1. Рекомбінантні (химерні) ДНК
Створювані генними інженерами рекомбінантні ДНК називають химерними. Вони були створені для найрізноманітніших цілей, у тому числі і для цілеспрямованого впливу на ВІЛ. В останні роки кількість наукових робіт у цьому напрямку дуже велике. Одна з випробуваних схем з використанням химерних ДНК полягала в наступному. До гену, що кодує білок-рецептор CD4, "підшили" інший ген, що забезпечує синтез рослинного білка рицину. Рицин ще в середні століття використовувався як сильної отрути. Потрапляючи в клітину, він блокує синтез білка в цитоплазмі, тим самим убиваючи її. Після внесення в клітини такий рекомбінантної ДНК в кінцевому підсумку відбувається утворення кодованого їй химерного білка. Та його частина, яка відповідає білку-рецептора, забезпечує суворо специфічне зв'язування химери з клітинами, на поверхні яких міститься вірусний білок CD4. Інша ж являє собою отрута рицин і знищує клітини, з якими зв'язується химерна молекула. Таким чином, одна частина химери забезпечує спрямований пошук в організмі клітин, заражених вірусом, а інша її частина вбиває їх. Схема досить проста і ефективна. У якості "вбивці" можна використовувати не тільки ген рицину, а й деякі інші гени.
Інший підхід до боротьби з ВІЛ-інфекцією заснований на здатності деяких вірусних білків (Tat і Rev), надзвичайно важливих для розмноження ВІЛ в клітинах, специфічно зв'язуватися з певними ділянками молекули вірусної РНК. Для того, щоб запобігти цьому життєво важливий процес, було запропоновано вводити в інфіковані клітини штучно синтезовані РНК, що містять ділянки зв'язування з вірусними білками. Вірусного білку все одно, з чим зв'язуватися - з вірусної РНК або точно такий же "копією", сконструйованої искусствено. Додана в клітку у великій кількості, "копія" грає в даному випадку роль "пастки": якщо її багато, білок вірусу буде зв'язуватися переважно з нею, а не з РНК вірусу, і, в результаті цього, ВІЛ перестане розмножуватися.
Теоретично описані підходи виглядають дуже привабливо. І, як показали проведені випробування, в ізольованих клітинах вони працюють дуже добре. Однак немає надійних способів доставки і забезпечення довгого функціонування химерних "конструктів" в цілому організмі.
Зазначені труднощі вчені намагаються подолати за допомогою тих же вірусів. Нещодавно опубліковано повідомлення про успішне використання для протидії ВІЛ вірусу сказу. Природно, це був не вірус сам по собі, а його варіант, який не здатний приводити до захворювання. До такого варіанту був "пришитий" ген білка CD4. В іншому схема була та ж, що і у випадку з рицином. Зв'язуючись тільки з ВІЛ-інфікованими клітинами, рекомбінантний вірус їх знищував, інші ж клітини залишалися незмінними. Можливо, такий шлях виявиться ефективним у майбутньому.
Нещодавно з'явилося повідомлення про створення ще однієї "химери" проти ВІЛ на основі антиретровірусного препарату енфервіртід.
Енфервіртід являє собою короткий фрагмент білка gp41 ВІЛ, який, незважаючи на те, що він ніби як "рідний", перешкоджає вірусу "зливатися" з клітиною. На основі ретровірусу мишей сконструювали химерний вірус, який здатний у клітинах людини виробляти такий короткий фрагмент білка ВІЛ і "виставляти" його на поверхні клітин, заражених вірусом химерним. У результаті ВІЛ не може проникати в клітини навіть за наявності в них усіх рецепторів і корецептора. Таким чином, фрагмент вірусного білка виступає в якості "щита" проти цілого вірусу. Дуже важливо, що захист спрацьовує на самому початковому етапі інфікування клітини. Адже коли вірус вже проник до неї, з ним боротися практично неможливо. Розпочаті в клініці випробування нової "химери", за твердженням дослідників, дали дуже обнадійливі результати.
2. Конструювання рекомбінантних ДНК
Під рекомбінантними розуміють ДНК, утворені об'єднанням in vitro (у пробірці) двох або більше фрагментів ДНК, виділених з різних біологічних джерел. Ключовими у цьому визначенні є слова "фрагмент ДНК" і "об'єднання in vitro", що вказує на сутність генетичної інженерії та її відмінність від всіх інших методів отримання гібридних (або химерних) організмів, таких як генетична селекція, ембріональна інженерія і т.д.
Фрагменти ДНК, в тому числі і фрагменти, що містять гени, отримують з використанням ферментів рестриктаз. Рестріктази можуть утворювати фрагменти як з тупими, так і з липкими кінцями. Зшивання фрагментів ДНК проводиться трьома основними методами, що залежать від того, які кінці мають фрагменти зшиваються ДНК.
Зшивання по однойменних "липким" кінців (рестріктазно лігазну метод)
Цей метод є найпоширенішим і популярним. Вперше цим способом гібридна ДНК була отримана С. Коеном з співробітниками в 1973 році. Деякі рестриктаз, наприклад Pst I, вносячи в ланцюзі ДНК симетричні, розташовані навскіс один від одного розриви на рівних відстанях від центру сайту впізнавання і утворюють "сходинку" (рис. 36). Ці комплементарні один одному ділянки мають тенденцію до асоціації за рахунок спаровування підстав, і тому їх називають комплементарними або липкими кінцями. Спаровування основ відбувається тільки між комплементарними послідовностями, тому Аатте-кінці, утворені Eco RI, не будуть злучатися, наприклад, з АГЦТ-кінцями, утвореними Hind III. Але будь-які два фрагменти (незалежно від їх походження), що утворилися під дією однієї і тієї ж рестриктаз, можуть злипатися за рахунок утворення водневих зв'язків між однониткових ділянками комплементарних нуклеотидів (рис. 39).
Однак після такого спарювання повної цілісності подвійної спіралі не відновиться, оскільки залишиться два розриву в фосфодіефірних кістяку. Для його відновлення, тобто зшивання, або лігування ниток використовують фермент ДНК-лігази. Цей фермент у живій клітині виконує ту ж функцію - зшивання фрагментів ДНК, що синтезуються при реплікації.
Зшивання по "тупим" кінців (коннекторний метод)
Липкі кінці не абсолютно необхідні для зв'язування фрагментів ДНК. Тупі кінці також можуть бути з'єднані за рахунок дії ДНК-лігази, якщо і лігаза, і тупі кінці присутні в реакційній суміші у високих концентраціях. У цьому випадку реакція лігування має свої особливості і її ефективність нижче, ніж при зшивці по липким кінцях. Вперше такі експерименти були виконані в 1972 році Полем Бергом в Стенфордському університеті, США. Липкі кінці також можна ферментативним шляхом приєднати до молекул ДНК з тупими кінцями. Для цього використовують фермент - кінцеву трансферазу з тимусу теляти, яка приєднує нуклеотиди до 3-кінців ланцюгів ДНК. Якщо до 3'-кінцях одного з рекомбініруемих in vitro фрагментів ДНК за допомогою кінцевий дезоксинуклеотидилтрансферазы добудувати одноланцюгові оліго (dA)-сегменти певної довжини, а до кінців іншого фрагмента - оліго (dT)-сегменти приблизно такої ж довжини, то при змішанні отриманих таким чином фрагментів відбувається спарювання за рахунок утворення водневих зв'язків між оліго (Dа) - і олігo (dT)-послідовностями (рис. 40). Для ковалентного з'єднання двох фрагментів використовується ДНК-лігаза. Ці процедури складають основу для другого спільного методу отримання рекомбінантних молекул ДНК.
Оскільки можна формувати досить довгі взаімокомплементарние одноланцюгові кінці, гібридні молекули утворюються з високою ефективністю. Зокрема, тому при клонуванні ДНК-копій матричних РНК, які доступні в обмежених кількостях, звичайно ви ¬ користовують коннекторний метод. При такому способі з'єднання між фрагментами вбудовуються ділянки АААА. Такі додаткові послідовності ТТТТТ можуть впливати на функції з'єднуються молекул і тому завжди, коли тільки можливо, для отримання рекомбінантних молекул ДНК користуються липкими кінцями, що утворилися в результаті дії рестриктаз.
Зшивання фрагментів з різнойменними липкими кінцями
У ситуації, коли необхідно зшити фрагменти, утворені різними Рестриктази, і мають різні, тобто некомплементарние один одному липкі кінці, застосовують так звані лінкера (або "перехідники"). Лінкер - це хімічно синтезовані олігонуклеотиди, які становлять сайти рестрикції чи їх комбінацію. Вперше цю ідею запропонував Шеллер з співробітниками в 1977 році.
Існують великі набори таких генних "перехідників". Природно, що при використанні лінкера повинна враховуватися необхідність дотримання правил експресії генетичної інформації. Часто в середину лінкера поміщають якийсь регуляторний генетичний елемент, наприклад, промотор або ділянка, пов'язаний з рибосомою. У цьому випадку лінкера забезпечують не тільки об'єднання генів, але і обумовлюють їхню експресію. Існують лінкера "тупий кінець - липкий кінець".
При необхідності липкі кінці можна перетворити на тупі. Це досягається або відщепленням липких кінців з допомогою ферменту - ендонуклеази S1, яка руйнує тільки одноланцюжкову ДНК, або липкі кінці "забудовують", тобто за допомогою ДНК-полімерази I на однониткових липких кінцях синтезують другу нитку.
3. Визначення нуклеотидної послідовності (секвенування) ДНК
Описані методи, що дозволили ідентифікувати генетично важливі ділянки ДНК, мали велике значення самі по собі. Але вони також проклали шлях до розробки виключно ефективних методів секвенування ДНК та створення рекомбінантних молекул. Секвенування дозволяє досить швидко визначити повну нуклеотидну послідовність сегмента довжиною 100 - 500 нуклеотидних пар, що утворюється при розщепленні ДНК рестрикційний ендонуклеаза.
Метод Маскама і Гілберта (хімічний)
Один з методів заснований на хімічній деградації ДНК. Він був запропонований у 1976 році Максамом та Гілбертом і названий їхнім ім'ям. Суть методу зводиться до наступного: один з кінців фрагменту ДНК мітять за допомогою ізотопу фосфору 32Р. Останнім часом замість радіоактивної вводять флюоресцирующую позначку. Її можна «чіпляти» і до нуклеотидам, причому для кожного типу нуклеотидів підбирати різне забарвлення. Препарат міченої ДНК ділять на чотири порції і кожну з них обробляють реагентом, специфічно руйнують одне або два з чотирьох основ, причому умови реакції підбирають таким чином, щоб на кожну молекулу ДНК доводилося лише кілька ушкоджень.
Руйнування йде в 2 етапи. На першому етапі відбувається модифікація азотистого підстави і подальше відщепленні його. На другому етапі проводять гідроліз ДНК в місцях відщепленні підстав. Пуринові основи модифікуються диметилсульфатом. Аденінових залишки метіліруют по третьому атому азоту, гуанінових - по положенню N7. Якщо таку модифікацію обробити 0,1 М HCl при 0оС, то вищепляются метіладенін. При подальшій інкубації в лужному середовищі (0,1 М NaOH) при температурі +90 оС відбувається руйнування цукрово-фосфатної зв'язку в місцях відщепленні підстав. Обробка пошкоджених молекул пиперидина призводить до гідролізу ДНК по залишках метилгуанін. Піримідинові підстави модифікуються гідразином. У безсольової середовищі модифікується і цитозин, і тимін, у присутності 2 М NaCl модифікується тільки цитозин. При подальшій обробці пиперидина відбувається розщеплення ДНК по точках модифікації. Можна використовувати і інші реакції хімічної модифікації підстав і розщеплення по них молекул ДНК. У результаті виходить набір мічених фрагментів, довжини яких визначаються відстанню від зруйнованого заснування до кінця молекули. Фрагменти, що утворилися у всіх чотирьох реакціях, піддають електрофорез в чотирьох сусідніх доріжках; потім проводять радіоавтографію, і ті фрагменти, які містять радіоактивну мітку, залишають "відбитки" на рентгенівській плівці. За положенням відбитків можна визначити, на якій відстані від міченого кінця знаходилося зруйноване підставу, а знаючи це підстава - його положення. Так набір смуг на рентгенівській плівці визначає нуклеотидну послідовність ДНК. Аналогічно спостерігають флюоресцентні фарбування. Якщо для кожного з чотирьох нуклеотидів був підібраний свій колір флюоресцентної мітки, то при електрофорезі їх наносять на 1 доріжку. Тоді розташування нуклеотидів зазначено штрихами різного кольору, а процедуру зчитування легко автоматизувати.
Метод Сенгера (ферментативний)
Інший метод, розроблений Сенгером і носить його ім'я, заснований не на хімічному, а на ферментативному підході. Cенгер використовував ДНК-полімеразу I. У клітці цей фермент бере участь у процесі реплікації, заповнюючи прогалини між знову синтезованими фрагментами ДНК (фрагментами Окадзакі). Для роботи ферменту в пробірці потрібні попередники ДНК - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), а також одноланцюжкова матриця, на якій має бути невеликий дволанцюжкової ділянка - запал, з якого починається синтез (рис. 41). Були також синтезовані модифіковані дідезоксірібонуклеотіди, в яких дезоксирибоза 3'-ОН відсутній, для кожного з чотирьох основ ДНК. ДНК-полімераза включає ці попередники в ДНК. Однак, включившись в ДНК, модифіковане основа не може утворити фосфодіефірних зв'язок з наступним дезоксирибонуклеотидів. У результаті зростання (елонгація) даного ланцюга зупиняється (терминируются) в тому місці, де в ДНК включився дідезоксірібонуклеотід (ddNTP). Тому їх називають термінаторами елонгації.
Реакційна суміш по Сенгер складається з ланцюга ДНК, нуклеотидну послідовність якої треба визначити, короткого фрагмента "міченої" ДНК, комплементарної концевому відрізку цього ланцюга (запал), одного з чотирьох ddNTP та відповідного dNTP в строго визначеному співвідношенні (щоб вони конкурували), а також інших трьох dNTP. Готують чотири суміші, кожна з яких містить один з чотирьох ddNTP. У кожній з пробірок утворюється набір мічених фрагментів різної довжини. Довжина їх залежить від того, в якому місці в ланцюг включений дефектний нуклеотид. Отримані мічені фрагменти ДНК розділяють у поліакриламідному гелі (з точністю до одного нуклеотиду), проводять радіоавтографію і по картині розподілу фрагментів у чотирьох пробах встановлюють нуклеотидну послідовність ДНК (рис. 41).
В даний час визначення точної нуклеотидної послідовності будь-якого сегменту ДНК помірної довжини - цілком здійсненне завдання. Вже визначено послідовність кількох сотень генів про-і еукаріотів. Знаючи послідовність гена і генетичний код, легко визначити амінокислотну послідовність кодованого їм білка. Раніше для визначення структури білка доводилося робити ретельний і вельми трудомісткий аналіз виділеного та очищеного білка. Зараз часто буває простіше визначити структуру білка через нуклеотидну послідовність, ніж за допомогою прямого секвенування. Якщо секвенування білка займає місяці і навіть роки, то ДНК вдається секвенувати за кілька тижнів.
Визначення послідовності ДНК призвело також до того, що були виявлені області, які не кодують білки, але беруть участь у регуляції експресії генів і реплікації ДНК. У 1996 році був секвенований геном дріжджів, у 1998 р. - геном арабідопсису, у 2000 році - геном людини, проте в даному випадку мова йде тільки про встановлення послідовності нуклеотидів, так як генетична структура і функції окремих ділянок геному ще не ідентифіковані, це більш складне завдання.
Відразу слідом за розробкою нових методів секвенування з'явилися настільки ж швидкі і прості методи синтезу порівняно довгих олігонуклеотидів з певною, заздалегідь заданою послідовністю. Тепер за три-чотири дні можна синтезувати послідовність з 12 - 20 нуклеотидів. Автоматизація цієї процедури ще більш полегшує і прискорює синтез. З'явилися прилади - ДНК-синтезатори, які виконують цю роботу за кілька годин.
Гібридизація як високочутливий метод виявлення специфічних послідовностей нуклеотидів
Якщо водний розчин ДНК нагріти до 100оС і підвищити рН до 13, то ДНК дисоціює на 2 кола (денатурує), так як комплементарні зв'язку між основами руйнуються. У 1961 році було виявлено, що цей процес звернемо: витримування ДНК при температурі 65 ° С вело до відновлення структури подвійної спіралі. Цей процес називається ренатурацією або гібридизація. Процеси гібридизації відбуваються між будь-якими одинарними ланцюгами, якщо вони комплементарні: ДНК - ДНК, РНК - РНК, ДНК - РНК.
Для тестування необхідно мати чистий одноланцюговий фрагмент ДНК, комплементарний тій послідовності, яку хочемо виявити. Цей фрагмент отримують або клонуванням, або шляхом хімічного синтезу. Одноланцюжкова ДНК, яка використовується як індикатор, називається ДНК-зонд. Вона може містити від 15 до 1000 нуклеотидів.
ДНК-зонди застосовуються в різних цілях. Гібридизація ДНК-зонда з РНК, виділеної з аналізованої клітини, може виявити наявність або відсутність експресії гена. Якщо гібридизації не відбувається, значить ген мовчить, не працює. ДНК-зонди також дозволяють проводити діагностику спадкових хвороб.
У більшості випадків мутації, що ведуть до спадкових хвороб, рецесивні, тобто хвороба розвивається, якщо людина отримує дефектні гени від обох батьків. Аномальні ембріони краще виявляти до народження. Наприклад, для серповидноклеточной анемії в мутантним гені, що кодує бета-ланцюг гемоглобіну, послідовність ГАГ замінена на ГТГ. У цьому випадку синтезують олігонуклеотиди довжиною близько 20 підстав, мітять радіоактивною міткою. З ембріональних клітин, що містяться в амніотичній рідині, виділяють ДНК і використовують її для гібридизації. Якщо ембріон дефектний, то тест буде позитивним.
Аналіз проводять за наступною схемою (рис. 42): досліджувану ДНК гідролізують рестріктазами, фракционируют електрофорезом, переносять розділені фрагменти на нітроцелюлозні фільтр і проводять реакцію гібридизації з міченими олігонуклеотидами. Цей метод був розроблений Саузерн в 1975 році. У вітчизняній літературі його прийнято називати «південний блот». «Блотів» - у перекладі з англійської означає «промокашка», «Саузерн» - «південний», в даному випадку гра слів: прізвище вченого перекладається як географічний напрямок.
Молекули ДНК розганяють в агарозному гелі електрофорезом. ДНК в гелі денатурують лугом. Луг нейтралізують і пластину гелю покривають листом нітроцелюлози. Зверху на нітроцелюлозу поміщають стопку листів фільтрувального паперу, забезпечуючи повільний ток буферного розчину через гель у напрямку, перпендикулярному напрямку електрофорезу. ДНК дифундує з гелю і зв'язується з нітроцелюлозні фільтром. Після прогрівання фільтра при 80оС у вакуумі ДНК необоротно зв'язується з нитроцеллюлозой. Розташування смуг иммобилизованной ДНК точно відповідає їх розташуванню в гелі.
ДНК, пов'язану з нітроцелюлозні фільтром, можна гібрідізовать з радіоактивно міченої ДНК. Блот по Саузерн є виключно корисним також і для локалізації досліджуваних генів у певних фрагментах, отриманих в результаті гідролізу різними рестріктазами гібридних молекул ДНК, хромосомної ДНК і т. д.
Аналогічним методом на нітроцелюлозу переносять молекули РНК (Північний блот) і білка (Західний блот). З частин світла залишилася вільною тільки західна, хоча вакантними залишилися 2 класу макромолекул - вуглеводи і ліпіди.
Одним з найбільш точних і сучасних методів аналізу є використання чіпів. Вони являють собою пластинки з іммобілізованими міченими ДНК-зондами. Кожна така платівка може містити кілька десятків тисяч зондів, розташованих у певній послідовності. Мітка проявляється тільки в спарених дволанцюжкові фрагментах. Якщо в досліджуваному зразку є послідовності, комплементарні послідовностей зонда, то гібридизацію можна визначити візуально або за допомогою спеціальних приладів. Як правило, детектори з'єднані з комп'ютером, тобто процедура зчитування й обробки інформації автоматизована.
Такі ДНК-чіпи можна застосовувати для комплексної діагностики інфекційних захворювань, спадкових дефектів, встановлення експресії тих чи інших генів (в цьому випадку йде гібридизація з мРНК), тобто відстеження порушень обміну речовин. Вони дешеві, дуже надійні, прості в обігу і може багаторазово використовуватися. Недолік - дорога апаратура для детекції.
4. Методи клонування ДНК
Після того, як ДНК зшита в пробірці, її необхідно розмножити.
Існує два підходи до клонування ДНК. Перший підхід передбачає використання бактеріальних або дріжджових клітин для розмноження введеної в них чужорідної ДНК. Другий спосіб є ампліфікацію ДНК in vitro.
Клонування ДНК in vivo
Використовуючи мікроорганізми, можна створювати два типи бібліотек ДНК: геномної і клонову (кДНК).
Геномна бібліотека. Якщо геном будь-якого організму розрізати, вставити в плазмідні або вірусні вектора і ввести в клітину, то в такому вигляді його можна зберегти. При розрізуванні плазмідної або фагової ДНК ймовірність випадання цілих і незмінених шматків геному досить висока.
Такий спосіб отримання геномної бібліотеки отримав назву «метод дробовика», так як геном в даному випадку представлений окремими фрагментами.
Принципи створення плазмідних та вірусних векторів загальні, тому розглянемо їх на прикладі плазмідних. Слід зазначити, що з вірусних ДНК краще використовувати ДНК фагів, так як вони мають велику ємність і дозволяють вставляти більші шматки геному.
Очищені кільцеві молекули ДНК обробляють рестриктазою, отримуючи лінійну ДНК. Клітинну ДНК обробляють тієї ж рестриктазою, додають до плазмідної, додають лігази. Таким чином отримують рекомбіновану плазмідну ДНК, яку вводять в бактеріальні або дріжджові клітини. Плазміда реплікується з утворенням багатьох копій. Багато плазміди несуть ген стійкості до антибіотиків, і якщо в рекомбінантної плазміди є такий ген, то клітини легко виявляти, вирощуючи на середовищі з антибіотиком.
Кожна така колонія представляє собою клон чи потомство однієї клітини. Плазміди однієї колонії містять клон геномної ДНК, а сукупність плазмід можна назвати бібліотекою геномної ДНК. Недолік такого методу в тому, що фрагменти ДНК утворюються у величезній кількості. Розрізання геномної ДНК визначається випадком, тому лише частина фрагментів містять повноцінні гени. Деякі фрагменти можуть містити лише частину гена або ж інтрони послідовності.
Бібліотека кДНК. Створення кДНК починається з синтезу на матриці РНК за допомогою зворотної транскриптази комплементарної нитки ДНК. Потім створюють лужні умови, руйнують ланцюг РНК на нуклеотиди, після чого за допомогою ДНК-полімерази синтезують комплементарну ланцюг ДНК. При цьому утворюється фрагмент ДНК з тупими кінцями. Таку ДНК вбудовують в плазміди і вводять в клітини бактерій. При ампліфікації плазміди утворюється клон комплементарної копії ДНК (кДНК).
Переваги клонової ДНК перед клонами геномної ДНК у тому, що кодує білок нуклеотидна послідовність гена нічим не переривається.
Гени еукаріот містять інтрони, які повинні вилучатися з транскріптной РНК перед перетворенням її в матричну, після чого слід сплайсинг (зрощення). Бактеріальні клітини не можуть здійснювати таку модифікацію РНК, що утворилася шляхом транскрипції гена еукаріотичної клітини. Тому якщо переслідують отримання білка шляхом експресії клонованого гена, то краще використовувати банк кДНК, отриманої на основі матричної РНК.
Методи клонування ДНК
Полімеразна ланцюгова реакція
У 1985 році К. Мюлліс із співробітниками розробили метод клонування послідовностей ДНК in vitro, який отримав назву полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
До анализируемому зразком ДНК додають в надлишку 2 синтетичних олігонуклеотиду - праймера розміром близько 20 нуклеотидів. Кожен з них комплементарний одному з 3'-решт фрагмента ДНК. ДНК нагрівають для розділення ланцюгів подвійної спіралі, а при охолодженні відбувається гібридизація праймерів з комплементарними ділянками фрагментів ДНК. У результаті в розчині будуть знаходитися однониткових ДНК з короткими дволанцюжкові ділянками - затравки (праймерами). При додаванні нуклеотидів і ДНК-полімерази синтезуються комплементарні ланцюга і утворюються ідентичні фрагменти ДНК (перший цикл, рис. 43). Реакція зупиняється і ДНК знову денатурируется прогріванням.
У процесі охолодження праймери, що знаходяться в надлишку, знову ефективно гибрідизуючою, але вже не тільки з ланцюгами початкової ДНК, але і з знову синтезованими. Внесення в систему ДНК-полімерази ініціює другий цикл полімеразної реакції. Багаторазове повторення описаної процедури дозволяє провести 30 і більш за цикли ферментативного подовження праймерів. При цьому число сегментів ДНК, обмежений з обох кінців використовуваними праймерами, з кожним циклом ПЛР збільшується експоненціально (наближається до залежності 2n, де n - число циклів). Вихід всіх інших продуктів реакції збільшується з лінійної залежності (рис. 44). Таким чином, в процесі даної реакції ефективно ампліфікує тільки та послідовність ДНК, яка обмежена праймерами.
Спочатку для ПЛР використовували фрагмент Кльонова ДНК-полімерази I E. coli. Проте недоліком даного підходу було те, що після кожного циклу реакції необхідно було вносити в реакційну суміш нову порцію ферменту. Крім того, в оптимальних температурних умовах такої полімеразної реакції (37 ° С) з'являлися вторинні ділянки зв'язування праймерів і спостерігалася ампліфікація незапланованих сегментів геному, тобто специфічність ампліфікації не була повною. Істотне поліпшення методу полімеразної ланцюгової реакції було досягнуто після заміни фрагмента Кльонова на ДНК-полімеразу термофільною бактерії Thermus aquaticus (Taq-полімераза). Температурний оптимум реакції, що спрямовується Taq-полімеразою, знаходиться в межах 70 ° С. Іншою важливою властивістю є те, що дана полімераза не інактивується після тривалої інкубації при 95 ° С.
Використовуючи Taq-полімеразу, вдалося вирішити відразу дві проблеми. По-перше, термостабільна полімераза не інактивується на етапі денатурації ДНК, і тому немає необхідності після кожного циклу реакції додавати нову порцію ферменту. Таке спрощення процедури дозволило автоматизувати проведення ПЛР, тому що тепер потрібно лише перенесення зразка з певним інтервалом часу у різні температурні умови: 90-95 ° С (температура денатурації) і 60-70 ° С (температура ренатурації ДНК і ферментативної реакції). По-друге, високий температурний оптимум реакції, що каталізується Taq-полімеразою, дозволяє підбирати жорсткі температурні умови відпалу, що забезпечують гібридизацію праймерів тільки в заданому районі досліджуваного геному, що істотно підвищує специфічність та чутливість методу.
Використовуючи метод ПЛР, можна in vitro селективно збагачувати препарат ДНК фрагментом з певною послідовністю в мільйон і більше разів. Це дозволяє надійно виявляти однокопійние гени та їх варіанти в таких великих і складних геномах, яким є геном людини. Чутливість методу така, що ампліфікувати в ПЛР і виявити цільову послідовність можна навіть у тому випадку, якщо вона зустрічається один раз у зразку з 105 клітин. Одержуваний сегмент ДНК надійно виявляється у вигляді дискретної смуги після електрофоретичного розділення молекул ДНК і забарвлення їх етідіум бромідом. Якщо до праймеру пришити фермент, то ферментна мітка буде накопичуватися при ампліфіцірованіі. Продукт ампліфікації перевіряється за принципом ІФА, тобто додається субстрат і відзначається зміна забарвлення. У якості мітки можна використовувати стрептавідин (див. розділ 3). Його можна пришивати як до праймеру, так і до нуклеотидам. В останньому випадку нуклеотиди, мічені стрептавідин, додаються до звичайних, що йде на синтез комплементарного ланцюжка ДНК. Цим досягається ще більше посилення сигналу.
Розмножений in vitro фрагмент отримують в кількостях, достатніх для його прямого секвенування. Оскільки при цьому не потрібно проміжний етап клонування фрагмента ДНК у молекулярних векторах, ПЛР іноді називають безклітинним молекулярним клонуванням (cell-free molecular cloning). Автоматизована процедура Taq-полімеразної ланцюгової реакції, що складається з 30 і більш за цикли, займає 3-4 години, що істотно швидше і простіше процедури клонування певного
5.Контроль над дослідженнями рекомбінантних ДНК
Суперечки про роль генетики почалися задовго до сучасного розквіту генної інженерії. Ще в 1970-х роках не тільки вчене співтовариство, але й широка публіка почали обговорювати питання, пов'язані з суперечливими перспективами нових біологічних технологій. У чому ж полягав основний питання? Основною темою суперечок була рекомбінантна ДНК, яку називали також химерною ДНК. У лабораторних умовах стало можливим створювати штучні ДНК, комбінуючи між собою гени різних видів і отримуючи такі поєднання, які б ніколи не зустрілися в природі. Більшість штучних ДНК синтезуються в наукових цілях. Це контрольовані експерименти, на основі яких вчені прагнуть отримати нові відомості про досліджуваних ними біологічних системах. Однак у деяких випадках дослідникам просто цікаво «подивитися, що вийде». Часто виходять очікувані результати, але часом відбувається щось несподіване. І це цілком зрозуміло з наукової точки зору: адже ми ніколи не можемо заздалегідь все знати і все передбачити. Тому вчені ніколи не можуть обіцяти, що отримані ними клітини з рекомбінантними ДНК будуть абсолютно безпечними. Саме така невпевненість і послужила відправною точкою для дискусій з приводу небезпек сучасної генетики.
З такою проблемою зіткнулися молекулярні біологи, які вивчали в 1970-х роках гени вірусів, що викликають виникнення раку, і впроваджували їх в бактерії Е. coli. При цьому вони керувалися благими намірами: вивчити функції ракових генів на прикладі простих біологічних систем. Але за допомогою цієї технології можна було б створити і шкідливі канцерогенні бактерії, що заражають людей. У міру розвитку технології вчені все більше приходили до думки про небезпечному напрямку своєї роботи і замислювалися про її глобальні наслідки. Зрештою, 11 відомих молекулярних біологів опублікували відкритий лист у престижних журналах «Nature» і «Science», закликавши своїх колег накласти мораторій на певні види експериментів і з більшою обережністю ставитися до інших дослідам. Зокрема, вони пропонували ввести заборону на експерименти з генами стійкості до антибіотиків, генами токсинів і генами канцерогенних вірусів; закликали організувати дискусію на цю тему; просили Національний інститут здоров'я США (NIH) розробити правила і принципи проведення подібних експериментів.
Для вченого спільноти це був крок величезної важливості: перед лицем невідомої і взагалі-то не цілком певну небезпеку вчені усвідомлено утримувалися від проведення експериментів. Підписалися під цим листом, по всій видимості, не очікували, який резонанс викличе їх заяву у всьому світі.
Як тільки про лист стало відомо засобам масової інформації, широка публіка сприйняла потенційну небезпеку, як цілком реальну. «Якби ці експерименти не були такі небезпечні, - часто міркували люди зі сторони, - то хіба вчені стали б їх забороняти?» Проте технологія отримання рекомбінантних ДНК відкрила зовсім нові напрями досліджень. Перспективи отримання Нобелівської премії і величезних економічних вигод також бентежили вчених. На час проведення дискусій багато з них вже прагнули не стільки обговорити можливі етичні проблеми, скільки переконати публіку в безпеці своїх робіт. Те, що починалося як відповідальний вчинок, перетворилося на небажання допускати в свої плани непосвячених. І хоча багато протиріч до нашого часу вже вдалося більш-менш дозволити, та і загострення пристрастей знизився, було б корисно коротко нагадати про суть цих суперечок.
З 24 по 27 лютого 1975 ряд відомих в усьому світі молекулярних біологів зібрався в Асі-ломаре, поблизу міста Монтерей в штаті Каліфорнія. Деякі з присутніх заявили, що етичні побоювання перебільшені і зажадали продовження важливих досліджень. Інші були стурбовані можливими законодавчими постановами або судовими переслідуваннями, якщо буде доведено, що дослідження становлять небезпеку для здоров'я. Багато ж просто вважали, що вони даремно витрачають час. На конференції було прийнято постанову продовжувати дослідження і замінити мораторій на ряд принципів, яких слід дотримуватися при проведенні експериментів з різним ступенем ризику. Були висловлені наступні пропозиції:
збільшити число рівнів безпеки для експериментів, що представляють високу ступінь потенційного ризику;
використовувати ослаблені різновиди генетично змінених мікроорганізмів у спеціальних лабораторних умовах.
Головна трудність тоді (втім, як і зараз) полягала в тому, щоб оцінити ступінь ризику таких обставин, про які ще мало що відомо. Національний інститут здоров'я, який фінансує більшу частку біологічних проектів, взяв ініціативу в свої руки і розробив ряд положень, запропонувавши їх для відкритого обговорення. Для визначення правил проведення досліджень був утворений Комітет з рекомбінантної ДНК, що складався з експертів різних галузей біології, а також з представників приватних компаній, що використовують нові технології. Наступні дискусії також розгорталися в основному навколо можливих небезпек. І хоча від представників промислових компаній варто було очікувати того, що вони будуть боротися за практично вільне експериментування, багато з них проявили відповідальність та висловилися за регулювання досліджень. Вони теж побоювалися можливих негативних наслідків і судових позовів у разі нанесення шкоди з їхнього боку, а тому також запропонували розробити основні принципи. Інші ж вчені стверджували, що їм не дають працювати, хоча дослідження в області рекомбінантної ДНК допомогли б вирішити такі глобальні проблеми, як голод та інфекційні хвороби.
23 червня 1976 Дональд Фредеріксон, директор Національного інституту здоров'я, затвердив ряд формальних правил досліджень в області рекомбінантної ДНК, дотримуватися яких повинні були всі, хто отримує гранти від цього інституту. У них були визначені чотири рівня фізичної безпеки досліджень згідно оціненої ступеня їхнього ризику. Перший рівень - нешкідливі експерименти з використанням стандартних біологічних технологій. З кожним наступним рівнем кількість обмежень і застережень зростала настільки, що для експериментів четвертого рівня - на зразок тих, що показані у фільмі «Штам Андромеди», - відповідних лабораторій не існувало аж до 1978 року. Крім того, три штами Е. coli були розподілені за трьома рівнями біологічної безпеки. Стандартні лабораторні штами позначили як ЕК1. Штами ЕК2 були визначені як характеризуються навмисно викликаної мутацією, здатні вижити поза лабораторією з імовірністю 1 х 10-8. ЕКЗ - ті ж штами, тільки зовсім не здатні вижити в організмах тварин і рослин або поза лабораторією. Для того щоб виростити ослаблений штам Е. coli, в який можна було б запровадити рекомбіновану ДНК, Рой Кер-тис, член комітету при Національному інституті здоров'я, розробив штам хі-1776 (на честь 200-річчя проголошення незалежності США), що містить 15 окремих блоків для нормального розмноження. Роль, яку освічена публіка може зіграти при вирішенні питань, пов'язаних з регулюванням потенційно небезпечних наукових досліджень, прояснилася в ході одного з обговорень в Кембриджі (штат Массачусетс). У той день, коли були опубліковані правила проведення генетичних експериментів, мер Кембриджу Альфред Ве-Луччі відкрив публічні слухання з приводу пропозиції побудувати спеціальну лабораторію з перенесення генів тваринного вірусу SV40 в Є. coli. Це пропозицію висунув Марк Пташний, вчений Гарвардського університету. На цьому слуханні був присутній один з авторів цієї книги. У Кембриджі, де розташовуються Гарвардський університет і Мас-сачусетскій технологічний інститут, звичайно ж уже були численні лабораторії, де проводилися генетичні експерименти, але будівництво нової будівлі вимагало дозволу міської ради, і пропозиція Пташний, що отримало широкий розголос, вирішили обговорювати на відкритому засіданні.
Протягом двох з половиною годин перед представниками телебачення, радіо та преси, а також перед сотнями присутніх виступали прихильники і противники будівництва. Одні вчені наводили аргументи про необхідність будівництва, стверджуючи, що така лабораторія надзвичайно корисна для вивчення раку, тоді як ризик виведення небезпечних бактерій «вкрай невеликий». Інші вчені і представники громадськості стверджували, що непередбачені інциденти вже неодноразово відбувалися в самих надійно захищених лабораторіях і що, якщо будуть виведені небезпечні мікроорганізми, їх вже не можна буде зупинити. Питання мера і його радників показували, що вони добре підготувалися до слухань та ознайомилися з матеріалом. На закінчення мер зажадав накласти дворічний мораторій на всі дослідження рекомбінантної ДНК, що проводяться в Кембриджі, але міська рада запропонувала створити Експериментальний громадська рада з перегляду (CERB) у складі восьми членів, які не належать до кола вчених. До нього ввійшли чотири чоловіки і чотири жінки: лікар, філософ, агент з продажу пального, інженер-проектувальник, клерк, медсестра, соціальний працівник і домогосподарка. Члени ради ознайомилися з необхідними спеціальними відомостями з молекулярної біології і в січні 1977 року винесли одностайне рішення - схвалити будівництво лабораторії. Цей комітет створив прецедент для подальших слухань подібного роду з приводу досліджень в області рекомбінантної ДНК. Даний випадок показав, що звичайні громадяни цілком здатні зрозуміти наукові проблеми і винести здорове рішення, не перешкоджає розвитку науки і не представляє небезпеки для суспільства.
У Великобританії питання про рекомбінантної ДНК було вирішено іншим чином. Уряд запровадив Консультативну групу з генетичним маніпуляціям (Genetic Manipulation Advisory Group, GMAG), до складу якої увійшли політики, вчені та представники профспілок. Усі пропоновані експерименти в області рекомбінантної ДНК повинні отримати схвалення GMAG, прийняте на основі сучасних даних. Основна відмінність від американської практики полягає у відсутності громадського обговорення, в об'єднанні в одному органі представників уряду, приватного сектора і вчених і в тому, що рішення може бути змінено у світлі наступних наукових відкриттів. В даний час як мінімум сім країн Європи заснували комітети з генної інженерії. Канадський Медичний дослідний рада дотримується постанов Національного інституту здоров'я, але приділяє особливу увагу вірусам і клітинним культурам ссавців.
Генетично модифіковані організми
Питання громадського впливу на генетику та регулювання наукових досліджень у цій області, багато в чому не вирішені до цих пір. У міру вдосконалення мікробіологічних технологій і методів з'являються все нові і нові приводи для занепокоєння. В даний час мова вже йде не про те, щоб додати кілька нових генів лабораторним бактеріям. У наш час цілком доступною стала технологія створення в комерційних цілях генетично модифікованих організмів, тобто трансгенних рослин і тварин із заданими ознаками. Багато трансгенні організми досі містяться в лабораторіях для тестування, але деякі вже випущені на ринок. Трансгенні технології стали черговим приводом для запеклих суперечок, так як тут зійшлися інтереси отримання вигоди і збереження навколишнього середовища і здоров'я людей. Питання зводиться до того, наскільки безпечно впроваджувати в організм чужу ДНК і наскільки далеко можна передбачити результати такого впровадження. Останні десять з гаком років, протягом яких генетично модифіковані продукти використовувалися досить широко, довели, що ці технології не такі вже нешкідливі. Наприклад, в деяких випадках інсулін, отриманий від трансгенних бактерій, приводив до несприятливих наслідків. Однак і особливо небезпечних ситуацій ще не виникало. Національний інститут здоров'я переглянув деякі свої рекомендації, і тепер генетики можуть користуватися значною свободою в своїх експериментах, хоча найбільш небезпечні з них як і раніше знаходяться під контролем. Питання щодо модифікованих організмів залишаються, і варто згадати хоча б деякі з них.
Першими генетично модифікованими організмами були бактерії центрів кристалізації льоду і помідори сорту Flavrsaver, виведені ще в 1970-х роках. Бактерії призначалися для того, щоб після розпилення на рослинах вони утворювали центри кристалізації льоду; таким чином можна було б трохи підвищити стійкість сільськогосподарських культур до холоду та збільшити період зростання. Помідори повинні були дозрівати пізніше звичайного, щоб довше зберігатися на складі. Планувалося також зменшення відходів з-за пом'ятих і дуже м'яких примірників. Після гучних протестів громадськості розведення цих організмів заборонили.
Багато генетики сприйняли шум навколо модифікованих продуктів як свого роду бурю в склянці води, і, дійсно, за першими протестами послідувало декілька відносно спокійних років. Але дві події показали, що деякі представники громадськості налаштовані різко проти впровадження досягнень сучасної генетики в повсякденне життя. Спочатку в 1993 році один чоловік на прізвисько Унабомбер (пізніше з'ясувалося, що його справжнє ім'я Теодор Качинські) послав поштою бомбу провідному американському генетику Чарльзу Епштейну на знак протесту проти «нової генетики». Цей інцидент отримав широке висвітлення в пресі. Пізніше, в 1996 році, багато газет і журналів обійшли фотографії, на яких члени організації «Грінпіс» протестують проти генетично модифікованих продуктів. Це було досить серйозне, добре організований захід з сотнями учасників на надувних човнах «Зодіак» і великими плакатами з написом «Зупинимо генетичне забруднення». Своєю мішенню «грінпісівці» вибрали вантажні судна, що доставляли трансгенну сою з Північної Америки до Європи. Для ванкуверських генетиків (таких, як А. Гріффіт і Д. Сузукі, авторів цієї книги) ця подія стала воістину подвійним потрясінням, оскільки організація «Грінпіс», спочатку боролася з китобійним промислом і випробуваннями ядерної зброї, зародилася саме в Ванкувері. Яким же ударом було дізнатися, що в розряд своїх ворогів вона включила і «злих генетиків»! За останні кілька років лихоманка протесту поширилася швидкими темпами і охопила весь цивілізований світ. Численні демонстрації проти генетично модифікованих продуктів стали звичайним явищем; рішуче налаштовані члени радикальних угрупувань висловлюють свою громадянську непокору тим, що знищують трансгенні рослини і навіть намагаються зруйнувати фабрики з їх виробництва та наукові центри. Нещодавно вийшов номер журналу «Економіст», на обкладинці якого була зображена жахлива картоплина «Франкенфуд», вигукує: «Хто боїться ГМ-їжі?» (ГМ - генетично модифікований продукт). У той же час і надії вчених на те, що за допомогою генетично модифікованих продуктів вдасться нагодувати бідні країни і вирішити проблему голоду, також не збулися. Про це ми поговоримо далі.
Технології в контексті Одна зі сторін виниклої проблеми - наукове просвітництво. Як жартують агенти з продажу нерухомості, три ключові елементи, що допомагають продати будинок, - це його місце, місце і ще раз місце. Точно так само і в науковому освіті основні три моменти - це контекст, контекст і ще раз контекст. Без знання контексту все нові відкриття вчених подібні повітряним кулям - красивим, але нічого не значущим для решти людства. Неприйняття досягнень сучасної генетики в чому корениться в тому, що невідомий контекст їх застосування, і тому ми повинні для початку розглянути нові генетичні технології в світлі технології взагалі.
У всякій технології є свої позитивні і негативні сторони. Багато хто погодиться з тим, що промислова революція XIX століття, заснована на наукових досягнень у галузі фізики і хімії, підвищила рівень життя в індустріально розвинених країнах. Однак зворотна сторона прогресу в наявності. Наприклад, промислова революція подарувала людству двигун внутрішнього згоряння, за допомогою якого пересуваються автомобілі та інші машини. Автомобіль люди люблять за швидкість, за те, що в ньому легко переміщатися у віддалені місця, але при цьому він завдає великої шкоди навколишньому середовищу і здоров'ю людей своїми вихлопними газами, не кажучи вже про те, що для виробництва автомобілів добувають у шахтах метали, викачують з надр землі нафту; для будівництва шосе вирубують ліси, зменшуючи тим самим біологічне різноманіття. З розвитком транспортної мережі міста ростуть і ще більш зменшують площу незайманих ділянок природи. Тільки в одній Канаді щорічно близько 16 тис. смертей відносять на рахунок забруднення атмосфери транспортними засобами. До цієї кількості потрібно додати тисячі тих, хто гине в автомобільних аваріях. І ці смерті реальні, а не гіпотетичність. Хоча всі трагічні випадки близько зачіпають членів сім'ї загиблих, суспільство ставиться до них поблажливо і вважає неминучою платою за ті блага, які приніс двигун внутрішнього згоряння.
Хімічна промисловість теж виробляє величезні забруднення. Хімічна революція минулого століття (що проходила під гаслом «Хімія дасть нам кращі речі для більшого комфорту») подарувала нам пластмаси, синтетичні барвники та багато інших корисні матеріали. Але вона ж стала причиною харчових отруєнь інсектицидами, дір у озоновому шарі, забруднення водойм, радіоактивних відходів і тисяч отруйних відстійників по всьому світу. Хімічна промисловість несе відповідальність не тільки за багато хвороб людей, а й за загибель незліченних рослин і тварин в природних екосистемах.
Генетично модифіковані організми слід розглядати в такому ж контексті. Звичайно, ніхто не сперечається з тим, що сучасні біотехнології мають свої негативні сторони з соціальної, екологічної та медичної точок зору, навіть якщо до цих пір практично не було повідомлень про захворювання, викликаних споживанням модифікованих продуктів. Але потенційний шкоди будь-якої технології потрібно розглядати разом з потенційним благом від її застосування, і в цьому відношенні генетичні технології коштують урівень з іншими технологіями.
Сучасні дискусії з приводу застосування генетичних технологій слід вести з урахуванням досвіду минулого та використання в майбутньому будь-яких технологій. Людство вже достатньо помилявся в минулому, пора навчитися обережності. Такий основний принцип обережності: за умови вибору тактики і при обмежених можливостях передбачити наслідки, діяти так, щоб завдати мінімум шкоди, і так, щоб будь-який крок був звернемо. У будь-якому разі не слід приймати важливих рішень, поки не будуть ретельно розглянуті всі сторони проекту. Така тактика заснована на тому, що в минулому вже приймалися безвідповідальні рішення про використання нових технологій, що не мають прецедентів, а можливість переносити гени з одного організму в інший дійсно не має прецедентів. Коли виявилося, що ДДТ може вбивати комах, то за допомогою цієї речовини сподівалися назавжди покінчити зі шкідниками. У 1948 році відкрив його Пауль Мюллер отримав Нобелівську премію. І хоча генетики розуміли, що відбір резистентних мутантів неминучий, а екологи знали, що шкідливі комахи представляють собою лише невелику частину всіх комах, широке застосування інсектициду здавалося цілком прийнятним способом контролю над одвічними ворогами полів. Ніхто і не припускав, що ДДТ та інші хімікати поширяться в природі настільки, що увійдуть у харчові ланцюги. Хімікати накопичуються в жировій тканині і разом з їжею переходять в організм інших тварин. У процесі біомагніфікаціі концентрація цих речовин збільшується в тисячі, і навіть сотні тисяч разів, досягаючи критичного рівня в скорлуповой залозах птахів і молочних залозах жінок. Цей феномен виявили тільки після того, як почали зникати багато хижаків. Ніякі запобіжні заходи не допомагали запобігти настільки непередбачену небезпека. Не було можливості передбачити наслідки застосування та хлорфторвуглеців, які в перший час називали дивом сучасної хімії. Ці речовини хімічно інертні і служать прекрасними переносниками хімічних речовин в аерозольних балончиках. Ніхто не знав, що хлорфторвуглеці будуть накопичуватися у верхніх шарах атмосфери і вільні радикали хлору почнуть руйнувати озоновий шар. Природа революційних технологій така, що ми не можемо передбачити всіх наслідків їх використання.
Висновок
Генетична інженерія, а зокрема робота з рекомбінантними ДНК на сьогоднішній день є найважливішою і найбільш швидко розвивається складовою частиною біотехнології. Методи генної інженерії перетворять клітини бактерій, дріжджів і ссавців у "фабрики" для масштабного виробництва будь-якого білка. Це дає можливість детально аналізувати структуру і функції білків і використовувати їх в якості лікарських засобів. В даний час кишкова паличка (E. coli) стала постачальником таких важливих гормонів як інсулін і соматотропін. Раніше інсулін отримували з клітин підшлункової залози тварин, тому вартість його була дуже висока. Для отримання 100 г кристалічного інсуліну потрібно 800-1000 кг підшлункової залози, а один заліза корови важить 200 - 250 грам. Це робило інсулін дорогим і важкодоступним для широкого кола діабетиків. У 1978 році дослідники з компанії "Генентек" вперше отримали інсулін в спеціально сконструйованому штамі кишкової палички. Інсулін складається з двох поліпептидних ланцюгів А і В довжиною 20 і 30 амінокислот. При з'єднанні їх дисульфідними зв'язками утворюється нативний дволанцюжкової інсулін. Було показано, що він не містить білків E. coli, ендотоксинів та інших домішок, не дає побічних ефектів, як інсулін тварин, а з біологічної активності від нього не відрізняється. Згодом у клітинах E. coli був здійснений синтез проінсуліну, для чого на матриці РНК за допомогою зворотної транскриптази синтезували її ДНК-копію. Після очищення отриманого проінсуліну його розщепили і отримали нативний інсулін, при цьому етапи екстракції і виділення гормону були зведені до мінімуму. З 1000 літрів культуральної рідини можна отримувати до 200 грамів гормону, що еквівалентно кількості інсуліну, що виділяється з 1600 кг підшлункової залози свині чи корови.
Соматотропін - гормон росту людини, секретується гіпофізом. Недолік цього гормону призводить до гіпофізарної карликовості. Якщо вводити соматотропін в дозах 10 мг на кг ваги три рази на тиждень, то за рік дитина, яка страждає від його нестачі, може зрости на 6 см. Раніше його отримували з трупного матеріалу, з одного трупа: 4 - 6 мг соматотропіну в перерахунку на кінцевий фармацевтичний препарат. Таким чином, доступні кількості гормону були обмежені, крім того, гормон, що отримується цим способом, був неоднорідний і міг містити повільно розвиваються віруси. Компанія "Genentec" в 1980 році розробила технологію виробництва соматотропіну за допомогою бактерій, який був позбавлений перерахованих недоліків. У 1982 році гормон росту людини був отриманий в культурі E. coli і тварин клітин в інституті Пастера у Франції, а з 1984 року розпочато промислове виробництво інсуліну і в СРСР. При виробництві інтерферону використовують як E. coli, S. cerevisae (дріжджі), так і культуру фібробластів або трансформованих лейкоцитів. Аналогічними методами отримують також безпечні і дешеві вакцини.
На технології рекомбінантних ДНК засновано отримання високоспецифічних ДНК-зондів, за допомогою яких вивчають експресію генів у тканинах, локалізацію генів у хромосомах, виявляють гени, що володіють спорідненими функціями (наприклад, у людини і курки). ДНК-зонди також використовуються в діагностиці різних захворювань.
Технологія рекомбінантних ДНК зробила можливим нетрадиційний підхід "білок-ген", що отримав назву "зворотна генетика". При такому підході з клітини виділяють білок, клонують ген цього білка, модифікують його, створюючи мутантний ген, що кодує змінену форму білка. Отриманий ген вводять в клітину. Якщо він експресується, несуча його клітка і її нащадки будуть синтезувати змінений білок. Таким чином можна виправляти дефектні гени і лікувати спадкові захворювання.
Якщо гібридну ДНК ввести в запліднене яйцеклітину, можуть бути отримані трансгенні організми, що експресують мутантний ген і передають його нащадками. Генетична трансформація тварин дозволяє встановити роль окремих генів і їх білкових продуктів як у регуляції активності інших генів, так і при різних патологічних процесах. За допомогою генетичної інженерії створені лінії тварин, стійких до вірусних захворювань, а також породи тварин з корисними для людини ознаками. Наприклад, мікроін'єкція рекомбінантної ДНК, яка мала ген соматотропіну бика в зиготу кролика дозволила отримати трансгенні тварина з гіперпродукцією цього гормону. Отримані тварини мали яскраво вираженої акромегалію.
Зараз навіть важко передбачити всі можливості, які будуть реалізовані в найближчі кілька десятків років.
Список літератури
Баурін В.В., Мірошниченко О.І., Захарченко В.І. и др. / / Генно-інженерні сільськогосподарські тварини, Москва, 1995, с. 154-165.
Бондарук В.В., Захарченко В.І., Бєляєва Р.Х. и др. / / Генно-інженерні сільськогосподарські тварини, Москва, 1995, с. 138-153.
Брем Г., Зінов'єва Н., Ернст Л.К. / / З.-х. біологія, 1993, № 6, с. 3-27.
Брем Г., Кройсліх Х., Штранцінгер Г. Експериментальна генетика у тваринництві / / М.: РАСГН, 1995, 326 с.
Васильєв І.М., Шихов І.Я., Некрасов О.А. и др. / / Доповіді АН СРСР, 1989, № 1, с. 206-209.
Гольдман І.Л., Башкеев Є.Д., Гоголівський П.А. и др. / / Доповіді РАСГН, 1992, № 9-10, с. 25-30.
Гольдман І.Л., Разін С.В., Ернст Л.К. и др. / / Біотехнологія, 1994, № 2, с. 3-12
Еніколопов Г.Н., Захарченко В.І., Гращук М.А. и др. / / Доповіді АН СРСР, 1988, т. 299, № 5, с. 1246-1249.
Зеленіна І.А., Семенова М.Л., Алімов А.А. и др. / / Генетика, 1991, Т. 27, № 12, с. 2182-2186.
Зінов'єва Н.А. / / Автореф. докт. дисс.: Дубровиці, 1998, 36 с.
Зінов'єва Н., Безенфельдер У., Мюллер С. та ін / / Біотехнологія, 1998а, № 1, с. 3-11
Зінов'єва Н., Безенфельдер У., Мюллер С. та ін / / З.-х. біологія, 1998б, № 6, с. 31-34.
Зінов'єва Н., Безенфельдер У., Мюллер М. / / Біотехнологія, 1998в, 4, 17-31.
Зінов'єва Н.А., Ернст Л.К., Брем Г. Трансгенні тварини та можливості їх використання: молекулярно-генетичні аспекти трансгенеза у тваринництві / / Дубровиці, 2000, 128 с.
Кузнєцова І.В., Кузнєцов А.В., Сігаєва В.А. и др. / / Біотехнологія, 1993, т. 11-12, с.2-5.
Ларіонов О., Добровольський В., Лагутін О. / / «Нові напрямки біотехнології», Пущино, 1994, 127.
Козікова Л.В., Медведєв С.Ю., Булла Й. І ін / / «Біотехнологія в рослинництві, тваринництві і ветеринарії», Москва, 2001, с. 160-161.
Колесніков В.А., Алімов А.А., бармінці В.А. и др. / / Генетика, 1990; Т. 26, № 12, с. 2122-2126.
Колесніков В.А., Зеленіна І.А., Семенова М.Л. и др. / / Онтогенез, Т. 26, № 6, 467-480.
Кузнєцов А.В., Кузнєцова І.В. / / Онтогенез, 1995, т.26, № 4, с. 300-309.
Кузнєцова І.В., Кузнєцов А.В., Сігаєва В.А. и др. / / Біотехнологія, 1993, № 11-12, с. 2-5.
Кузнєцова І.В., Щит І.Ю.; Кузнєцов А.В. / / З.-х. біологія, 1998; № 6, с. 40-44.
Мірошниченко О.І., Захарченко В.І., Прокоф'єв М.І. и др. / / Доповіді ВАСГНІЛ, 1988, № 5, с. 31-32.
Прокоф'єв М.І., Ларіонов О.А., Мезина М.М. и др. / / «ДНК-технології в клітинної інженерії і маркування ознак сільськогосподарських тварин», Дубровиці, 2001, с. 114-115.
Розенкрантц А.А., Ячменев С.В., Соболєв А.С. / / Доповіді АН СРСР, 1990, Т. 312, № 2, с. 493-494.
Ком В.Г., Солодухіна Л.І., Соколов Н.В. и др. / / Генно-інженерні сільськогосподарські тварини, Москва, 1995, с. 73-84.
Савченкова І., Зінов'єва Н., Булла Й. та ін / / Успіхи сучас. біології, 1996, 116 (1), 78-91.
Титова В.А., Зінов'єва Н.А., Савченкова І.П. и др. / / Доповіді РАСГН, 2001, № 6, с. 29-31.
Чистяков Д.А., Захарченко В.І., Мезина М.М. и др. / / Генно-інженерні сільськогосподарські тварини, Москва, 1995, с. 127-137.
Шафен Р.А., Зеленіна І.А., Семенова М.Л. и др. / / Онтогенез, 2000, Т. 31, № 5, с. 388-394.
Ернст Л.К. / / Сільськогосподарська біологія, 1987, № 11, с. 11-17.
Ернст Л.К. Проблеми селекції та біотехнології сільськогосподарських тварин / / Москва, 1995, 359 с.
Ернст Л.К. Генна інженерія - важливий фактор селекції сільськогосподарських тварин / / «ДНК-технології в клітинної інженерії і маркування ознак сільськогосподарських тварин», Дубровиці, 2001, с. 7-18.
Ернст Л.К., Георгієв Г.П., Еніколопов Г.М. / / Вісник с.-г. науки, 1987, № 9, с. 68-73.
Ернст Л.К., Гольдман І.Л., Кадулін С.Г. / / Біотехнологія, 1993, № 5, с. 2-14.
Ернст Л.К., Брем Г., Махаев Є.А. / / Генно-інженерні сільськогосподарські тварини, Москва, 1995а, с.48-53.
Ернст Л., Гольдман І., Зінов'єва Н. и др. / / Доповіді РАН, 1995б, 345 (4), 555-558.
Ернст Л.К., Гольдман І.Л., Семенова В.А. и др. / / Вівчарство, 1991, № 5, с. 14-16.
Ернст Л.К., Гольдман І.Л., Семенова В.А. и др. / / Доповіді ВАСГНІЛ, 1990, № 6.
Ернст Л.К., Кузін Б.А., Еніколопов Г.М. и др. / / Доповіді ВАСГНІЛ, 1989, № 9, с. 45-49.