Постсинаптическая трансформація сигналу

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Постсинаптическая трансформація сигналу

Введення
Активність нервових закінчень регулюється двома екзогенними факторами - зміною мембранного потенціалу і прямим взаємодією медіаторів нервових імпульсів з рецепторами. У результаті цих подій змінюється цитоплазматичний рівень щонайменше вторинних посередників - Са +, цАМФ, цГМФ, Інозитолтрифосфат і діацилгліцеринів, що призводить до активації відповідних пулів протеїнкіназ: цАМФ-залежних протеїнкіназ; цГМФ-залежних протеїнкіназ; Са-кальмодулін і Са-фосфолипид- залежних протеїнкіназ. Активація протеїнкіназ обумовлює фосфорилювання регуляторних білків-мішеней у клітинах нервової системи і тим самим модулює функціональну активність цих клітин.
Визначальний внесок у проблему внутрішньоклітинної регуляції був зроблений у 50-60-і роки Е. Сазерлендом, що сформулював уявлення про роль циклічних нуклеотидів як вторинних посередників, які накопичуються в клітині у відповідь на нейромедіаторні або гормональний стимул і здійснюють зв'язок між рецепторами та виконавчими системами. У результаті подальшого розвитку цих досліджень виявилося, що циклічний аденозинмонофосфат регулює обмін білків, вуглеводів, ліпідів та нуклеїнових кислот, впливає на проникність мембран, електричну, скоротливу і секреторну функції клітин, диференціювання і проліферацію. Встановлено роль фосфорилювання білків як основного шляху дії цього нуклеотіла на клітини тварин. Знайдено зв'язок між вмістом циклічних нуклеотидів і характером перебігу деяких патологічних процесів в тканинах. Описано участь цАМФ і цГМФ у прояві дії багатьох лікарських препаратів на організм. Через лише 10-15 років після відкриття, зробленого Е. Сазерлендом, уявлення про роль і механізм дії циклічних нуклеотидів виявилися невіддільними від сучасної біохімії, фізіології і медицини. Завдання цієї роботи полягає в порівняно детальному розгляді постсинаптичних механізмів.

1. цАМФ-Залежне фосфорилювання
1.1 аденилатциклаза, її активація
Синтез в клітці цАМФ з АТФ здійснює аденилатциклаза. Фермент виявлений практично у всіх тканинах ссавців. Максимальна активність аденілатциклази виявлено в мозку, далі в порядку убування активності ферменту тканини можна розподілити таким чином: селезінка, скелетні м'язи, серце, легені, нирки, печінка, жирова тканина. Аденилатциклаза локалізована майже виключно в плазматичних мембранах, хоча є повідомлення про присутність ферменту в мітохондріальній і мікросомальній фракціях.
Аденилатциклаза представляє собою мультімолекулярний комплекс, що складається з рецепторного і каталітичного компонентів. Відповідь клітини на дію гормону або біологічно активної речовини залежить від концентрації рецепторів на поверхні мембрани і ступеня сполучення рецепторів з аденилатциклазой. В останньому випадку в ролі сопрягающей компонента виступають G-білки, що володіють як ГТФ-зв'язує, так і ГТФ-гидролизующее активністю.
Рецепт з участю G-білків відрізняється від інших відомих систем трансформації позаклітинного сигналу. Всі ці системи включають рецептор - дискримінатор сигналу, з високою специфічністю і чутливістю "знімає" позаклітинний сигнал з зовнішньої мембрани. Рецептор може знаходитися всередині клітини - у тому випадку, якщо ефектори є ліпофільними молекулами, легко проникають через мембрану. Рецептори для водорозчинних ефекторів вбудовані в зовнішню мембрану: ці рецептори можуть бути ферментами; інший тип мембрановстроенних рецепторів пов'язаний з іонними каналами. Нарешті, рецептори, яким не притаманні властивості ані каналу, ані ферменту, пов'язані з ферментами-виконавцями за допомогою G-білків.
Регуляцію аденілатціклазной системи за участю G-білків можна представити таким чином. У системі є два білки, які складаються з субодиниць а, р і в і названих G s і Gj. р - у-субодиниці на відміну від а-субодиниць практично ідентичні у всіх вивчених G-білках. а-субодиниця містить ділянку зв'язування з гуаніловимі нуклеотидами і володіє ГТФазной активністю. Кожен з G-білків пов'язаний зі своїм рецептором. При утворенні комплексу агоністрецептор відбувається активація G-білка шляхом заміни в нуклеотідсвязивающем центрі ГДФ на ГТФ. При цьому змінюється конформація а-субодиниці, що обумовлює її дисоціацію від комплексу ру. Для дисоціації необхідний Mg +. Активована а-субодиниця G | інгібує активність аденілатциклази, в той час як активована G s - стимулює її.
Очевидно, майже ідентичні за структурою комплекси Ру можуть інгібувати аденілатциклазу непрямим способом, а саме, шляхом зв'язування з ct-субодиницею G s, таким чином "вимикаючи" її здатність стимулювати фермент. Дійсно, у багатьох досліджених тканинах, у тому числі в нервовій, концентрація Gj значно вище, ніж G s. Отже, можливо вивільнення достатньої кількості комплексу Ру з G i для з'єднання з усіма а-субодиницями G s. Сполучається ефект G-білків припиняється повільним гідролізом пов'язаного ГТФ до ГДФ. G-білки можуть бути знову задіяні при зв'язуванні рецептора з "сигнальної" молекулою.
Встановлено, що рецептори багатьох гормонів зібрані в групи, кластери і малорухливі в мембрані. Тому при активації кластера, що містить рецепторів одного типу, відбувається стимулювання аденілатциклази і збільшення рівня цАМФ в обмеженому районі клітини. Це веде до підвищення протеінкіназной активності і фосфорилювання субстратів тільки в даній зоні клітини, в даному компартменте. Компартменталізація цАМФ і А-кінази встановлена ​​в багатьох типах клітин: наприклад, стимуляція серця як за допомогою катехоламінів, так і простагландину Ej призводить до збільшення рівня цАМФ та активації протеїнкінази А. Однак катехоламіни і простагландин Ej роблять різний вплив на фосфорилювання фосфорілази глікогену. Мабуть, рецептори катехоламінів і простагландину і відповідні постсинаптичні системи розташовані в різних компартментах клітини.
1.2 Протеїнкінази
Через 10 років після відкриття Сазерлендом цАМФ була виявлена ​​цАМФ-залежна протеїнкіназа, значно підвищує швидкість фосфорилювання субстратів у присутності цАМФ. Реакція протеінфосфорілірованія виглядає наступним чином:

Гідроксил білка, яка акцептує термінальний фосфат АТФ, майже завжди належить серин, рідше - треонін і тирозин. Фосфосеріновие залишки в білках істотно іонізовані при фізіологічних значеннях рН, тому фосфорилювання або дефосфорілірованіе серину різко змінює заряд білкових молекул. Після відкриття протеїнкінази А стало ясно, що реакції фосфорилювання - дефосфорилювання опосередковує дію багатьох гормонів і нейромедіаторів, які через р-адренергическую рецепти активують аденілатциклазу і призводять до підвищення внутрішньоклітинного рівня цАМФ.
Протеїнкіназа А виявлена ​​у всіх нормальних клітинах ссавців, а також у деяких типах клітин немлекопітающіх. Високим рівнем протеїнкінази А відрізняється мозок, де фермент розподілений рівномірно по всіх відділах. Для прояву активності ферменту необхідні іони магнію. Так, з легких кролика виділено стимулюючий модулятор протеїнкінази, що зв'язує магній і названий "магмодуліном". Протеїнкіназа А - тетрамер, побудований з двох різних субодиниць: регуляторної, що зв'язує цАМФ та каталітичною, що здійснює фосфотрансферазную реакцію; будучи з'єднані разом, вони утворюють неактивний комплекс. При активації відбувається зв'язування цАМФ Р-субодиницею холоферменту, після чого можлива дисоціація Р від К-субодиниці. Вільна К-руб'едініца здатна каталізувати фосфорилювання різних клітинних білків:

Таким чином, в активному стані протеїнкіназа А представляє димер Р-субодиниць, пов'язаний з 4 молямі цАМФ, і 2 вільні К-субодиниці.
Швидкість зворотної реакції обумовлена ​​не тільки спонтанної дисоціацією комплексів Р - цАМФ, а й концентрацією К-субодиниць, так як останні вивільняють пов'язаний цАМФ шляхом рекомбінації з комплексом Р - цАМФ. Цей своєрідний "ретрокооператівний" ефект К-субодиниці, названий так Свілленсом і Дюмон, веде до тимчасового збільшення концентрації цАМФ, необхідної для активації протеїнкінази. У період стимуляції системи рівень К-субодиниць різко падає.
Існування еквівалентних кількостей каталітичних та регуляторних субодиниць цАМФ-залежної протеїнкінази в багатьох тканинах призвело до уявлення про те, що єдина функція регуляторної субодиниці - контроль протеінкіназной активності. Однак регуляторна субодиниця може існувати окремо від каталітичної в деяких типах клітин, наприклад, у клітинах нейробластоми. Це вказує на можливість прояву біологічної дії регуляторної субодиниці незалежно від каталітичної. Далі буде розглянута така можливість на прикладі зміни проникності мембран нейронів для Na + і К у присутності Р-субодиниці. Треба також мати на увазі, що цАМФ-зв'язуючі білки, не асоційовані з протеінкіназою, можуть регулювати активність останньої шляхом модулювання рівня вільного циклічного нуклеотиду, здатного приєднуватися до протеїнкінази.
Відзначимо далі, що вільні Р-субодиниці інгібують фосфодіестеразу цАМФ, що може призводити до збільшення рівня цього нуклеотиду в клітці. Встановлено також, що вільні Р-субодиниці протеїнкінази типу А на відміну від холоферменту кінази та її К-субодиниці інгібують фосфопротеінфосфатази декількох типів. Інгібування обумовлено зниженням швидкості каталізу без зміни спорідненості до ензими. Очевидна фізіологічна значимість такого інгібування, так як в цьому випадку дисоціація А-кінази може сприяти не тільки стимулювання фосфорилирует активності, але і інгібування дефосфорилювання субстратів.
Протеїнкіназа А чи існує у формі двох ізоферментів, відносна кількість яких варіює в різних тканинах.
Ізоферменти були названі кіназами I і II. Вони мають різні швидкості дисоціації в присутності гистона і розчинів NaCl і реассоціаціі після видалення цАМФ. Так, кіназа I типу швидко дисоціює в присутності гистона або 0,5 М NaCl і повільно реассоціірует після видалення цАМФ, навпаки, кіназа II типу повільно дисоціює в присутності зазначених агентів і швидко реассоціірует після видалення цАМФ.
Каталітичні субодиниці кіназ I і II типу мають молекулярну масу 40 кД і мінімальні відмінності у амінокислотним складом. Навпаки, регуляторні субодиниці кіназ I і II типу значно відрізняються по первинній структурі. Ймовірно, субодиниця Р I типу - 49 кД - є протеолітичним фрагментом Р II типу з молекулярною масою 55 кД. Один з серинових залишків Р-субодиниці II типу фосфорилюється каталітичної субодиницею цАМФ-залежної протеїнкінази. Очищена ж Р-субодиниця I типу не фосфорилюється каталітичної субодиницею цАМФ-залежної протеїнкінази. Іншою відмінністю кінази I типу від II типу є те, що тільки перший фермент пов'язує Mg-АТФ з високою спорідненістю.
цАМФ-залежні протеїнкінази локалізовані в основному в цитозольної фракції клітин. Проте в мозку, наприклад, значна частина кінази II типу є мембранно-зв'язаної. Очевидно, субклітинних локалізація і співвідношення кіназ I і II типу можуть обумовлювати специфіку дії цАМФ в клітці. Ставлення кінази I типу до кінази II типу варіює в різних органах і в різних фазах клітинного циклу.
При дослідженні локалізації фосфорилируют систем в ЦНС встановлено, що цАМФ-залежна система вибірково сконцентрована в нейронах, особливо в дендритах, а не в глії. Мозок пацюки містить як I, так і та II форму протеїнкінази А при співвідношенні цих форм 1:4 відповідно. Високий вміст А-кінази II типу у порівнянні з ферментом I типу взагалі характерно для нервової тканини. Нещодавно встановлена ​​гетерогенність Р-субодиниць А-кінази II типу. При цьому в мозку виявлена ​​власна, специфічна Р Н-субодиниця, відмінна за імунохімічних властивостями від Р-субодиниць II типу в інших тканинах. Р II мозку відрізняється від Р II - м'язів за характером взаємодії з К-субодиницею, а також по електрофоретичної рухливості аутофосфорілірованних форм. Показано, що фракція Р-субодиниць II типу мозку взаємодіє з Са + і кальмодуліном. Незвичайні властивості Р Н-субодиниці мозку можуть бути наслідком адаптації нервових клітин до специфічної функції передачі та зберігання інформації.
Асоціації А-кінази II типу мозку з мембранної фракцією клітин обумовлені тільки Р-субодиницею. цАМФ при дисоціації холоферменту вивільняє з мембранно-зв'язаного стану лише К-субодиницю; таким чином, компартменталізація К-субодиниці змінюється при активації А-кінази. Молекула цієї субодиниці гідрофільна, тому дисоціація мембранно-зв'язаної А-кінази II типу призводить до транслокації каталітичної субодиниці в цитоплазму і далі в ядро. Передбачається, що така транслокація може обумовлювати цАМФ-залежне зміна експресії генів в нейронах, найбільша концентрація Р-субодиниць А-кінази II типу виявлена ​​в пре-і постсинаптичної мембранах, що свідчить про важливу роль цієї кінази в синаптичної передачі.
Відмінності між регуляторними субодиницями А-кінази II типу нервової та інших тканин виявляються також і у взаємодії цих субодиниць з субстратами кінази. Так, для Р-субодиниці II типу з мозку характерно тісна взаємодія з МАР-2 - нейроспецифічних білком, локалізованим у відростках нейронів, кальцинейрин та іншими білками. Така взаємодія Р II з субстратами А-кінази може призводити, з одного боку, до локалізації А-кінази II типу біля специфічних субстратів і, відповідно, в певних внутрішньоклітинних компартментах, що, очевидно, має важливе фізіологічне значення. З іншого боку, крім зв'язування К-субодиниці Р-субодиниця II типу нервової тканини може брати участь у регуляції функціонування інших білків.
Регуляція активності протеїнкінази А здійснюється декількома шляхами. Так, у багатьох тканинах, в тому числі і нервової, виявлений низькомолекулярний термостабільний інгібітор кінази. Інгібітор зв'язується з вільною К-субодиницею і пригнічує її ферментативну активність. Ймовірно, фізіологічна роль інгібітора полягає в блокаді фосфорилирует активності при "базаяном", тобто нестімуліруемом рівні цАМФ. У мозку спостерігається зміна концентрації інгібітора у відповідь на деякі гормональні сигнали, що може мати певне значення в довготривалій регуляції активності А-кінази. Регуляція активності кінази II типу здійснюється також аутофосфорілірованію її Р-субодиниці; це веде до підвищення активності ферменту, що обумовлено зменшеною швидкістю реассоціаціі фосфорильованій Р з вільною К-субодиницею. Кіназа I типу також може бути фосфорилюватись, але фосфорилювання її Р-субодиниці здійснюється цГМФ-залежної протеїнкінази. Встановлено ау-тофосфорілірованіе К-субодиниці, проте функціональне значення цього процесу невідомо.
Можливо, що фосфорилювання за допомогою вільної К-субодиниці А-кінази і відповідна активація фосфопротеінфосфатазного інгібітора I, що приводить до зниження активності фосфопротеінфосфатази I, зменшує дефосфорілірованіе комплексу Р-цАЛ1Ф і, отже, сприяє дисоціації кінази II типу за принципом позитивного зворотного зв'язку. Така подія поряд з компартменталізація цАМФ в клітині може сприяти ефективній активації цАМФ-залежної кінази при незначному збільшенні внутрішньоклітинного рівня цАМФ.
цАМФ-залежне фосфорилювання білків нервових закінчень робить істотний вплив на синаптичну передачу. Так, встановлено, що мутації в дрозофіл, що змінюють метаболізм цАМФ, призводять до плейотропних порушень механізму навчання. У молюска аплізіі серотонинергическая синаптична передача посилюється ін'єкцією цАМФ в нейрон або інкубацією ганглія з блокаторами фосфодіестерази. Так як відомо, що вхідний струм кальцію є неодмінною посередником у здійсненні синаптичного дії, вважають, що серотонін посилює такий струм за допомогою підвищення внутрішньоклітинного рівня цАМФ та активності А-кінази. Прямі докази здійснення цього механізму отримані в експериментах, де відмічено збільшення Са-провідності нейронів равлики при ін'єкції в них К-субодиниці А-кінази. Блокатори протеїнкінази А надають протилежний ефект - швидке зниження Са-провідності.
Підвищення рівня іонізованого Са + всередині клітини при відкриванні Са-каналів може сприяти зниженню в ній вмісту цАМФ за рахунок активації Са - КМ-залежної фосфодіестерази і за принципом негативного зворотного зв'язку приводити до переходу Са-каналів у неактивний стан. Введення в нейрон теофіліну уповільнює процес ослаблення Са-провідності. Таким же впливом на кальцієву провідність володіють інгібітори кальмодуліну, наприклад трифтазин.
Таким чином, функціонування Са-каналів прямо регулюється протеінкіназою А, здійснює фосфорилювання їх білкових компонентів, а також опосередковано контролюється гормонами, медіаторами й іншими чинниками, що викликають або активацію аденілатциклази, або її інгібування. При порушенні фосфорилювання канали швидко втрачають здатність активуватися під дією зміни трансмембранного електричного поля. Протягом деякого часу цей стан є оборотним і фосфорилювання знову переводить канали у робочий стан або змінюючи кінетику їх активації, або включаючи раніше неактивні канали. При тривалому порушенні цАМФ-залежного фосфорилювання канали піддаються незворотних змін.
Додатковий шлях для струмів Са + всередину клітини можуть утворювати хемоуправляемие канали, безпосередньо активуються медіаторнимі речовинами у відповідь на їх взаємодію з рецепторами. На відміну від електрокерованих Са-каналів час життя цих каналів істотно більше, однак відносна кількість іонів, які переносяться через хемоуправляемие канали, ймовірно, невелика порівняно з електрокеровані шляхом. По ряду даних хемоуправляемие канали повністю інактивуються при збільшенні внутрішньоклітинного вмісту цАМФ.
Заслуговує також розгляду участь цАМФ в К-і Na-провідності мембрани.
Відомо, що болюче подразнення посилює рефлекс втягування зябра у молюска еплізіі за рахунок модуляції секреції передавачів сенсорними нейронами. Підвищення чутливості відбувається за рахунок зниження К-провідності і відповідного збільшення тривалості потенціалу дії, в результаті чого посилюються Са-рефлекс і екзоцитоз. Болюче роздратування викликає виділення серотоніну "полегшує" нейроном в закінченнях сенсорних нейронів. Серотонін, у свою чергу, збільшує синтез цАМФ, активність протеїнкінази А та ступінь фосфорилювання білка, тісно пов'язаного з К-каналом. У результаті відбувається закриття каналу. Блокада К-каналів призводить до того, що приходить в нервове закінчення потенціал дії спадає повільно: "продовжені" потенціали дії утримують потенціал-залежні Са-канали у відкритому стані, внаслідок чого приплив іонів Са зростає. Це, у свою чергу, веде до спорожнення більшого числа синаптичних пухирців. До блокаді К-каналів призводить також додавання АТФ і К-субодиниці протеїнкінази А в мембранні препарати нейронів; додавання протеїнфосфатази обумовлює відкривання К-каналів.
Електрозалежність Na-канали відповідальні за формування потенціалу дії в збудливих мембранах. Встановлено, що в сінаптосомах мозку а-субодиниця № ^ каналів, іграюшая центральну роль у функціонуванні цих каналів, фосфорилюється як ендогенної, так і екзогенної протеінкіназою А. Фосфорилювання призводить до інгібування активованого нейротоксином входить Na-струму. Таким чином, активність Са-каналів, К-каналів та Na-каналів нейронів модулюється під дією протеїнкінази А та / або через зміну швидкості їх дефосфорилювання протеїнфосфатаз.
Відзначимо, що протеїнкіназа А в нервовій тканині регулює також чутливість р-адренорецепторів до агонистам. Так, десенсітізація цих рецепторів корелює з їх цАМФ-залежним фосфорилюванням. Встановлено також регулювання А-кіназою біосинтезу самих р-агоністів. Ця регуляція здійснюється за допомогою цАМФ-залежного фосфорилювання тірозінгідроксілази - вузлового ферменту біосинтезу катехоламінів. Таке фосфорилювання може бути складовою частиною механізму прискорення біосинтезу катехоламінів у відповідь на нервовий імпульс або секрецію нейромедіаторів у нервової тканини в умовах in vivo,
Зупинимося на ролі цАМФ і ще одного вторинного посередника - 2 ', 5'-олігоаденілат в регуляції проліферації і диференціювання нервових клітин. 2-5А - це олігонуклеотиди, що складається з декількох залишків АМФ, пов'язаних 5'-фосфодіефірних зв'язком. У клітці існують 2 ферменту, що забезпечують певний рівень 2-5А. Олігосінтетаза - фермент біосинтезу 2-5А, активний лише в присутності двуспіральной РНК; молекулярна маса - 100-105 кД. 2'-фосфодіестерази гкдролізует 2-5А до АМФ і АТФ, молекулярна маса цього ферменту близько 40 кД.
Щоб оцінити біохімічне та фізіологічне значення процесів утворення 2-5А, необхідно зупинитися на механізмах переважного впливу цАМФ на проліферативний статус нервових клітин. Так, дію низки факторів, зокрема фактору росту нервів, а також підвищення рівня цАМФ, викликане теофіліном або дібутіріл-цАМФ, призводить до зупинки поділу та диференціювання цих клітин. Дія теофіліну на відміну від фактора росту нервів або дібутірільного аналога цАМФ носить короткочасний характер. Підвищення концентрації цАМФ в результаті інгібування фосфодіестерази під дією теофіліну, як і у випадку фактора росту нервів і дібутіріл-цАМФ, призводить до блокади активного ділення і диференціювання нервових клітин. Проте надалі падіння активності фосфодіестерази, обумовлене теофіліном, і відповідне збільшення рівня цАМФ компенсується індукцією біосинтезу цього ферменту. Саме цим і пояснюється короткочасне дію теофіліну.
Підвищення рівня цАМФ в нервових клітинах, викликане дією факторів, які безпосередньо впливають на аденилатциклазную систему, супроводжується більш ніж 10-кратним збільшенням концентрації 2-5А. Встановлено, що зростання рівня оліго синтетази та концентрації 2-5А спостерігається при диференціювання клітин і уповільненні клітинного ділення.
Дослідження біологічних властивостей 2-5А показало, що цей олігоіуклеід здатний оборотно активувати специфічну латентну нуклеазу, прискорювати гідроліз РНК і, таким чином, інгібувати синтез білка in vivo і гальмувати процес розмноження клітин. Отже, підвищення рівня 2-5А і зміна концентрації цАМФ є частиною універсального механізму регуляції клітинного поділу. До теперішнього часу встановлені два взаємодоповнюючих процесу, за допомогою яких здійснюються ці регуляторні реакції. З одного боку, стимуляція А-кінази при підвищенні рівня цАМФ призводить до фосфорилювання білка см г - 18 кД. Цей білок у вигляді фосфоформи є інгібітором активності 2 '- фосфодіестерази - ферменту гідролізу 2-5А. З іншого боку, підвищення концентрації цАМФ усередині клітини викликає індукцію оліго синтетази. здійснює синтез 2-5А.
Сукупність цих подій призводить до стійкого підвищення рівня 2-5А і пов'язаного з цим переходу нервових клітин в стан спокою. Мабуть, саме таким чином здійснюється яскраво виражений антінроліфератівний ефект цАМФ, викликаний дією цього вторинного посередника на систему метаболізму 2-5А. При цьому взаємний вплив рівнів цАМФ і 2-5А засноване на механізмі негативного зворотного зв'язку. Так, встановлено, що підйом рівня 2-5А, обумовлений збільшенням внутрішньоклітинної концентрації цАМФ за вказаними механізмам, у свою чергу, сприяє активації фосфодіестерази цАМФ. У результаті відбувається зниження рівня цАМФ і припинення росту концентрації 2-5А, який є в цьому випадку вторинним посередником у прояві антіпроліфера-тивного дії цАМФ.

1.3 фосфодіестерази
У припиненні сигналу цАМФ беруть участь фосфодіестерази, гідролізуються цей нуклеотид до АМФ. На противагу аденілатциклази фосфодіестерази - переважно розчинна фермент. У той же час активність ферменту виявлена ​​у фракціях саркоплазматичного ретикулума, мітохондрій та ядер.
Циклонуклеотидактивируемая фосфодіестерази гідролізує як цАМФ, так і цГМФ, при цьому під дією цГМФ прискорюється гідроліз цАМФ і навпаки, що свідчить про позитивну кооперативності двох активних центрів. Незаперечна роль ферменту в проведенні нервового імпульсу: так, в постсинаптической мембрані нервової тканини виявлений надзвичайно високий рівень фосфодіестерази цГМФ.
Для фосфодіестерази характерна наявність множинних форм. Ці форми розрізняються як за молекулярною масою, так і по спорідненості до одного й того ж і до різних циклічним нуклеотидам. У цілому, спорідненість до циклічних нуклеотидам у фосфодіестераз в 100-1000 разів нижче, ніж у протеїнкіназ А і G, тому при прискоренні синтезу нуклеотидів спочатку відбувається насичення циклічними нуклеотидами регуляторних центрів кіназ і лише потім - гідроліз цАМФ і цГМФ фосфодіестерази.
У мозку містяться Са-кальмодулінрегуліруемие форми як цАМФ-синтезуючого, так і цАМФ-гідролізу ферментами. Са-кальмодулінзавісімая фосфодіестерази представляє собою гомодимера, що складається з субодиниць з різною молекулярною масою у різних ізоформ ферменту. Обмежений протеоліз субодиниці 60 кД призводить до появи фрагмента з М г = 36 кД і незворотної активації фосфодіестерази. Частковий 36 кД більше не активується кальмодуліном. Отже, субодиниці фосфодіестерази включають 2 фрагменти: каталітичний і регуляторний.
Аналіз регуляторних властивостей фосфодіестерази в нервовій тканині свідчить про тісну сполученні між цАМФ-і Са-залежними системами внутрішньоклітинної сигналізації; це сполучення може модулюватися за допомогою ізоферментів фосфодіестерази. Так, в мозку бика знайдені 2 ізоформи Са-КМ-залежної фосфодіестерази, що складається з субодиниць з М г = 60 і 63 кД. Ізофермент з субодиницями 60 кД може фосфорилюватись цАМФ-залежної протеїнкінази, що призводить до зменшення спорідненості фосфодіестерази до кальмодулін. Дефосфорілірованіе цього ізоферменту здійснює Са-КМ-стимулируемая протеїнфосфатаз; при цьому відновлюється чутливість фосфодіестерази до кальмодулін.
На відміну від ізоферменту з субодиницями 60 кД фосфорилювання ізоформи фосфодіестерази з субодиницями 63 кД здійснюється Са-КМ-залежної протеїнкінази. Це фосфорилювання також призводить до втрати чутливості фосфодіестерази до кальмодуліну і "звертається" Са-КМ-стимулируемой протеїнфосфатаз з відновленням чутливості фосфодіестерази до КМ. Очевидно, такий механізм регуляції фосфодіестерази реалізується в мозку in vivo, незважаючи на дуже високу, "насичуючу" концентрацію в ньому КМ. Фосфорірованіе знижує спорідненість ферменту до КМ і обумовлює залежність його активності від фізіологічних концентрацій Са +.
У нервовій тканині, таким чином, існує тісний взаємозв'язок між двома системами вторинних посередників, Са + і цАМФ, що здійснюється за допомогою цАМФ-і Са-залежного фосфорилювання-дефосфорилювання різних ізоферментів фосфодіестерази цАМФ. Цей взаємозв'язок може модулюватися також різною спорідненістю до Са + аденілатциклази, фосфодіестерази, протеїнкінази і фосфатази. Так, аденилатциклаза мозку активується набагато більш низькими концентраціями Са ніж фосфодіестерази.
Крім циклічних нуклеотидів, Са + і обмеженого протеолізу фосфодіестеразу активують також поліаніона, фосфоліпіди, жирні кислоти. Інгібіторами або активаторами ферменту є численні фармакологічні речовини. Фосфодіестерази є більш "зручною" мішенню для дії лікарських препаратів, ніж аденилатциклаза, так як менш специфічна щодо ефекторних впливів. Потужними інгібіторами фосфодіестерази є похідні ксантинів - інгібування здійснюється блокадою аллостеріческого центру зв'язування нуклеотидів.

2. цГМФ-залежне протеінфосфорілірованіе
Незабаром після відкриття цАМФ-залежних протенкіназ був виявлений ще один клас ціклонуклеотідзавісімих фосфорилируют ферментів, стимульованих за допомогою цГМФ, - протеїнкінази G. У тканинах ссавців зміст протеїнкінази G досить невелика. Найбільш високий рівень активності та вмісту протеїнкінази G в мозочку, серцевому м'язі і легких, ці ж тканини містять і найбільша кількість цГМФ, що не перевищує, втім, 10% від вмісту в них цАМФ. Основна кількість протеїнкінази G виявлено у цитозолі, деяка частина ферменту пов'язана з цитоплазматичними мембранами та ядерної фракцією.
Фермент складається з двох приблизно ідентичних субодиниць, кожна з яких має каталітичну активність і здатна пов'язувати циклічний нуклеотид. Обмеженого протеолізу можна перевести димер в мономери і потім розділити кожну субодиницю на цГМФ-зв'язуючий і каталітичний фрагменти. Ці дослідження поряд з виявленою гомологією між протеінкіназою G і протеінкіназою А II типу за субстратної специфічності, амінокислотної послідовності, здатності до аутофосфорілірованію, імунологічним властивостям призвели до уявлення про те, що цАМФ і цГМФ-залежні протеїнкінази еволюціонували від загального гена, що кодує одну поліпептидний ланцюг. У процесі розвитку цАМФ-залежний фермент став синтезуватися у вигляді роз'єднаних компонентів, тоді як цГМФ-залежна протеїнкіназа синтезується як один ланцюг.
На відміну від каталітичної субодиниці протеїнкінази А, здатної вивільнятися під час активації ферменту, внутрішньоклітинний переміщення "недиссоциированной" протеїнкінази G може бути утруднений. На підставі амінокислотного аналізу протеїнкінази G було встановлено, що одна субодиниця ферменту містить два центри зв'язування нуклеотиду.
Регуляторна N-кінцева половина молекули протеїнкінази G схожа з сімейством цАМФ-зв'язуючих білків, у той час як каталітична Сконцевая половина споріднена групі кіназ з різною специфічністю. Протеїнкіназа G здатна до аутофосфорілірованію з розрахунку 2 моля фосфату на 1 моль холоферменту. Автофосфорилювання не змінює спорідненості до цГМФ і незначно підвищує V makc фосфотрансферазной реакції, але помітно збільшує спорідненість протеїнкінази G до цАМФ. Таким чином, автофосфорилювання може обумовлювати регуляцію протеїнкінази G не тільки з допомогою цГМФ, але і цАМФ.
Протеїнкіназа G фосфорилирует, ймовірно, ті ж амінокислотні залишки в молекулі субстрату, що і протеїнкіназа А, але з набагато меншою швидкістю. Різна швидкість фосфорилювання протеїнкінази А і G може бути основою їх субстратної специфічності.
Як згадувалося, найбільший вміст протеїнкінази G в нервовій тканині зазначено у мозочку. У свою чергу, в цьому відділі мозку фермент локалізований в клітинах Пуркіньє. Знайдена кореляція між збільшенням вмісту G-кіназ у цитоплазмі клітин Пуркіньє, початком зростання дендритів і встановленням синаптичних контактів в клітинах Пуркіньє і подібних до них субкортікальних клітинах, що може свідчити на користь безумовної значущості цГМФ-залежного фосфорилювання для нейрональной диференціювання цих клітин. У клітинах Пуркіньє знаходиться і єдиний в мозку ссавців специфічний субстрат для протеїнкінази G, названий G-субстратом; G-субстрат - кіслоторастворімий і термостабільний білок з М г = 23 кД. Виявлено, що фосфорілірованний за допомогою цГМФ-залежної протеїнкінази G-субстрат інгібує протеїнфосфатаз, виділену з мозочка, будучи специфічним для клітин Пуркіньє протеінфосфатазним інгібітором. При цьому інгібіруемая фосфатаза з цих клітин, ймовірно, каталізує дефосфорілірованіе білків, які не є субстратами протеїнкінази А.
Збільшення рівня цГМФ обумовлено взаємодією з плазмалеммой різних гормонів і нейромедіаторів. Так активується пов'язана з мускариновими рецепторами гуанілатциклази Активація гуанілатциклази зазвичай обумовлена ​​мобілізацією Са + з ендоплазматичного ретикулуму.
У клітинах мозку виявлений термостабільний білок, що стимулює активність протеїнкінази G, але не змінює активність протеїнкінази А. Зворотний процес - інактивація протеїнкінази G полягає в гідролізі цГМФ фосфодієстеразою, специфічною для цього нуклеотиду. Крім того, в тканинах ссавців, у тому числі і нервової, знайдений інгібітор G-кінази з М г = 15 кД.
Відзначимо, що системи циклічних нуклеотидів здійснюють внутрішньоклітинну регуляцію в тісній взаємодії один з одним. Так, наприклад, якщо концентрація цАМФ в клітці тривалий час підвищена, може відбуватися фосфорилювання білків, вбудованих в канали плазматичної мембрани, що призводить до підвищення в цитоплазмі концентрації Са +. У результаті цього активуються фосфодіестерази і гуанілатциклази; відповідно прискорюється гідроліз цАМФ і утворюється цГМФ.
Отже, цГМФ грає важливу роль в нервовій системі, особливо в клітинах Пуркіньє мозочка. Про це свідчить виборча локалізація в цих клітинах всіх компонентів системи цГМФ, включаючи гуанілатциклазу, протеинкиназу G і G-субстрат. Різні нейромедіатори, в тому числі ацетилхолін, викликають збільшення рівня цГМФ у клітинах Пуркіньє і активацію G-кінази, що, по всій видимості, модулює такі властивості цих клітин, як швидкість проведення збудження і здатність до стимуляції.
Встановлено також, що цГМФ модулює активність іонних каналів мембран нервових клітин. Так, введення в нейрони равлики цГМФ або G-кінази збільшує провідність Са-каналів.

3. Са-кальмодулінзавісімое протеінфосфорілірованіе
Як згадувалося, в процесі еволюції виробилися ефективні механізми видалення Са + в позаклітинний простір або спеціалізовані внутрішньоклітинні структури. Низька внутрішньоклітинна концентрація Са + дозволила клітинам використовувати "впорскування" Са + в цитоплазму як сигнал на зовнішні впливи. При цьому кальцій може бути навіть більш універсальним внутрішньоклітинним регулятором, ніж цЛМФ. Так, період дії Са + дуже короткий і вимірюється мілісекундами, а не секундами, як у випадку цАМФ. Як стало зрозуміло останнім часом, обидві системи вторинних посередників функціонують у тісній взаємодії.
Для внутрішньоклітинної "реалізації" кальцієвого сигналу в процесі еволюції створені спеціальні внутрішньоклітинні білкові рецептори Са +, здатні опосередковувати дію цього іона на молекулярні мішені. Основним рецептором Са + у всіх клітинах є кальмодулін. Кальмодулін - глобулярний білок см р - 16,5 кД. Структурно він дуже консервативний: так, виявлено лише шість чи трохи більше амінокислотних замін в кальмодулін, виділеному з живих об'єктів, еволюційно розділених мільйонами років. Кальмодулін містить 4 Са-зв'язуючих ділянки: до складу кожного з цих ділянок входять кислі залишки амінокислот, необхідні для зв'язування Са + і зумовлюють низьке значення ізоелектричної точки KM. Фосфорильованих форм КМ не виявлено.
Кальмодулін локалізована головним чином в цитоплазмі, а також асоційований з різними клітинними структурами, мікротрубочками і мембранами, включаючи постсинаптичні мембрани. Внутрішньоклітинне розподіл КМ регулюється циклічними нуклеотидами. Так, цАМФ-залежний транспорт Са + через клітинні мембрани може змінювати спорідненість КМ до мембранної і цитоплазматичної фракціям клітини.
При стимулюванні відбувається зв'язування Са + з КМ. У результаті кальмодулін зазнає конформаційні зміни: експонування гідрофобного ділянки при цьому - важлива умова для подальшої взаємодії КМ з акцепторними білками. Серед ферментів-виконавців, активність яких модулюється в присутності КМ, безпосереднє відношення до регуляторних реакцій внутрішньоклітинного протеінфосфорілірованія мають Са-КМ-залежні протеїнкінази, аденилатциклаза, фосфодіестерази циклічних нуклеотидів і КМ-залежна протеїнфосфатаз.
На перший погляд, здатність КМ в багатьох тканинах активувати системи як синтезу, так і деградації цАМФ виглядає парадоксом. Проте локалізація ферментів аденілатциклази в мембрані, а фосфодіестерази в інтозоле обумовлює переважну Са-активацію аденілатциклази. Крім того, для повної активації аденілатциклази досить комплексу КМ-Са +, а для фосфодіестерази необхідно заповнення третього, а можливо, і четвертого Са-зв'язуючого ділянки КМ. Це означає, що аденилатциклаза активується при більш низьких концентраціях Са +.
Результатом дії Са + і кальмодуліну часто є фосфорилювання, що каталізується Са-КМ-залежної протеїнкінази. До теперішнього часу виявлено 3 тина КМ-залежних протеїнкіназ В, які в порядку убування молекулярної маси позначаються як протеїнкінази В I, II і III. Основні відмінності цих типів протеїнкінази В належать до їх субстратної специфічності. Так, протеїнкіназа У I типу фос-форілірует лише декілька білків в нервовій тканині, в той же час для кінази II типу тільки в головному мозку знайдено більше 10 субстратів. Спорідненість цих протеїнкіназ до КМ практично однаково, що свідчить про однакову структурі КМ-дізнався ділянки ферменту.
У нервовій тканині, де концентрація Са-КМ-залежних протеїнкіназ особливо висока, виявлені специфічні ізоферменти По-кіназ I і II типу. Так, в мозку бика знайдено, щонайменше, 3 ізоферменту По-кінази I типу. Високомолекулярні олігомерні В Н-кінази з лобових часток мозку і мозочка відрізняються за суб'едінічная складу. Якщо перший фермент складається з субодиниць а й р з М г = 50/55 і 60/65 кД у молярному співвідношенні 3:1, то В-кіназа з мозочка має інше співвідношення цих субодиниць - 1:4. Гетерогенність і висока концентрація В-кіназ у нервовій тканині може обумовлювати фізіологічну значущість Са-КМ-залежного фосфорилювання в клітинах нервової системи.
Як встановлено, протеїнкіназа У II типу становить приблизно 0,4% від загального білка головного мозку ссавців, що свідчить про важливу регуляторної ролі ферменту в цьому відділі ЦНС. По-кіназа II типу переважно пов'язана з мембранної фракцією на відміну від "цитоплазматичної" кінази У I типу. Мембранозв'язаних ферментів II типу сконцентрований в області постсинаптичного ущільнення в тих відділах нервової системи, які пов'язані з навчанням. Кіназа У II типу має властивості двофазного перемикача зі стабільністю, необхідною для кодування довготривалої пам'яті.
КМ-залежні протеїнкінази можуть бути розділені на 2 групи за структурними особливостями. Так, в одній групі КМ є інтегральною частиною ферменту, а в іншій - здатний оборотно диссоциировать від протеїнкінази. Прикладом першого випадку може служити кіназа фосфорілази, [Три активації ферменту Са + зв'язується з субодиницею ферменту, що є кальмодуліном. Близько 20 років тому було виявлено стимулюючу дію на кіназу фосфорілази протеїнкінази А. До теперішнього часу встановлено, що 10-20 кратне збільшення активності ферменту може бути викликано цГМФ-залежної і КМ-залежної протеїнкінази. Участь екзогенного КМ у регуляції активності кінази фосфорілази відбувається лише за відсутності стимулів, що призводять до збільшення внутрішньоклітинного вмісту цАМФ. Глікоген і ферменти його метаболізму присутні в глії і нейронах: електростімуліруемое розщеплення глікогену в нервовій тканині регулюється за допомогою активації кінази фосфорілази.
Кіназа легких ланцюгів міозину є представником другої групи КМ-залежних протеїнкіназ. Регулювання за допомогою КМ-кінази легких ланцюгів міозину здійснюється за принципом "все або нічого". Так, за відсутності КМ фермент практично не активний, а при дії комплексу Са-КМ його активність зростає у 200-300 разів. Встановлено, що АТФазну активність актоміозіна мозку збільшується в 2-3 рази при фосформірованіі міозину кіназою легких ланцюгів.
Як згадувалося, активність КМ-залежних протеїнкіназ модулюється аутофосфорілірованію. Автофосфорилювання 2 субодиниць кінази фосфорілази призводить до значного збільшення її активності. Автофосфорилювання регулює також компартментализацию По-кіназ в нервових клітинах, як це показано на нейронах аплізіі. У присутності комплексу Са-кальмодулін або цАМФ відбувається транслокація активності В-кінази у цитозоль з мембраноцітоскелетной фракції. По-кіназа тісно асоційована з певними білками цитоскелету і мембран: фосфорилювання цих білків, як показано на препаратах мозку щурів, призводить до ослаблення спорідненості По-кіназ до мембран і цитоскелету.
Очевидно, що зміни у змісті цитоплазматичного Са + мають множинні наслідки для синаптичної функції, особливо для екзоцитозу. Мішенню низки регулюючих екзоцитоз лікарських препаратів і антитіл може бути кальмодулін. Встановлено, що запускається деполяризацією секреція вазопресину і окситоцину з нервових терминалей гіпофіза є Са-залежної і не вимагає участі цАМФ або протеїнкінази С, причому комплекс Са - кальмодулін зв'язується з білками мембран секреторних гранул, що представляють собою, ймовірно, субодиниці специфічною протеїнкінази. Наслідком цього процесу є посилення екзоцитозу за допомогою злиття мембран секреторних гранул з цитоплазматичною мембраною.
У секреції нейромедіаторів беруть участь протеїнкінази У I і II типу, а також протеїнкінази А та С. Взаємодія цих протеїнкіназ чітко проявляється при фосфорилюванні сінапсінов - специфічних білків синаптичних структур. Один з цих білків - сінапсін I, що становить 6% від загального білка високоочищених синаптичних везикул і є своєрідним "містком" між везикулами і цитоскелетом, фосфорилюється протеінкіназою У I типу та протеінкіназою А по одному залишку серину. Два інших залишку серину у молекулі сінапсіна I фосфорилирует протеїнкіназа У II типу, і, ймовірно, протеїнкіназа С. У нейронах знайдений так званий протеїн-Ш - білок, також пов'язаний з синаптичними мембранами і по ряду властивостей нагадує сінапсін I. Протеїн-Ш по єдиному залишку серину фосфорилируют як протеїнкіназа А, так і протеїнкіназа У I типу. Очевидно, цАМФ-і Са-залежне фосфорилювання сінапсіна I і протеїну-III забезпечує регуляцію секреції нейромедіаторів. Так, ін'єкція в синапс По-кінази II типу збільшує секрецію, в той час як ін'єкція дефосфорильованого сінапсіна I пригнічує вивільнення нейромедіаторів. Для ефективної секреції необхідно одночасне фюсфорілірованіе сінапсіна I А-, В-і С-кіназами. Секреція нейромедіаторів регулюється, мабуть, розривом зв'язку фосфорильованого сінапсіна I з актином тубуліну. У результаті везикули вивільняються з комплексу з білками цитоскелету і стає можливою Са-індукція екзоцитозу. Передбачається також, що сконцентровані в синаптичних закінченнях молекули По-кінази II типу самі по собі є стеричним перешкодою для вивільнення медіаторів з секреторних везикул. Автофосфорилювання кінази сприяє її дисоціації на субодиниці і, таким чином, стимулює секрецію.
Важливу роль у функціонуванні нейронів відіграє спільне фосфорилювання протеїнкінази А II типу і В II типу високомолекулярного білка МАР-2, сконцентрованого в дендритах нейронів. Як згадувалося, саме тут локалізована Р-субодиниця А-кінази II типу, яка володіє високою спорідненістю до МАР-2 і є своєрідним "якорем" цАМФ-залежною фосфорилирует активності в дендритах. МАР-2 бере участь у складанні мікротрубочок: фосфорилювання цього білка кіназами В і АII типу контролює процес збірки і, таким чином, може модулювати функціональну активність нейронів. МАР-2 фосфорилирует також протеїнкіназа С; роль цього процесу у функціонуванні нейронів з'ясовується.
Передбачається, що комплекс МАР-2 - Р-субодиниця А-кінази II типу може змінювати проникність мембран нейронів для Na + і К + без фосфорилювання К-субодиницею кінази. Можливо, сигналом для такої зміни мембранної проникності є взаємодія цАМФ з Р-субодиницею протеїнкінази II типу, асоційованої з МАР-2. Сигнал розповсюджується уздовж цитоскелету до мембрани нейронів з дуже високою частотою; для підтримки такої частоти достатній час потрібна енергія АТФ.
Синергізм в дії протеїнкінази В і А в нервовій тканині виявляється також при потенціювання цАМФ-індукованих входять струмів внутрішньоклітинними іонами Са. Підвищення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ в нейронах виноградного равлика призводить до деполяризації мембрани, а в умовах фіксації потенціалу - до виникнення іонного струму по каналах пасивної проникності. Збільшення внутрішньоклітинної концентрації Са + призводить до значного збільшення амплітуди і тривалості цАМФ-струму.
Можна вважати, що синергічну дію Са + і іАМФ на відповідні іонні канали пов'язано з наявністю у останніх двох різних ділянок фосфорилювання; для В-і А-кіназ. Виникаючі під впливом КМ-залежного фосфорилювання зміни в структурі каналу забезпечують підвищення доступності відповідної ділянки фосфорилювання для протеїнкінази А. Навпаки, при вивченні впливу внутрішньоклітинного Са + на Са-залежні калієві канали взаємодія двох систем вторинних посередників відрізняється тим, що цАМФ виступає в ролі агента, збільшує чутливість каналу до внутрішньоклітинного Са + і КМ. Можна вважати, що регулювання кількості каналів та їх активності за допомогою протеінфосфорілірованія пов'язана зі змінами у процесах поведінки і навчання.
Останнім часом з'явилися дані про регулювання протеінкіназной і протеінфосфатазной активності за допомогою Са-зв'язуючого білка S-100. S-100 активує фосфопротеінфосфатази мозку, а також модулює активність ядерних і цитоплазматичних протеїнкіназ цієї тканини, зокрема К-субодиниці протеїнкінази A. S-100 інгібує фосфорилювання ряду субстратів в клітинах мозку; кальмодулін активує фосфорилювання цих же білків. Можливо, S-100 і кальмодулін діють в мозку як антагоністи. В усякому разі, в нервовій тканині реалізується ще один шлях Са-залежного фосфорилювання-дефосфорилювання, незалежний від КМ-стимульованого процесу. S-100-стимульоване фосфорилювання-дефосфорілірованіе може приймати участь в регуляції ряду функцій нервових клітин.
Необхідно відзначити участь По-кінази II типу поряд з протеінкіназою А в фосфорилювання і відповідної активації т! фозінгідроксілази, що призводить до прискорення синтезу катехоламінів у відповідь на нервовий імпульс і нейромедіаторних сигнал. Встановлено, що тршггофангідроксілаза - фермент, що каталізує першу реакцію біосинтезу серотоніну, також фосфорилюється протеінкіназою У II типу. Фосфорилювання тріптофангідроксілази призводить до двократного збільшення її активності. Таким чином, Са-КМ-залежне фосфорилювання ферментів, які беруть участь у синтезі нейромедіаторів і гормонів, є одним з ключових аспектів участі По-кіназ в нейрогуморальної регуляції.
Відзначимо, що на підставі результатів численних досліджень встановлено тісний взаємозв'язок між процесами, регульованими Са +, цАМФ і 2-5А. Це дає підставу для їх розгляду в рамках єдиної регуляторної системи. Взаємодія Са +, цАМФ і 2-5А обумовлено двома типами регуляторних зв'язків. По-перше, ряд життєво важливих для клітин реакцій контролюється цими вторинними посередниками одночасно. Так, наприклад, активність кінази фосфорілази глікогену залежить від цАМФ і Са +, швидкість синтезу білка полірібосомамі контролюється за допомогою фосфорилювання А-кіназою і рівнем 2-5А і т.д. По-друге, збільшення внутрішньоклітинного рівня одного з посередників призводить до зміни змісту інших. Так, зростання рівня Памфіл обумовлює індукцію олігосінтетази та інгібування 2'-фосфодіестерази, що призводить до збільшення концентрації 2-5А. У свою чергу, Са * і 2-5А активують фосфодіестеразу цАМФ і тим самим викликають падіння рівня цАМФ. Крім того, збільшення внутрішньоклітинного рівня цАМФ призводить до викиду Са + з мітохондрій у цитоплазму і вивільнення кальмодуліну з примембранних компартментов.

4. Са +-фосфолипид-залежне протеінфосфорілірованіе
4.1 Освіта діацилгліцеринів і інозітолфосфатов
Ця група вторинних посередників утворюється при активації фосфоліпази С, локалізованої в зовнішній клітинній мембрані. Для її активації необхідно зв'язування ряду гормонів і нейромедіаторів, відомих своєю здатністю збільшувати концентрацію Са + в цитозолі, з відповідними рецепторами. До числа агоністів, стимулюючих фосфоліпазу С, відносять ацетилхолін, норадреналін, гістамін, серотонін, а також ряд гормонів білкової природи і ростових факторів. Сполучення фосфоліпази С з рецепторами досить специфічно; наприклад, з 4 відомих основних типів адренорецепторів характерно тільки для c-типу, а з 2 типів холінорецепторів - тільки для мускарин-чутливого, але не для нікотінчувствітельного. Так само, як і у випадку аденілатциклази, для сполучення рецепти і активації фосфоліпази С необхідні G-білки, іноді звані G p. Встановлено, що білок типу Gj також може безпосередньо брати участь у регуляції фосфоліпази С, а G s - опосередковано, шляхом цАМФ-залежного інгібування фосфоліпази С.
Субстратом фосфоліпази С є фосфатидилинозитол-дифосфат - відносно рідкісний фосфолипид мембран.
Фермент розщеплює фосфатидилинозитолдифосфат на ліпідний компонент діацилгліцеринів, який залишається в мембрані, і водорозчинний Інозитолтрифосфат. Якщо в системі цАМФ трансмембранний перенос інформації відбувається з утворенням одного вторинного посередника, то в фосфоіно-зітідной системі йде роздвоєння шляхи передачі сигналу, так як в результаті утворюються два різних вторинних посередника: діацилгліцеринів і Інозитолтрифосфат. Вони діють у клітці узгоджено і активують відповідні пули протеїнкіназ.
Інозитолтрифосфат стимулює вивільнення кальцію з ендоплазматичного ретикулума, при цьому активується сімейство Са-КМ-залежних протеїнкіназ. Його концентрація, необхідна для досягнення максимальної швидкості вивільнення Са + з депо ретикулума в нервовій тканині, істотно нижче в порівнянні з іншими тканинами. Таким чином, чутливість ендоплазматичного ретикулума до Інозитолтрифосфат в клітинах нервової системи може бути найбільш високою.
Інозитолтрифосфат, очевидно, не єдиний з Інозитолтрифосфат, що виступають у ролі вторинного посередника. Утворений в результаті фосфорилювання Інозитолтрифосфат інозітолтетрафосфат також бере участь у регуляції внутрішньоклітинної концентрації Са +. Ця регуляція здійснюється, мабуть, впливом інозітолтетрафосфата на вступ позаклітинного Са + в цитоплазму. Надходження Са "в клітку в цьому випадку відбувається не через рецепторзавісімие Са-канали, а якимось іншим, поки невідомим способом.
Діацилгліцеринів служить джерелом арахідонової кислоти, що активує гуанілатциклазу. Цей шлях регуляції має особливе значення для реалізації ефектів холінергічної імпульсації та функції мускарінчувствітельних холінорецепторів і Н 1 - рецепторів гістаміну, для яких роль цГМФ як вторинного посередника загальновизнана. Отже, в системах вторинних посередників - цГМФ та фосфоінозітідной - існує функціональна взаємозв'язок через стадію утворення арахідоната, забезпечує інтегральний характер транссінаптіческого регуляції біохімічних процесів в клітці.
З арахідонової кислоти утворюються простаглавдіни, тромбоксан і, крім того, під дією відповідної кінази діацилгліцеринів перетворюється на фосфатидний кислоту. Передбачається, що фосфатидний кислота має Са-іонофорного властивостями. Так, фосфатидний кислота накопичується в мембранах клітин при дії Са-агоністів. За таким механізмом, очевидно, відбувається інактивація електрозбудження Са-каналів нейронів при дії дофаміну. Взаємодіючи з власним мембранним рецептором, дофамін в нейронах великого ставковика через G-білок активує фосфоліпазу С. Новоутворена з діацилгліцеринів фосфатидний кислота індукує надходження в клітину зовнішнього кальцію і накопичення його в примембранном шарі цитоплазми. Результатом локального підвищення концентрації Са + є інактивація електровозбудімьгх Са-каналів. Таким чином, система метаболізму фосфатіділінозітідов може регулювати внутрішньоклітинну концентрацію Са + як за допомогою збільшення потоку Са + через плазматичну мембрану, так і за рахунок виходу Са + з внутрішньоклітинних депо.
Нарешті, діацилгліцеринів активує також протеінкіна-зу, пов'язану з плазмалеммой, - фосфоліпідзалежні, Са-активується фермент - протеинкиназу С.
4.2 протеїнкінази С
Вже зазначалося, що протеїнкінази, як і пов'язані з ними G-білки, мають різну переважну локалізацію в клітинах нервової тканини. Так, аденилатциклаза і протеїнкіназа З присутні у високих концентраціях у мозочку, але С-кіназа локалізована в клітинах Пуркіньє, в той час як аденилатциклаза - в гранулярних клітинах. Таким чином, різні типи клітин мозку адаптовані до сигналів, що активує синтез різних вторинні посередників: цАМФ, цГМФ, Інозитолтрифосфат і діанілгліцеріна. У мозочку рецепторів фосфоінозітідной системи приблизно в 500 разів більше, ніж у периферичної нервової тканини.
У багатьох відділах мозку, включаючи мозочок, рецептори фосфоліпази С і С-кіназа мають однакову локалізацію і функціонують синергічно. Однак у деяких відділах, таких, як грудний відділ спинного мозку, рецептори і кіназа роз'єднані; дві гілки цього внутрішньоклітинного сигнального шляху не становлять там еквівалентну пару. Тому в ряді випадків діацилгліцеринів формується і активує С-кіназу без освіти Інозитолтрифосфат. У цих випадках, очевидно, діацилгліцеринів утворюється вже не з фосфатидилинозитолдифосфата, а з монофосфорильованих мембранного ліпіду - фосфатидилінозитолу Таким чином, в нервовій тканині є ще один варіант активації протеїнкінази С.
Протеїнкіназа З виявлена ​​в різних тканинах ссавців і позбавлена ​​суворої тканинної та видової специфічності. Проте в мозку її концентрація є найбільшою. Субклітинні розподіл протеїнкінази С неоднаково в різних тканинах і органах: фермент переважно локалізований в ци-тозоле клітин серця і в мембранної фракції клітин мозку. Протеїнкіназа З мозку - мономер з М г = 80-87 кД, що складається з двох доменів: регуляторного, що має ділянки зв'язування для діацилгліцеринів і фосфоліпідів, і каталітичного. Домени поділяють ділянку поліпептидного ланцюга, чутливий до протеолітичної атаці.
Найбільший активуючий ефект на протеинкиназу З надають діацилгліцеринів і в меншій мірі фосфатіділянозітол, фосфатидилсерин і фосфатидного кислота. Діацилгліцеринів збільшують спорідненість протеїнкінази С до фосфоліпідів. При цьому протеїнкіназа С стає чутливою до фізіологічних концентрацій Са + в клітині. Діацилгліцеринів швидко утворюється у відповідь на сигнал-рецепторное взаємодія і швидко руйнується, що в кінцевому підсумку і визначає його властивості як вторинного посередника.
Відомо, що спорідненість С-кінази до плазматичної мембрани збільшується під час активації. Для транслокації кінази необхідний Са +. Зв'язування С-кінази з мембранами обумовлено координаційним взаємодією 4 карбоксильних груп молекул фосфатидилсерин з комплексом Са +-фермент.
Таким чином, індуковане Інозитолтрифосфат збільшення внутрішньоклітинної концентрації Са + може активувати С-кіназу при вбудовуванні її в мембрани. Активована і локалізована на зовнішній мембрані С-кіназа обумовлює фосфорилювання білкових компонентів іонних каналів, змінюючи тим самим їх проникність.
Як нещодавно встановлено, Са + і фосфоліпіди не завжди необхідні для активації протеїнкінази С. Так, ненасичені жирні кислоти можуть активувати фермент незалежно від Са + і фосфоліпідів. У складі ізоферментів протеїнкінази С виявлена ​​також Са-незалежна, але фосфоліпідзалежні форма ферменту.
Протеїнкіназа З піддається аугофосфорілірованію у присутності Са + і фосфоліпідів. Фізіологічне значення цього процесу полягає, ймовірно, в підвищенні активності кінази. Встановлено також активація протеїнкінази С обмеженого протеолізу під дією мембранозв'язаних Са-активованої ендогенної протеази. Отримані фрагменти втрачають спорідненість до мембран незалежно від присутності Са + і діацилгліцеринів. Такі рас * творені фрагменти С-кінази, активність яких не залежить від Са * і фосфоліпідів, з'являються при взаємодії форболових ефірів з деякими клітинами. Інгібітори Са-залежних протеїназ блокують цю дію форболових ефірів. Очевидно, при стимуляції рецепторів фосфоліпази З збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонізованого Са + під дією Інозитолтрифосфат призводить поряд з транслокацією С-кінази на мембрани також до активації мембранозв'язаних, Са-стимульованих протеїназ і появи незалежної від Са + і фосфоліпідів активності С-кінази.
Таким чином, фосфорилюються здатність С-кінази може бути збережена досить довго після припинення дії вторинних посередників, що наводить на думку про участь цього процесу в довготривалому зберіганні інформації в нейронах мозку - органа з найбільшою активністю протеїнкінази С.
Сильними інгібіторами протеїнкінази С є такі фармакологічні агенти, як психотропні препарати фенотіазинового ряду і місцеві анестетики. Очевидно, фармакологічна дія цих препаратів, яке раніше пов'язували з інгібуванням кальмодуліну, обумовлено їх ліпофільній природою і здатністю конкурентно зв'язуватися з фосфоліпідами, тим самим перешкоджаючи активації протеїнкінази С. Поліаміни також здатні інгібувати протеінкіна-зу С, що пов'язано з надмірною позитивним зарядом цих сполук. У мозку недавно виявлений термостабільний інгібітор С-кінази: димер білкових субодиниць з М г = 19 кД. Кальмодулін та інші Са-связиваюшіе білки також інгібують активність ферменту, ймовірно, за рахунок впливу на механізм активації С-кінази.
У клітинах мозку знайдено кілька субстратів для протеїнкінази С. Відзначимо серед них основний білок мієліну, 87 кД-білок і В-50-білок. Ступінь фосфорилювання основного білка мієліну протеінкіназою С, присутньої в мієліну, збільшується in vivo при К +-деполяризації мембрани. Протеїнкінази В не мають такої дії.
Встановлено, що активація С-кінази форболових ефірами призводить до збільшення секреції нейромедіаторів, викликаної пресинаптичними потенціалами дії. Вважають, що здатність С-кінази збільшувати секрецію пов'язана саме з фосфорилюванням згаданого вище 87 кД-білка. Цей білок локалізований переважно в сінаптосомах - як у мембранної, так і цитозольної фракціях. Ймовірно, його фосфорилювання С-кіназою в закінченнях нейронів обумовлює регуляцію Са-залежної секреції нейромедіаторів.
У-50-білок асоційований з пресинаптичними мембранами нейронів мозку. Як нещодавно встановлено, цей білок проявляє активність фосфатіділінознтол-4-фосфат кінази - ферменту, що бере участь у синтезі фосфатидилінозит-толдіфосфата. Таким чином, передача сигналу через систему фосфатидилінозитолу в мозку може регулюватися за допомогою фосфорилювання У-50-білка протеінкіназою С.
Протеїнкіназа С, мабуть, регулює як хемозавісімие так і електрозалежність Са-канали в нервових клітинах. Так, штучні аналоги діацилгліцеринів - форболових ефіри - в задніх корінцях спинного мозку, блокують хемозавісімие Са-канали в концентраціях, при яких ці сполуки активують білкову С. Встановлено також, що внутрішньоклітинна ін'єкція протеїнкінази С збільшує амплітуду електрозалежність Са-струму і зменшує Са-активується калієвий струм у нейронах молюска аплізіі. При цьому, за наявними даними, С-кіназа переважно фосфорилирует регуляторні компоненти мембран, пов'язані з каналами, а не пептиди, що формують власне трансмембранні канали. Таким чином, наведені дані про вплив на секрецію нейромедіаторів і трансмембранні потоки іонів свідчать про безпосередню участь С-кінази у важливих процесах нервової тканини.
Оцінюючи місце протеїнкінази в системах регуляції, відзначимо, що існують два варіанти взаємодії між системами вторинних посередників, які визначаються як станом рецепторів, так і розподілом в різних тканинах, природою і умовами для фосфорилювання окремих білків-мішеней: синергізм та антагонізм. Протеїнкіназа С, по всій видимості, є тією ланкою, яка шляхом тонкого підстроювання сопрягающей апарату пов'язує аденилатциклазную і фосфоліпазну системи передачі та посилення сигналу.
Так, виявлено фосфорилювання протеїнкінази С а-субодиниці G {, провідне до зняття інгібіторного дії цього сопрягающей білка на аденілатциклазу. Крім того, вже згадувалося, що G {може бути одним із прямих активаторів фосфоліпази С. Непряма активація фосфоліпази С може бути обумовлена ​​збільшенням активності фосфоліпази А 2 при дії G i. Показано інгібування фосфоліпази С за допомогою активації G s. Так, встановлено зменшення освіти діацилгліцеринів і Інозитолтрифосфат при підвищенні рівня цАМФ за допомогою гормонів, дібутіріл-цАМФ, форсколіна. Ймовірно, пригнічення активності протеїнкінази С при активації протеїнкінази А обумовлено десенситизації відповідних рецепторів, втратою їх чутливості до агоністів. На користь такого висновку свідчать дані про втрату специфічного зв'язування з агоністами мускаринових холінорецепторів синаптичних мембран при фосфорилюванні цих рецепторів К-субодиницею протеїнкінази А. У свою чергу, стимуляція М-холінорецепторів серця викликає зменшення активності аденілатциклази і зниження рівня цАМФ.
Разом з тим відомі і приклади синергізму у взаємодії протеїнкіназ. Синергізм в дії протеїнкінази А, В і С чітко проявляється при фосфорилюванні фосфоламбаіа - білка саркоплазматичного ретикулума міокарда. Показано збільшення індукованого Інозитолтрифосфат вивільнення Са + під дією К-субодиниці протеїнкінази А, інгібітор К-суб'едінііи блокує цей ефект Встановлено також, що протеїнкіназа С в деяких типах клітин підсилює р-адренергическую стимуляцію утворення цАМФ. Преінкубація ендотеліальних клітин у присутності 10 мкм і "внутрішнього" механізмів. У першому випадку різні метаболіти зв'язуються з субстратом, змінюючи швидкість дефосфорилювання, у другому випадку ліганди зв'язуються з фосфатазою і, таким чином, прямо змінюють фосфатазной активність.
Вивчення фосфатаз призвело до відкриття безлічі форм ферменту, які дефосфорилюється широкий спектр фосфо-білків. Д. Коен і співавтори класифікували протеїнфосфатази на два типи. Фосфатази 1-го типу ингибируются білковими інібіторамі, відносно нечутливі до інгібування АТФ і переважно дефосфорилюється р-субодиницю кінази фосфорілази. Фосфатази 2-го типу не ингибируются термостабільними білковими інгібіторами, чутливі до інгібування АТФ і переважно дефосфорилюється а-субодиницю кінази фосфорілази. У свою чергу, всі фосфопротеінфосфатази 2-го типу поділяються на підтипи 2А, 2В і 2С. Відмінною особливістю фосфатаз 2С є регульованість Mg, а фосфатаз 2 В-залежність від Са + і кальмодуліну.
Протеїнфосфатази 2 В і 2А присутні в мозку в найбільших концентраціях в порівнянні з іншими тканинами. У нервовій тканині знайдені також специфічні протеїнфосфатази, дефосфорилюється основний білок мієліну, сінапсін 1, МАР-2, білки цитоскелету, нікотинові рецептори ацетілхо-ліна. Найбільша активність фосфопротеінфосфатаз нервової тканини виявлена ​​в мембранної фракції в порівнянні з цитозолі, що свідчить про можливу участь цих ферментів у синаптичній передачі.
Зауважимо, що раніше протеїнфосфатаз 2В була названа кальцинейрин, тому що вперше вона була ідентифікована в нервовій тканині як термолабільний інгібітор КМ-стимулируемой фосфодіестерази циклічних нуклеотидів. Кальцинейрин належить до сімейства КМ-зв'язуючих білків, що містять Са-связьшающіе субодиниці. Активність кальцинейрин контролюється іонами кальцію.
Нещодавно виявлено, що кальцинейрин, крім серину і треоніну, здатний дефосфоріліроеать також тирозинових залишки білків. Це передбачає участь кальцинейрин у процесах трансформації та клітинного росту, контрольованих, як відомо, тнрозінкіназамі. Цікаво, що в N-кінці субодиниці В кальцинейрин міститься міристинова кислота, що може полегшувати вбудовування білка в мембрану.
У мозку кальцинейрин локалізований в основному в постсинаптичних мембранах і тісно пов'язаний з мікротрубочками дендритів, що передбачає його участь у транссінаптіческого передачі та функціонуванні мікротрубочок. Основними субстратами кальцинейрин в нервовій тканині є білки DARPP-32, G-субстрат і Р-субодиниця II типу протеїнкінази А.
У мозку містяться також інгібітори протеїнфосфатаз: так званий фосфатазной інгібітор 1 і білок DARPP-32 знайдені в мозку і фосфорилюються ендогенної А-кіназою по єдиному залишку треоніну. У фосфорильованій формі DARPP-32, як і фосфатазной інгібітор 1, інгібує активність протеїнфосфатази I. DARPP-32 пов'язаний в мембранах з дофаміновими рецепторами аденілатциклази і, таким чином, може приймати участь в транссінаптіческого дії дофаміну.
Кальцинейрин і DARPP-32 локалізовані разом у синаптичних мембранах. Отже, ступінь фосфорилювання DARPP-32 і медіаторна дію дофаміну можуть регулюватися цАМФ і Са +.
Відзначимо, що кальцинейрин може виступати в ролі своєрідного антагоніста біохімічних ефектів цАМФ, модулюючи тим самим взаємодія двох систем вторинних посередників - цАМФ і Са +, Так, кальцинейрин дефосфорилюється багато субстрати протеїнкінази А, в тому числі аутофосфорілірованную форму регуляторної субодиниці протеїнкінази АII типу. В останньому випадку кальцинейрин може прямо контролювати цАМФ-залежну протеінкіназную активність, так як ступінь фосфорилювання Р-субодиниці II типу визначає характер дисоціації холоферменту протеїнкінази і. відповідно, швидкість фосфорилювання.
цГМФ регулює активність протеїнфосфатаз 1 і 2А в клітинах Пуркіньє мозочка за допомогою фосфорилювання G-субстрату протеінкіназою G. G-субстрат, як згадувалося, є специфічним протеінфосфатазним інгібітором. Дефосфорілірованіе цього інгібітора кальцинейрин може, таким чином, сполучати вплив цГМФ та Са + на функціональну активність клітин Пуркіньє.
У синаптичних мембранах виявлено також дві ендогенні, тісно пов'язані з цими мембранами специфічні протеїнфосфатази. Ці протеїнфосфатази дефосфорилюється білки синаптичних мембран: сінапсін 1 і Р-субодиницю II типу протеїнкінази А. При цьому фосфатаза, що має високу спорідненість до Р-субодиниці, не дефосфорилюється сінапсін 1, а фосфатаза сінапсіна 1 - Р-субодиницю. Крім того, специфічна протеїнфосфатаз Р-субодиниці стимулюється цАМФ, в той час як протеїнфосфатаз сінапсіна 1 нечутлива до цього нуклеотиду. Таким чином, цАМФ може стимулювати як автофосфорилювання, так і дефосфорілірованіе Р-субодиниці А-кінази II типу.
Для розуміння різноманіття і важливість функцій систем фосфорилювання - дефосфорилювання важливі нещодавні повідомлення про виділення ендогенної Са-незалежної протеїнази, тісно асоційованої з нейрофіламенти та іншими компонентами цитоскелету. Ця протеиназа "атакує" тільки нефосфорілірованние нейрофіламенти, розщеплюючи їх на позбавлені біологічної активності фрагменти. Отже, фосфорилювання захищає білки цитоскелету від деградації, зумовленої дією ендогенних, Са-незавісімьгх протеїназ.
Навпаки, Са-актівіруемие нейтральні протеїнази за допомогою обмеженого протеолізу розщеплюють фосфорильованих форму нейрофіламентів на біологічно активні фрагменти. Встановлено, що фосфорилювання білків цитоскелету, зокрема нейрофіламентів, - необхідна умова для їх складання в організовані, морфологічно єдині структури.
Таким чином, стан цитоскелету нервових клітин визначається як цАМФ-залежним фосфорилюванням його компонентів, так і Са-залежним дефосфорілірованіе: ступінь фосфорилювання білків цитоскелету, у свою чергу, може регулювати їхню виборчу чутливість до Са-залежної і Са-незалежної протеїназно атаці. Протеїнфосфатази грають дуже важливу роль у функціонуванні нервової тканини. Так, поряд з протеїнфосфатаз 1, 2А, 2С, 2В і фосфатазной інгібітором 1 в мозку присутні ендогенні фосфатази сінапсіна, мієліну, Р-субодиниці А-кінази II типу, а також специфічні інгібітори фосфопротеінфосфатазной активності - DARPP-32 і G-субстрат, активність яких регулюється фосфорилюванням. Можна думати, що в нервовій тканині фізіологічна дія нейромедіаторів у ряді випадків модулюється протеінфосфатазной активністю.

Висновки
1. G-білки сполучають рецептори клітин з системами, що генерують вторинні посередники.
2. До вторинних посередникам ставляться: цАМФ, цГМФ, інозітолфосфати, диацилглицерол і іони кальцію.
3. Вторинні посередники активують протеїнкінази, що здійснюють фосфорилювання певних білків клітини, або впливають на метаболізм олігоаденілат. Нейромедіатори, гормони і сам по собі нервовий імпульс регулюють фосфорилювання-дефосфорілірованіе багатьох регуляторних субстратів у нервовій тканині. Величезна різноманітність фізіологічних ефектів, що викликаються цими агентами, зумовлено специфічністю систем протеінфосфорілірованія, контрольованих різними вторинними посередниками.
4. Нервова тканина унікальна щодо високого змісту практично всіх протеїнкіназ, активність яких регулюється цАМФ, цГМФ, Са +, кальмодуліном і фосфоліпідами.
5. За субстратної специфічності всі протеїнкінази і протеїнфосфатази в нервовій тканині можуть бути розділені на дві основні категорії. Протеїнкіназа G, протеїнкіназа У I типу, кіназа легких ланцюгів міозину, кіназа фосфорілази і кальцинейрин мають вузьку субстратне специфічність і приймають участь у спеціалізованій нервової регуляції. Навпаки, протеїнкіназа А, кіназа У II типу, С-киназа і ряд протеїнфосфатаз виявляють широку субстратне специфічність і залучені в регуляторні процеси практично всіх типів нервових клітин.
6. Певні протеїнкінази, протеїнфосфатази та їх специфічні субстрати локалізовані не рівномірно, а в спеціальних відділах нервової системи і в тому числі мозку.
7. Речовини, які активують синтез або інгібуючі гідроліз цАМФ, надають на нервові клітини антипроліферативну дію, пов'язану з впливом цього нуклеотиду на систему метаболізму 2 ', 5'-олігоаденілат.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Курсова
131.8кб. | скачати


Схожі роботи:
Поляризаційна структура випроміненого сигналу прийнятого сигналу Когерентне об`єднання накопичення
Дискретизація сигналу
Відновлення безперервного сигналу
Кодер - декодер мовного сигналу
Розрахунок каналу обробки аналогового сигналу
Передача і кодування сигналу в сітківці ока
Сутність та алгоритм некогерентного накопичення сигналу
Формування програми управління Параметри стимулюючого сигналу
Вимірювання параметрів сигналу Структура оптимального вимірювача
© Усі права захищені
написати до нас