, виключення певних генів і ектопічної експресії, узгоджуються з цими ідеями. Додатковим доказом є вивчення мутацій Нох генів і інших гомеобоксних генів у людини, які призводять до змін в певних областях ЦНС.
Наступний очевидне запитання: а що визначає патерн експресії Нох генів? Відповіддю, принаймні частково, є градієнт ретиноєвої кислоти. Ретиноєва кислота виробляється в Гензеновском вузлику, який називається Шпемановскім організатором (Spemann organizer) у ембріонів птахів і хребетних (див. рис. 3). Але ретиноєва кислота не просто активує транскрипцію всіх Нох генів: була описана систематична різниця чутливості різних генів Нох сімейства до ретиноєвої кислоти. Таким чином, дифузія ретиноєвої кислоти з Гензеновского вузлика сприяє формуванню градієнта, який відіграє велику роль у впорядкованій експресії різних Hax генів у рострокаудальном напрямку в задньому мозку.
Хорда і базальна пластинка
Будова і функпчонірованіе нервової системи хребетних варіюють у дорзовентральном і рострокаудальном напрямку. Наприклад, смужка спеціалізованих гліальних клітин, названих базальної пластинкою (floor plate), розташована по середній лінії вздовж вентральній поверхні спинного мозку. Сусідні, більш латерально розташовані Базальї області нервової трубки утворюють мотонейрони, більш дорзальний зони дають початок інтернейронах, і самі дорзальний області утворюють нервовий гребінь.
Характерні властивості вентральної хорди, такі як диференціювання базальної пластинки і освіта мотонейронів, регулюються сигналом із спинного мозку (notochord). Таким чином, якщо пересадити в ембріон еше одну хорду, поруч з нервовою трубкою, то це призведе до формування другий базальної пластинки і другої групи мотонейронів (рис. 3), а якщо у ембріона видалити хорду, то не мотонейрони, ні базальна пластинка не формуються .
Сигнали з хорди, які керують формуванням клітин базальної пластинки і мотонейронів, є продуктами транскрипції гена Sonic hedgehog24). Білок Sonic hedgehog синтезується клітинами хорди (а потім також клітинами базальної пластинки), концентрується на їх поверхнях і дифундує до сусідніх клітин. Високий рівень Sonic hedgehog на поверхні хорди призводить до формування клітин базальної пластинки з клітин нервової трубки. Більш низький рівень веде до експресії гомеотіческого гена (Mkx-2.2), що викликає розвиток клітин у вісцеральні мотонейрони. Ще більш низький рівень Sonic hedgehog викликає транскрипцію Рах-6, які пригнічують експресію Nkx-2.2, що дозволяє клітинам розвиватися за їх основним шляху і ставати соматичними мотонейронами.
Загальна схема регіональної диференціювання
Рострокаудальний і дорзовентральний градієнти факторів транскрипції визначають локальну ідентифікацію клітин в межах ЦНС. Ці ж фактори здатні приводити до розвитку досить різних властивостей в залежності від того, в якому місці ембріона вони експресуються. Наприклад, білок Sonic hedgehog визначає вентральний фенотип вздовж рострокаудальной осі, приводячи до утворення мотонейронів в спинному мозку, серотонінергічних нейронів в передній частині заднього мозку, дофамінергічних нейронів в задній частині заднього мозку, окорухових нейронів в передній області середнього мозку. Подібним же чином інші фактори транскрипції (ВМР-4 і ВМР-7) призводять до утворення дорзального фенотіпа30). Загальним правилом є те, що можливі шляхи розвитку плюрипотентні клітини-попередниці в певній галузі розвивається нервової системи в першу чергу обмежуються її становищем щодо переднезадней осі, наприклад, шляхом експресії Нох генів (рис. 23.9) 31). Можливі клітинні фенотипи надалі ще більше обмежуються з урахуванням дорзовентрального положення по середній лінії за допомогою таких посередників, як Sonic hedgedog.
Рис. 3. Індуковане хордою освіта базальної пластинки і рухових нейронів під час розвитку спинного мозку. (А і В) Специфічне фарбування за допомогою антитіл до клітин базальної пластинки (F). (А) Нормальний ембріон курчати. (В) Додавання клітин другого хорди (N) викликає освіта другої базальної пластинки. (С і D) Специфічне фарбування за допомогою антитіл до клітин базальної пластинки, рухових нейронів і афферентам спинального ганглія. (С) Нормальний ембріон. (D) При видаленні хорди клітини базальної пластинки і рухової платівки відсутні, а клітини спинального ганглія (D) займають незвичне вентральної становище. Аксони сенсорних інтернейронов, які зазвичай йдуть в складі вентральної частини спинного мозку, зараз формують пучки волокон, які залишають спинний мозок (стрілка).
Походження нейронів і клітин глії
У хребетних індукційні взаємодії між клітинами відіграють важливу роль у визначенні їхньої подальшої долі. У більш простих організмів доля клітини може бути визначена автономно на підставі її походження.
Походження клітин та індукційні взаємодії в простих нервових системах
.
Походження клітин найбільш добре досліджено на прикладі простих безхребетних, таких як п'явка, коник, плодова муха і маленька нематода Caenorhabditis ele gans. У цих препаратах можливо простежити розвиток кожної клітини і дослідити формування таких характеристик, як властивості мембрани, трансмітери, зростання аксонів і їх розгалуження. которая содержит всего около 300 нейронов, эмбрион настолько маленький и прозрачный, что можно идентифицировать каждый нейрон и проследить его работу при помощи микроскопа. У С. elegans, яка містить лише близько 300 нейронів, ембріон настільки маленький і прозорий, що можна ідентифікувати кожен нейрон і простежити його роботу за допомогою мікроскопа. Альтернативним підходом може бути маркування окремих клітин і визначення того, які типи клітин з них виходять. Такого роду аналіз, вперше запропонований Вайсблата, стентів та їх колегами для ембріонів п'явки, включає в себе вступ внутрішньоклітинних маркерів, таких як флуоресцентний декстран або фермент пероксидаза хрону (HPR), в окремі клітини і таким чином дослідження подальшого потомства або на живому ембріоні, або після фарбування ембріона, коли можна побачити клітини, в яких знаходиться фермент. Можна провести порівняльні експерименти, вводячи комплементарні ланцюга ДНК, які кодують гени флуоресцентного білка, або створюючи трансгенних тварин, які експресують цей протеїн.
Рис. 4. Система координат просторової інформації в задньому мозку хребетних, встановлювана в два етапи. (А) Спочатку визначається рострокаудальная позиція, наприклад за експресією гена Hox. (В) Після цього дорзовентральная позиція визначається градієнтами сигналів середньої лінії, такими як Sonic Hedgehog і BMP 4 / 7. (С) Результуюча двовимірна система координат просторової інформації обмежує можливий репертуар клітинної диференціювання плюріпотентних клітин-попередників.
Експерименти подібного роду показують, що у простих безхребетних цілком можливо відтворити певну послідовність у розподілі і диференціювання клітин. Таким чином, використовуючи промінь лазера можна викликати загибель окремих ідентифікованих клітин з метою простежити, яким чином це вплине на долю решти клітин. У більшості випадків ті, що вижили клітини ігнорують втрату свого сусіда, спрямування їх розвитку визначено автономно, на підставі того, до якої клітинної лінії вони належать. У подібних клітин експресія генів визначається факторами, які спочатку знаходяться в їх цитоплазмі або ядрі і являють собою незалежні внутрішньоклітинні сигнали. В інших випадках, однак, втрата сусіда може вплинути на долю тих, що вижили клітин. Таким чином, навіть у тварин, у яких є жорстко певні патерни ділення клітин, їх подальший розвиток може змінюватися в залежності від індукційних взаємодій.
Індукційні взаємодії при розвитку очей дрозофіли
Стереотипно відбувається розвиток складного очі дрозофіли являє собою ще одну систему, в якій можливе пряме спостереження для ідентифікації окремих клітин і простеження їх подальшого розвитку. Крім того, генетика дрозофіли дає дуже великі можливості для оцінки ролі походження клітин і індукційних взаємодій між ними в диференціювання нервової тканини. Можливо виділення мутантів, у яких немає певного клітинного типу або у яких патерн диференціювання лише незначно порушений, що дозволяє визначити їх вплив на долю інших клітин.
Рис. 4. Індукційні взаємодії, що регулюють розвиток фоторецепторних клітин у дрозофіли. (А) сканограмах складного очі дрозофіли. Кожна фасетки представляє собою один омматідіев. (В) Нормальний розвиток диференціювання восьми фоторецепторів в кожному омматідіев. Seven / ess (sev -) і bride of seven (boss) мутації порушують диференціювання R7. (С) Сигнальні каскади, що регулюють диференціювання R7. Продукт boss гена, інтегральний мембранний білок, екслрессіруемий в R8 (Boss), активує продукт гена sev, рецептора тирозинкінази (SevRTK). Sev кіназа запускає внутрішньоклітинний сигнальний каскад, що активує MAP кіназу, яка має кілька мішеней. MAP кіназа фосфорилирует протеїн Van (який би інакше блокував диференціювання), приводячи до його розпаду. MAP кіназа також викликає експресію білка Phyl який разом з другим протеїном, Sina, призводить до розпаду фактора транскрипції Ttk88 Ttk88 запобігає нервову диференціювання. MAP кіназа також активує Pntp2 і АР-1, два фактори транскрипції, які сприяють нейрональной диференціювання.
Подібна техніка була використана в експериментах Бензер, Реді, Рубіна, Толімсона, Цірупскі та їхніх колег, які досліджували диференціювання нейронів і супутніх (опорних) клітин ока. Око дрозофіли складається з кристалоподібний набору повторюваних одиниць, званих омматідіев (рис. 4A), кожен з яких містить 8 фоторецепторів (R1-R8). Перша клітина, яка визначає початок диференціювання в кожному омматідіев, є одним з фоторецепторів, R8. Клітини R8 з'являються хаотично в області нейроепітелія. Як тільки почалася диференціювання клітини R8, це призводить до інгібування диференціювання її сусідів у клітини R8. Потім діфференііровке піддаються клітини R2 і R5, після чого R4, R1 і R6 і, нарешті, R7 (рис. 4В). Були виявлені дві мутантні лінії, в яких очі розвиваються нормально, за винятком того, що не утворюється R7 (рис. 4В). (sev--) и brideof-sevenless (boss-- ) для обозначение отсутствия образования R7.
Такі лінії були названі sevenless (sev -) і brideof-sevenless (boss -) для позначення відсутності освіти R7. При детальному дослідженні цих мутантних ліній вперше були вивчені молекулярні механізми того, як індукційні взаємодії між клітинами можуть впливати на подальший розвиток клітин. Ген кодує рецептор sevenless (званий Sevenless, або Sev), для якого продукт експресії bride-of-sevenless гена, названий Boss, є лігандом. Під час розвитку R8 індукує утворення R7. Це відбувається, коли Boss, які експресуються на поверхні клітини R8, зв'язується з Sev, який розташований на клітці-попередниці R7 (рис. 4С). Взаємодія між Boss і Sev активує внутрішньоклітинний домен Sev рецептора, тирозинкіназ, яка ініціює сигнальний каскад в клітці R7, що приводить до її диференціювання. Сигнальний каскад є складним шляхом, який включає в себе послідовну активацію серії протеїнкінази (ферментів, які фосфорилируют білки), що призводить до інгібування негативного впливу, а також збільшенню позитивного впливу на експресію генів R7. Велика кількість сигналів, які призводять до змін в еспрессо генів, здійснюють це через тирозинкінази, які управляють даними клітинними каскадами.Походження клітин в ЦНС ссавців
Вивчати послідовність розвитку клітин в ЦНС ссавців технічно більш складно, тому що окремі клітини важче ідентифікувати і заповнити барвником. Вдалими методиками дослідження тут показали себе картування шляхів розвитку генетично помічених клітин у химерних тварин - ембріонів і дорослих, а також інфікування клітин ЦНС розвиваються тварин спеціально створеними вірусами (рис. 5). Подібні віруси сконструйовані таким чином, що вони перманентно включаються до складу хромосом клітини-господаря, реплицируются під час поділу клітини, і, отже, передаються нащадкам цієї клітини. Таким чином, інформація, яка перебуває у вірусі, не зменшується при діленні клітин. Присутність вірусу може бути потім виявлено на будь-якій стадії розвитку клітин, використовуючи білок, який він кодує. За умови, що спочатку кількість інфікованих клітин мало, надалі можна буде зробити висновок, що кластер клітин, що містять даний білок, є клоном, потомством тієї самої клітини, яка була раніше інфікована.
Наприклад, коли такий вірус був введений в око новонародженого щурика, а сітківка була досліджена в дорослому віці, білок містили як гліальні клітини, так і декілька типів нейронів. Таким чином, загальна клітина-попередниця у сітківці при розподілі утворює як нейрональні, так і гліальні клітини.
На відміну від п'явки або дрозофіли, в сітківці гризунів немає специфічної послідовності розвитку клітин, коли одна клітина утворює кілька різних типів нейронів. У даному випадку, ймовірно, клітина - попередник має деяку внутрішню інформацію (intrinsic competence) про те, як відповідати на зовнішні сигнали і сигнали, які знаходяться в навколишньому її середовищі. Ці сигнали змінюються з часом, що призводить до послідовного формування клітин різних типів. З іншого боку, коли подібні експерименти проводилися в корі великих півкуль, клони, які містили б і гліальні клітини, і нейрони, були досить рідкісні. Це дає підстави вважати, що в момент інфікування окремі популяції клетокпредшественііков гліальних і нервових клітин вже сформувалися в вентрікулярной області кори. Більш того, клони здебільшого містили виключно пірамідні або непірамідние клітини, показуючи, що поділ між цими двома лініями відбувається на ранньому етапі нейрогенеза.
Рис. 5. Клітини одного клону позначені за допомогою введення ретровірусних маркерів у сітківку щури. (А) ретровірусу, що кодує бета-галактозидазу був введений в око між сітківкою і пігментним епітелієм в ранньому періоді розвитку, що призвело до зараження декількох попередників клітин сітківки. (В) Фарбування сітківки дорослого за допомогою гістохімічне реакції на бета галактозидазу виявляє кластери, що містять мітку і є нащадками однієї клітини-попередниці. Зображення клону включає в себе 5 паличок (р), одну біполярну клітину (bp) знаходиться поблизу до термінали палички (t)
Резюмуючи вищесказане, в нервовій системі простих організмів можливий спектр подальшого розвитку клітини (lineage history) обмежує потенціал її розвитку. У ЦНС більш складних тварин існують індукційні взаємодії між клітинами, які відіграють виняткову роль у напрямку розвитку клітини. У добре відомою і іскрометною аналогії Сідней Бреннер охарактеризував два шляхи розвитку клітини як «план по-американськи» і «план по-європейськи»: «по-європейськи» те, хто ти є (який нейрон), визначається твоїми предками; «по- американськи »це визначається твоїми сусідами.
Література
1. .8 60).
Vol .8 60). New York Academy of Sciences, New York. ] [22]2. k gether, T., and Evert, B.
Kloc k gether, T., and Evert, B. 1998. Genes involved in hereditary ataxias. Trends Neurosci. 1: 413-4 1 8. 2 Січень: 413-4 1 8.3. H.
Paulson, H. ., L., chb eck, К . Н . and Fis chb eck, К. Н. 1996. ri n- u cleotide repeats in neurogenetic disorders. T ri n-u cleotide repeats in neurogenetic disorders. a . Ann a. Rev. Neurosci. 19: 79-107.4. fi eld, W., and Rasm u ssen, T.
Pen fi eld, W., and Rasm u ssen, T. 1950. Mon: A Clinical Study of Localization of Function. Macmillan, New York. The Cerebral Cortex of Mon: A Clinical Study of Localization of Function. Macmillan, New York.