Введення.
Метилювання ДНК - це процес ковалентного приєднання in vivo метильної групи до підстав у складі ДНК.
5-метилцитозин (5-міс) був першим виявленим модифікованим підставою (Hotchkiss RD, 1948). Метилювання залишків геномної ДНК має місце у бактерій, рослин, тварин, в тому числі і ссавців (включаючи людину), але відсутній у дріжджів і нематод (Caenorhabditis elegans). Крім 5-МІС ДНК прокаріот містить модифіковане підставу N6-метіладенін, тоді як ДНК вищих еукаріот - тільки 5-міс (Bird AP, 1995). Оскільки нуклеотидна послідовність при цьому не змінюється, то за своєю суттю метилювання - подія епігенетичні (Baylin SB, et al, 1998).
Найбільш складні функції метилювання ДНК виконує в клітинах ссавців. Воно залучено в такі фундаментальні процеси життєдіяльності клітини, як регуляція експресії генів і підтримання стабільності геному. У першому випадку - це стабільна репресія транскрипції певних генів (гени інактивованої Х-хромосоми у самок, імпринтовані гени, частина тканеспеціфічних генів), у другому - регулювання процесів рекомбінації та захист генома від інвазії та поширення чужорідної інформації. Очевидно, що різноманіття функцій метилювання і важливість процесів, в яких вона бере участь, припускає наявність досить жорсткого регулювання. У дослідженнях на експериментальних моделях було показано, що порушення регуляції метилювання в ембріогенезі може призводити до загибелі організму. Зміна ступеня метилювання в соматичних клітинах дорослого організму спостерігається при деяких патологічних станах у людини, в тому числі і злоякісних новоутвореннях. Далі будуть розглянуті сучасні уявлення про метилюванні ДНК в клітинах ссавців і його ролі в канцерогенезі.
Метилювання ДНК в нормальних клітинах.
Для розуміння ролі метилювання при канцерогенезі необхідно знання закономірностей протікання цього процесу в нормальному організмі.
Клітини ссавців мають здатність епігенетичні модифікувати свій геном шляхом ензиматичного по п'ятому положенню метилювання залишків цитозину в складі 5/-CpG динуклеотид. Цитозинових залишок у складі 5/-GpC або будь-яких інших динуклеотид НЕ метіліруется. Приблизно 70-80% CpG динуклеотид в геномах ссавців метиловані (Baylin SB, et al, 1998). Одночасно, їх розподіл в ДНК є не випадковим, і, в цілому, геноми збіднена по відношенню до CpG динуклеотидами (Antequera F. & Bird A., 1993). Передбачається, що саме метилювання зіграло в цьому критичну роль. 5-міс в складі CpG динуклеотид гіпермутабілен, оскільки аміногрупа в шостому положенні цитозинових кільця вкрай нестабільна. 5-МІС може легко піддаватися спонтанного дезамінування з утворенням тиміну. Ця обставина вело в процесі еволюції до численних замін пар GC на А-Т, у результаті чого динуклеотид CpG у складі ДНК приблизно в 5 разів менше (~ 1 CpG на 80 динуклеотид), ніж варто було б (1 на 16) (Gardiner-Garden V. & Frommer M., 1987).
Існують два види розподілу CpG динуклеотид у складі ДНК ссавців. Перше - це розсіяні CpG (їх ~ 80% від загальної кількості). Вони розосереджені по всьому геному у вигляді одиночних динуклеотид, причому особливої закономірності в їх розподілі виявити неможливо. Найчастіше вони зустрічаються в інтрони і набагато рідше в транскрипційного областях. Значна частина тканеспеціфічних генів мають у своїх промоторах поодинокі CpG. Ступінь їх метилювання може бути різною в різних клітинах і тканинах (Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П., 2001).
Другий вид розподілу полягає в наступному. У геномах ссавців існують короткі (від 500 до 5000 пар нуклеотидів) послідовності, де CpG дінуклеотід розподілені кластерами. Щільність їх близька до розрахункової (1 на 16), а зміст G + C перевищує 60%. Такі послідовності отримали назву CpG-острівців. Характерною властивістю цих структур є їх часта локалізація в 5/-регуляторних районах генів, але вони також зустрічаються і в інтрони, а також на 3 / - кінцях генів. Понад половини генів, що складають функціонуючий геном людини, містять CpG-острівці. До їх числа відносяться, мабуть, всі гени домашнього господарства, близько 40% тканеспеціфічних генів, багато протоонкогени і гени супресори пухлинного росту. CpG-острівці, асоційовані з регуляторними областями генів, Неметиловані у всіх тканинах ембріона і дорослого організму (включаючи і гамети), незалежно від того, експресуються в них гени чи ні. Виняток становлять тільки гени, розташовані на інактивованої Х-хромосомі у самок, а також імпринтовані гени, які експресуються тільки з одного з двох алелів, материнського або батькового. У цих генів у нормальних клітинах CpG-острівці метиловані (Baylin SB, et al, 1998; Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П., 2001). Крім того, велику частину геному ссавців (~ 95%) становить генетичний баласт чи junk ДНК, ділянки якої, піддаються інтенсивному метилюванні. Наприклад, до числа послідовностей, збагачених CpG динуклеотидами, відносяться транспозони (~ 25% геному людини) і сателітні повтори (~ 10% геному людини). Ці паразитичні елементи метиловані у всіх вивчених сайтах геному нормального дорослого організму (Selker EU, 1999). Подібним же чином у нормальних клітинах гризунів і людини інтегровані вірусні послідовності піддаються метилюванні і зумовленого ним стабільного блоку транскрипції (Walsh CP, et al, 1998).
Паттерн метилювання конкретних генів і геному в цілому встановлюється в процесі ембріогенезу і стабільно зберігається в популяціях соматичних клітин дорослого організму. Так, незабаром після запліднення, на стадії 1-2 клітинних поділів, відбувається тотальне деметилювання геному, що усуває патерн вихідних статевих клітин. Деметильованих стан ДНК зберігається до стадії імплантації бластоцисти (Razin A. & Shemer R., 1995). На післяімплантаційному стадії починається процес метилювання de novo, коли більшість CpG-сайтів знову метіліруется, за винятком тих, що перебувають у складі CpG-острівців (Tuker MS, 1999). Механізм, що дозволяє CpG-острівців уникати метилювання de novo в ембріогенезі, поки невідомий. Припускають, що захисну роль у цьому процесі відіграють специфічні цис-діючі генетичні елементи. В даний час така функція доведена для послідовності, що є одночасно сайтом впізнавання транскрипційного фактора Sp1 (Tuker MS, 1999). Пізніше, в процесі диференціювання відбувається локальне деметилювання індивідуальних генів. У результаті цих послідовних подій 70-80% CpG-сайтів в геномі людини та миші виявляється метилованими. Сформований профіль метилювання потім зберігається у ряді клітинних поколінь. Підтримуюче метилювання здійснюється тільки в тих сайтах знову синтезованої ланцюга ДНК, де у вихідній ланцюга вже містилися CpG дінуклеотід з етиловому залишком цитозину (Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П., 2001).
В даний час у ссавців, включаючи людину, відомі чотири ферменти, що здійснюють метилювання геномної ДНК. Це ДНК-метилтрансферази: Dnmt1, Dnmt2, Dnmt 3a і 3b (Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П., 2001; Robertson KD & Jones PA, 2000). Dnmt1 - найбільш вивчений на сьогодні фермент системи метилювання ДНК у хребетних. Гомозиготна делеція dnmt1 у мишей приводить до летального результату на стадії ембріона (Li E., et al, 1993). Саме це спостереження стало доказом необхідності метилювання ДНК у вищих еукаріот. У структурі Dnmt1 були виявлені два домени: каталітичний і регуляторний. Каталітичний домен локалізована в С-кінцевий області білка і структурно близький до бактеріальних цитозинових метилтрансферази. У свою чергу, регуляторний домен розташований в N-кінцевій частині Dnmt1 і містить спеціальну сигнальну послідовність, направляючу фермент в активні реплікативні комплекси діляться клітин (Bestor TH & Verdin GL, 1994). Активність ферменту різко зростає з початком синтезу ДНК і в перші хвилини після реплікації профіль метилювання дочірньої нитки відтворюється за зразком материнської. Dnmt 3a і 3b, як виявилося, необхідні для метилювання de novo (Okano M., et al, 1998a). Інактивація відповідних генів несумісна з розвитком зародка у миші. Ферменти експресуються на високому рівні в ембріонах і на дуже низькому в соматичних клітинах дорослого організму. Ці ферменти різняться за своїми функціями, так як тільки Dnmt3b небхідно для метилування центромірних мінісателітних повторів (Okano M., et al, 1999). Функції Dnmt2 залишаються поки неясними (Okano M., et al, 1998b).
В даний час нічого не відомо і про те, як відбувається тотальне деметилювання геному в ембріогенезі. Тільки зовсім недавно була відкрита ДНК-деметилази, яка за своїми властивостями є досить імовірним кандидатом на роль ферменту, що здійснює тотальне деметилювання. ДНК-деметилази здатна пізнавати метиловані CpG дінуклеотід і трансформувати 5-міс на цитозин, не порушуючи цілісності ДНК (Bhatacharya SK, et al, 1999). Що стосується механізму локального деметилювання, то для декількох тканеспеціфічних генів встановлено, що цей процес контролюється певними цис-діючими генетичними елементами, які впізнаються специфічними транс-діючими білковими факторами (Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П., 2001).
Метилювання пригнічує експресію на рівні транскрипції. Існує, принаймні, два механізми, за допомогою яких метилювання може перешкоджати транскрипції. Один з них полягає в прямому інгібуванні зв'язування специфічних факторів транскрипції (c-Myc/Myn, AP-2, E2F і ATF / CREB-подібні білки), чиї сайти впізнавання містять одиночні метиловані CpG дінуклеотід (Robertson KD & Jones PA, 2000). Другий механізм репресії опосередковується через метил-CpG зв'язуючі білки, такі як MeCP1 і MeCP2, відомі також як MBD-сімейство (Boyes J. & BirdA., 1992). Вони не проявляють специфічності до послідовності немодифікованих нуклеотидів, але мають високий ступінь спорідненості до метилірованої ДНК. Найбільш вивчений з них, MeCP2 локалізується в ядрі в гетерохроматин (неактивний, конденсована, реплікується у пізньому S-фазі). Структура білка включає 2 домену: один пов'язує метиловані CpG, другий забезпечує функції репрессора транскрипції. Взаємодіючи з метилованими підставами, MeCP2 рекрутує корепрессорний комплекс mSin3a/HDAC (гістондеацетілаза), який здійснює деацетилюванню N-кінцевих аміногруп гістонів. У результаті гістони набувають додатковий позитивний заряд і здатність міцно взаємодіяти з витками нуклеосомной ДНК. Нуклеосоми компактізуются і втрачають здатність взаємодіяти з факторами транскрипції. Навпаки, рекрутування у комплекс з транскрипційними факторами білків з гістонацетілазной активністю (НАТ) здатний знімати репресує дію метилювання, приводячи до утворення еухроматину (деконденсірован, потенційно активний, реплікується в ранній S-фазі) (Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П. , 2001; Spencer TE, et al, 1997).
Таким чином, поряд з формуванням репресивних комплексів на основі звичайних білків - репрессором, котрі дізнаються специфічні послідовності, вищі еукаріоти з ускладненим геномом мають додатковим унікальним епігенетичних механізмом регуляції транскрипції, який успадковується дочірніми клітинами при поділі.
Порушення метилювання ДНК при канцерегенезе.
За останні 15-20 років було встановлено, що патерн метилювання в неопластичних клітинах значно змінюється в порівнянні з нормальними клітинами, причому тотального деметилювання геному супроводжується збільшенням активності метилтрансферази і локальним гиперметилюванням CpG-острівців. У всіх, без винятку, досліджених неоплазіях спостерігається подібний дисбаланс метилювання. У світлі описаних вище функцій метилювання в нормальних клітинах, очевидно, що ці порушення можуть змінювати структуру хроматину і функції ДНК, вносячи тим самим значний внесок у створення генетичної і фенотипова нестабільності пухлинної клітини.
1.Тотальное гіпометілірованіе геному.
Було виявлено, що одним з первинних порушень метилування ДНК в неопластичних клітинах, є тотальне гіпометілірованіе геному. Зменшення кількості метильних груп є одним з ранніх, часто ще до появи сформованої пухлини, подією в клітинній трансформації. Напряму роль гіпометілірованія ДНК в процесі клітинної трансформації була доведена на підставі даних про те, що зміст гризунів на безметіоніновой дієті, яка веде до дефіциту донорів метильних груп, викликає гіпометілірованіе ДНК і утворення пухлин печінки (Pogribny IP, et al, 1995). Незважаючи на явну асоціацію гіпометілірованія ДНК з процесом утворення пухлин, причини і конкретні механізми, що обумовлюють його канцерогенний ефект, до цих пір залишаються неясними. Є дані, що гіпометілірованіе може зачіпати певні онкогени, такі як К-ras при раку легені і кишечника у людини. Ці локальні ген-специфічні зміни виникають на ранніх стадіях канцерогенезу і виявлені, зокрема, в доброякісних поліпах, які є попередниками карциноми кишечника (Baylin SB, et al, 1998; Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П., 2001). Тим не менш, спектр генів, які активуються в пухлинах в результаті гіпометілірованія геному, обмежений. Ймовірно, це пояснюється тим, що гіпометілірованіе зачіпає розсіяні CpG динуклеотидами. CpG-острівці не можуть бути об'єктами деметилювання. Виняток становлять імпринтовані гени і гени на інактивованої Х-хромосомі у самок. Таким чином, деметилювання може зачіпати групи тканеспеціфічних генів, що містять в регуляторних областях поодинокі CpG динуклеотидами.
Порушення імпринтингу в результаті деметилювання та його роль в канцерогенезі були доведені при вивченні пухлини Вільмса (Jirtl RL, 1999). Пухлина цього типу розвивається у дітей у ранньому віці з метанефріческіх бластних клітин. Існують спорадична і спадкова форми захворювання (RyanG., et al, 1995). Було виявлено, що в 70% випадків в пухлинах Вільмса має місце аберрантное деметилювання материнського алеля і біаллельная експресія гена інсулінподобного чинника зростання IGF2. Як відомо, при сверхекспрессіі IGF2 проявляє властивості онкогена. Біаллельная експресія IGF2 часто спостерігається в фенотипічно нормальних тканинах оточують пухлину, тобто є раннім подією при виникненні пухлини Вільмса. Порушення імпринтингу IGF2 спостерігається більш ніж в 20 різних типах пухлин (Jirtl RL, 1999).
Як вже згадувалося вище, тотальне гіпометілірованіе генома може, змінюючи структуру хроматину і переводячи його в активний стан, опосередковано впливати на експресію генів. Так, було показано, що деметилювання геному нормальних клітин під впливом 5-азацітідіна веде до трансформації деяких клітинних культур і порушення процесу розходження хромосом під час мітозу (Baylin SB, et al, 1998; Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П., 2001).
Ще одним наслідком тотального гіпометілірованія і, можливо, найбільш імовірним, є виникаюча в результаті порушення патерну метилювання загальна нестабільність геному. Так гіпометілірованіе ДНК в ембріональних клітинах миші, нокаутувавши по гену dnmt1, збільшувало частоту реарранжіровок ендогенних ретровірусів і паразитичних послідовностей, частоту утворення делеції або транслокацій деяких унікальних генів, тобто було причиною хромосомних аномалій і подальшого летального результату (Chen RZ, et al, 1998). Однак, для пухлинних клітин поки відсутні дані, які підтвердили б, що перелічені порушення, завжди присутні в них, є прямим наслідком тотального гіпометілірованія.
2.Локальное гиперметилюванням.
Локальне гиперметилюванням поширюється на невелику частину CpG динуклеотид (~ 20%), які входять до складу CpG-острівців. CpG-острівці, за відомими винятками, завжди Неметиловані в нормальних клітинах. Аберрантное гиперметилюванням CpG-острівців є особливістю імморталізованних і трансформованих клітин і пов'язане з інактивацією певних генів супресорів пухлинного росту y людини (Toyota V. & Issa J.-PJ, 1999).
Механізм локального гиперметилюванням не цілком ясний. Мабуть, важливу роль у цьому процесі відіграє підвищення метілтрансферазной активності, тим більше що воно є характерним властивістю пухлинних клітин (Robertson KD, et al, 1999). При дослідженні деяких клітинних культур було показано, що підвищення ДНК-метілтрансферазной активності часто передує злоякісної трансформації. Так, трансфекція клонованого гена людського Dnmt1 в імморталізованние фібробласти людини призводить до аберрантним метилюванні CpG-острівців в промоторних зонах ряду генів, у тому числі генів E-cad (E-cadherin) і HIC1 (hypermethylated in cancer). У теж час, CpG-острівці, асоційовані з іншими генами (наприклад, з геном-супрессором p16INK4A), не змінюють статус метилювання, незважаючи на постійну експресію Dnmt1 (Vertino PM, et al, 1996). Таким чином, очевидно, що підвищення активності Dnmt1 відіграє певну роль у аберрантним метилюванні CpG-острівців. Однак простим підвищенням рівня експресії не можна пояснити появу в ферменту здатності до метилюванні de novo. Мабуть, у трансформованих і пухлинних клітинах порушений механізм захисту CpG-острівців від метилювання. Крім того, недавно було показано, що Dnmt1 є мішенню дії онкобелков Ras і Fos, тобто активність ферменту регулюється внутрішньоклітинними шляхами, передають мітогенний сигнали (Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П., 2001).
Гиперметилюванням CpG-острівців призводить до стабільної інактивації прилежащего гена, тобто феномену MAGI (methylation-associated gene inactivation). Це відбувається в результаті виникнення стеричних перешкод до зв'язування транскрипційних факторів або гетерохроматінізаціі, опосередкованої метилцитозин-зв'язуючими білками MBD (Robertson KD & Jones PA, 2000). Якщо прилеглих геном виявиться ген домашнього господарства, то його інактивація буде летальна для клітини, але не матиме особливих наслідків для організму. Придушення експресії будь-якого з тканиноспецифічною генів завдасть певної шкоди диференціальному фенотипом клітини, не впливаючи на загальну життєздатність. У той же час, інактивація гена супресора пухлинного росту або гена репарації може створити умови для неконтрольованої проліферації (Baylin SB, et al, 1998; Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П., 2001). Аберрантное метилювання CpG-острівців є раннім подією в процесі виникнення пухлини. Наприклад, гиперметилюванням промоторної регіону гена супресора пухлинного росту p16INK4A при плоскоклітинному раку легені було виявлено вже в гіперплазії (Baylin SB, et al, 1998).
Ген ретинобластоми (Rb1) - перший класичний ген супресор пухлинного росту, стосовно якого було встановлено феномен MAGI. Важливість цього гена визначається тим, що, як вважають, все (або майже всі) антипроліферативний сигнали реалізуються в клітці опосередковано, через білок Rb або споріднені білки (Hanahan D. & Weinberg RA, 2000). Білок Rb синтезується протягом усього клітинного циклу і майже весь час присутні в неповністю фосфорильованій вигляді. Така форма білка здатна зв'язувати чинники, що відповідають за перехід клітини з фази G1 у фазу S, тобто бере участь у негативній регуляції клітинного циклу (Kouzarides T., 1995). Коли білок Rb фосфорилюється з допомогою специфічних для клітинного циклу кіназ (наприклад, циклінів D1/CDK4), пов'язані з ним ефектори вивільняються і запускають перехід в S-фазу.
Сама по собі, ретинобластома представляє собою пухлина, що розвивається з ембріональної сітківки і успадковане в більшості випадків за аутосомно-домінантним типом з 90%-ної пенетрантностью. Крім сімейних випадків виникнення ретинобластоми описані і спорадичні випадки (Киселев Ф.Л., 1998). Гиперметилюванням CpG-острівця промотора гена Rb1 має місце лише за спорадичної (унілатеральной) ретинобластомі в 10-15% випадків (Hanahan D. & Weinberg RA, 2000). До теперішнього часу відомо дуже багато генів супресорів пухлинного росту, інактивованих в різних пухлинах шляхом гіпеметілірованія CpG-острівців, локалізованих в їх регуляторних областях. Серед них: гени Rb1, р53, VHL, BRCA1, MLH1 та інші (Baylin SB, et al, 1998; Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П., 2001; Robertson KD & Jones PA, 2000; Hanahan D. & Weinberg RA, 2000; Кисельов Ф.Л., 1998).
3.5-МІС як ендогенний мутаген.
5-МІС може піддаватися спонтанного дезамінування навіть при звичайних умовах теплових флуктуацій, що робить CpG сайти "гарячими точками" для виникнення мутацій. CpG дінуклеотід, розташовані в кодують регіонах генів супресорів пухлинного росту можуть спровокувати мутації, що приводять до виникнення пухлини (Rideout WMI, et al, 1990). Про серйозність цього феномену свідчить та обставина, що з 300 мутацій гена р53, головного зберігача цілісності геному, зареєстрованих в пухлинах людини різної локалізації, 25-30% ставляться до мутацій цього типу або епімутаціям (Greenblatt MS, et al, 1994).
Збільшення мутабельності 5-МІС може бути обумовлено трьома факторами: різною ефективністю репарації, швидкістю спонтанного дезамінування і швидкістю поділу клітин (Robertson KD & Jones PA, 2000). Дезамінування 5-МІС призводить до утворення тиміну, такого ж природного підстави ДНК, як і інші, і тому можливі помилки системи репарації. Серйозність проблеми полягає в тому, що заміни нуклеотидів виникають досить часто. Згідно з розрахунками, за добу в кожній клітині відбувається ~ 100 реакцій дезамінування, з яких багато хто приводить до мутацій (Ліхтенштейн А.В. & Кисельова Н.П., 2001). Що стосується третього чинника, то виявилося, що пов'язані з CpG мутації швидше відбуваються в ушкоджених тканинах у процесі відновлення (Greenblatt MS, et al, 1994).
Висновок.
Характерною рисою пухлинних і трансформованих in vitro клітин ссавців є дисбаланс метилювання геномної ДНК, який робить значний внесок у створення генетичної і фенотипова нестабільності. У теж час, нестабільність 5-міс в складі CpG динуклеотид, що призводить до епімутаціям, може мати той же кінцевий результат. Таким чином, метилювання, будучи епігенетичної модифікацією ДНК, може у разі порушення приводити до генетичних змін, роблячи очевидною взаємозв'язок між генетичними і епігенетичними процесами при виникненні та розвитку пухлини.
Порушення патерну метилювання проявляється на ранніх стадіях злоякісної трансформації клітин ссавців. З медичної точки зору це відкриває можливості для ранньої діагностики і лікування захворювання. Тим більше, що на відміну від мутацій, які принципово незворотні, модифікації ДНК, хоча і досить стабільні, але принципово оборотні.
Література
Antequera F., Bird A. (1993) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90, 11995-11999;
Baylin SB, Herman JG, Graff JR et al (1998) Adv.Cancer Res., 72, 141-196;
Bestor TH, Verdin GL (1994) Carr.Opin. Cell Biol., 259, 946-951;
Bhatacharya SK, Ramchandani S., Cervoni N., Szyf M. (1999) Nature, 397, 579-583;
Bird AP (1995) Trends Genet., 11, 94-100;
Boyes J., BirdA. (1992) EMBO J., 11, 327-333;
Chen RZ et al (1998) Nature, 395, 89-92;
Gardiner-Garden V., Frommer M. (1987) J.Mol.Biol., 196, 261-268;
Greenblatt MS, Bennett WP, Нollstein M., Harris CC (1994) Cancer Res., 54, 4855-4878;
Hanahan D., Weinberg RA (2000) Cell, 100, 57-70;
Hotchkiss RD (1948) J.Biol.Chem., 168, 315-322;
Jirtl RL (1999) Exp. Cell Res., 248, 18-24;
Кисельов Ф.Л. (1998) Молекулярна Біологія, 32, 197-205;
Kouzarides T. (1995) Sem.Canser Biol., 6, 91-98;
Ліхтенштейн А.В., Кисельова Н.П. (2001), Біохімія, 66, 293-317;