Зміст
Лекція 1. Обладнання біохімічної лабораторії. Загальні принципи біохімічного дослідження
Лекція 2. Руйнування клітин і екстракція. Центрифугування
Лекція 3. Поділ білків шляхом осадження
Лекція 4. Буферні розчини та спеціальні добавки. Ультрафільтрація. Діаліз. Детергенти та їх застосування
Лекція 5. Загальні принципи хроматографії, класифікація хроматографічних методів
Лекція 6. Матеріали матриць сорбентів і обмінників. Техніка колонкової хроматографії
Лекція 7. Адсорбційна та розподільна хроматографії
Лекція 8. Тонкошарова хроматографія
Лекція 9. Іонообмінна хроматографія
Лекція 10. Іонообмінна ЖХВД білків. Хроматофокусірованіе
Лекція 11. Адсорбційна хроматографія
Лекція 12. Гель-фільтрація
Лекція 13. Теоретичні та методичні основи електрофорезу
Лекція 14. Ізоелектричного фокусування і ізотахофорез
Лекція 15. Виявлення, кількісне визначення і характеристика макромолекул після електрофорезу
Лекція 16. Принцип імунного електрофорезу. Іммунофіксація
Лекція 17. Електросінерез. Електроіммуноаналіз
Лекція 18. Методи мічених атомів
Лекція 19. Спектрофотометричні методи аналізу
Лекція 20. Флюоріметріческіе методи аналізу
Лекція 21. Імуноферментний аналіз
Лекція 22. Радіометричний аналіз. Мас-спектроскопія
Лекція 23. Блот-аналіз
Лекція 1. Обладнання біохімічної лабораторії. Загальні принципи біохімічного дослідження
Джерела небезпеки і заходи безпеки в лабораторії при проведенні біохімічного аналізу. Особливості застосування загальних лабораторних методів у біохімічному експерименті. Мікро - і нанометоди.
Лабораторний посуд: матеріали для її виготовлення, вибір оптимального матеріалу залежно від поставленого завдання біохімічного експерименту, види лабораторного посуду, біосумісні способи миття та сушіння лабораторного посуду, особливі способи підготовки лабораторного посуду для біохімічного аналізу.
Вихідні реактиви для біохімічної лабораторії. Відомості про реактивах: маркування реактивів, використання літературних та електронних джерел довідкової інформації. Особливості зберігання реактивів для біохімічного аналізу. Способи перевірки якості і чистоти реактивів, вибір способу перевірки, адекватного поставленої аналітичної задачі. Методи додаткової підготовки та очищення реактивів для біохімічного аналізу. Перекристалізація.
Методи відбору реактивів у біохімічному аналізі. Зважування: види ваг для аналітичної біохімії, принципи і джерела похибок зважування. Дозування рідин, використання піпетковий дозаторів, можливі джерела похибок. Особливості приготування розчинів в аналітичній біохімії: принципи приготування, способи вираження, концентрацій, розчинності, розчинники для біохімічного аналізу, способи поступового додавання реактивів, розчинення погано розчинних речовин (суспендированием, емульгування, детергенти, використання яких допустимо в біохімічному аналізі). Буферні розчини для використання в біохімічному аналізі.
Методи контролю температури в біохімічній лабораторної практиці.
Необхідність проведення ряду біохімічних аналізів в спеціальних умовах. Техніка робіт з реагентами, чутливими до вологи, кисню повітря і світла. Проведення реакцій в апротонних розчинниках, у безводних умовах і в інертній атмосфері. Техніка проведення фотохімічних реакцій.
Лекція 2. Руйнування клітин і екстракція. Центрифугування
Принцип методу, основні визначення та формули. Центрифугування застосовується для розділення неоднорідних рідких середовищ.
Центрифугування дозволяє розділити суміш, що складається з двох або більше компонентів з різною питомою щільністю, якщо принаймні один з цих компонентів - рідина.
Поділ речовин за допомогою центрифугування засноване на різній поведінці часток у відцентровому полі. У відцентровому полі частинки, що мають різну щільність, форму або розміри, осідають з різною швидкістю.
Швидкість осадження, або седиментації, залежить від відцентрового прискорення (G), прямо пропорційного кутовий швидкості ротора (, в рад / с) і відстані між часткою і віссю обертання (г, в см): G = 2 • м. Оскільки один оборот ротора складає 2л радіан, кутову швидкість ротора в оборотах на хвилину (об / хв) можна записати так: = 2 (об. / хв), а відцентрове прискорення тоді буде одно: G = 4 r / 3600 (об. / хв) 2.
Відцентрове прискорення зазвичай виражається в одиницях g {гравітаційна постійна, рівна 980 см * с-1) і називається відносним відцентровим, прискоренням (Оцу), тобто Оцу = 4 r/3600 * 980 (об. / хв) 2 або Оцу = 1,11 * 10-5 * r (об. / хв) 2 (*)
На підставі рівняння (*) Доулем і Котціасом була складена номограма, що виражає залежність Оцу від швидкості обертання ротора і радіуса г - середнього радіусу обертання стовпчика рідини в центріфужний пробірці (тобто відстані від осі обертання до середини стовпчика рідини).
Номограма для розрахунку відцентрового прискорення
Для визначення G з'єднують прямою лінією значення радіуса та швидкості обертання ротора на крайніх шкалах; точка перетину цієї прямої з середньою шкалою дає шукану величину відцентрового прискорення. Слід мати на увазі, що права колонка цифр шкали G відповідає правій колонці цифр шкали швидкості обертання ротора; ліва - лівої.
Швидкість седиментації сферичних частинок залежить не тільки від відцентрового прискорення, але і від щільності і радіуса самих частинок і від в'язкості середовища суспендированием. Час осадження сферичної частинки в рідкому середовищі від меніска рідини до дна центріфужний пробірки обернено пропорційно швидкості седиментації і визначається наступним рівнянням (закон Стокса, видозмінений Сведберг і Нікольс):
де t - час седиментації, с; - в'язкість середовища, Паскаль • секунда; ГЧ - радіус частинки, см; рч - щільність частинки (питома вага); p - щільність середовища (рідини) або питома вага; гм - відстань від осі обертання до меніска рідини, см; гд - відстань від осі обертання до дна пробірки, див.
Як випливає з рівняння (**), при заданій швидкості обертання ротора час, необхідний для осадження гомогенних сферичних частинок, обернено пропорційно квадрату їх радіусів і різниці густин частинок і середовища і прямо пропорційно в'язкості середовища. Тому суміш гетерогенних, приблизно сферичних частинок, що розрізняються по щільності і (або) розмірами, можна назвати або за рахунок різного часу осадження їх на дно пробірки при даному прискоренні, або за рахунок розподілу седіментірующіх частинок вздовж пробірки, що встановлюється через певний проміжок часу. При розділенні речовин необхідно враховувати і такі важливі фактори, як щільність і в'язкість середовища.
Описаними методами можна виділяти клітинні органели з гомогенатов тканин. Основні компоненти клітини осідають в такій послідовності: спочатку цілі клітини та їх фрагменти, потім ядра, хлоропласти, мітохондрії, лізосоми (або інші мікротільця), мікросоми (фрагменти гладкою і шорсткою ендоплазматичної мережі) і, нарешті, рибосоми.
Осадження несферичних часток не підпорядковується рівнянню (**), тому частинки однакової маси, але різної форми осаджуються при різних швидкостях. Ця особливість використовується при дослідженні конформації макромолекул.
Препаративні центрифугування полягає у виділенні біологічного матеріалу для наступних біохімічних досліджень.
За допомогою препаративного центрифугування виділяють велику кількість клітинних частинок для вивчення їхньої морфології, структури і біологічної активності. Метод застосовується для виділення таких біологічних макромолекул, як ДНК і білки, з попередньо очищених препаратів.
Аналітичне центрифугування застосовується головним чином для вивчення чистих і практично чистих препаратів макромолекул або частинок, наприклад, рибосом. У даному випадку використовується невелика кількість матеріалу, а седиментація досліджуваних частинок безперервно реєструється за допомогою спеціальних оптичних систем. Метод дозволяє отримувати дані про чистоту, молекулярній масі і структурі матеріалу.
У практиці препаративні центрифугування застосовується набагато частіше, ніж аналітичне, тому ми зупинимося на ньому більш докладно, хоча в основі обох методів лежать загальні принципи.
Лекція 3. Поділ білків шляхом осадження
Осадження нуклеїнових кислот.
Зазвичай, коли говорять про висолювання, мають на увазі висолювання саме сульфатом амонію. Цьому методу вже більше 130 років. Раніше він застосовувався і для фракціонування, зараз, в основному, як дешевий і зручний метод осадження білків. Можна вважати, що пощастило, якщо при цьому виходить ще і істотна очищення (за висолювання з клітинного екстракту можна розраховувати на приблизно 2-10 кратне збагачення).
Чому саме сульфат амонію?
При рівній молярної концентрації полівалентні аніони долее ефективні для висолювання, ніж моновалентні (почасти через те, що має значення не концентрація солі, а іонна сила розчину), а полівалентні катіони навіть перешкоджають дії полівалентних аніонів. Виходить, що оптимальне сполучення - це полівалентний аніон з моновалентний катіонами.
Ефективність висолювання убуває в серії Гофмейстера (Hofmeister):
Цитрат> Сульфат> Фосфат> Хлорид> Нітрат> тіоционату
У цьому ж ряду убуває стабілізуючий ефект і зростають хаотропні властивості солі. Таким чином, найбільш відповідні кандидати: цитрат і сульфат. Сульфат більш зручний через кращу розчинності (наприклад, при нормальній температурі розчинність амонійних солей цитрату і сульфату рівні приблизно 2.5м і 4.1М); низької ціни і стабілізуючого впливу, який він чинить на більшість білків при концентраціях вище 0.5м.
(NH4) 2SO4 преципітує білки по двом механізмам
сульфат-іони роблять молекулу білка більше компактної (менше розчинної) за рахунок взаємодії з позитивно зарядженими амінокислотами. Це взаємодія більш еффеектівно при pH <pI.
зневоднення. Один іон SO42 - має 13-14 молекул H2O тільки в першому гідратному шарі і, можливо, більше - у другому. Якщо одна молекула сульфату координує навіть 15 молекул H2O, то 3M сульфат амонію пов'язує 45 з наявних у воді 55M молекул H2O.
Іонна сила розчину
I = 1 / 2 ci (zi) 2,
де:
ci - концентрація іона; zi - заряд іона.
Наприклад, для 1M NaCl: I = 1 / 2 (1 (1) 2 + 1 (1) 2) = 1 для 1M (NH4) 2SO4: I = 1 / 2 (2 (1) 2 + 1 (1) 2 ) = 3
Розчинність білків
Вплив іонної сили і температури При низькій іонній силі (<0.2M) розчинність білка збільшується при підвищенні концентрації солі, так як екранування тяжіння протилежно заряджених груп призводить до розпушення структури білка. При високій іонній силі (> 0.2M) - розчинність білка знижується через висолювання і зневоднення. Вона падає експоненціально з підвищенням іонної сили: logS = ß - KsI, де:
S [g / l] - розчинність білка; I - іонна сила; ß; Ks - константи.
Ks - злегка розрізняється для різних білків і майже не залежить від pH і температури. ß - сильно залежить від білка, pH і температури; підвищення температури викликає пониження ß => зменшення розчинності білка.
Вплив pH. При низькій іонній силі (<0.2M) розчинність білка мінімальна при pH рівному ізоелектричної точці білка. При високих концентраціях (NH4) 2SO4 розчинність підвищується з підвищенням pH, тому що при низьких pH сульфат іон компактізует білок взаємодіючи з позитивно зарядженими групами. Так що краще проводити осадження при pH <pI.
Вплив початкової концентрації білка Білки бувають двох типів. Для типу I розчинність не залежить від вихідної концентрації білка; для типу II - залежить сильно.
Обмеження методу.
Висока концентрація іонів амонію в осаді може заважати точному визначенню концентрації білка.
Висаліваются не тільки білки, а й, наприклад, миючий засіб. Наприклад, 0.5% Tween 20 і Triton X100 починають збирати при концентраціях сульфату амонію більше 1M. Утворений преципітат має щільність трохи менше щільності сольового розчину. При центрифугуванні він спливає, прихоплюючи з собою білки.
Осадження сульфатом амонію не можна використовувати для білків, що вимагають присутності Ca2 + через нерастворимости сульфату кальцію.
Лекція 4. Буферні розчини та спеціальні добавки. Ультрафільтрація. Діаліз. Детергенти та їх застосування
Буферні розчини (синонім: буферні суміші, буферні системи, буфери) - розчини з певною концентрацією водневих іонів, що містять пов'язану кислотно-основну пару, що забезпечує стійкість величини їх водневого показника при незначних змінах концентрації або при додаванні невеликої кількості кислоти або лугу.
Кислотно-основна пара Б. р. являє собою слабку кислоту та її сіль, утворену сильною основою (наприклад, оцтова кислота СН 3 СООН і ацетат натрію CH 3 COONa) або слабка основа і його сіль, утворену сильною кислотою (наприклад, гідроокис амонію NH 4 OH і хлористий амоній NH 4 CI ). При розведенні розчину або додавання до нього певної кількості кислоти або лугу кислотно-основна пара здатна відповідно бути донором або акцептором водневих іонів, підтримуючи Т.ч. величину водневого показника на відносно постійному рівні.
Буферні розчини зберігають стійкість буферних властивостей у певному інтервалі значень рН, тобто мають певну буферною ємністю. За одиницю буферної ємності умовно приймають ємність такого буферного розчину, для зміни рН якого на одиницю потрібно додати 1 моль сильної кислоти або сильної лугу на 1 л розчину. Буферна ємність знаходиться в прямій залежності від концентрації Б. р.: Чим концентрированнее розчин, тим більше його буферна ємність; розведення Б. р. сильно зменшує буферну ємність і лише незначно змінює рН.
Тканинна рідина, кров, сеча та інші біологічні рідини є буферними розчинами. Завдяки дії їхніх буферних систем підтримується відносна сталість водневого показника внутрішнього середовища, що забезпечує повноцінність метаболічних процесів. Найбільш важливою буферною системою є бикарбонатная система крові. Концентрація в крові бікарбонатів служить одним з основних показників кислотно-лужного стану організму. Цей показник дозволяє встановити характер порушення кислотно-лужної рівноваги при ряді патологічних процесів.
У лабораторній практиці Б. р. використовують в тих випадках, коли те чи інше дослідження може бути проведено лише при постійному значенні рН (наприклад, визначення активності ферментів, вивчення кінетики ферментативних реакцій, електрофоретичного розділення білкових сумішей та інше) і в якості стандартів при визначенні рН різних розчинів, в т . ч. біологічних рідин.
Буферні розчини готують зазвичай шляхом розчинення у воді взятих у відповідних пропорціях слабкої кислоти і її солі, утвореної лужним металом, часткової нейтралізації слабкої кислоти сильною лугом або слабкої основи сильною кислотою, розчинення суміші солей багатоосновної кислоти.
Лекція 5. Загальні принципи хроматографії, класифікація хроматографічних методів
Всім хроматографическим методам властиві деякі загальні характеристики, що дозволяють нижче викласти елементи їх узагальненої теорії. Проте спочатку розглянемо специфічні особливості різних варіантів хроматографічного фракціонування. Це, з одного боку, дозволить за теоретичними міркуваннями увесь час бачити реальні риси хроматографічного експерименту, а з іншого - дасть можливість запровадити класифікацію хроматографіче-ських методів. У ході подальшого викладу (зокрема, для його розбиття по главах) найзручніше класифікувати методи за основним принципом фракціонування. Таку класифікацію ми розглянемо досить докладно і лише в кінці розділу коротко відзначимо інші можливі варіанти класифікації.
КЛАСИФІКАЦІЯ ЗА ПРИНЦИПОМ ФРАКЦІОНУВАННЯ.
Як вже згадувалося, в будь-якому хроматографічному процесі фігурують нерухома і рухома фази, між якими розподіляються молекули фракціоніруемой суміші речовин. Під основним принципом фракціонування будемо мати на увазі природу фізичного, хімічного або біологічного явища, що обумовлює такий розподіл.
Класифікація за способом елюції.
Фронтальний аналіз.
Так називається варіант хроматографічного процесу, коли розчин суміші компонентів безперервно подається на вхід хроматографічної колонки. На виході її в цьому випадку з'являються один за одним кілька "фронтів" елюата. За першим з них слід чистий, швидше за інших мігруючий в даній системі компонент суміші, що відрізняється, очевидно, найменшим спорідненістю до нерухомій фазі. Другий фронт відзначає додавання до нього наступного за рухливості компонента. За третім фронтом слід вже суміш трьох компонентів. В даний час з цілком зрозумілих причин фронтальний аналіз майже вийшов з ужитку і застосовується лише в окремих, спеціальних випадках.
Витіснювальний хроматографія.
У цьому варіанті в колонку або на стартову лінію хроматографічної пластинки наносять певну порцію розчину вихідної суміші речовин, а потім ведуть елюція розчином речовини, що володіє завідомо великим спорідненістю до нерухомій фазі хроматографічної системи, ніж будь-який з компонентів суміші. Відбувається витіснення їх з нерухомої фази, причому в першу чергу тих, які мають менший спорідненістю до сорбенту, а потім і всіх інших. Елюент виштовхує всі компоненти суміші попереду себе на зразок поршня. Так як вони виходять у рухливу фазу концентрованими, то між ними також йде конкуренція за зв'язок з нерухомою фазою. Компоненти, поступаються іншим в силі спорідненості до цієї фазі, відтісняються ще вперед, де сорбуються, але тільки до тих пір, поки їх знову не витіснять компоненти, що володіють великим спорідненістю до сорбенту. У результаті такого чергування сорбції та витіснення компоненти суміші будуть виходити з колонки один за одним в порядку зростання сили їх зв'язку з нерухомою фазою. Ясно, що при цьому зони сусідніх компонентів будуть стикатися або навіть трохи перекриватися один з одним. Для аналітичного фракціонування метод непридатний, але вдалий для препаративного або напівпромислового розділення речовин, оскільки ємність колонки тут використовується дуже ефективно.
Хроматографічна елюція.
На відміну від попереднього в цьому методі елюірующій розчин володіє меншим спорідненістю до сорбенту, ніж будь-який з компонентів вноситься на колонку або пластинку суміші речовин. Ці компоненти поступово "вимиваються" з нерухомої фази і рухаються вздовж колонки за рахунок безперервного перерозподілу їх молекул між нерухомою фазою і елюентом. Кожен з них мігрує незалежно від інших у відповідності із співвідношенням сил його спорідненості до нерухомої і рухомої фаз. Міграція йде тим повільніше, чим більше спорідненість до нерухомій фазі. Саме цей, придатний для аналітичних цілей варіант хроматографії докладно розглянуто в наступному розділі, тому тут можна обмежитися вказівкою на те, що при хроматографічної елюції компоненти суміші виходять з колонки окремими, розділеними одна від одної зонами, які відповідно з типовою формою профілю розподілу речовини в кожній такій зоні (див. нижче) часто називають хроматографічними піками.
КЛАСИФІКАЦІЯ По розташуванню нерухомої фази.
Ця класифікація не вимагає особливих пояснень. Якщо пористі гранули гелю або сорбенту для будь-якого типу хроматографії заповнюють скляну або металеву колонку, то говорять про хроматографії на колонці, або "колонкової хроматографії", хоча останній вираз відноситься до категорії вкоріненого жаргону. Хроматографію на колонці в багатьох випадках тепер ведуть при дуже великому тиску подачі елюента (до 300-400 атм), що дозволяє зменшити діаметр гранул до 5-10 мкм з витікаючими звідси (див. нижче) істотними перевагами у швидкості і якості фракціонування мікрокількостей вихідної речовини . За це доводиться розплачуватися використанням дорогих сталевих прецизійних колонок та спеціальної апаратури, але у випадку серійних аналізів такі витрати себе виправдовують. Рідинну хроматографію на колонках при високому тиску домовимося скорочено позначати ЖХВД. В англійській літературі прийнято позначення HPLC, яке розшифровують як "high pressure (іноді - Align performance) liquid chromatography".
Якщо хроматографічний процес йде в похило розташованому, рівному і щодо товстому (кілька міліметрів), відкритому з поверхні шарі гранул, між якими рідина рухомої фази тече тільки під дією сили тяжіння, то його можна назвати хроматографією в товстому шарі "Практично цей метод знайшов собі застосування тільки для гель-фільтрації.
Тонкий (0,1-0,5 мм) шар гранул, адсорбованих або іншим чином закріплених на поверхні пластинки зі скла або пластику, дозволяє здійснювати хроматографії в тонкому шарі, або "тонкошарової хроматографії" (ТШХ). ( thin layer chromatography ). Англійське позначення TLC (thin layer chromatography). Рух рідкої фази відбувається за рахунок капілярних сил.
Замість тонкого шару сорбенту на основі целюлози можна використовувати просто фільтрувальний папір, іноді спеціальну - з введеними в неї йоногенних групами. Відповідний процес слід називати хроматографією на папері.
Замість паперу для аналогічного типу хроматографії використовують плівки з модифікованої целюлози, поліамідні плівки і т.д. - Це варіанти хроматографії на плівках,
Платівки, папір чи плівка можуть розташовуватися горизонтально або вертикально, у останньому випадку рух рухомої фази може бути висхідним або низхідним - це не грає принципової ролі, так як воно обумовлене в основному капілярними силами. Препарати на пластинки або папір найчастіше наносять у вигляді смужки або плями розчину в одного краю сорбенту, неподалік від рівня елюірующей рідини, в яку цей край занурюють. Останнім часом для ТШХ все частіше застосовують варіант кільцевої хроматографії, коли вихідний препарат наносять у вигляді кільця, а елюція йде радіально.
Лекція 6. Матеріали матриць сорбентів і обмінників. Техніка колонкової хроматографії
Матрицею називають тверду основу нерухомої хроматографічної фази. Вона має вигляд суцільних або пористих гранул, які часто представляють собою просторову сітку лінійних полімерів. Для додання матеріалу матриці необхідних для хроматографії властивостей його модифікують. Модифікація може представляти собою хімічне приєднання ("присадку") йоногенних груп, гідрофобних молекул, біологічно активних речовин або фіксацію шляхом адсорбції тонкого шару розчинника. Хоча особливості хроматографічного процесу визначаються в основному характером модифікації, фізико-хімічні параметри матриці можуть суттєво впливати на властивості нерухомої фази. До таких параметрів належать такі: розміри і форма гранул і їх пір; діапазон розкиду цих розмірів, механічна міцність матеріалу матриці; характер його змочування і набрякання у елюент; хімічна стійкість та інертність в умовах хроматографічної елюції; реакційна здатність, забезпечує можливість хімічної модифікації матриці.
Одні й ті ж матриці, по-різному модифіковані, можуть утворювати нерухому фазу для різних хроматографічних методів, тому щоб уникнути повторень у цьому розділі ми познайомимося з фізико-хімічними властивостями всіх вживаних в даний час матриць, а їх модифікації (а також властивості й номенклатуру одержуваних шляхом цих модифікацій сорбентів) розглянемо у наступних розділах, присвячених різним методам хроматографії. Перш ніж перейти до аналізу властивостей різних матриць, вкажемо загальні для них способи позначення діапазону лінійних розмірів гранул (а для сфер - їх діаметрів). "). Цей діапазон вказують або безпосередньо в мікронах, або у вигляді інтервалу чисел "меш" ("mesh"). Число меш відповідає числу ниток на дюйм в сітці з квадратними осередками, через яку просіваються гранули. З урахуванням товщини самих ниток це означає, що через сітку в 100 меш пройдуть всі гранули, максимальний розмір яких менше 160 мкм, через сітку у 200 меш - менше 80, 400 меш - менше 40. Таким чином, діапазон розмірів гранул 40-80 мкм відповідає 200-400 меш. У нього потраплять гранули, які просіваються через сітку у 200 меш, але не проходять через осередки сітки в 400 меш. Для дрібних гранул, розмір яких менше 40 мкм, прийнято позначення - 400 меш.
Хроматографічної колонки.
Колонки, виготовлені в лабораторії.
У лабораторній склодувної майстерні нескладно виготовити скляну колонку діаметром до 8 см і довжиною до 1,5 м. Зверху колонка забезпечена стандартним шліфом № 14 або. № 29, куди вставляється шліфована пробка з крапельницею. Остання забезпечена оливою малого діаметра, на яку можна одягти трубочку з силіконової гуми, куди вставляється тонка (1-2 мм) поліетиленова або тефлонова трубка від насоса. На нижній кінець крапельниці доцільно надегь з деяким перекосом шматочок поліетиленової трубочки так, щоб при установці пробки на місце трубочка майже стосувалася стінки колонки. Цим запобігається взмучивания верхнього шару сорбенту при падінні краплі. Верхню половину поверхні шліфа змащують силіконовою змазкою, але так, щоб мастило не потрапляла всередину колонки. У момент установки в гніздо пробку трохи провертають. Якщо шліф добре притертими, шар мастила повинен бути прозорим. Герметичність посадки пробки слід перевіряти перед кожним досвідом - при непрацюючому насосі рідина з колонки не повинна випливати. У більш простому варіанті шліфовану скляну пробку можна замінити на гумову.
У нижню частину колонки заплавляются скляний фільтр. Щоб не забиватися, його пори повинні бути свідомо меншого розміру, ніж гранули сорбенту. Разом з тим небажано, щоб фільтр був великий опір току елюента. Для сорбентів, використовуваних при звичайній хроматографії низького тиску, з гранулами не дрібніше 30 мкм у поперечнику підходить скляний фільтр № 3. Однак він може поступово забиватися, якщо використовується сорбент, засмічений "пилом", що утворюється при його стиранні. Щоб уникнути цього не слід нехтувати описаної нижче операцією "відмулювання" сорбенту. Слід також пам'ятати про те, що скляний фільтр сорбує деяку кількість білка або нуклеїнової кислоти. З цієї точки зору в якості фільтрів слід віддати перевагу поліамідні (найлон) або тефлонові пористі пластинки. Однак колонку в цьому випадку доведеться робити збірної, що значно ускладнює її конструкцію. Такі фільтри використовуються в продажних фірмових колонках.
Під фільтром, при переході до зливної трубці малого діаметра утворюється конічна порожнину. При виготовленні колонки треба прагнути до того, щоб обсяг цієї порожнини був мінімальним, оскільки в ній може відбуватися змішування близько йдуть фракцій. На зливний трубці є така ж, як на пробці, олива для трубочки із силіконової гуми, куди вставляється тонка трубка, яка йде до денситометри. Гумову трубочку зручно пережимати гвинтовим затиском, "замикаючи" таким чином вихід з колонки.
Лекція 7. Адсорбційна та розподільна хроматографії
У адсорбційної хроматографії поділ речовин, що входять в суміш і рухаються по колонці в потоці розчинника, відбувається за рахунок їх різної здатності адсорбуватися і десорбувався на поверхні адсорбенту з розвиненою поверхнею, наприклад, силікагелю.
У розподільній ВЕРХ поділ відбувається за рахунок різної розчинності поділюваних речовин в нерухомій фазі, як правило, хімічно прищепленої до поверхні нерухомого носія, і рухомій фазі - розчиннику. Цей метод поділу найбільш популярний, особливо у випадку, коли прищеплена фаза являє собою неполярний алкільних залишок від C8 до C18, а рухлива фаза більш полярна, наприклад суміш метанолу або ацетонітрилу з водою. Це так звана обернено-фазна (назад-фазна, або зі зверненням фаз) хроматографія.
Лекція 8. Тонкошарова хроматографія
Тонкошарова хроматографія (ТШХ) спочатку була розроблена для розділення ліпідів. Хоча хроматографія на папері швидше, ніж хроматографія на колонці, до недоліків її слід віднести те, що папір може бути виготовлена тільки з матеріалів на основі целюлози, що не дозволяє застосовувати її для поділу неполярних речовин. Тонкошарова хроматографія зберігає всі переваги хроматографії на папері, але при цьому дозволяє використовувати будь-який матеріал, який можна тонко подрібнити і отримати потім однорідний шар. Це можуть бути неорганічні речовини, наприклад силікагель, оксид алюмінію, діатомова земля і силікат магнію, а також органічні речовини, зокрема целюлоза, поліаміди і порошок поліетилену.
Платівку з закріпленим сорбентом поміщають в камеру, що містить розчинник, і виявляють висхідній хроматографією. Після того як фронт розчинника майже досягне верхнього краю, платівку виймають з камери і сушать. Для отримання двовимірної хроматограми висушену платівку можна повторно хроматографіровать під прямим кутом в іншому розчиннику. Положення плям, як і при хроматографії на папері, визначають по фарбуванню, по флуоресценції або при обприскуванні різними реагентами, які реагують з речовинами в плямі з утворенням забарвлених продуктів. Зазвичай використовують наступні реагенти: нингидрин для амінокислот, родамін В для ліпідів, хлорид сурми для стероїдів і терпенів, сірчану кислоту з наступним нагріванням практично для всіх органічних сполук (відбувається обвуглювання), перманганат калію в сірчаній кислоті для вуглеводнів, анісовий альдегід в сірчаної кислоті для вуглеводів, пари брому для олефінів і т.д. Речовини можна елюіровать шляхом соскребания.
Лекція 9. Іонообмінна хроматографія
Іонообмінної хроматографії, рідинна хроматографія, заснована на разл. здатності поділюваних іонів до іонного обміну з фиксир. іонами сорбенту, що утворюються в результаті дисоціації йоногенних груп останнього. Для розділення катіонів використовують катіоніти, для поділу аніонів - аніоніти (див. Іоніти). Елюентом в першому випадку служить р-р кислоти, у другому - р-р лугу. Поділ іонів регулюють підбором оптим. значень рН елюента. Сильнокислотного сульфокатионитами і високоосновні аніоніти можуть використовуватися при будь-яких значеннях рН, слабокислотні карбоксильні катіоніти - тільки при рН> 6; слабоосновние аніоніти знаходяться в ионизованном стані при рН <8. Варіюючи рН елюента, можна різко змінювати ступінь іонізації компонентів суміші, що розділяється (сорбатом) і, отже, час їх утримування, домагаючись необхідної селективності розділення. Багатозарядні іони утримуються іонітом сильніше однозарядних. При рівних величинах зарядів утримування падає з ростом радіуса гідратуючий. іона. Тому при І. х. в разб. р-рах на сульфокатионитами час утримування катіонів падає в ряду: Ва 2 +> РЬ 2 +> Sr 2 +> Са 2 +> Ni 2 +> Cd 2 +> Сu 2 +> Со 2 +> Zn 2 +> Mg 2 +> UO 2 +> Тl +> Ag +> Cs +> Rb +> K +> NH 4 +> Na +> H +> Li +. Для орг. іонів на електростатіч. взаємодій. з фиксир. зарядами іоніти накладається ще й гідрофобна взаємодій. орг. частини іона з матрицею іоніту. Щоб зменшити його внесок у утримування орг. іонів і добитися оптим. селективності їх поділу, до водного елюент додають орг. компонент (1-25% метанолу, ізопропанолу, ацетонітрилу або діоксану). Елюент в І. х. крім к-ти або підстави і орг. добавок може містити нейтральний електроліт, напр. NaNO 3, іони к-якого конкурують з розділяються іонами за взаємодій. з сорбентом; при цьому утримування однозарядних іонів падає пропорційно концентрації солі в розчині, двозарядних іонів - пропорційно її квадрату. Важлива також природа нейтрального електроліту: чим вище спорідненість його іонів до сорбенту, тим вище елюірующая сила розчину. У І. х. аніонів часто використовують фосфатні р-ри, к-які володіють великою елюірующей здатністю при високих значеннях рН, де фосфат набуває заряду - 3. Мн. неорг. катіони поділяють на сульфокатионитами, використовуючи як елюента комплексообразователи (орг. к-ти або гідроксикислоти). Поділ грунтується на тому, що константи стійкості утворюються комплексів, а значить і їх сорбційні св-ва, навіть таких близьких за св-вам катіонів, як лантаноїди і актиноїди, при певних значеннях рН розрізняються досить сильно; при цьому заряд комплексу можна міняти (аж до негативного). За допомогою І. х. поділяють нек-риє нейтральні сполуки., якщо вони здатні перетворюється. в заряджені комплекси, як, напр., комплекси вуглеводів з борат-іоном. Утримання поділюваних іонів у колонці пропорційно обмінної ємності іоніту. Для використовуваних в І. х. полімерних іонітів ємність 3-6 мг-екв / г, для іонітів на основі силікагелю з прищепленими до його пов-сти функц. групами - на порядок нижче. При рівному розмірі зерен (зазвичай 5-15 мкм) іоніти на основі силікагелю володіють більш високою швидкістю іонного обміну, що підвищує ефективність хроматографіч. колонок, проте їх гідролітіч. стійкість при рН / 8 недостатня. Для збільшення ефективності (числа теоретич. Тарілок) колонки з полімерними іонітами зазвичай використовують при підвищ. т-рах (50-80 ° С); при цьому збільшуються коеф. дифузії іонів у фазі іоніту. У якості сорбентів для І. х. можуть використовуватися нейтральні носії, просочені рідкими іонітами, тобто несмешивающимися з водою орг. підставами або до-тами, напр., тріоктіламіном, тріоктілметіламмоніем, алкілових зфірамі алкілфосфорной к-ти. Розбавлені розчини йоногенних ПАР в поєднанні з нейтральними гідрофобними носіями знаходять застосування в іон-парної хроматографії (див. Рідинна хроматографія), к-раю відрізняється високою ефективністю і великим числом варійованих параметрів для підбору оптим. селективності розділення. Детектування в І. х. здійснюють за допомогою будь-якого детектора, застосовуваного в рідинної хроматографії (див. Детектори хроматографічні). Наїб. універсальний для іонних сполук кондуктометр, на застосуванні до-якого заснований варіант І. х. - Іонна хроматографія.І. Х. застосовується для розділення катіонів металів, напр., сумішей лантаноїдів і актиноїдів, Zr та Hf Мо і W, Nb і Та; останні поділяють на аніонітах у вигляді аніонних хлоридних комплексів в розчинах соляної і плавикової к-т. Лужні метали поділяють на катіоніту у водних і водно-орг. середовищах, щел. - Зем. і рідкоземельні метали на катіоніту у присутності. комплексонів. Велике значення має автоматич. аналіз сумішей прир. амінокислот на тонкодисперсному сульфокатіоніте в цитратно буфері при підвищ. т-рі. Амінокислоти детектируют фотометричним після їх р-ції з нінгідрином або флюоріметріческі після деріватізаціі фталевим альдегідом. Високоефективна І. х. (Колонки, упаковані сорбентом з розміром зерен 5-10 мкм, тиск для прокачування елюента до 10 7 Па) сумішей нуклеотидів, нуклеозидів, пуріяових і піримідинових основ та їх метаболітів у біол. рідинах (плазма крові, сеча, лімфа та ін) використовується для діагностики захворювань. Білки і нуклеїнові к-ти розділяють з допомогою І. х. на гідрофільних високопроникних іонітах на основі целюлози, декстранів, синтетичні. полімерів, шірокопорістих силікагелів; гідрофільність матриці іоніти зменшує неспеціфічен. взаємодій. біополімеру із сорбентом. У препаративних масштабах І. х. використовують для виділення індивідуальних РЗЕ, алкалоїдів, антибіотиків, ферментів, для переробки продуктів ядерних перетворень.
Лекція 10. Іонообмінна ЖХВД білків. Хроматофокусірованіе
Хроматофокусірованіе - метод іонообмінної хроматографії, що використовує як інструмент поділу градієнт рН, що формується в шарі сорбенту всередині колонки. Метод успішно застосовують для поділу цвіттер-іонних біологічних макромолекул [1-3]. Формування внутрішнього градієнта рН в хроматофокусірованіі полягає в попередньому зрівноважуванні аніонообмінної хроматографічної колонки стартовим розчином (СР) з високим значенням рН, що містить слабка основа, і в подальшому пропусканні елюента з більш низьким рН, складеного зі слабких органічних кислот або амфоліти.
Запропоновано варіант хроматофокусірованія перехідних металів, що поєднує принципи комплексообразовательной хроматографії з формуванням низхідного градієнту рН всередині колонки, заповненої сорбентом з прищепленими олігоетіленамінамі.
В основі цього варіанту лежить утворення амінних комплексів іонів металів (наприклад, Cu2 +, Co2 +, Ni2 +, Zn2 +, Cd2 +, Fe3 +, Cr3 +, Mn2 +, UO22 +, Pb2 +) при початковому значенні рН 7,0 - 7,5 і їх подальша дисоціація при лінійному зниженні рН до 3. Можливості методу продемонстровано на прикладі концентрування і розділення 4 - 5 іонів металів з вивченого ряду у варіантах хроматографії низького тиску та ВЕРХ [4, 5]. На даний момент ведуться роботи на карбоксильних катіонообменних сорбентах.
Це пов'язано з тим, що комплексоутворення іонів металів з олігоетіленамінамі є багатоступеневим процесом з повільною кінетикою. У випадку з карбоксильними сорбентами, ймовірно, вдасться розширити коло іонів металів, поділюваних в умовах формування спадного градієнта рН, включивши в нього лужноземельні метали. Відзначимо, що спадні градієнти рН всередині катіонообменних колонок у хроматофокусірованіі раніше не отримували.
Лекція 11. Адсорбційна хроматографія
Адсорбційна хроматографія (від лат. Affinis - споріднений) (біоспеціфіч. хроматографія, хроматографія по спорідненості), метод очищення і розділення білків, заснований на їх избират. взаємодій. з лігандом, ковалентно пов'язаним з інертним носієм. У кач-ве лігандів використовують соед., Взаємодій. к-яких з розділяються в-вами засноване на біол. ф-ції останніх. Так, при поділі ферментів (для чого преим. І застосовується А. х) лігандами служать їх субстрати, інгібітори або коферменти. Головна особливість, до-раю обумовлює високу ефективність А. х., Полягає в тому, що поділ грунтується на відмінності не фіз. - Хім. ознак молекули (заряду, форми і розміру), а специфічний. функціональних св-в, що відрізняють даний фермент від безлічі інших біополімерів.
Нерухома фаза в А. х. являє собою спеціально отримуваний сорбент, побудований зазвичай за схемою: носій - з'єднує ланка ("ніжка") - специфічний. ліганд. Носієм служить найчастіше сефарозапроізводное агарози, має поперечні зшивки. Приєднання до неї ліганда або "ніжки", що містять, як правило, аміногрупу, здійснюється після активації сефарози бромцианом:
Зміст ліганда коливається від 0,1 до 10 мкмоль на 1 г вологого сорбенту. Сефароза, однак, малоустойчива до дії ряду хім. в-в і мікроорганізмів.
Більш стабільні макропористі неорг. носії (кремнезем, скло) і орг. полімери. Якщо ліганд приєднується безпосередньо до носія, ефективність специфічний. взаємодій. з ферментом помітно знижується внаслідок просторів. труднощів. "Ніжка", як правило, усуває стеріч. перешкоди, віддаляючи ліганд від носія. Як і носій, вона повинна бути інертною і не впливати на процеси в ході А. х., Чого, однак, не завжди вдається досягти. Напр., Приєднання "ніжки" за наведеною вище р-ції призводить до утворення катіонної угруповання ізомочевіни, і сорбент набуває св-ва аніоніта. У кач-ве "ніжки" використовують зазвичай ді - і поліаміни, амінокислоти, пептиди, олігосахариди.
Лігандами можуть служити субстрати (напр., крохмаль або глікоген при поділі амілаз), проте їх перетворюється. в ході А. х., що каталізується поділюваним ферментом, постійно змінює св-ва сорбенту. Тому, як правило, застосовують аналоги субстратів, стійкі до подальшого превращ., Тобто інгібітори ферментів. Так, для виділення протеїназ використовують не розщеплюється ними пептиди D-амінокислот. Ефективні прир. інгібітори ферментів, напр. пепстатін - інгібітор аспартільних протеїназ. Іноді застосовують ліганди, що зв'язують великі групи споріднених ферментів (зокрема, кінази і дегідрогенази). Приклади таких "группоспеціфіч." лігандів-антрахіноновие барвники, аналоги нікотінамідаденіндіну-клеотіда.
Відомі ліганди (напр., похідні фенілборной к-ти), що імітують при взаємодій. з ферментом структуру перехідного комплексу з субстратом. Такі ліганди ефективні при виділенні серинових гідролаз.
Розділення у А. х. зазвичай проводять на хроматографіч. колонках; іноді поділювану суміш поміщають у посудину з сорбентом і витримують до повного зв'язування досліджуваного компонента. Потім сорбент (у колонці або посудині) промивають буферним розчином для видалення незв'язаних в-в, після чого десорбується досліджуваний компонент.д.есорбція (елюція) останнього зазвичай досягається підвищенням іонної сили, зміною рН буферного розчину чи додаванням до нього орг . р-рителя, що послаблює взаємодій. ліганд - фермент. Більш вибіркова десорбція р-ром ліганду.
Крім ферментів, методом А. х. можна виділяти також токсини, рецептори, інгібітори, транспортні білки та інших біологічно активні в-ва. Високої вибірковістю відрізняється т. зв. іммуносорбція, при якій в кач-ве ліганда використовують антитіла, що володіють специфічністю до виділеним білкам; особливо ефективні моноклональні антитіла.
Для розділення білків застосовується також ряд ін аналогічних методов.Т. зв. ковалентний хроматографія заснована на избират. освіті і подальшому розщепленні ковалентних зв'язків між виділяються в-вом і носієм, напр. між білком з SH-групами і ртуть-орг. похідними агарози.
Застосовується також лігандообменная хроматографія, при якій ферменти зв'язуються через функціональний іон металу з комплексоном, іммобілізованим на носії.
Набула поширення гідрофобна хроматографія, при якій сорбент (напр., фенілсефароза), що містить гідрофобні угруповання, вкраплені в гідрофільну матрицю, взаємодіє з гідрофобними ділянками, що містяться на пов-сти білків. Нерідко при цьому спостерігаються також іонообмінні взаємодій., Як, напр., При використанні в якості сорбенту алкіламіносефароз. Избират. виділення глікопротеїнів забезпечують іммобілізовані на носіях лектини - білки, специфічно взаємодіють з кінцевими моносахаридних ланками вуглеводних ланцюгів.
Іммобілізовані субодиниці ряду білків з четвертинної структурою м. б. використані для вилучення цих білків зі складних сумішей внаслідок специфічний. межсуб'едінічних контактів. А. х. сформувалася як метод у кон.60-х гг.20 ст.
Лекція 12. Гель-фільтрація
ГЕЛЬ-ФІЛЬТРАЦІЯ ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДУ.
Звичну назву "гель-фільтрація" для хроматографічного методу фракціонування молекул за їх розмірами можна зберегти і в разі хроматографії при високому тиску, де серед використовуваних жорстких пористих матриць головну роль грає силікагель. ") или "эксклюзивная" (" exclusion ... ") хроматография. Іноді використовують і такі назви, як "молекулярно-ситова" ("molecular sieve") або "ексклюзивна" ("exclusion ...") хроматографія.
Нерухома фаза при гель-фільтрації представлена рідиною, що знаходиться всередині пористих, добре змочуються гранул, що заповнюють хроматографічну колонку. Якщо на таку колонку подається розчинена в елюент суміш молекул різних розмірів, то великі молекули, нездатні проникнути всередину гранул, будуть рухатися вздовж колонки разом з рухомою фазою;
для них коефіцієнт розподілу До == 0. У той же час найбільш дрібні молекули, розміри яких свідомо менше діаметра пір в гранулах, будуть рівномірно розподілятися між рухомою і нерухомою фазами. Для них буде здійснюватися хроматографічний процес з властивим йому уповільненням міграції хроматографічної зони; значення К при цьому близько до одиниці. Для молекул проміжної величини завдяки статистичному розподілу розмірів пор виявиться доступною тільки частина обсягу нерухомої фази. Для них 0 <К <1, тому зона або зони таких молекул будуть мігрувати вздовж колонки швидше, ніж дрібні молекули, але повільніше, ніж великі. У результаті відбудеться фракціонування вихідної суміші молекул на зони залежно від їх розмірів. Зони виходять з колонки в порядку убування цих розмірів. "). У найпростішому випадку, коли у вихідній суміші містяться молекули тільки двох категорій (великі і дрібні), гель-фільтрація дозволяє здійснити "сортування" цих молекул ("group separation"). Зокрема, таким чином проводять знесолення розчинів біополімерів і очищення макромолекул від супутніх їм низькомолекулярних компонентів, наприклад від "попередників", беруть участь в їх біосинтезі. Суміш молекул кількох проміжних розмірів у ході гель-фільтрації розділяється на ряд дискретних груп, що розрізняються між собою за ступенем доступності для них обсягу всередині гранул. Відповідні хроматографічні зони мігрують з різними швидкостями і виходять з колонки у вигляді розділилися "піків".
Лекція 13. Теоретичні та методичні основи електрофорезу
Електроміграційних МЕТОДИ, методи дослідження в розчинах іонізують. в-в і поділу їх складних сумішей; засновані на явищі переносу заряджених частинок в електричні. полі, прикладеному до досліджуваного р-ру. Осн. параметр, що характеризує перенос часток, - рухливість і, тобто відстань l, нак-рої в-во переміститься під дією одиниці градієнта електричні. потенціалу Е за одиницю часу
Процеси, пов'язані з комплексоутворення, асоціацією або пересольватаціей іонів, а також зі зміною стану р-рителя, призводять до зміни заряду або радіусу іонів, що впливає на їх рухливість; на цьому засновано застосування Е. м. для дослідження р-цій в р -рах.
Неоднакова рухливість мовляв. іонів і заряджених частинок разл. хім. природи дозволяє використовувати Е. м. також для розділення сумішей; в даному випадку ці методи часто наз. електрофорезом.
Методи вимірювання рухливості заряджених частинок. Рухливість, або швидкість міграції індивідуальних іонів, можна визначати:
1) щодо зміни концентрації іонів досліджуваного елемента в приелектродному просторі при електролізі;
2) шляхом зміщення в електричні. полі вузьких зон досліджуваних іонів;
3) за допомогою рухомий кордону між зонами (фронтальні методи, ізотахофорез).
Дослідження реакцій у розчинах. Інформацію про рівноважних процесах в р-ре отримують при вивченні залежності швидкості міграції іонів досліджуваного елемента від концентрації одного або дек. беруть участь у р-ції в-в. З цієї залежності можна виявляти склад продуктів р-ції і визначати константи рівноваги.
У випадку р-цій комплексоутворення досліджуваний метал М може перебувати одночасно в дек. іонних формах зв'язку з лігандом А, між якими встановлюється рухома рівновага. У такій системі загальна, або сумарне, переміщення в електричні. поле всіх іонів, що містять М і мають індивідуальні рухливості і i, відбувається з нек-рій СР швидкістю і з, що характеризує сумарний ЕЛЕКТРОМІГРАЦІЯ. перенесення металу в одиницю часу:
де i - число лігандів у комплексі; - Частка металу, зв'язаного в i-у іонну форму;
- Повна константа стійкості іонної форми; [М], [А] і [МА i] - соотв. рівноважні концентрації металу, ліганда і комплексу.
Крива електроміграціі (рис.1), що відображає зміщення рухомого рівноваги між разл. іонними формами при зміні рівноважної концентрації ліганду, встановлює області існування: своб. іонів (I); координаційно ненасичених форм (II); координаційно насичених комплексних іонів (III).
Склад комплексних іонів можна визначати дек. прийомами: за емпі-річ. залежності між рухливістю іонів і величиною їх заряду; зі співвідношення загальної та рівноважної концентрацій ліганда, до-рої визначається за швидкістю електроміграціі введеного в систему допоміжних. металу (за ур-нію 2); за співвідношенням між коеф. дифузії і рухливістю при одній і тій же концентрації ліганду. Константи стійкості іонних форм розраховують шляхом рішення системи з п рівнянь виду (2), де п дорівнює числу іонних форм.
Рис.1. Залежність середньої швидкості міграції металу і з від концентрації ліганда [А]: I, II, Ш - області здійснення соотв. своб. іонів металу, координаційно ненасичених форм і координаційно насичених комплексних іонів.
При дослідженні хім. взаємодій в розчині важливе збереження сталості складу фонового електроліту, до-рої може порушуватися внаслідок електродних р-цій. Тому доцільно використовувати апаратуру, що запобігає проникнення продуктів електролізу в робочу частину приладу. Якщо ця умова виконана, то Е. м. дають досить правильні результати завдяки тому, що відсутня необхідність введення в досліджувану систему нових фаз - іонообмінних смол, екстрагентів і т.п., що викликають побічні рівноважні процеси.
Крім рівноваг Е. м. дозволяють дослідити кінетику комплексоутворення, використовуючи явище доповнить. квазідіффузіонного розмивання під дією електрич. поля спочатку вузької зони, що містить разл. іонні форми з різними знаками заряду. Для досягнення цього ефекту необхідно докласти поле такої напруженості, щоб швидкість ЕЛЕКТРОМІГРАЦІЯ. переносу іонів перевищувала швидкість протікання комплексоутворення.
Для вивчення кінетики р-цій можна використовувати також зонну ЕЛЕКТРОМІГРАЦІЯ іонів в нерівноважному з ними електроліті. В обох випадках застосування Е. м. доцільно при аналізі процесів, швидкість яких брало лежить у прикордонній області між повільними і швидкими р-ціями.
Закономірності електроміграціі іонів в розплавах солей досліджені в значно меншому ступені, ніж у водних розчинах. Звичайне місце при проведенні електроміграціі в розплавлених солях - безводні розплави нітратів і перхлоратів лужних металів або евтектіч. суміші, що мають порівняно низьку т-ру плавлення.
Для електроміграціі в розплавах характерні дві осн. проблеми: сильне взаємодій. іонів досліджуваних металів і розплавленої солі; відсутність електрично нейтрального р-рителя, для к-якого можна виміряти справжню швидкість руху іонів. Тому зазвичай їх рухливість визначають щодо приладу, в якому проводять ЕЛЕКТРОМІГРАЦІЯ. У цьому випадку дані про рухливості в розплавах зміщені на невідому постійну величину.
Лекція 14. Ізоелектричного фокусування і ізотахофорез
Фокусуючий іонний обмін. Цей метод часто наз. електрофоретіч. фокусуванням або просто електрофокусірованіем, пов'язаний з накладенням градієнта концентрації або рН розчину паралельно електричні. полю. Завдяки цьому колективні іони можуть змінювати величину і знак заряду в міру переміщення в полі градієнта. При цьому в фиксир. точках системи кожен компонент переходить в ізоелектріч. стан, в якому СР заряд частинок даного компонента дорівнює нулю. Згадані точки є місцем концентрування (фокусування) окремих компонентів суміші (мал. 5). Положення зон фокусування визначається градієнтом концентрації комплексоутворюючої реагенту або рН розчину і константами стійкості комплексних іонів елементів, що розділяються. При поділі суміші білків або ін амфотерних соед. положення зон визначається значеннями їх ізоелектріч. точок.
Для створення градієнта рН електродні камери заповнюються буферними розчинами з різними значеннями рН. Напр., Для поділу рідкоземельних елементів церієвої групи в 0,001 М розчині етилендіамінтетраоцтової к-ти рН повинен змінюватися по довжині колонки від 1,7 у анода до 2,4 у катода.
У сер.60-х гг.20 ст. було запропоновано створювати градієнт рН за допомогою амфоліти - сумішей аліфатіч. поліамінокіслот. Під впливом електрич. поля амфоліти розподіляються відповідно до своїх ізоелекгріч. точками і тим самим утворюють градієнт рН.