Розвитку нейрона момент часу

РОЗВИТКУ НЕЙРОНА, МОМЕНТ ЧАСУ
Взаємозв'язок між часом освіти нейронів і долею клітин
Істотний чи для розвитку нейрона момент часу, коли його клітина-попередниця припиняє ділитися і мігрує геть від вентрікулярной зони? На це запитання можна відповісти за допомогою маркування нейронів в той час, коли вони переходять у постмітотіческое стан, або «народжуються». У цій техніці, вперше розробленої Ангевіном і Сідманом, проводиться одноразове введення ^[3 Н]-тимідину або внутриматочно, або внутрішньовенно у визначений день розвитку. Ця позначка захоплюється і вбудовується в ДНК клітини, що знаходиться у стадії поділу в даний момент. Невстроівшійся тимідин швидко зникає з кровотоку. Таким чином, клітини, які знаходяться в постмітотіческой стадії, не містять позначки. У клітці, яка продовжує ділитися після введення мітки (гліальні клітини і клітини-попередниці, які залишаються в вентрікулярной зоні), мітка може зменшуватися в концентрації під час подвоєння ДНК і наступного за ним поділу клітини. Однак, якщо клітина ділиться під час піку концентрації ^[3 Н]-тимідину і одна або обидві дочірні клітини припиняють поділ, мігруючи геть від вентрікулярной зони і диференціюючись в нейрони, тоді ці нейрони мають дуже високу концентрацію ^[3 Н]-тимідину. Таким чином, шлях розвитку нейрона, що утворився в певний день розвитку, може бути візуалізувати шляхом одноразового введення ембріону ^[3 Н]-тимідину в даний день, після чого триває нормальний розвиток ембріона, і надалі ауторадіографії використовується для виявлення помічених клітин.
Використання цієї техніки дало змогу виявити, що в головному мозку (ГМ) ссавців є систематична взаємозв'язок між часом освіти нейрона і місцем його остаточного розташування в корі ГМ; розвиток відбувається за принципом «навпаки» (inside-out fashion) 1)
Рис. 1. Нейрогенез первинної зорової кори кішки. (А) Ауторадіограмма зрізів кори дорослої тварини з ^[3 Н]-тимідину, введеним ембріону на 33-й (ЕЗЗ) і 56 (Е56) день. Мікрофотографія цих же зрізів в світлому полі, забарвлених крезів Віолета, показує, що найбільш забарвлені клітини розташовані в шарі 6 кори після введення у віці ЕЗЗ і в шарах 2 і 3 після введення у віці Е56. (В) Гістограма, що показує розподіл клітин, помічених в різні терміни між Е30 і Е56, ілюструє inside-out патерн розвитку зорової кори.

Нейрони найглибших кортикальних шарів утворюються в першу чергу. Нейрони самих поверхневих шарів утворюються пізніше і мігрують через клітини більш глибоких шарів до місця свого остаточного розташування в корі. Схоже відповідність між часом освіти і остаточним розташуванням нейрона спостерігається і в інших відділах нервової системи, хоча і не у всіх.
Яким чином мігрують нейрони? Чи відбувається цей процес спонтанно в напрямку зсередини назовні, поки вони не досягнуть поверхні развіваюшейся кори, або мігруючий нейрон здатний розпізнавати певний шар, куди він повинен мігрувати? Експерименти на розвиваються тхорах показали, що кортикальні нейрони здатні мігрувати в строго певну позицію (рис. 2). Клітини, в тому числі ембріональні попередники нейронів шару 5 і 6, витягали з вентрікулярной зони ембріонів на ранніх стадіях і трансплантували в вентрикулярна зону ембріонів на більш пізніх термінах, в область клітин, що є попередниками більш поверхневих шарів 2 і 3. фазе клеточного цикла (когда происходит синтез ДНК), изменяли свое развитие: нейроны, образовавшиеся из них, мигрировали в слои 2 и 3. Клітини-попередники, які були трансплантовані в ранній S фазі клітинного циклу (коли відбувається синтез ДНК), змінювали свій розвиток: нейрони, що утворилися з них, мігрували в шари 2 і 3.
Рис. 2. Шар визначає напрямок диференціюю ки в корі тхора. (А) Неї ку, що утворилися на терміні Е29, мігрують і утворюють шар 6 кортикальної пластинки у дорослих. (В) Нейрони, що утворилися в перший день постнатального розвитку (Р1) мігрують і утворюють шар 2 / 3 кортикальної пластинки дорослих. (С) Клітини, пересаджені з вентрікулярной зони Е29 ембріона в вентрикулярна зону Р1 новонароджених, слідують одним з двох можливих шляхів розвитку. Клітини, пересаджені на пізніх стадіях свого останнього клітинного циклу або вже як постмітотіческіе нейрони, ще не мігрували з вентрікулярной зони (показано чорним), зберігають свою вихідну диференціювання і мігрують в шар 6.
клеточного цикла (показано серым), меняют свою дифференцировку и мигрируют в слой 2/3. Клітини, пересаджені під час фази S клітинного циклу (показано сірим), змінюють свою диференціювання і мігрують в шар 2 / 3.

Однак, якщо клітини були трансплантовані на більш пізніх стадіях їхнього останнього клітинного циклу або вже були постмітотіческімі нейронами, мігрували з вентрікулярной зони, вони зберігали свою вихідну диференціювання. Вони мігрували тільки в межах шару 6, де зупинялися і утворювали зв'язку, характерні для свого типу диференціювання. Таким чином, область, куди буде мігрувати кортикальний нейрон визначається, поки він знаходиться в вентрікулярной зоні, безпосередньо перед фінальними митозом клітини.
Генетичні аномалії будови кори у мишей лінії reeler
(названных так из-за своей неровной походки). Інший приклад того, як визначається подальший розвиток нейрона до того, як він досягне свого остаточного розташування, виявлений у мутантних мишей лінії reeler (названих так із-за своєї нерівній ходи). более молодые нейроны не мигрируют сквозь слои других клеток. У розвивається корі мишей reeler молодші нейрони не мігрують крізь шари інших клітин. Таким чином, їх розташування відносно один одного у дорослих протилежне: нейрони, утворені раніше, розташовуються в більш поверхневих шарах, а нейрони, народжені пізніше, - у більш глибоких. Незважаючи на аномальне розташування, нейрони мають правильну вихідну морфологію (визначається моментом народження) і утворюють між собою зв'язку в залежності від часу утворення. Виходить, що морфологія кіркових нейронів і природа їх синаптичних взаємодій визначаються у момент народження нейрона і можуть виявлятися незалежно від його розташування. Такий reeler фенотип є результатом великої кількості дрібних змін в результаті мутації в корі та інших областях мозку.
Продуктом експресії гена reeler є великою глікопротеїн позаклітинного матриксу, званий reelin. Він не експресується в кортикальних клітинах, не мігруючих правильним чином, а в основному експресується у клітинах Кахаля-Ретціуса в крайовій зоні кори. Порушення експресії інших генів в кортикальних клітинах можуть приводити до схожих з reeler фенотипам прояви. Наприклад, мутація цитоплазматичного білка, що містить фосфотірозін (cytoplasmic phosphotyrosine-containing protein), названого Disabled-1, також призводить до reeler фенотипом, як і генетичне виключення (knock-out) рецептора ліпопротеїнів низької щільності разом з рецепторами 2 типу до аполіпопротеїну Е. На підставі цього можна судити про те, що ці три білки є частиною внутрішньоклітинного механізму, який дозволяє кортикальним клітинам розпізнавати сигнал з reelin-білка, що передається через позаклітинний матрикс, і використовувати цей сигнал для встановлення правильної структури шарів кори. Велика кількість інших генетичних мальформацій в корі ГМ людини пов'язано з порушенням міграції нейронів.
Вплив локальних сигналів на корковую архітектуру
Прикладом здібності кіркових нейронів змінювати свою будову після того, як вони мігрували геть від вентрікулярной зони, є експеримент, в якому шматочок розвивається зорової кори був пересаджений в область подання вібрис соматосенсорной кори ^щура,. Нейрони в трансплантант реорганізувалися і сформували чітко помітну колончатую структуру, характерну для їх нового місцезнаходження, утворюючи фенотип, не характерний для зорової кори. Таким чином, внутрішні впливи можуть визначати особливості фенотипів кіркових нейронів.
Гормональний контроль за розвитком нервової системи
У деяких областях ЦНС розвиток нейронів знаходиться під гормональним контролем. Це особливо помітно в областях мозку, що визначають сексуальну поведінку. center, HVC) играет ключевую роль в приобретении и запоминании песни — что является исключительно мужским поведением. Наприклад, у таких співочих птахів, як канарки, ядро вищого вокального центру (ВВЦ, high vocal center, HVC) відіграє ключову роль у отриманні й запам'ятовуванні пісні - що є винятково чоловічим поведінкою. Ця зона мозку більше розвинена у самців, ніж у самок (рис. 3.). Однак спів можна викликати навіть у дорослих самок введенням тестостерону, в результаті чого ядро ВВЦ і інші структури, пов'язані з відтворенням пісні, збільшуються.
Ядра ВВЦ у дорослих самців і самок канарки є особливими центрами, так як там відбувається постійний кругообіг ^{нейронів).} Освіта (recruitment) нових нейронів ВВЦ у самців відбувається максимально восени і навесні, відразу після піку загибелі старих нейронів. Таким чином, у цей час відбувається модифікація їх пісень для нового шлюбного сезону. Період загибелі нейронів збігається з падінням рівня тестостерону, а утворення нових - з його піком. Призначення тестостерону самкам призводить до збільшення утворення нових нейронів у ВВЦ, які, як їх попередники, отримують певні синаптичні сигнали і посилають свої аксони до певних мішенях. Ці дивовижні спостереженнями показують, що в зрілому мозку можливо не тільки утворення нових нейронів, але також їх включення в складно влаштовану і функціонуючу систему, що призводить до перемоделювання такого властивого птахам поведінки, як їхні пісні.
Стовбурові нервові клітини
ВВЦ співочих птахів є не єдиним прикладом того, коли нові нейрони включаються до складу нервової системи дорослих тварин.
Рис. 3 .. Статевий диморфізм в головному мозку птахів. Схематична діаграма основних зон мозку і шляхів, які беруть участь у формуванні пісні у співочих птахів. Вищий вокальний центр (HVC), міцне ядро архістріатума (RA) і під'язикові ядро формують задній вокальний моторний шлях (показано чорним). HVC, зона X, медікальное дорзолатеральное ядро тала Муса (DLM) і латеральне магноцеллюлярное ядро переднього неостріатум (LMAN) утворюють передній шлях (показано сірим). HVC, під'язикової ядро і RA мають значно більші розміри у самців; зона X не виявляється в мозку самок зябликів.
Fig. 23.14. Sexual Dimorphism in the Avian Brain. Schematic diagram of the major brain areas and pathways involved in production of song in songbirds.

Нейрони також постійно оновлюються в гіпокампі і нюхової цибулини у дорослих ссавців. Однак як утворюються ці клітини? Нервові стволові клітини, які мають здатність до самовідновлення, були виділені з стінок шлуночків і з гіпокампу дорослого мозку і було простежено їх розмноження in vitro. Ці клітини можуть диференціюватися в нейрони, олігодендроцити та астроцити. Нейрони, постійно додаються в нюхової цибулини in vivo, відбуваються з повільно діляться стовбурових клітин самого внутрішнього, епендімального шару стінок бічних шлуночків (залишок початковій вентрікулярной зони). Один із нащадків кожного клітинного ділення направляється в субепендімальную зону, щоб стати там клітиною-попередницею. Клітина-попередниця швидко ділиться, утворюючи незрілі нейрони, які мігрують в ростральному напрямку в область цибулини, де вони диференціюються в інтернейрони й інтегруються в наявні мережі. При пошкодженні ЦНС клітина-нащадок стовбурових клітин стає астроцитом, а не нейроном, мігрує в область пошкодження та бере участь в утворенні рубця в області ушкодження. Таким чином, доля нащадка стовбурної клітини у дорослих може бути змінена під впливом зовнішніх сигналів.
Стовбурові нервові клітини, таким чином, представляють собою популяцію клітин, здатних розмножуватися в культурі і піддаватися диференціювання або в гліальні клітини, або в нейрони. Це забезпечує можливість використання цих клітин в якості резерву нейронів або гліальних клітин при лікуванні захворювань нервової системи, при яких спостерігається загибель клітин ГМ або їх дисфункція.
Контроль за фенотипом нейронів в ПНС
Збігаються чи є механізми, що визначають долю клітин в ПНС хребетних з механізмами, що визначають розвиток ЦНС? Наприклад, яку роль відіграють походження клітин, час їх утворення та локальні сигнали у визначенні шляху розвитку периферичних нейронів і гліальних клітин? Запрограмовані чи клітини-попередниці на формування клітин певного типу, наприклад клітин автономної, а не сенсорної системи, або на використання цими клітинами ацетилхоліну, а не норадреналіну, як трансмітера?
Подібні питання вивчалися в нервовій системі курчат і перепілок Ле Дуаріном, Вестон та іншими. В ембріоні хребетних клітини нервового гребеня, розташовані в різних місцях уздовж нервової осі, утворюють різні типи клітин ПНС (рис. 5А). Для вивчення того, чи визначено фенотип клітин, що розвиваються з нервово го гребеня, вже на ранніх стадіях розвитку або він може змінюватися при переміщенні клітин в інше місце уздовж нервової осі, Ле Дуарін пересаджував клітини з одного регіону нервового гребеня в інший регіон ембріонахозяіна і потім досліджував розвиток пересаджених клітин. У цих експериментах клітини донори бралися з ембріона перепелиці і потім имплантировались в ембріон-господар курчати таким чином, щоб пересаджені клітини можна було розрізнити з очевидних цитологічним відмінностям між клітинами перепелиці і курчати (рис. 5В). Після пересадки клітини куріпки розвивалися відповідно до свого нового розташування. Наприклад, клітини, взяті з області, яка при нормальному розвитку утворювала наднирник, замість цього утворювали іннервацію кишечника.
Рис. 5. Доля клітин нервового гребеня визначається оточенням. (А) Клітини нервового гребеня утворюють велику кількість різних периферичних гангліїв. Ресничний ганглій утворений клітинами з мезенцефального нервового гребеня. Ганглій Ремака і кишкові ганглії тонкої кишки утворюються з клітин вагального (соміт 1-7) та люмбосакральной (Каудальні S28) областей нервового гребеня. Ганглії симпатичної ланцюжка відбуваються з усіх областей нервового гребеня Каудальні S5. Наднирник заселяється клітинами нервового гребеня з S18-S24. (В) Якщо клітини нервового гребеня з S18-S24, які мають утворити наднирник, пересадити від донора-перепілки в вагальних або люмбосакральную область ембріона курчати, вони будуть слідувати шляху розвитку, характерному для свого нового положення і заселять ганглій Ремака або кишковий ганглій тонкої кишки .
Близьким питанням є те, чи визначений фенотип клітин нервового гребеня до того, як клітини мігрують геть від нервової трубки або після того, як вони досягнуть свого остаточного місця розташування на периферії. Відповідь на це запитання отримана в дослідженнях клітин нервового гребеня, виділених з одного периферичного місця розташування: попередника (primordiurn) наднирника ембріона ссавців. У культурі ці клітини утворюють або хромафінні клітини, або клітини мозкової речовини надниркових залоз, або адренергічні симпатичні нейрони. Глюкокортикоїди (синтезовані клітинами кори наднирника) викликають експресію ферментів, специфічних для хромафінних клітин (рис. 6). І навпаки, два білки, присутні в місцях утворення симпатичних гангліїв, звані основний фактор росту фібробластів (basic fibroblast growth factor, bFGF) і фактор росту нерва (nerve growth factor, NGF), в культурі клітин викликають диференціювання клітин-попередниць в симпатичні нейрони.
Рис. 6. систему. Визначення напряму розвитку клітин нервового гребеня, що утворюють симпатоадреналові (SA) систему. клетки-предшественники. Плюрипотентні клітини нервового гребеня утворюють біпотентние SA клітини-попередники. клеток-предшественников зависит от сигналов извне. SA клетки-предшественники, которые мигрируют в область надпочечника, подвергаются влиянию глюкокортикоидов, ингибирующих нервную дифференцировку и способствующих дифференцировке их в хромаффинные клетки. Доля SA клітин-попередників залежить від сигналів ззовні. SA клітини-попередники, які мігрують в область наднирника, підпадають під вплив глюкокортикоїдів, інгібуючих нервову диференціювання і сприяють диференціювання їх в хромафінні клітини. клетки-предшественницы, которые мигрируют в область развивающейся симпатической цепочки, подвергаются воздействию основного фактора роста фибробластов, который приводит к экспрессии ФРН в SA предшественниках. Альтернативним чином, SA клітини-попередниці, що мігрують в область розвивається симпатичної ланцюжка, піддаються впливу основного фактору росту фібробластів, який призводить до експресії ФРН в SA попередників. Подальше дію ФРН призводить до того, що клітини, нечутливі до диференціювання у відповідь на глюкокортикоїди, починають диференціюватися в симпатичні нейрони.
Таким чином, фенотип клітин нервового гребеня може бути визначений після того, як вони мігрували геть від нервової трубки, за допомогою факторів, що знаходяться на периферії.
Вибір трансмітера
При пересаджуванні клітин нервового гребеня у відносно ранньому періоді їх подальший розвиток може змінюватися аж до того, що вони можуть у подальшому використовувати абсолютно інший трансмітер, наприклад ацетилхолін, замість норадреналіну. У деяких випадках така зміна медіатора відбувається в ході нормального розвитку. Наприклад, симпатичні нейрони, що іннервують потові залози, спочатку синтезують норадреналін, але в період між другою - третьою тижнями постнатального розвитку фактори, які виділяються залозою, призводять до того, що вони починають виробляти ацетилхолін. На більш пізніх стадіях клітини нервового гребеня стають вже занадто зрілими і втрачають здатність змінювати свою диференціювання відповідно до змін навколишнього середовища.
Вивчення механізму зміни трансмітера проводилося на культурах клітин симпатичних гангліїв. Коли нейрони виділялися з верхнього шийного ганглія новонародженого щурика і вирашівалісь в культурі у відсутність клітин інших типів, вони все містили фермент тірозінгідроксілазу, синтезували й утворювали запаси катехоламінів.
Рис. 7. Окремі нейрони симпатичних гангліїв здатні виділяти як ацетилхолін, так і норадреналін в синапсах на культурі клітин серця. (А) микрокультура, що містить окремі симпатичні нейрони, вирощені на острівці клітин серцевого м'яза. (В) Коротка серія імпульсів в нейроні (10 Гц, показано у вигляді відхилень нижньої запису) викликає інгібування спонтанної активності миоцита через вивільнення АХ (верхня запис). (С) Додавання атропіну (10 ^{- 7} М) блокує гальмові холінергічний відповідь, що призводить до прояву збуджуючого ефекту, викликаного вивільнення норадреналіну.

Однак, якщо нейрони вирашівалісь у присутності певних типів ненейрональних клітин, таких як клітини серцевого м'яза або потових залоз, нейрони поступово переставали синтезувати катехоламіни і починали синтезувати замість цього фермент холінацетілтрансферазу і ацетилхолін. Для того, щоб остаточно встановити, що подібні зміни можливі в одиночних нейронах, вони культивувалися на мікроостровках клітин міокарда (рис. 7). Нейрони швидко витягали свої відростки і утворювали синаптичні контакти з клітинами міокарда. Спочатку ці синапси були чисто адренергічними, потім, після декількох днів, клітини починали виділяти разом норадреналін і ацетилхолін. У кінцевому рахунку передача ставала повністю холінергічної.
Фактор, який викликав холінергічну диференціювання симпатичних нейронів, був виділений з середовища клітин серця і клонований. Виявилося, що це фактор ингибирующий розвиток лейкемії (leukemia inhibitory factor, LIF), білок, який раніше був описаний на його здатності індукувати диференціацію клітин імунної системи. Два інших близьких цитокіну, цилиарной нейротрофічний фактор (ciliary neurotrophic factor, CNTF) і кардіотрофін-1, як було виявлено, викликають схожі ефекти в культурі нейронів. Всі ці три фактори активують рецепторний комплекс (званий LlFR/3-gpl30 рецептор), блокування якого пригнічує розвиток холінергічних нейронів, що культивуються разом з клітинами потових залоз. Однак іннервація потових залоз у мутантних мишей, які не мають L1F і CNTF, формується нормально, а результати інших експериментів змушують припустити, що кардіотрофін-1 не є чинником, який може викликати перемикання в клітинній іннервації потових залоз in vivo. Хоча ще не описано генетичне вимикання всіх трьох генів, цілком можливо, що скоро буде описано новий, ще не ідентифікований чинник потових залоз, що є лігандом для LIFR-gpl30 рецептора.

Література:

Rekling, JC, and Feldman, JL 1998. Pre-Botzinger complex and pacemaker neurons: Hypothesized site and kernel for respiratory rhythm generation. Ann. Rev. Physiol 60: 385-405.
Thach, WT, Goodkin, HG, and Keating, JG 1992. The cerebellum and the adaptive coordination of movement. Annu. Rev. Neurosci. 15: 403-442.
T., and DeLong, MR 1996. Wichmann, T., and DeLong, MR 1996. Functional and pathophysiological models of the basal ganglia. Curr. Opin. Neurobiol. 6: 751-758.