Пори канали і переносники

. Получим выражение для т. мембрани С і питомою опором R. Отримаємо вираз для т.

Почнемо з того, що продиференціюємо по часу рівняння для ємності:

/ dt dQ / dt одно току / і дорівнює нулю, коли напруга досягає свого кінцевого значення Кк. Струм через іонний канал пропорційний різниці між істинним напругою і напругою, визначеними із рівняння Нернста для рівноважного стану при нульовому потоці. Відповідно до закону Ома / = / R. Звідси

Рішення рівняння має вигляд

або . де т = RC.

. Следовательно, произведение удельного сопротивления мембраны R Напруга на мембрані зростає експоненціально від нуля до кінцевого значення 100 мВ з постійною часу т, що дорівнює RC. Отже, твір питомого опору мембрани R на ємність С має розмірність часу та характеризує час електричного відповіді мембрани. Припустимо, що в мембрані відкрито 50 каналів на 1 мкм ^2. Це означає, що питома провідність мембрани складає 10 мСм / см ² і питомий опір мембрани відповідно дорівнює 100 Ом см ^2. У цьому випадку RC = 0,1 мс, що знаходиться в інтервалі значень, характерних для збудливих мембран залежить головним чином від питомого опору мембрани, оскільки ємність визначається в основному ліпідним бі-шаром.

Зверніть увагу, що питомий опір мембрани залежить від кількості каналів, часу, протягом якого вони відкриті, і провідності кожного каналу у відкритому стані. З розробкою методів, що дозволяють реконструювати роботу поодиноких каналів, з'явилася можливість прямо виміряти ці параметри.

КАНАЛИ і переносника ЯК ФЕРМЕНТИ: ЗАСТОСУВАННЯ ТЕОРІЇ ШВИДКОСТЕЙ

Кінетичну теорію перехідного стану Ейрінг, використовувану ензимології, успішно застосовують і в разі різних траспортних систем. В основі цього підходу лежить припущення про те, що система може перебувати в декількох дискретних станах, кожному з яких відповідає стандартне значення електрохімічного потенціалу. При цьому взаємні переходи між двома станами пов'язані з переходом системи через проміжні стадії з більш високою свобод-

ної енергією, і константи швидкостей переходів залежать від висоти відповідних енергетичних бар'єрів. Мінімуми на кривих зміни вільної енергії відповідають місць зв'язування речовин, що транспортуються. Можна припустити, що канал або переносник має одне або кілька місць зв'язування переносимих речовин. При досить високих концентраціях стерпного речовини всі ці місця опиняються зайнятими і швидкість переносу досягає свого максимального значення У _тлх, рівного максимальної швидкості роботи ферменту. Експериментальні підтвердження цьому отримані всім переносників і для багатьох каналів.

Застосування теорії перехідного стану при вивченні роботи каналів

Застосуємо теорію перехідного стану для аналізу роботи іонного каналу у випадку, коли іони спочатку присутні тільки з одного боку мембрани. Приймемо »для простоти, що всередині каналу є єдине місце зв'язування і що іони не можуть вільно проникати всередину каналу або залишати його. Якщо всередині каналу є багато місць зв'язування, за якими іон може послідовно передаватися, то швидкість переносу буде як і раніше описуватися рівнянням Міхаеліса-Ментен. Якщо прийняти, що трансмембранне напруга дорівнює нулю, то «реакцію» можна представити наступним чином:

и So — транспортируемое вещество внутри и снаружи, ES — комплекс субстрата с местом связывания внутри канала. де Е - це канальний білок у «відкритому» стані, Si і So - транспортується речовина всередині і зовні, ES - комплекс субстрату з місцем зв'язування всередині каналу. На рис. 8.1 показаний профіль вільної енергії для такої моделі. Наведено також профіль для каналу в закритому стані. Проходженню іона через канал перешкоджає збільшення висоти одного з енергетичних бар'єрів, але який механізм цього процесу, поки невідомо, за винятком, можливо, каналу щілинного контакту. Закривання каналу може бути обумовлене, наприклад, зміною положення а-спіралі або тільки бічного ланцюга, в результаті чого ефективно блокується транспорт іонів через канал.

Застосування критерію стаціонарного стану дає вже знайоме рівняння Міхаеліса-Ментен для швидкості:

₂ "К-, + k ₂ . _rc.

де К м = -, о - сумарна концентрація переносника.

Розглянемо два випадки: 1) насичуюча концентрація субстрату,> Км \ 2) низька концентрація субстрату, <А "м.

1. Насичуюча концентрація субстрату. У цих умовах всі місця зв'язування зайняті і швидкість переносу досягає свого максимального значення, що визначається висотою енергетичного бар'єру для виходу з каналу. Це легко побачити, перетворивши рівняння Міхаеліса - Ментен для випадку> Км:

2. Низька концентрація субстрату. При <Км спостерігається лінійна залежність швидкості від концентрації субстрату, тобто має місце кінетику другого порядку. Уявну константу швидкості другого порядку можна отримати, перетворивши рівняння Міхаеліса-Ментен для випадку малих:

Отримане рівняння досить важливо, оскільки воно описує роботу більшості, якщо не всіх іонних каналів. Позірна константа швидкості другого порядку для цієї реакції дорівнює до ₂ / Км-Навіть для такого простого випадку це не справжня мікроскопічна константа швидкості, а комбінація констант швидкостей.

З цієї простої моделі випливає кілька висновків.

1. Вимірювана константа швидкості, яка визначає швидкість транспорту по відкритому ионному каналу, містить інформацію про начебто спорідненості іона до місця зв'язування і про кількість обертів. У відсутність напруги на мембрані ця константа швидкості прямо пов'язана з проникністю, зумовленої одиничним каналом. Якщо внутрішній бар'єр малий, то константа швидкості транспорту буде дорівнює ki - Константі швидкості другого порядку для іона, що входить в канал. "' c ^{_ l} . Если внутренний энергетический барьер велик , то константа скорости транспорта будет равна произведению -кг- Лімітуючим фактором для цієї реакції може служити дифузія, при цьому до \ становитиме 10-10 ^{вересня} M "'c ^{_ l.} Якщо внутрішній енергетичний бар'єр великий, то константа швидкості транспорту буде дорівнює добутку-кг-

2. Залежність швидкості транспорту від напруги визначається провідністю. Це легко зрозуміти, якщо подивитися, як падіння напруги на мембрані впливає на індивідуальні мікроскопічні константи. Якщо на профіль потенціалу, зображений на рис. — увеличится. 8.1, накласти пряму, що відповідає лінійному падіння напруги на мембрані, то висота енергетичних бар'єрів, що відповідають кг і до \, зменшиться, а до - i - збільшиться. У результаті цього істотно збільшиться константа швидкості другого порядку для іонного транспорту, що і слід було очікувати. Прості моделі типу розглянутої нами не передбачають лінійної залежності струму від напруги, що спостерігається експериментально. Однак при введенні в такі моделі додаткових енергетичних бар'єрів крива залежності потоку від напруги стає дуже близькою до лінійної.

3. Іонну селективність можна пояснити кількома шляхами. Селективність - це здатність каналу пропускати деякі іони краще, ніж інші, її можна кількісно охарактеризувати як відношення проникності або провідностей для порівнюваних іонів. Оскільки у вираз для константи швидкості транспорту входять як ки так і до _2, то причиною селективної іонної провідності може служити як більш низький енергетичний бар'єр на вході в канал, так і більш низький бар'єр для переміщення усередині каналу для певного типу іонів. Наприклад, якщо біля входу в канал є негативні заряди або диполі, то швидкість транспорту аніонів може зменшитися, тобто канал виявиться катіонселектівним. Така картина спостерігається для декількох рецепторних канальних білків і граміцидину А. Розміри переносимих речовин також впливають на швидкість транспорту. Якщо розмір молекули стерпного речовини більше, ніж діаметр каналу, то ця речовина не зможе потрапити в канал. І нарешті, селективність може бути пов'язана з різницею в швидкостях перенесення різних іонів усередині каналу. ⁺ -селективного канала энергетический барьер для переноса этого иона внутри канала существенно ниже, чем для других ионов, таких, как К ⁺ , что ведет к увеличению проводимости no Наприклад, у випадку Na ^{+-селективного} каналу енергетичний бар'єр для перенесення цього іона всередині каналу істотно нижче, ніж для інших іонів, таких, як К ^+, що веде до збільшення провідності no ⁺ . Na ^+. Видається малоймовірним, щоб причиною іонної селективності було збільшення спорідненості іона до каналу. Така зміна, відповідне збільшення глибини западини на профілі потенціалу, повинно було б приводити до зменшення швидкості виходу іона з каналу, тобто до зменшення максимального потоку через канал, а також до зменшення концентрації іона, необхідної для насичення каналу, тобто до зменшення Км. Близько значення К _м ⁺ или К ⁺ , достаточно высоки, 200—300 мМ, что выше обычных физиологических концентраций этих ионов. для тих каналів, які переважно пропускають Na ⁺ чи К ^+, досить високі, 200-300 мМ, що вище звичайних фізіологічних концентрацій цих іонів.

Застосування теорії перехідного стану при вивченні роботи переносників

Звернемося тепер до переносникам. Розглянемо простий переносник з одним місцем зв'язування, що транспортує молекули через мембрану. Рис. 8.2 ілюструє основні властивості як первинного активного переносника, так і пермеаз. Розглянемо чотири стану білка-переносника: 1) білок звернений усередину / пов'язаний із субстратом, 2) звернений усередину / не пов'язана; 3) звернений назовні / пов'язаний із субстратом, 4) звернений назовні / не пов'язаний. Тоді транспорт можна представити у вигляді такої послідовності елементарних оборотних стадій.

1. Субстрат зв'язується з ділянкою, зверненим до однієї сторони мембрани.

2. Відбувається конформационное зміна, істотно зменшує кінетичний бар'єр для переміщення іона до виходу з каналу і збільшує енергетичний бар'єр для руху в зворотному напрямку. Це конформационное зміна може бути спонтанним або може відбуватися зі споживанням енергії. Ділянка переносника із зв'язаним субстратом виявляється тепер зверненим до протилежної сторони мембрани.

3. Субстрат вивільняється з комплексу з переносником і виходить на протилежній стороні мембрани. Для активних переносників спорідненість субстрату до білка нижче, коли місце зв'язування звернено до / іронс-стороні мембрани.

4. /ис-стороне. Відбувається конформационное зміна, повертає білок-переносник до вихідної конформації, в якій місце зв'язування знову звернена до j / ис-стороні.

Ключовим моментом у роботі всіх переносників є наявність високого енергетичного бар'єру, для подолання якого відповідні білки повинні зазнати конформаційні зміни. Якщо для цього необхідна енергія, то система може працювати як активний переносник. Якщо для конформаційного переходу необхідно, щоб молекула стерпного речовини була пов'язана з білком, тобто стадія 4 відсутня, то білок буде каталізувати лише обмін речовини через бішар, оскільки він не може изомеризоваться в «незавантаженою» формі.

Для опису роботи іонних каналів і різних видів

переносників розроблено багато моделей і схем. Хоча кінетична теорія перехідного стану має певні обмеження, особливо в тому, що стосується кінетичних властивостей каналів, її застосування спрощує розв'язання багатьох складних завдань і дозволяє єдиним чином підходити до розгляду різних транспортних механізмів.

АНАЛІЗ СТАЦІОНАРНОГО СТАНУ

Для кінетичної характеристики транспортних систем, які каталізують полегшену дифузію або активний транспорт, можуть використовуватися різні підходи до аналізу стаціонарного стану. Всі ці підходи засновані на вимірюванні швидкості перенесення розчинних речовин через мембрану, але за різних умов. Як приклад ми розглянемо експерименти, які проводилися на пермеаз і мембранних везикулах. Зазвичай для такого роду вимірів використовують радіоактивні мітки. Ключовим моментом є те, що пермеаз повинна не тільки переносити речовину через бішар, то також і повертатися назад. Швидкість транспорту може залежати від будь-якої з цих стадій. Опишемо коротко деякі підходи до аналізу.

1. Субстрат присутній тільки з одного боку мембрани. Початкова швидкість транспорту вимірюється для односпрямованого потоку. Зверніть увагу, що для забезпечення постійного потоку речовини, що транспортується переносник повинен повернутися вільним. Вимірюють потік як функцію для процесу, що протікає в будь-якому напрямку.

2. Рівноважний обмін. Субстрат присутній в однаковій концентрації з обох сторін мембрани, але радіоактивна мітка - тільки з одного боку. У цьому випадку пермеаз може повертатися, будучи пов'язаною з немічених речовиною. Вимірюють потік як функцію.

3. Мічений субстрат Нахо з цис-боку мембрани, а в насичує концентрації він присутній на протилежній стороні. . Вимірюють потік як функцію ^ _uc. Як і в першому випадку, при цьому реєструють односпрямований потік. Такий потік називають також зустрічним, оскільки мічених речовин переноситься проти свого хімічного градієнта.

4. „ _uc изменяется. Питома радіоактивність субстрату з обох сторін мембрани однакова. У насичує концентрації субстрат знаходиться на транс-стороні, a _"uc змінюється. У цьому випадку вимірюють сумарний перенесення, оскільки радіоактивну речовину перетинає мембрану в обох напрямках. За таких умов вимірювання стан системи близько до рівноважного.

У всіх випадках визначають До _тах і Км, які при цьому не обов'язково збігаються для різних підходів. Для різних моделей можна отримати кінетичні рівняння для стаціонарного стану та перевірити їх. Як і в класичних працях з ензимів-логії, дуже корисним може виявитися використання інгібіторів. При цьому інгібітори можна вводити з будь-якої сторони мембрани, що дозволяє отримати додаткову інформацію.

Такого роду підходи можна застосовувати при роботі з клітинами, субклітинні мембрани везикулами або штучними реконструйованими системами. Для дослідження роботи іонних каналів зазвичай застосовують електричні методи, які дають величезні переваги.

Доповнення 8.2. Дослідження транспорту в стаціонарному стані з використанням мутантної лактоеопермеази з Є. coll

в положении 325 заменен на Ala . Як приклад використання описаних вище підходів розглянемо вивчення транспорту в стаціонарному стані, здійснюваного однією з мутантних форм лактоеопермеази, в якій залишок Glu в положенні 325 замінений на Ala. На рис. 8.11 цей залишок знаходиться в спіралі 10. При вимірах використовували радіоактивну лактозу, при цьому накопичення лактози вивчали на інтактних клітинах, а виведення, зустрічний потік і обмін лактози - на цитоплазматичних мембранних везикулах з правильною орієнтацією. Пермеаз дикого типу каталізує сім-порт / 3-галактозид і Н ^+. У присутності протонного електрохімічного градієнта пермеаз використовує вільну енергію, що вивільняється при перенесенні Н ⁺ за градієнтом, для накопичення / 3-галактозид проти концентраційного градієнта.

-325 на Ala активный транспорт лактозы прекращается. При заміні залишку Glu -325 на Ala активний транспорт лактози припиняється. Для вимірювання накопичення лактози використовували інтактні клітини, в яких пермеаз дикого типу була замінена мутантної пермеаз. Для цього до суспензії дихаючих клітин додавали-лактозу і вимірювали кількість лактози, що накопичується клітинами, в залежності від часу. Приблизно через 3 хв перенесення лактози досягав максимальної величини, але в клітинах з мутантної пермеаз залишався дуже незначним. Для вивчення виведення лактози инкубировали мембранні пухирці протягом кількох годин у присутності високих концентрацій радіоактивної лактози, а потім аліквотах переносили в середовище без лактози. Швидко фільтрували везикули, вимірювали їх радіоактивність за допомогою сцін-тіляціонного лічильника і визначали швидкість втрати лактози везикулами. Час напіввиведення для контрольних везикул становило 10 с, а для бульбашок, що містили мутантних пермеаз, воно було рівне 540 з. Мутантна пермеаз нездатна транспортувати лактозу як у прямому, так і в зворотному напрямках.

Зовсім інші результати були отримані, однак, при вимірюванні рівноважного обміну. Ці вимірювання проводять точно так само, як і вимірювання по виведенню лактози, тільки навантажені лактозою везикули поміщають в середу, що містить немічених лактозу в такій же концентрації. У цих дослідах швидкості виведення-лактози з везикул, що містили в одному випадку пермеаз дикого типу, в іншому - мутантних, були ідентичними. Ці експерименти показують, що, хоча мутантна пермеаз не може здійснювати повний цикл транспорту лактози, вона здатна ізо-мерізоваться в завантажену форму, що робить можливим трансмембранний обмін лактози. Подібним чином мутантна пермеаз нормально функціонує в дослідах по вимірюванню зустрічного потоку. При такому підході везикули навантажують немічених лактозою, розводять середовищем, що містить-лактозу в низькій концентрації, і вимірюють потік міченої лактози всередину везикул. Цей підхід також показав, що пов'язана з лактозою форма пермеаз нормально ізомеризується і здійснює трансмембранний обмін лактози.

Наведені вище дані дозволили зробити висновок про те, що мутантна пермеаз, що містить А1А-325, не може депротоніруется-ватися. Таким чином, пермеаз виявляється дефектною по всіх зв'язаних транспортним процесам, в яких Н ⁺ і лактоза переносяться разом в циклі, що вимагає наявності депротонованої-ної форми переносника для ізомеризації.

Інші приклади використання такого роду підходів більш детально розглянуті у відмінній книзі Штейна.

РЕЄСТРАЦІЯ струму, викликаного через одиночного каналу: ВБУДУВАННЯ У ПЛОСКІ МЕМБРАНИ І МЕТОД Петч-клампи

Електричний струм, що виникає при швидкому переміщенні іонів через канал, можна легко виміряти. с одной стороны мембраны 0,5 М. Это — обычное значение проводимости для ионных каналов. Наприклад, реконструйований нікотинових ацетилхолінових рецепторів - хімічний ворітної катіонселектівний канал в постсинаптичних мембранах, відкривання і закривання якого регулюється за допомогою хімічних речовин, - має провідність у відкритому стані 45 ПСМ при концентрації NaCl з одного боку мембрани 0,5 М. Це - звичайне значення провідності для іонних каналів. При цьому при напрузі на мембрані 100 мВ через кожен канал проходить струм 4,5 пА, або 2,7-10 ⁷ іонів / с. Цей струм легко зареєструвати за допомогою відповідної електронної апаратури. Отже, струм через одиничний канал можна прямо виміряти, якщо фоновий струм через мембрану досить малий. Для того щоб дослідити властивості індивідуальних канальних молекул, необхідно виміряти струм через ділянку мембрани в умовах, коли одночасно відкрито не більше одного каналу. Для цього можна використовувати штучну систему, коли в плоску мембрану вбудовані поодинокі канальні білки. Можна також скористатися методом Петч-кламп. В основі методу лежить зроблене в 1979 р. відкриття, яке показало, що якщо чисту скляну мікропіпетку притиснути до клітинної мембрани і злегка втягнути повітря в піпетку, то на її кінці утворюється дуже тонка, але міцна мембранна плівка. Це дозволяє отримувати вольт-амперні характеристики будь-яких каналів, що знаходяться на цьому невеликій ділянці мембрани. Фоновий струм зазвичай буває значно менше 1 пА, так що струм через індивідуальний канал можна легко виміряти. Застосування цієї техніки зробило справжню революцію у вивченні іонних каналів, дозволивши детально досліджувати роботу різноманітних каналів з ​​різних мембран. На рис. 8.3 схематично показано чотири модифікації методу Петч-кламп. У рамках даного методу можна змінювати склад розчину як з однієї, так і з обох сторін мембрани, можна вимірювати провідність одиничних каналів, вивчати ензимології одиничних молекул. Все це робить метод Петч-кламп надзвичайно потужним.

Щоб оцінити можливості даного підходу, розглянемо запис роботи одиничного ацетилхолінового рецепторного каналу, вбудованого в бішар. Ворота індивідуальних каналів можуть спонтанно відкриватися і закриватися. Кожне відхилення запису вниз відповідає відкриванню каналу. Струм, поточний через відкритий канал, можна виміряти, а це дає можливість визначити провідність одиничного каналу. Час, протягом якого кожен канал залишається відкритим, також легко виміряти. Одержуване при цьому розподіл часу життя каналу у відкритому стані прямо пов'язано з константою швидкості закривання каналу. Для самої простої моделі, коли є одне відкрите і одне закрите стан,

розподіл часу життя каналу описується експоненційної функцією з характерним часом т, рівним величині, зворотній константі швидкості першого порядку для закривання каналу. Коли функція розподілу часу життя каналу у відкритому стані відрізняється від простої експоненційної залежності, як у випадку ацетилхолінового рецептора, для пояснення експериментальних даних необхідно використовувати більш складні стану. Можна вивчати вплив на роботу каналу різних хімічних агентів; при цьому необхідно відрізняти вплив цих агентів на кінетичні параметри відкривання-закривання каналів від їх впливу на провідність поодиноких каналів.

Доповнення 8.3. Визначення константи зв'язування інгібітору за даними про провідності одиничного каналу

Розглянемо використання даних про провідності одиничного каналу на прикладі дослідження взаємодії харібдотоксин з Са ^{2 +-Активована} К ^{+-специфічним} каналом. Харібдоток-син, невеличкий пептид, виділений зі скорпіонів, є ефективним інгібітором цього каналу. Біохімічні характеристики каналу не вивчені, проте його роботу інтенсивно досліджували, використовуючи техніку реєстрації струму через поодинокі канали. Для цього спочатку готували мембранні везикули з поперечних волокон скелетних м'язів щура і проводили їх злиття з плоским ліпідного бішару. На рис. 8.5 наведені записи електричного струму через одиничний канал, швидко переходить з відкритого стану в закрите. Якщо ці дані представити у мілі-секундному масштабі, то можна буде побачити окремі акти спрацьовування каналу, як це показано на рис. 8.4.

При додаванні харібдотоксин в роботі каналу з'являються тривалі періоди, протягом яких він залишається в непроводящем стані. Очевидно, зв'язування токсину якимось чином блокує канал. Частота появи цих «мертвих» періодів дозволяє визначити швидкість зв'язування харібдотоксин з каналом, час, протягом якого канали залишаються закритими, залежить від константи швидкості дисоціації комплексу канал-токсин.

Середній час життя каналу в активному стані т \ обернено пропорційно швидкості зв'язування токсину, а час життя його в закритому стані т - i - Швидкості дисоціації:

Дані, представлені на рис. 8.5, показують, що швидкість блокування каналу залежить від концентрації токсину, а швидкість дисоціації не залежить від концентрації вільного токсину.

З цих даних легко отримати як А: _дисс, так і до _зв'я для токсину; їх ставлення дає константу дисоціації. Чудово, що одержувані параметри - як кінетичні, так і

термодинамічні - відносяться до подій, що відбуваються з індивідуальною молекулою.

НЕВЕЛИКІ МОЛЕКУЛИ, ВИКОРИСТОВУЮТЬСЯ В ЯКОСТІ МОДЕЛЕЙ КАНАЛІВ І ПОР

Кінетичні методи використовуються для аналізу роботи різних каналів і переносників, які виявляються в біомембранах. Розшифрована амінокислотна послідовність багатьох з цих білків. Проте, до цих пір не вдалося провести рентгенострук-турне дослідження з високою роздільною здатністю ні для одного з цих транспортних білків, тому при вивченні структури і механізмів роботи каналів доводиться вдаватися до модельних побудов. Великі можливості дає використання малих молекул, здатних утворювати пори в бішарі. Особливо цікаві в цьому відношенні три з'єднання: 1) ністатин - поліенових антибіотик, який утворює комплекс з холестеролом, 2) грамідіцін А - пептид, який утворює катіонселектівний канал, найбільш повно охарактеризований з усіх вивчених до теперішнього часу каналів; 3) аламетіцін - пептид, який утворює регульований напругою ворітної канал.

Ністатин і амфотерицин В

Структурні формули цих подібних полієнів наведено на рис. 8.6. Коли до містить стерол плоским мембран з одного боку від них додають ністатин, відбувається збільшення мембранної проникності для води, одновалентних іонів і невеликих неелектролітів. Неелектроліти, ббльшіе, ніж глюкоза, пройти через канал не можуть. Це говорить про те, що діаметр пори складає близько 8 А. На рис. 8.6 представлена ​​модель каналу, згідно з якою від 8 до 10 молекул повні образи циліндричну структуру, в якій гідроксильовані сегменти кожної молекули звернені всередину, утворюючи заповнену водою пору. Зовнішня поверхня такої структури неполярних, при цьому між кожною парою молекул ністатину є простір для молекули стеролу. Провідність каналу відносно низька, 5 ПСМ в 2 М КС1. Коли ністатин додають до плоскої мембрані з обох сторін, дві такі циліндричні структури, мабуть, об'єднуються, утворюючи в два рази довший канал.

Необхідно відзначити, що ця пороутворюючими молекула є амфіфільних, оскільки володіє полярним і неполярних

ділянками. Полярна частина утворюється з послідовно розташованих гідроксильних і карбонільних груп. Пороутворюючими комплекс, мабуть, стабільний всередині бішару. Обидві ці структурні особливості характерні для більшості каналоутворюючих білків. Відзначимо, однак, що структура ністатіновую пори є гіпотетичною, хоча побудована вона на цілком розумних положеннях і узгоджується з експериментальними даними.

Граміцидин А

- и D -аминокислот, — охарактеризован к настоящему времени наиболее полно. Канал, що утворюється граміцидину А - гідрофобним пептидом з чергуються L - і D-амінокислот, - схарактеризовано до теперішнього часу найбільш повно. Виходячи з наявних експериментальних даних, була побудована модель каналу. Відповідно до моделі, канал утворений двома молекулами граміцидину А, розташованими голова до голови в / 3-спіральної конфігурації. - и D -аминокислот образуется спираль, в которой все боковые цепи располагаются снаружи, а карбонильные группы остова — внутри канала. У результаті чергування L - і D-амінокислот утворюється спіраль, в якій всі бічні ланцюги розташовуються зовні, а карбонільні групи кістяка - всередині каналу. Цей тип спіралі не зустрічається більше ні в яких білках і утворюється з-за незвичайного чергування стереоізомерів амінокислот у граміцидину А. З цієї точки зору граміцидин А є поганою структурною моделлю формованих білками трансмембраніих пір. Однак у багатьох інших відносинах канал, утворений граміцидину А, має багато спільних рис з іншими каналами і порами. Відзначимо наступні його особливості.

1. Граміцидин А надзвичайно гідрофобний, він не містить ні однієї полярної амінокислоти.

2. Провідність одиничного каналу, який утворюється граміцидину, досить велика. катионная проводимость составляет 30 пСм на канал. Наприклад, в 100 мМ RbCl катіонна провідність становить 30 ПСМ на канал. Втім, це набагато нижче теоретичної граничної величини для пори цього розміру, якщо перенесення речовини через пору лімітується тільки дифузією.

3. Граміцідіновий канал є катіонселектівним. ~ равна нулю. Невеликі неорганічні і органічні катіони проходять через нього, в той же час проникність по CI ~ дорівнює нулю. Хоча цей аніон досить малий, щоб легко пройти через пору такого діаметру, він не транспортується через граміцідіновий канал і не блокує його. Цей факт дуже примітний, якщо взяти до уваги, що в граміцидину немає полярних або заряджених амінокислот. Така селективність пояснюється електростатичним відштовхуванням аніонів і диполів, утворених карбонільними групами у воротах каналу.

4. Проникність каналу для одновалентних катіонів змінюється в наступному порядку: Cs ^+> Rb ^+> К ^+> Na ⁺ ; такая же последовательность сохраняется и для свободной диффузии этих ионов в воде. ^+> Li ^+; така ж послідовність зберігається і для вільної дифузії цих іонів у воді. Селективність, демонстрована каналом відносно даних одновалентних катіонів, невелика, вона відповідає за все п'ятикратному зміни коефіцієнтів проникності. Енергія активації провідності мала, близько 5 ккал / моль. У цьому сенсі канал функціонує так, як ніби він заповнений водою. Можливості вільної дифузії катіонів у розчині в значній мірі залежать від електростатичних взаємодій з водою. Невеликі іони взаємодіють з молекулами води сильніше, ніж великі, і електростатична поляризація викликає уповільнення дифузії. Такого ж роду сили, ймовірно, впливають і на лімітуючі стадії, коли катіони проходять через довгий вузький граміцідіновий канал.

5. Молекули можуть проходити через канал лише поодинці, оскільки його діаметр становить всього 4 А. Отже, що транспортується іон в момент входження в канал має частково дегідратованих. 'Крім стерпного катіона в каналі можуть перебувати від п'яти до семи молекул води, та іон буде контактувати з двома з них, що знаходяться спереду і ззаду від нього. У каналі повинні бути присутні також групи, з якими буде взаємодіяти транспортується іон замість втрачених при дегідратації молекул води. Дегідратація вимагає великих витрат енергії, тому швидше за все саме ця стадія буде лімітуючої.

6. Транспорт іонів через канал, утворений граміцидину А, характеризується при досить високих концентраціях солі кінетикою з насиченням. Це вказує на те, що в каналі є певне число місць зв'язування катіонів. ⁺ -проводимости составляет 0,31 М. Кинетические модели переноса предполагают наличие двух мест связывания, по одному у каждого входа в канал. Наприклад, полунасищающая концентрація для Na ^{+-провідності} становить 0,31 М. Кінетичні моделі переносу припускають наявність двох місць зв'язування, по одному у кожного входу в канал. Зв'язування катіона здійснюється в результаті його взаємодії з диполями, зокрема з карбонільної групою залишку 11.

7. Вода проходить через канал зі швидкістю близько Ю ⁸ молекул в 1 с при низькій іонній силі. Переміщення катіона під впливом електричного поля супроводжується перенесенням 5 - 7 молекул води, що знаходяться в каналі, що створює електроосмотичного ефекти.

8. Відкривання і закривання граміцідінового каналу відбувається відповідно в результаті асоціації мономерів, які утворюють димер, і дисоціації димера. Час життя димеру становить близько 10 мс - 10 с і залежить від ліпідного складу мембрани та інших факторів.

9. Коли граміцидин А знаходиться в негативно зарядженому ліпідному бішарі під впливом поверхневих зарядів може відбутися збільшення локальної концентрації катіона біля входу в гра-міцідіновую пору. Це значно збільшить провідність каналу при низьких концентраціях солі.

Все сказане вище ясно показує, чому граміцидин А є настільки важливою експериментальною моделлю. Багато хто з його властивостей аналогічні властивостям, проявляють фізіологічно важливими каналами, такими, як ацетилхолінових рецепторів.

Аламетіцін

Аламетіцін - це один із представників групи природних пептидів, які утворюють потенціалзалежні канали і тому представляють собою гарну модель для вивчення регуляції роботи каналу за допомогою трансмембранного потенціалу. Молекула аламетіціна складається з 20 амінокислот, зокрема, вона містить залишки а-аміноізобутірата. Основною структурною особливістю аламетіціна і його гомологів є їх здатність утворювати а-спіралі. 3- cnnpa -ли, образуемой грамицидином А, пространство внутри а-спирали слишком мало, чтобы через него мог пройти ион. На відміну від j 3 - cnnpa-ли, утвореною граміцидину А, простір всередині а-спіралі занадто мало, щоб через нього міг пройти іон. Експериментальні дані скоріше свідчать про те, що до 12 молекул ала-метіціна агрегує і утворюють пору. Коли аламетіцін знаходиться в такій конфігурації, полярні атоми виявляються всередині структури. Відзначимо, що для забезпечення полярності наповненого водою каналу не потрібно присутності бічних груп полярних амінокислот.

При низькій напрузі плоска мембрана, яка містить аламетіцін, не проводить електричний струм. У міру збільшення напруги до якогось критичного значення аламетіціновие канали починають проводити струм. Напруга на мембрані може бути будь-якого знаку. Провідність одиничного каналу дуже висока: вона становить 5000 ПСМ в 1 М КС1 і свідчить про те, що розмір пір дуже великий. Якщо припустити, що канал утворюється 12 агрегованими мономерами аламетіціна, то його діаметр повинен бути дорівнює 20 А, що відповідає високої провідності одиничного каналу.

Для пояснення можливого механізму регуляції роботи ала-метіцінового каналу шляхом зміни напруги на мембрані розроблено кілька моделей. -конце молекулы, а отрицательный — на С-конце. Всі вони припускають, що диполі в а-спіралі, що утворюються пептидними групами, сумуються і створюють загальний диполь, такий, що позитивний заряд локалізується на N-кінці молекули, а негативний - на С-кінці. Трансмембранний потенціал досить великий, щоб при взаємодії з цим постійним диполем могло відбутися зміна орієнтації спірального пептиду в мембрані або збільшилася ефективність його включення в мембрану.

Розглянемо найпростішу модель, що описує відкривання каналу при накладенні поля. Відповідно до цієї моделі, під дією електричного поля збільшується число вбудованих в мембрану молекул аламетіціна, в результаті чого мономери починають збирати з утворенням циліндричного каналу, причому процес характеризується високим ступенем кооперативності. Однак існує й інша точка зору, згідно з якою аламетіцін знаходиться у зв'язаній з мембраною непроводящая формі вже під час відсутності напруги і при накладанні електричного поля тільки агрегує з утворенням каналу у відкритій конформації. Електричне поле в рамках цих моделей викликає дипольний фліп-флоп-перехід а-спірального пептиду, стабілізуючи агрегат, в якому а-спіралі паралельні один одному.

Аламетіцін являє собою гарну модель, що дозволяє пояснити процес утворення пори при асоціації а-спіра-лей; він також дає можливість продемонструвати на простій системі, як трансмембранний потенціал стабілізує певні білкові конформації і тим самим робить істотний вплив на провідність каналу. Такими властивостями володіють не тільки пептиди типу аламетіціна. Як приклад можна навести синтетичні пептиди і меліттін.

Кілька прикладів пор і каналів

Останнім часом досягнуто великих успіхів у визначенні будови пор і каналів на молекулярному рівні. Виявляються деякі загальні структурні елементи цих утворень. Аналіз амінокислотних послідовностей відповідних молекул вказує на існування структурно споріднених груп іонних каналів. Особливо цінним у цих дослідженнях виявився метод реконструкції зображення, з його допомогою вдалося не тільки візуалізувати отвори в мембрані, створювані великими порами, але і виявити симетричну організацію субодиниць навколо центрального отвору. Спільним структурним мотивом для цих білків може бути циліндричний канал, що формується декількома амфіфіли а-спіралями різних субодиниць або окремими доменами однієї субодиниці. Втім, структура аламетіціна і граміцидину А свідчить про те, що бічні ланцюги полярних амінокислот не потрібні для формування полярної внутрішньої структури заповненого водою каналу. Ні в одному з випадків не доведено достовірно, що кислі залишки безпосередньо беруть участь в утворенні пори. Важливим виключенням із а-спірального сімейства каналів є пори-яи, оскільки вони формують пори з / 3-шарів, а не за допомогою а-спіралей.

Щілинні контакти

Щілинні контакти - це кластери мембранних каналів, які з'єднують вміст сусідніх клітин в тканинах. Через такі канали проходять невеликі молекули - метаболіти і неорганічні іони. Діаметр каналів в клітинах ссавців становить від 12 до 20 А. Через ііх здійснюється перенесення з клітини в клітину іонів і хімічних речовин. Таким чином, ці канали з'єднують дві плазматичні мембрани. Досліди з клонування і біохімічної реконструкції показали, що канал утворений олігомером єдиного пептиду, мовляв. маса якого для клітин печінки становить 32000. Виходячи з даних про амінокислотної послідовності, можна припустити, що в кожній субодиниці є чотири трансмембранні а-спіралі. До теперішнього часу охарактеризовано білки щілинних контактів з декількох тканин; мабуть, вони утворюють велику групу споріднених білків. Ці канали зазвичай знаходяться у відкритому стані, але закриваються, коли знижується швидкість метаболізму. Первинним сигналом для закривання каналу є, по всій вірогідності, підвищення концентрації Са ^{2 +,} Хоча при зміні трансмембранного потенціалу чи закислення середовища також спостерігається закривання каналу. Можливо, ефект Са ^{2 +} є опосередкованим. Іншим способом регулювання роботи каналу може бути фосфорилювання.

Основна модель, що описує будову і можливий механізм роботи каналу, представлена ​​в роботі. Для з'ясування структури каналу автори використовували електронну мікроскопію. Кожен канал складається з 12 субодиниць, по шість від кожної клітини. Канал являє собою гексамерні структуру з центральною часом. Кожна субодиниця має форму стрижня, що пронизує бішар. Два гексамерні комплексу сусідніх мембран з'єднані кінець до кінця і утворюють протяжний канал, який об'єднує обидві мембрани. Структура каналу щілинного контакту залежить від наявності іонів Са ^{2 +.} У присутності Са ^{2 +} Субодиниці розташовані паралельно центральній осі каналу, а за відсутності цих іонів вони кілька нахилені. Це наводить на думку, що відкривання і закривання каналу відбувається аналогічно роботі діафрагми фотоапарата; субодиниці ковзають один відносно одного у відповідь на сигнал до відкривання або закривання. Однак точний механізм цього процесу далеко не ясний.

ЯДЕРНІ поровий КОМПЛЕКСИ

Ядерна оболонка складається з двох мембран. Ядерні порові комплекси беруть участь у транспорті речовин між ядром і цитоплазмою. Ці пори, аналогічно каналах щілинних контактів, пронизують дві мембрани. За даними електронної мікроскопії високої роздільної здатності, ядерна пора має октагональную симетрію, але влаштована складніше, ніж канал щілинного контакту. Ядерна пора представляє собою два октагональних циліндра, з'єднаних разом кшталт каналу щілинного контакту. Поліпептидний склад пори ядерної оболонки остаточно не встановлений.

Розмір пори ядерної оболонки дуже великий, радіус її функціональної частини складає - 90 А; через неї можуть проходити як невеликі розчинні речовини, так і багато великі молекули. Існують спеціальні механізми транспорту макромолекул всередину ядра і з ядра в цитоплазму, проте до цього часу про них мало що відомо.

ПОРІНИ

Поріни утворюють пори, які функціонують як молекулярні сита, опосередковуючи дифузію невеликих гідрофільних молекул через зовнішню мембрану грамнегативних бактерій. Дослідження більше ніж сорока різних порінов дозволило виявити деякі їх загальні особливості. Мовляв. маса порінов варіює від 28 ТОВ до 48 ТОВ. У мембрані вони зазвичай присутні у вигляді тримерів. Для порінов характерний високий вміст / 3-шарів. : OmpF , OmpC , PhoE и LamB . Найбільш повно до теперішнього часу охарактеризовано поріни з Є. coli: OmpF, OmpC, PhoE і LamB. Їх основною особливістю є те, що вони утворюють наповнений водою трансмембранний канал, причому цей канал утворений в основному ^-структурними елементами. На рис. 8.7 представлена ​​одна з можливих моделей освіти порінового каналу з амфіфільних, так і по селективності. Селективність пов'язана з наявністю всередині каналу або біля входу в канал заряджених амінокислотних залишків. Вимірювання проводи-

мости поодиноких каналів і проникності пір, а також електронно-мікроскопічні дослідження вказують на те, що будова пір не однаково для різних порінов. В одних випадках тримери поріна утворюють один великий канал, в інших - три незалежні канали. имеет три входа с наружной стороны клетки, которые затем сливаются, образуя единый выход в периплазму. Канал OmpF має три входи із зовнішнього боку клітки, які потім зливаються, утворюючи єдиний вихід в периплазмі.

Три з чотирьох пори Є. coli мають багато спільних структурних особливостей, а їх амінокислотні послідовності в значній мірі гомологічних. . Ці поріни утворюють пори діаметром 10-12 A. В, значительно отличается от трех предыдущих, хотя его аминокислотная последовательность обнаруживает некоторое сходство с ними. Четвертий порін, Lam В, значно відрізняється від трьох попередніх, хоча його амінокислотна послідовність виявляє деяку схожість з ними. является частью системы транспорта мальтозы и обладает сродством к производным мальтозы. Оі теж утворює головним чином / 3-складчасті структури. LamB є частиною системи транспорту мальтози і має споріднення до похідних мальтози. образует небольшие каналы, которые целиком блокируются при связывании мальтозы. У відсутність мальтози LamB утворює невеликі канали, які цілком блокуються при зв'язуванні мальтози. является стимуляция накопления мальтозы, а не работа в качестве диффузионной поры для небольших растворимых веществ. Головною функцією LamB є стимуляція накопичення мальтози, а не робота в якості дифузійної пори для невеликих розчинних речовин. исследовали с помощью различных методов, включая генетические. Топографію LamB досліджували за допомогою різних методів, включаючи генетичні. У результаті була побудована детальна модель цього каналу, що пронизує мембрану.

Припущення про те, що поріни є воротних каналами і, отже, можуть перебувати в закритому стані, піддавалося всебічної перевірки. In работа поринов может регулироваться напряжением на мембране, однако физиологическая значимость этого явления остается неясной. vitro робота порінов може регулюватися напругою на мембрані, проте фізіологічна значимість цього явища залишається неясною.

І нарешті, слід зазначити, що із зовнішньої мембрани мітохондрій були виділені поріни, робота яких регулюється напругою на мембрані. Вони називаються потенціалзалежні аніонселектівнимі каналами. Ці поріни не є спорідненими бактеріальним порінам, але вони також рбразуют циліндричну пору з / 3-структурних елементів

-канал является примером канала, работа которого регулируется нейромедиатором. nAChR-канал є прикладом каналу, робота якого регулюється нейромедіатором. Ці канали знаходяться головним чином в кінцевих пластинках - постсинаптичних мембранах нервово-м'язових з'єднань скелетних м'язів. При електричному збудженні нейрона з нього вивільняється нейромедіатор ацетил-тілхолін. Останній дифундує від пресинаптичної мембрани нейрона до мембрани скелетної м'яза. Нікотинові ацетілхо-линів рецептори мають вигляд щільно упакованих кластерів в плазматичній мембрані м'язового волокна, що входить до складу кінцевої пластинки. При взаємодії з ацетилхоліном канал відкривається, опосередковуючи селективне переміщення катіонів. Під дією іонного струму змінюється трансмембранний потенціал і відбувається електричне порушення м'язової клітини, що призводить до скорочення м'яза.

-канал регулируется с помощью химических механизмов, причем сигнал действует непосредственно на канал. nAChR-канал регулюється за допомогою хімічних механізмів, причому сигнал діє безпосередньо на канал. Хімдческім сигналом є ацетилхолін, який передає порушення від нервового волокна до м'яза. Аналіз амінокислотної послідовності показав, що нікотинових ацетилхолінових рецепторів і два інших нейромедіаторних рецептора - гліціновий рецептор і рецептор 7-аміномасляної кислоти - мають багато спільних структурних особливостей. Вони утворюють групу хімічно регульованих каналів. Втім, незважаючи на схожість амінокислотних послідовностей, ці білки мають різну четвертинну структуру. Біохімічні властивості рецептора глутамату, одного з важливих іейромедіаторов головного мозку, не досліджені.

Відзначимо, що номенклатура і класифікація нейромедіатор-них рецепторів грунтуються головним чином на даних про вплив на них різних лікарських речовин, особливо тих, які виступають в ролі агоністів, стимулюючи рецептор зразок природного нейромедіатора, або антагоністів, які блокують стимулюючий ефект агоністів. Наприклад, рецептори ацетилхоліну на початку цього століття поділяли на нікотинові і мус-каріновие на підставі їх фармакологічних відмінностей. Нікотинові рецептори ацетилхоліну - це група споріднених рецеп-раторних білків. -каналом и в действительности не является каналом. Мускаринових рецептор з клітин мозку структурно не схожий з nAChR-каналом і насправді не є каналом. Необхідно відзначити, що охарактеризовані нікотинові рецептори ацетилхолінові з тканини мозку, за деякими структурними та функціональними особливостями відрізняються від каналів коіцевой платівки.

-канал охарактеризован наиболее полно, и связано это с тем, что существует легкодоступный источник, содержащий большие количества данного белка. У порівнянні з іншими канальними білками nAChR-канал охарактеризований найбільш повно, і пов'язано це з тим, що існує легкодоступний джерело, що містить великі кількості даного білка. Більша частина біохімічних експериментів була поставлена ​​з використанням рецептора, виділеного з електричного органу скатів Eiectrophorus . Показано, что эти каналы очень похожи на каналы концевых пластинок как в структурном, так и в функциональном отношении. і Torpedo. Показано, що ці канали дуже схожі на канали кінцевих пластинок як у структурному, так і у функціональному відношенні. Гібридні білки, що складаються з субодиниць рецепторів з електричного органу Torpedo і нерви-мишеч з'єднання бика, виявилися повністю функціональними.

-канал состоит из пяти полипептидных субъединиц четырех разных типов со стехиометрией а ₂ 08у. Две копии а-субъединиц, присутствующие в комплексе, по всей вероятности, выполняют разные функции. Виділений і очищений nAChR-канал складається з п'яти поліпептидних субодиниць чотирьох різних типів зі стехіометрією а ₂ 08у. Дві копії а-субодиниць, присутні в комплексі, по всій вірогідності, виконують різні функції. Субодиниці близькі один до одного по амінокислотної послідовності і розрізняються за що здається молекулярній масі. Всі субодиниці фосфорилюватись і глікозовані, а до двох, а і / 3, ковалентно приєднаний ліпід.

На основі електронно-мікроскопічних методів реконструкції зображення була побудована модель каналу, наведена на рис. 8.8. Метод негативного контрастування ясно показуючи-

ет, що канал має центральний отвір діаметром 30 А з позаклітинного кінця і значно вужче з ци-топлазматіческой сторони. На фотографіях чітко видно пентамер-ва структура комплексу. Це означає, що п'ять субодиниць організовані навколо центральної пори. Використання реагентів, що утворюють поперечні зшивки, показує, що субодиниці розташовані в наступній послідовності: / 3 - а - 6 - у-а, так що а-субодиниці не є сусідами один з одним. За даними численних досліджень, місця зв'язування ацетилхоліну, інших агоністів і конкурентних антагоністів розташовуються на а-субодиниці. Отже, існують два місця зв'язування для цих хімічних агентів. Антагоністи перешкоджають активації, спричиненої агоністами, або шляхом прямої конкуренції за зв'язування з тими ж ділянками, або за рахунок зв'язування з яким-небудь іншим місцем і, можливо, співпрацю з каналом per . se.

Як видно з рис. -канал имеет длину около 140 А, причем участок длиной 70 А расположен над поверхностью бислоя с наружной стороны, образуя большие ворота канала. 8.8, nAChR-канал має довжину близько 140 А, причому ділянка довжиною 70 А розташований над поверхнею бішару з зовнішнього боку, утворюючи великі ворота каналу. У клітинах Torpedo канал існує у вигляді димерной одиниць, пов'язаних один з одним дисульфідних містків між 6-субодиницями з позаклітинної сторони. Частина каналу, що виступає з бішару з цитоплазматичною боку, набагато менш протяжна; мабуть, вона взаємодіє з елементами цитоскелету, що сприяє утворенню плотноупакованной кластерів канальних білків в кінцевій пластинці. Було висловлено припущення, що ці взаємодії опосередковує особливий білок мовляв. масою 43 000. У кінцевий платівці канали можуть бути зібрані в кластери з щільністю до 10000 молекул на 1 мкм ^2, що близько до теоретичної межі. При взаємодії з ацетилхоліном або іншими агоністами через дану ділянку мембрани починає текти електричний струм, Деполяризуючий постсинаптичну мембрану.

-канал а можно с успехом анализировать, если рассматривать его как аллостерический фермент, способный находиться в нескольких конформациях. Кінетичне поведінка nAChR-канал а можна з успіхом аналізувати, якщо розглядати його як аллостеріческій фермент, здатний знаходитися в декількох конформаціях. Існують як мінімум три стани, в яких може перебувати канал: відкрите, закрите і інактивовані. Для індукції переходу каналу із закритого стану у відкрите, в якому він залишається близько 1 мс, необхідно кооперативне зв'язування двох молекул ацетилхоліну. У інактивування стані канал залишається закритим навіть у присутності ацетилхоліну. Вимірювання провідності одиночного каналу свідчать про наявність більш ніж одного відкритого стану, і кінетична модель при цьому виявляється досить складною. Досліди по вбудовуванню каналу в ліпідний бішар показали, що ліпідну оточення може впливати на здатність каналу до переходу з однієї конформації в іншу.

У відкритій конформації канал проникний для катіонів і невеликих неелектролітів, але не аніонів. Обмеження, що накладаються на розмір проходять молекул, дозволяють судити про розміри найвужчої частини каналу. Відповідні дані представлені на рис. 8.9 разом з даними для двох інших каналів. Радіус невеликого негідратовану іона, здатного проходити через канал, є розумною оцінкою граничних розмірів каналу. Непроникність каналу для аніонів і в три рази ббльшую проникність для катіонів, ніж для незаряджених молекул, можна пояснити електростатичними взаємодіями, що виникають завдяки присутності у воротах каналу біполярних чи негативно заряджених груп. Селективність каналу по відношенню до одно-і двовалентних катіонів невелика, але узгоджується з моделлю, в якій іони навіть усередині каналу взаємодіють головним чином з молекулами води, а не з елементами власне каналу. -канала относительно велики, он все же слишком мал, чтобы через него могли проходить полностью гидратированные ионы. Хоча розміри nAChR-каналу щодо великі, він все-таки занадто малий, щоб через нього могли проходити повністю гідратовані іони. Внутрішня порожнина каналу повинна містити групи, які могли б легко замінити втрачені при дегідратації молекули води.

Про молекулярній структурі цього каналу відомо більше, ніж про структуру будь-якого іншого каналу. І все ж, на жаль, не вироблено єдиної точки зору на те, як побудований даний канал, хоча було створено багато досить детальних моделей. Великий внесок у дослідження цього питання внесли роботи з використанням методів молекулярної генетики. -канала из нескольких источников были определены аминокислотные последовательности этих субъединиц, анализ которых выявил наличие высококонсервативных участков. Так, за допомогою клонування генів кожної з субодиниць nAChR-каналу з декількох джерел були визначені амінокислотні послідовності цих субодиниць, аналіз яких виявив наявність висококонсервативний ділянок. В якості потенційних трансмембранних а-спіралей було ідентифіковано до семи різних сегментів. Найбільш цікавий один з них, що позначається як М5 або МА; він може утворювати амфіфільних спіраль із зарядженими групами, розташованими з одного боку. Більшість дослідників вважають, що вузька частина каналу, що пронизує бішар, побудована з субодиниць, кожна з яких утворює а-спіраль. Ансамбль а-спіралей формує центральну пору. Першим кандидатом на цю роль є амфіфільних спіраль, хоча модельні дослідження з граміцидину А з очевидністю показали, що наявність заряджених груп не є необхідною умовою для утворення наповненого водою катіонселектівного каналу. Експериментальні дані про пряму участь амфіфільних спіралі у формуванні каналу відсутні; навіть питання про те, чи є ця спіраль трансмембранної, не вирішено остаточно. Є дані, що у формуванні каналу бере участь інша спіраль, М2. Ці дані були отримані при вивченні зв'язування з каналом неконкурентних антагоністів і за допомогою молекулярно-генетичних методів. Хоча спіраль М2 не є амфіфільних, вона може утворювати канал, аналогічний граміцідіновому або аламетіціновому. Відзначимо, що інші члени групи нейромедіаторних рецепторів не мають ділянок, аналогічних амфіфільних спіралі нікотинового ацетилхолінового рецептора.

У роботах Нума та ін вперше були продемонстровані можливості застосування сайт-специфічного мутагенезу при дослідженні подібного роду систем. -клетках обезьяны и ооцитах Хепорш и наблюдали экспрессию функциональных каналов в плазматической мембране. Гени, що кодують кожну з чотирьох субодиниць каналу, клонували в cos-клітинах мавпи і ооцитах Хепорш і спостерігали експресію функціональних каналів в плазматичній мембрані. Для вивчення роботи таких каналів дуже цінним виявилися методи реєстрації струмів через поодинокі канали. Є надія, що з розвитком подібних експериментальних підходів ми зможемо отримати відповіді на багато давно цікавлять нас питання про будову каналів. Використання поліклональних і моноклональних антитіл допоможе виявити ті ділянки поліпептидів, які відповідальні за зв'язування ацетилхоліну, а також ділянки, що формують власне канал. В даний час більшість дослідників вважають, що цей канал утворюється з а-спіралей, як аламетіціновий канал. Ті самі уявлення лягли в основу моделі Na ^{+-Каналу.}

ПОТЕНЦІЛЗАВІСІМИЙ натрієвий канал

Потенціалзалежний натрієвий канал забезпечує швидке збільшення натрієвої провідності, відповідальне за фазу деполяризації при розвитку потенціалу дії в нервових і м'язових клітинах. Цей канал був очищений до гомогенного стану з декількох джерел, зокрема з мозку щура, скелетних м'язів ссавців, серця курчати і електричного органу ската Electrophorus . electricus.

Очищені канали з Elektrophorus electricus і серця курчати містять єдину глікопротеїнових субодиницю з мовляв. масою -260000, в той час як канали, виділені з тканин ссавців, містять ще одну або дві менші субодиниці з мовляв. масою від ЗЗООО до 38 000. Більшу частину з цих очищених препаратів каналів вдалося вбудувати в плоскі мембрани, при цьому вони зберігали притаманні їм in электрофизиологические и фармакологические характеристики. vivo електрофізіологічні і фармакологічні характеристики. Для успішної реконструкції каналу, виділеного з тканин ссавців, необхідний щонайменше один з невеликих асоційованих білків.

Натрієві канали взаємодіють з різними токсинами, зокрема з тетродотоксином, саксітоксіном і а-токсином скорпіона, які дуже міцно зв'язуються з канальними білками і можуть використовуватися при кількісних біохімічних вимірах. Присутність цих токсинів дуже важливо як для біохімічного очищення каналів, так і для вивчення їх роботи in . vivo. Як і канал кінцевої пластинки, натрієві канали розподілені в плазматичній мембрані не рівномірно, а зібрані в кластери. В м'язових клітинах Na -каналами. ^{+-Канали} сконцентровані в районі кінцевої пластинки разом з nAChR-каналами.

Нума з співавторами клонували гени, що кодують білки натрієвих каналів з ​​Electrophorus і головну субодиницю каналу з мозку щура, і визначили їх нуклеотидну послідовність. Було показано, що білок натрієвого каналу з Electrophorus містить 1820 амінокислотних залишків, організованих в чотири повторювані гомологічні одиниці. На думку різних авторів, кожен гомологічний ділянку містить 4, 6 або 8 трансмембранних а-спіралей. -канала. Деякі з цих передбачуваних трансмембранних спіралей амфіфільних і аналогічні постульований для nAChR-каналу. Є експериментальні дані про те, що карбоксильний кінець поліпептидного ланцюга локалізована на цитоплазматичній поверхні; повідомлялося також, що амфіфільних 54-спіраль є внецітоплаз-тичного. Проте ніякої додаткової інформації, що дозволяє підтвердити запропоновані топологічні моделі, не існує. Немає також даних про те, які ділянки поліпептиду безпосередньо залучені в освіту пори. Різні моделі натрієвого каналу концептуально близькі до моделей каналу кінцевої пластинки в тому відношенні, що канал per состоит из кластера а-спиралей, образующих центральную пору. se складається з кластера а-спіралей, що утворюють центральну пору. У цьому випадку, однак, замість п'яти різних субодиниць ми маємо чотири гомологічних домену єдиною субодиниці. По всій імовірності, специфічні групи організовані в каналі таким чином, що утворюється «селективний фільтр».

Граничні розміри каналу можна оцінити, використовуючи метод «молекулярного сита», однак при цьому не можна пояснити селективність каналу по відношенню до досить малим іонів. На рис. ⁺ через канал. 8.10 наведено профіль вільної енергії для дифузії іонів Na ⁺ через канал. Якщо лімітуючою стадією є дегідратація, то параметром, що визначає висоту енергетичного бар'єру, буде геометрія тих компонентів, які тимчасово замінюють воду. Для К ⁺ становище відповід-

відних груп не буде оптимальним, оскільки цей іон дещо більше за діаметром, а тому енергетичний бар'єр буде вище. Навпаки, для К ^{+-селективних} каналів відповідний енергетичний бар'єр буде мінімальний саме для іонів К ^+.

Останнім часом було побудовано також багато моделей, що описують регуляцію роботи каналу за допомогою трансмембранного потенціалу. У регуляції, без сумніву, бере участь зміна заряду білка у відповідь на накладення електричного поля. Однак ніяких даних про те, які саме ділянки поліпептиду утворюють ворота або відповідають на зміну напруги, не існує. Висловлюється припущення, що це може бути амфі-ною 54-спіраль.

Дані про амінокислотної послідовності натрієвого каналу свідчать про те, що він відноситься до групи потенціал-залежних каналів. У цю ж групу входять калієвий канал з Drosophila і Дигідропіридиновий калієвий канал із скелетних м'язів кролика. 4- cer -менту натриевого канала. Всі ці білки містять амфі-ною позитивно заряджений сегмент, аналогічний S 4 - cer-менту натрієвого каналу. Це ще раз підтверджує висновок про те, що даний сегмент бере участь у регуляції роботи каналу, відповідаючи на зміну напруги на мембрані. Відзначимо, що як натрієвий канал з тканин ссавців, так і кальцієвий канал наступний розділ) мають субодиниці, функції яких невідомі.

Кальцієвого каналу

Са ^{2 +-Селективні} канали дуже широко поширені в збудливих клітинах - нервових і м'язових, а також у більшості інших типів клітин. Деякі Са ^{2 +-Канали} відповідають на зміну напруги на мембрані, а робота інших регулюється опосередковано за допомогою рецепторів. Зазвичай концентрація іонів Са ^{2 +} у цитоплазмі не перевищує 10 ^"7 М, що в 10000 разів нижче, ніж концентрація іонів Са ^{2 +} поза клітини. З-за цих умов і на відміну від Na ⁺ - І К ^{+-каналів} відкривання Са ^{2 +-Каналу} може призводити до значних змін концентрації цього іона в цитоплазмі, що в свою чергу індукує різноманітні біохімічні події. Наприклад, потенціалзалежне збільшення концентрації іонів Са ^{2 +} в цитоплазмі призводить до вивільнення нейромедіаторів.

Виходячи їх фармакологічних даних, була проведена класифікація Са ^{2 +-каналів.} Для очищення і подальшої харктеристики каналів дуже корисними виявилися органічні блокують агенти з високою спорідненістю до каналів. Єдиний клас Са ^{2 +-Каналів,} охарактеризованих біохімічно, - це потенціалзаві-незалежними канали, які блокуються різними органічними сполуками, зокрема похідними дігідропірідііа. Ці канали були виділені з серцевою і скелетної м'язів і виявилися однаковими. Вони складаються як мінімум із двох субодиниць з мовляв. масою 140000 та 30000. Велика субодиниця була клонована і секвенований і виявилася структурно близька до потенціалзалежне натрієвого каналу.

З'являється все більше даних, що свідчать про подібність структури різних каналів і пор. В основі всіх цих систем лежить заповнена водою пора, вистелена зсередини полярними групами. Пора може бути утворена або а-спіральними, або 0 - структурними елементами. Щоб транспорт здійснювався з високою швидкістю, в каналі не обов'язково повинні бути присутніми місця зв'язування, що володіють високою спорідненістю до стерпним речовин, оскільки селективність визначається висотою енергетичних бар'єрів, а не глибиною западин. Селективність каналів можна в більшості випадків пояснити тим, що в декількох ключових місцях розташовуються специфічні амінокислотні залишки, що визначають характер тих речовин, які можуть проходити через канал. Можливо, Воротні механізми різних каналів також мають багато спільного, але експериментальні дані з цього приводу поки що немає.

Як ми побачимо пізніше, аналогічні структурні властивості можна знайти й у інших транспортних білків.

Деякі уніпортери, сімпортери і антіпортери

До теперішнього часу досить добре охарактеризовано кілька систем, що каталізують транспорт одного або більше розчинних речовин. При цьому швидкість переносу за допомогою цих білкових комплексів набагато нижче, ніж навіть через найбільш «повільні» канали. Ми розглянемо переносник глюкози і аніонний переносник з мембрани еритроцита, лактозопермеазу з Є. coli і групу мітохондріальних переносників. Транспортні функції цих білків дуже різні: оіі каталізують полегшену дифузію одного якоїсь речовини, сімпорт Н ⁺ і цукру, в результаті чого відбувається накопичення цукру в клітці, і антіпорт розчиненої речовини. Відзначимо деякі загальні властивості цих процесів.

1. У деяких випадках ці транспортні білки є олі-Гомера, зазвичай димерами. Проте, мабуть, тільки у мітохондріальних переносників канал утворюється із структурних елементів різних мономерів. У всіх інших випадках, цілком ймовірно, кожна суб'єктів незалежно едіііца функціонує незалежно, навіть якщо вона є частиною олігомеру.

2. Дуже висока ступінь гомології транспортних білків вказує иа їх близьке структурний спорідненість, хоча вони істотно розрізняються як за субстратної специфічності, так і по функціях. Це дозволяє припустити, що для широкої групи функціонально різних переносників характерні загальні транспортні механізми.

3. У більшості випадків для аналізу роботи транспортних білків можна з успіхом використовувати моделі з чергуванням кон-формаційних станів, аналогічні моделі, схематично представленої на рис. 8.2. При цьому лімітуючою стадією є конформационное зміна з тією стороною мембрани, де знаходиться місце зв'язування.

4. У більшості випадків спорідненість переносника до транспортованого речовини не залежить від того, до якої сторони мембрани звернено місце зв'язування. Однак для первинних активних транспортних систем спостерігається інша картина.

5. Всі розглянуті тут переносники зазвичай чутливі до реагентів, дія яких спрямована на сульфгідрильні групи. Однак це не обов'язково має означати, що між переносниками є значна структурна подібність або вони використовують однаковий механізм транспорту. Наприклад, встановлено, що жоден з восьми залишків цистеїну лактозопермеази не бере участь безпосередньо в транспорті. Висловлювалося також припущення, що занурені в мембрану залишки проліну розподілені в транспортних білках непропорційно, однак значення цього факту залишається неясним.

Переносників глюкози З Мембрана еритроцита

Цей переносник охарактеризований найбільш повно з усіх білків, що каталізують дифузію єдиного речовини через мембрану. -глюкозу, которая затем используется при гликолизе. Він переносить через еритроцитарну мембрану D-глюкозу, яка потім використовується при гліколізі. Такі ж або аналогічні переносники глюкози присутні і в інших типах клітин тварин. Великий прогрес у цій галузі досліджень був досягнутий завдяки секвенированию ДНК, що кодує переносник глюкози з клітин гепатоми людини і з клітин мозку щура. Очищений переносник з еритроцитів являє собою глікопротеїн з здавалося мовляв. масою 55 000. Мабуть, в мембрані він перебуває у вигляді димеру. Якщо судити за даними про амінокислотної послідовності, то переносник повинен містити 12 трансмембранних а-спіральних ділянок, однак експериментальні дані не дають остаточної відповіді на це питання. Очищений переносник вдалося вбудувати в фосфоліпідних везикули, при цьому виявилося, що він орієнтований асиметрично.

Як і при дослідженні канальних білків, дуже важливу роль зіграли досліди з використанням специфічних інгібіторів, що володіють високою спорідненістю до переносники. У число цих інгібіторів входять цітохалазін В і флоретін, які зв'язуються з переносником зі стехіометрією 1:1. Одні інгібітори зв'язуються з переносником тільки в тому випадку, якщо вони перебувають з цитоплазматичної сторони мембрани, інші специфічно зв'язуються з зовнішнього боку мембрани. У роботі було показано, що місця зв'язування двох зазначених інгібіторів знаходяться поблизу С-кінця поліпептиду.

-глюкозы, находящееся внутри канала. Більшість кінетичних даних і даних щодо зв'язування узгоджуються з простою моделлю чотирьох станів, в якій передбачається, що існує єдине місце зв'язування D-глюкози, яка була всередині каналу. Для вимірювання індивідуальних констант швидкостей використовували ЯМР і метод зупиненої струменя. Конформація завантаженого каналу змінюється з константою швидкості 2000 з ~ ', яка приблизно в сім разів вище аналогічною константи для незавантаженого каналу. Отже, обмін глюкози відбувається з більшою швидкістю, ніж транспорт як такої, для здійснення якого незавантажений переносник повинен повернутися через мембрану. Природа конформаційного зміни невідома, хоча воно було зареєстровано за допомогою інфрачервоної спектроскопії з перетворенням Фур'є і, як припускають, включає ковзання а-спіралей один щодо одного.

Між переносником глюкози з клітин ссавців і деякими транспортними системами бактерій спостерігається значна гомологія. Дивно, що така гомологія спостерігається також між переносником глюкози і білками, що здійснюють сімпорт Н ^{+-арабінози} і Н ^{+-ксилози.} Ці сім-портер, як і описувана нижче система транспорту Н ^{+-лактози,} використовують для акумуляції зазначених цукрів електрохімічний протонний градієнт. Переносник глюкози з мембрани еритроцитів не транспортує Н ⁺ і не здатний до транспорту проти градієнта глюкози. Дуже важливими представляються роботи з вивчення взаємозв'язку структури білкового комплексу та механізму його роботи.

ЛАКТОЗОПЕРМЕАЗА З Є. coll

Цей комплекс вивчений найбільш повно з усіх сімпортних білків. - оперона, и его часто называют lac -пермеазой. Він кодується / АСУ-геном, який є частиною lac - оперона, і його часто називають lac-пермеаз. Ген lacY був клонований і секвенований, і з штаму-сверхпродуцентов був виділений білок - продукт цього гена. Пермеаз можна вивчати в цито-тичних мембранних везикулах, в інтактних клітинах або в реконструйованих протеоліпосомах. Судячи по дан-

вим про амінокислотної послідовності, білок має мовляв. масу 46 500, хоча результати електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН дають іншу величину. Майже не викликає сумніву, що функціональною одиницею в мембрані є мономер, хоча деякі дані свідчать про існування димерной форми пермеаз in . vivo.

На підставі даних про амінокислотної послідовності лактозопермеази були побудована моделі, згідно з якими цей білок має 12 або 14 трансмембранних а-спіралей. Це в основному узгоджується з спектроскопічними даними, що свідчать про високий вміст а-спіралей, і нечисленними топологічними даними. На рис. 8.11 представлена ​​модель, побудована Кабаков, із зазначенням сегментів, які, згідно з експериментальними даними, є цито-або періплаз-автоматичними.

1. Пермеаз має одну або більше місць зв'язування для протона і одне - для лактози. Ці місця бувають по черзі звернені до періплазматіческой і цитоплазматичної сторонам мембани, і відповідний коіформаціоніий перехід є лімітуючою стадією процесу. Максимальна швидкість транспорту дорівнює 25-50 з ~ ^1. При наявності трансмембранного протонного електрохімічного потенціалу для лактози становить ~ 80 мкМ; місце зв'язування протона, можливо, характеризується високим рК _л, тому більшу частину часу протонувати. При ДД _Н ♦ = 0 значення Км для лактози набагато вище - 15-20 мМ.

2. Транспорт лактози обов'язково супроводжується транспортом Н ⁺ зі стехіометрією 1:1.

3. Кінцевим результатом транспорту є перенесення через бішар позитивного заряду. Отже, важливу роль у встановленні рівноваги і швидкості транспорту грають трансмембранний електричний потенціал і різниця протонного хімічного потенціалу.

Доповнення 8.4. Генетичні підходи і сайт-специфічний мутагенез: важливі методи вивчення лактоеопермеази

Найбільш цінні дані при вивченні лактоеопермеази були отримані за допомогою генетичних методів. Ці роботи почали проводити порівняно недавно, але вже ясно, що такого роду підходи допоможуть отримати важливі результати при вивченні як цієї, так і інших транспортних систем. За допомогою направленого мутагенезу було показано, що при заміні аланіну-177 або тірозііа-236 дана пермеаз може переносити мальтозу. Ці сайти, зазначені на рис. 8.11 гуртками, можуть брати участь у зв'язуванні цукру.

Кабак і його колеги використовували сайт-специфічний мутагенез для вивчення механізму функціонування пермеаз. Було показано, що заміна багатьох амінокислот не робить помітного впливу на кінетику транспорту. Це означає, що дані амінокислоти не беруть прямої участі в транспорті, більше того - їх заміна не приводить до «глобальним» конформаційних змін білкового комплексу і не перешкоджає нормальній організації комплексу в мембрані.

Були виділені три мутантні форми, нездатні каталізувати визначення стадії транспорту. Особливо істотні для нормального транспорту гістидин-322, глутамат-325 і аргінін-302; можливо, ці амінокислоти беруть участь у перенесенні заряду всередині мембрани. Було висловлено припущення, що вони утворюють якусь пов'язану водневими зв'язками групу між спіралями 9 і 10. Пермеаз, в якій глутамат-325 замінений на аланін, не може каталізувати активний транспорт або виведення лактози, але здатна здійснювати нормальний обмін лактози. Отже, навантажена форма переносника може зазнавати нормальні конформаційні зміни, блокується ж якась інша стадія повного циклу, можливо депротонування пермеаз. Можна сподіватися, що саме за допомогою такого роду експериментів вдасться зрозуміти механізм роботи даного переносника. При цьому очевидно, що в інтерпретації результатів ключову роль могло б зіграти встановлення тривимірної структури ферменту.

, так и у высших организмов имеются другие системы симпорта сахара и катионов. Як у Є. coli, так і у вищих організмів є інші системи сімпорта цукру і катіонів. Однак лактозопермеаза НЕ гомологічна ні переносникам Н ^{+-ксилози} або Н ^{+-арабінози,} ні переносники глюкози ссавців. . Ніякої гомології не було виявлено також між лак-тозопермеазой і мелібіозопермеазой з Є. coli. Остання використовує в якості рушійної сили для накопичення мелібіо-зи сімпорт не тільки Н ^+, але також і Na ^+. Здатність використовувати Na ^+, Цілком ймовірно, виключає механізми з перескакиванием протона по мережі водневих зв'язків у пронизує мембрану частини переносника. Відомий також якийсь переносник Na ^{+-Глюкози,} який каталізує накопичення глюкози в клітинах щіткової облямівки кишечника.

Білок смуги 3 - аніонів Переносник З МЕМБРАНИ ЕРИТРОЦИТІВ

На частку білка смуги 3 припадає близько 25% загальної кількості мембранних білків еритроцита людини; подібні білки присутні також у неерітроідних клітинах. -концевая часть является гидрофильной и локализована с цитоплазмати-ческой стороны эритроцитарной мембраны. Цей білок виконує кілька функцій, причому їх можна співвіднести з двома основними доменами білкової молекули. N-кінцева частина є гідрофільної і локалізована з цітоплазматі-технічну сторону еритроцитарної мембрани. Вона містить місця зв'язування для компонентів цитоскелету, а також для ферментів гліколізу і гемоглобіну. Цей домен можна видалити шляхом протеолізу, не торкнувшись С-кінцевого домену, який залишається зв'язаним з мембраною та опосередковує С1 "/ НСО _е. ~ обмін, а також утворює канал в мембрані, через який може проникати вода. Внецітоплазматіческій компонент цієї частини білка містить також вуглеводні антигенні детермінанти кількох систем груп крові. У мембрані білок смуги 3 знаходиться у формі димеру або тетрамера.

Було проведено клонування і секвенування ділянки кДНК, що кодує білок смуги 3 з еритроцитів миші. Ці дані послужили основою для побудови моделі білка смуги 3. Було висловлено припущення, що він має 12 трансмембранних а-спіралей, при цьому деякі з них є ам-фіфільнимі. Експериментальні дані, що підтверджують цю гіпотезу, отримані тільки для декількох ділянок поліпептиду і грунтуються головним чином на результатах протеолізу та локалізації пов'язаних вуглеводів.

Великі кінетичні дослідження узгоджуються з моделлю з чергуванням конформації і одним місцем зв'язування. Однак швидкість рівноважного аніонного обміну за допомогою переносника щонайменше в 10 ⁴ разів перевищує швидкість транспорту як такого. Отже, незавантажений переносник не зазнає швидких конформаційних перетворень, необхідних для того, щоб аніон міг зв'язатися з мембраною. За даними ЯМР з використанням ³⁵ С1, у переносника є єдине місце зв'язування, і воно може бути звернено як всередину, так і назовні. Результати дослідів з використанням ігнібіторов транспорту теж свідчать про те, що в каналі є єдине місце зв'язування аніону, локалізоване десь в середині каналу. При цьому передбачається, що перехід цього місця зв'язування з одного боку мембрани на іншу блокується таким собі «ковзним бар'єром», який переміщається уздовж каналу в результаті конформаційних змін. Лімітуючою стадією є конформаційний перехід навантаженого переносника, але відбувається він досить швидко, з частотою ¹⁰ травня з ~ ¹ при 37 ° С. Мабуть, така висока швидкість запобігає значні конформаційні зміни в білку. Природа цього конформаційного переходу і точна структура каналу експериментально не визначені.

Конформаційний перехід завантаженого переносника, лімітуючий весь транспортний процес, лише в дуже малому ступені залежить від мембранного потенціалу. Це узгоджується з таким кон-формаційних переходом, в результаті якого через мембрану переміщається 0,1 пов'язаного з білком заряду. Якщо цей перехід пов'язаний з переміщенням аніонного субстрату, то він повинен супроводжуватися перенесенням протівоіона, наприклад зарядженої амінокислотної групи. На відміну від цього потенціалзалежне конформационное зміна, індукуюча відкривання натрієвого каналу, призводить до результуючою переміщення через мембрану шести пов'язаних з білком зарядів.

ГРУПА Мітохондріальна Переносники

Гомологічною деяких транспортних білків внутрішньої мітохондріальної мембрани свідчить про їх близьку спорідненість: цілком ймовірно, вони походять від спільного предка в результаті дивергентной еволюції. / ATP -транслоказа; 2) переносчик фосфата и 3) разобщающий белок. Є щонайменше три представники цієї групи: 1) ADP / ATP-транслоказа; 2) переносник фосфату і 3) роз'єднувальний білок. / ATP -транслоказа катализирует транспорт ADP и АТР через бислой. У структурі цих білків є багато спільного, і тим не менш оіі істотно розрізняються за субстратної специфічності. ADP / ATP-транслоказа каталізує транспорт ADP і АТР через бішар. При фізіологічних умовах АТР транспортується з мітохондрій, a переносится в матрикс. ADP переноситься в матрикс. , и поэтому обмен зависит от трансмембранного электрического потенциала на митохондриальной мембране. Механізм цього процесу, мабуть, аналогічний такому для білка смуги 3, за винятком того, що АТР несе на один негативний заряд більше, ніж ADP, і тому обмін залежить від трансмембранного електричного потенціалу на мітохондріальній мембрані. . Переносник фосфату здійснює одночасно і сімпорт Н ^+, і, по-видимому, механізм його роботи схожий з описаним раніше механізмом для Н ^{+-лактозопермеа-зи} з Є. coli. Цей білок каталізує транспорт фосфату всередину мітохондрій. Завдяки сімпорту Н ⁺ процес в цілому є електронейтральний і не залежить від трансмембранного потенціалу. Роз'єднувальний білок був виявлений в мітохондріях з клітин бурого жиру ссавців; його функція полягає в дисипації протонного електрохімічного градієнта, створюваного при функціонуванні дихальної ланцюга, у результаті чого генерується тепло. ~, так что, может быть, на самом деле он катализирует транспорт ОН ~, который невозможно экспериментально отличить от транспорта Н ⁺ . Роз'єднувальний білок може також каталізувати транспорт аніонів, наприклад CI ~, так що, може бути, насправді він каталізує транспорт ОН ~, який неможливо експериментально відрізнити від транспорту Н ^+. Цей переносник зв'язується з нуклеотидами, які інгібують транспорт, і його робота може регулюватися жирними кислотами.

Всі три переносника, а можливо, ще й а-кетоглутарат/малат-транслоказа, мають подібну будову; цей висновок був зроблений на основі даних про їх амінокислотної послідовності. Всі вони мають мовляв. масу близько 33 000 Та й складаються з трьох гомологічних доменів, кожен з яких містить ~ 100 амінокислот. По всій імовірності, ці три домени утворилися в результаті потроєння єдиного гена. Була побудована модель, згідно з якою кожен з гомологічних доменів двічі перетинає мембрану, а вся субодиниця містить шість трансмембранних а-спі-ралей. З цією моделлю узгоджуються дані по хімічній модифікації. Відзначимо, що така структура має багато спільного з Na / ATP -транслоказа является димером и, по-видимому, содержит единственный канал, по которому осуществляется транспорт. ^{+-Каналом,} що складається з чотирьох споріднених гомологічних доменів. ADP / ATP-транслоказа є димером і, мабуть, містить єдиний канал, по якому здійснюється транспорт. Такий висновок грунтується на результатах досліджень щодо зв'язування інгібіторів з високою спорідненістю.

Кілька прикладів активних переносників, що використовують енергію гідролізу АТР або фосц'оенолпірувата

Зробимо декілька зауважень, що стосуються первинних активних переносників. Охарактеризовано досить багато систем, за допомогою яких відбувається поєднання транспорту тих чи інших речовин через мембрану з гідролізом макроергічних фосфатних зв'язку або з іншого реакцією, в ході якої вивільняється енергія. Ми не прагнемо дати докладний аналіз великої літератури з даного питання, а хочемо лише відзначити деякі основні особливості будови та механізму роботи цих транспортних систем в контексті того, що ми вже дізналися про інші групи транспортних білків.

Як ми вже відзначали, в основі кінетичних моделей багатьох первинних активних транспортних систем лежить концепція чергування конформаційних змін. При цьому зовсім необов'язково, щоб реакція, в ході якої вивільняється енергія, наприклад реакція гідролізу АТР, була прямо пов'язана з конформаційним переходом, необхідним для транспорту, як це показано на рис. 8.2; важливо лише, щоб таке сполучення існувало з однією або кількома стадіями кінетичного циклу. Вимоги, що пред'являються до структури трансмембранного «каналу» первинного активного переносника, аналогічні таким для інших переносників, але тут виникає додаткова складність - необхідність контролю сполучення хімічної реакції, в ході якої вивільняється енергія, і транспорту розчинної речовини.

Про молекулярній структурі первинних активних транспортних систем відомо навіть менше, ніж про транспортні білках. Ідентифікувати групи споріднених переносників, близьких за будовою і механізму роботи, допомагають дані про їх амінокислотної послідовності, яких стає все більше. Проте достовірні дані про те, яке будова ділянок, безпосередньо залучених в транспорт речовин, відсутні. В основі різного роду структурних моделей активних переносників лежить припущення про те, що трансмембранний канал, через який транспортуються речовини, утворений кластером трансмембранних амфіфільних а-спіралей. Подібним чином і моделі, які описують сполучення хімічних реакцій і транспорту речовин, спираються на досить нечисленні експериментальні дані. Моделі пари можна розділити на дві головні групи. Відповідно до моделі прямого сполучення, хімічна реакція безпосередньо впливає на перенесення речовини, що транспортується, причому цей процес не вимагає значних опосередкованих білком конформації-онних змін. Наприклад, протони, які беруть участь у гідролізі АТР, могли б бути саме тими іонами, які транспортуються через мембрану в ході даної реакції. Для цього необхідно, щоб ділянка комплексу, де протікає хімічна реакція, і ділянка зв'язування речовини, що транспортується були розташовані дуже близько один до одного. На відміну від цього в моделі непрямого сполучення хімічна реакція впливає на транспортний процес через опосередковані білком конформаційні зміни. Допускається навіть, що хімічна реакція і активний транспорт можуть бути пов'язані з різними субодиницями всередині комплексу. Ці моделі мають ту перевагу, що з їх допомогою неважко пояснити транспорт різних речовин одними і тими ж або близькородинними білками за участю одних і тих самих механізмів.

Активні транспортні системи функціонують зі швидкостями, типовими для багатьох ферментів, тобто 10 ² -10 ³ з ^"1 в ​​умовах насичення. На відміну від канальних білків селективність відносно субстрату обумовлюється головним чином спорідненістю речовини, що транспортується до активного переносники. Більш того, більшість первинних активних переносників зазвичай функціонує в умовах, коли концентрація стерпного речовини з # ис-сторони близька або трохи перевищує Км і лімітуючою стадією транспорту є конформаційний перехід білка або хімічна реакція, що служить джерелом енергії для даної системи.

І нарешті, роль первинних активних транспортних систем полягає у переміщенні речовини через мембрану проти його концентраційного градієнта в одному напрямку. Оскільки переносник після вивільнення речовини, що транспортується повинен знову змінити свою орієнтацію з транс на цис, необхідний якийсь механізм, що перешкоджає поверненню на цис-бік завантаженого переносника. Отже, спорідненість активного переносника до транспортованого речовині має бути | вище з г / ис-сторони, ніж з т/7Анс-сторони. /юнс-стороны. Якби це було не так, переносник працював би дуже неефективно при високих концентраціях субстрату з m / Юнс-сторони. У такій реакції енергія витрачається головним чином на зміну спорідненості переносника до транспортованого речовини. Наприклад, фосфорилювання Na ⁺ / К ^{+-АТРази} або Са-АТРази за допомогою АТР веде до стабілізації конформації тих переносників, у яких місце зв'язування іонів звернуто назовні і які мають низьку спорідненість відповідно до Na ⁺ Або Са ^{2 +.} У той же час зв'язування АТР стабілізує ту форму Na ⁺ / К ^{+-АТРази,} в якій місця зв'язування іонів, звернені до цитоплазми, мають низьку спорідненість до К *. Отже, механізм сполучення реакції, в ході якої вивільняється енергія, і транспорту, катализируемого активними переносниками, краще за все розглядати виходячи з термодинамічних принципів, тобто як тимчасову стабілізацію певних конформації і зміна спорідненості до транспортованого речовини.

Можна виділити п'ять груп переносників, які використовують вільну енергію макроергічних фосфатних зв'язків для здійснення транспорту речовин, тобто Природа знайшла кілька шляхів вирішення цього завдання.

Переносники КАТІОН Цитомембрана: АТР-Залежні іонні насоси

Кілька про-та еукаріотичних іонпереносящіх АТРази складають єдине сімейство і володіють схожими амінокислотними послідовностями і механізмами перенесення іонів. Найбільш повно охарактеризовано Na ⁺ - ATPa 3 a из плазматической мембраны животных клеток и Са ^{2 +} / K ⁺ - ATPa 3 a з плазматичної мембрани клітин тварин і Са ^{2 +-АТРази} з сар-коплазматіческого ретикулуму. Більшість ферментів цієї групи представляють собою єдиний поліпептид з мовляв. масою 100 000; виняток становить Na ⁺ / К ^{+-АТРази,} виділена з декількох джерел, яка містить другу, меншу субодиницю з невідомою функцією. Ці переносники інгібі-ються ванадатів і прямо фосфорилюються АТР з утворенням фосфорильованого інтермедідата, що грає важливу роль в транспорті. Катіонні переносники цієї групи значно різняться за іонної специфічності. Неоднакова і стехіометрія транспорту. Наприклад, Са ^{2 +-АТРази} переносить 2Са ^{2 +} /К ⁺ -АТРаза переносит 3 Na ⁺ наружу и 2К ⁺ в цитоплазму через плазматическую мембрану. ⁺ / АТР в порожнину саркоплазматичного ретикулуму, в той час як Na ⁺ / К ^{+-АТРази} переносить 3 Na ⁺ назовні і 2К ⁺ в цитоплазму через плазматичну мембрану. При цьому відмінності в роботі АТРази стосуються не тільки стехіометрії і природи переносимих іонів, але також і того, що Са ^{2 +-АТРази} здатна переносити іони лише в одному напрямку, в той час як Na ⁺ -АТРаза делает это в обоих направлениях. ⁺ / K ^{+-АТРази} робить це в обох напрямках.

Назва «фермент Е1Е2-ТІГЩ» було введено в роботі, присвяченій Na ⁺ / К ^{+-АТРази.} Як показали дослідження, цей білок існує щонайменше у двох розрізняються конформаціях, для яких характерні різний зв'язування субстратів і неоднакова схильність м'якому протеолізу. Форма Е, відповідає конформації, в якій місця зв'язування іонів звернені у бік цитоплазми і яка володіє високою спорідненістю до АТР. Місця зв'язування іонів у фосфорильованій формі Е ₂ звернені назовні. На рис. 8.12 зображений транспортний цикл, у якому беруть участь дві ненавантажені форми переносника і дві навантажені, Е ₂ 3 , со «спрятанными» внутри насосного комплекса ионами. _{CBCM 3,} зі «схованими» всередині насосного комплексу іонами. Вивчення зв'язування К ⁺ фосфорильованій формою переносника показало, що воно відбувається в двох різних місцях.

Відзначимо основні особливості каталітичного циклу.

1. -форма связывает три иона Na ⁺ с цитоплазматической стороны мембраны и затем взаимодействует с АТР, образуя фосфори-лированный фермент. Ei-форма пов'язує три іона Na ⁺ з цитоплазматичної сторони мембрани і потім взаємодіє з АТР, утворюючи фосфор-ваною фермент. Фосфорилюється при цьому специфічний ас-партат, консервативний в цій групі ферментів.

2. ионы оказываются «спрятанными» внутри комплекса. Після від'єднання ADP іони виявляються «захованими» всередині комплексу.

3. Фосфорилювання білка стабілізує конформацію з низькою спорідненістю до Na ^+; При цьому місця зв'язування іонів звернені назовні. - P -» Ег-Р, в результате которого и осуществляется перенос. Це сприяє переходу Ei - P - »Ег-Р, в результаті якого і здійснюється перенесення.

4. У формі Ег-Р місця зв'язування іонів звернені в позаклітинне середовище; ця конформація володіє високою спорідненістю до К ^+, який пов'язується, каталізує дефосфорілірованіе і залишається «захованим» всередині комплексу. ⁺ необходим для быстрого фосфорилирования, а К ⁺ — для быстрого дефосфорилирования. Зверніть увагу, що Na ⁺ необхідний для швидкого фосфорилювання, а К ⁺ - для швидкого дефосфорилювання. Ванадат зв'язується з формою Е _2, можливо, як якийсь аналог перехідного стану фосфату. В інших ферментів Е ^ г-типу, наприклад Са ² , которая в свою очередь переходит в незагруженную форму. ^{+-АТРази,} форма Ег-Р дефосфорилюється і переходить у форму Ei, яка в свою чергу перетворюється на незавантажених форму.

1. Лімітуючою стадією каталітичного циклу є, по всій вірогідності, звільнення К ⁺ і перехід його з пов'язаного з ферментом стану у вільний. Цей процес стимулюється зв'язуванням АТР з сайтом, які мають низьку спорідненість. Отже, АТР виконує дві різні функції, виступаючи в якості субстрату і аллостеріческого ефектора. Скільки місць зв'язування АТР має фермент, поки неясно.

⁺ /К ⁺ -АТРазу из не- Визначено амінокислотна послідовність кількох АТРази Е | Є _2-типу, включаючи Na ⁺ / К ^{+-АТРази} з не-

скількох джерел, Са ^{2 +-АТРази,} Н ^{+-АТРази} з плазматичної мембрани дріжджів і Neurospora crassa . faecalis . і К ^{+-АТРази} з S. faecalis. Виходячи з профілів гідрофобності, були побудовані моделі, згідно з якими ці білкові комплекси мають 6, 8 або 10 трансмембранних а-спіральних сегментів. Деякі ділянки поліпептидів, в тому числі і сегмент; містить сайт фосфорилювання, в значній мірі гомологічних. Всі білки мають велику гідрофільну петлю, яка містить домени, з якими, ймовірно, зв'язуються нуклеотиди і де відбувається фосфор-лювання.

У Са ² *-АТРази один розщеплюється трипсином сайт, чутливий до конформаційний перехід Е | - ♦ Ег, перебуває в «трансдукціонном» домені. Досліджувався також зв'язування Са ^{2 +} з ферментом; було висловлено припущення, що транспорту Са ^{2 +} передує зв'язування двох іонів Са ^{2 +} з певними ділянками всередині білкового комплексу. По всій імовірності, у Са ^{2 +-АТРази} місця зв'язування Са ^{2 +} З високою спорідненістю розташовуються на значній відстані від місця зв'язування нуклеотидів, проте цю гіпотезу потрібно ще перевірити. Основні особливості будови Са ^{2 +-АТРази,} представлені на рис. 8.13, узгоджуються з даними електронної мікроскопії, згідно з якими цей білковий комплекс сильно виступає з бішару в цитоплазму. Ймовірно, в умовах in АТРазы Е|Ег-типа агрегируют, образуя по меньшей мере димеры, но подтвердить данное предположение экспериментально очень трудно. vivo АТРази Е | Ег-типу агрегує, утворюючи щонайменше димери, але підтвердити це припущення експериментально дуже важко. Тим не менш очевидно, що мономери також здатні до каталізу, принаймні в деяких випадках.

Визначено амінокислотна послідовність меншою @-субодиниці Na ⁺ / К ^{+-АТРази.} Було висловлено припущення, що ця субодиниця має одну або чотири трансмембранні а-спіралі.

На закінчення відзначимо, що завдяки легкості клонування цих мембранних АТРази та можливості використання різних експериментальних підходів ці системи є чудовим об'єктом для застосування до них спрямованого мутагенезу та інших генетичних методів. -АТРаз. Подібні методи вже застосовуються в дослідженнях FiFo-АТРази.

-ТИПА ИЗ МИТОХОНДРИЙ, ХЛОРОПЛАСТОВ И БАКТЕРИИ АТРази Fq-ТИПУ З мітохондрій, хлоропластів та БАКТЕРІЇ

-типа, которые используют трансмембранный протонный электрохимический градиент для синтеза АТР из ADP и неорганического фосфата. Більшість бактерій, а також мітохондрії і хлоропласти містять родинні АТРази FiFo-типу, які використовують трансмембранний протонний електрохімічний градієнт для синтезу АТР з ADP і неорганічного фосфату. У фізіологічних умовах ці ферменти є АТР-синтази. ₂ - THna из плазматических мембран. Вони містять від 8 до 13 різних субодиниць і, таким чином, є набагато більш складними структурами, ніж АТРази EiE ₂ - THna з плазматичних мембран. -типа состоят из двух частей: 1) гидрофильного глобулярного Fi -комплекса, содержащего места связывания нуклеотидов и функционирующего в качестве АТРазы, и 2) мембраносвязанного Fo - kom - плекса, который функционирует как Н ⁺ -проводящий канал. F |- и Fo -комплексы могут отсоединяться друг от друга, а после очистки их можно реконструировать с восстановлением функциональной активности. АТРази FiFo-типу складаються з двох частин: 1) гідрофільного глобулярного Fi-комплексу, що містить місця зв'язування нуклеотидів і функціонуючого в якості АТРази, і 2) мембранозв'язаних Fo - kom - плексу, який функціонує як Н ^{+-провідний} канал. F | - і Fo-комплекси можуть від'єднуватися один від одного, а після очищення їх можна реконструювати з відновленням функціональної активності.

-комплекс из Е. coli Fi-комплекс з Є. coli / Sj - yot . містить п'ять субодиниць в стехіометрії m / Sj - yot. наблюдается асимметрия, возникающая, по всей вероятности, в результате асиммет ричиых взаимодействий с другими субъединицами. Між трьома парами а $ у складі Fi спостерігається асиметрія, що виникає, ймовірно, в результаті асіммет річіих взаємодій з іншими субодиницями. У складі кожного комплексу є по три каталітичних центру, і для швидкого обороту ферменту необхідно, щоб АТР був пов'язаний більш ніж з одним місцем зв'язування. Для пояснення механізму каталізу були побудовані різні моделі з чергуванням місць зв'язування, зокрема модель, згідно з якою в ході каталізу відбувається фізичне обертання частин ферменту. - и Fo -компонентов фермента в мембране участвуют 5- и е-субъединицы. Можливо, у зв'язуванні Fi - і Fo-компонентів ферменту в мембрані беруть участь 5 - та е-субодиниці.

-комплекс из фермента Е. coli Fo-комплекс з ферменту Є. coli влаштований досить просто, він містить лише три субодиниці в стехіометрії а \ ЬгСю. Всі ці субодиниці необхідні для формування Н ^{+-провідного} каналу. образована а-спиралями из множественных копий с-субъедииицы. Вважають, що Н ^{+-провідна} частина Fo утворена а-спіралями з множинних копій з-суб'едіііци. По всій імовірності, ця субодиниця містить п'ять трансмембранних а-спіралей, в той час як а-і Ь-субодиниці - по одній. Результати, отримані за допомогою генетичних методів, узгоджуються з припущенням, згідно з яким занурені в мембрану частини всіх трьох субодиниць грають важливу роль у забезпеченні протонної провідності.

Вивчення цієї системи показує нам, наскільки успішним може бути застосування генетичних методів для дослідження будови мембранних білків, для яких відсутні кристалографічні дані високої роздільної здатності. Дуже важливо з'ясувати, чи приводить заміна єдиною амінокислоти в такому білку до конфор-Інформаційним змін, які позначаться на каталізі. Мабуть, результат такої заміни сильно залежить від природи переносника. Наприклад, як ми вже обговорювали, дуже обнадійливими в цьому відношенні є дані, отримані для лактоеопермеази. Очевидно, в наступному десятилітті у вивченні взаємозв'язку між структурою і функцією мембранних білків головну роль будуть грати різні генетичні методи, зокрема спрямований мутагенез.

-АТРазы из Е. coli . Розглянемо результати, прлученние до теперішнього часу для FiFo-АТРази з Є. coli.

1. Наявність численних мутантних по £ - субодиниці форм дозволяє ідентифікувати ділянку, яка є, по всій вірогідності, каталітичним нуклеотідсвязивающім доменом. Дослідження мутантних форм показало також, що між а-і / 3-субодиницями є конформационное сполучення.

2. АТРазной активностью, а также к связыванию комплексов F , и Fo . Показано, що мутантні по е-субодиниці форми нездатні до об'єднання в пару транспорту Н ⁺ з каталізуються комплексом Fi АТРазною активністю, а також до зв'язування комплексів F, і Fo.

3. Показано, що певні амінокислотні залишки в субодиниці А, Ь і з опосередковує протонну проникність; наявні генетичні дані дозволяють припустити, що субодиниця b безпосередньо контактує в мембрані з субодиницями а та с.

Чи пов'язані всі ці явища з локальними або глобальними конформаційними змінами, покажуть подальші дослідження. -типа, а также с чем связана протонная проводимость. Поки ж ми не може сказати точно, як відбувається сполучення гідролізу АТР та транспорту Н ⁺ при роботі АТРази FiFo-типу, а також з чим пов'язана протонна провідність.

Важливими в цьому відношенні можуть виявитися дані про те, що цитоплазматична мембрана анаеробної бактерії Propionigenium modestum ⁺ -зависимую АТРазу FiF ^ vrHna . містить Na ^{+-залежну} АТРази FiF ^ vrHna. ⁺ -насос, то логично предположить, что механизм функционирования Н ⁺ -АТРазы и Na Якщо цей фермент працює як первинний АТР-залежний Na ^{+-насос,} то логічно припустити, що механізм функціонування Н ^{+-АТРази} та Na ^{+-АТРази} однаковий. Наприклад, це дозволить виключити моделі прямого сполучення.

ТРИ ІНШИХ КЛАСУ Переносники

| Fo -типов есть еще три класса активных переносчиков, использующих свободную энергию гидролиза макроэргических фосфатных связей. Крім АТР-залежних активних переносників Е1Е2-і F | Fo-типів є ще три класи активних переносників, що використовують вільну енергію гідролізу макроергічних фосфатних зв'язків. Про реальні механізми транспорту або сполучення в цих системах відомо небагато. Відзначимо кілька цікавих їх особливостей.

1. Бактеріальні фосфотрансферази. Цей комплекс був виявлений тільки в бактеріях; він каталізує транспорт Сахаров, таких, як глюкоза і манітол. Унікальною особливістю цієї системи є те, що транспорт цукру супроводжується його фосфорилюванням. Отримувана фосфатне похідне цукру вже не може служити субстратом для переносника в бактеріальної мембрані, і таким чином запобігає зворотний потік цукру через цю систему. 2 - THna фосфорилирование переносчика стабилизирует форму с низким сродством к переносимому веществу, что также препятствует обратному переносу транспортируемых веществ. Згадаймо, що в переносниках EiE 2 - THna фосфорилювання переносника стабілізує форму з низькою спорідненістю до переносимості речовини, що також перешкоджає зворотному переносу речовин, що транспортуються.

Кінцевим донором фосфату в фосфотрансферазной системі є фосфоенолпіруват. Фосфат переноситься специфічної послідовністю розчинних фосфорильованих інтермедіа-тов в цитоплазму до мембранозв'язаних транспортного білку, званому фермент II або ОІ. Існує група ферментів ЕП-типу, специфічних до різних цукрів, але володіють схожою первинною структурою. По всій імовірності, всередині мембрани ферменти ЕП-типу утворюють димери. Висловлювалося припущення, що вони формують канали. Ці білки чутливі до реагентів, що діють на сульфгідрильні групи, і до окислення, що може грати важливу роль в умовах in . vivo. Трохи відомо про те, яким чином фосфорильовані ферменти ЕП-типу здійснюють транспорт і фосфорилювання Саха рів. Розумною представляється модифікована модель з чергуванням конформації і єдиним місцем зв'язування.

2. Бактеріальні періплазматіческіе транспортні системи. На додаток до систем сімпорта і фосфо-трансферазной системі бактерії мають ще одну систему активного транспорту розчинних речовин, яка використовується для різних амінокислот і Сахаров. Так, охарактеризовано системи, специфічні до гістидину і мальтози. На жаль, біохімічні дані, які могли б доповнити інтенсивні генетичні дослідження мембранозв'язаних компонентів цих систем, вельми нечисленні. Унікальною особливістю цих систем є те, що вони містять субстратспеці-фічние зв'язуючі білки, локалізовані в періплазматіче-ському просторі. Роль цих білків полягає у зв'язуванні стерпного речовини і подальшої передачі його власне транспортує системі цитоплазматичної мембрани. Специфічність системи визначається як зв'язуючими білками, так і мембранозв'язаних компонентами. Цитоплазма етичний мембранний компонент містить три субодиниці, дві з яких є трансмембранних білків, а третя, ймовірно, міцно пов'язана з цитоплазматичною стороною мембрани. Як виявилося, цей третій компонент транспортного комплексу содер жит місце зв'язування нуклеотидів, де, як передбачається, відбувається гідроліз АТР - реакція, що є рушійною силою активного транспорту. Однак прямі дані, що підтверджують цю гіпотезу, відсутні. Практично нічого не відомо про механізм транспорту, за винятком того, що для нього необхідний розчинна зв'язуючий білок.

По всій імовірності, ця система аналогічна транспортній системі ссавців, яка використовується ними для виведення з клітини небажаних лікарських речовин і забезпечує множинну лікарську стійкість. Мабуть, транспорт різних лікарських речовин єдиною транспортною системою опосередковується групою НЕМЕМБРАННИХ зв'язуючих білків. Подібне припущення висловлювалося щодо кодируемой плазмидой бактеріальної транспортної системи, яка виводить з клітин арсенати. Передбачається, що ці системи також використовують гідроліз АТР в якості дже ника енергії, однак це не було прямо продемонстровано.

3. Вакуолярно Н ^{+-АТРази.} В еукаріотичних клітинах є Н ^{+-АТРази,} локалізовані в мембранах різних внутрішніх органел. -, 'так и Е|Ег-типов. Ці АТРази відрізняються від АТРази як FiFo -, 'так і Е | Ег-типів. У деяких випадках функцією Н ^{+-АТРази} є транспорт протонів всередину тієї чи іншої органели для закислення її вмісту. Наприклад, відомо, що низький рН в ендоцітозних бульбашках необхідний для від'єднання лігандів від їх рецепторів, що відбувається слідом за ендоцитозу. Хоча достовірні дані про структурний спорідненість цих Н ^{+-АТРази} поки не отримані, відомо, що всі вони 1) містять більше однієї субодиниці, 2) не утворюють фосфорильованого інтермедіату, 3) нечутливі до ванадат; 4) транспортують Н ^+. Проте всі ці питання вимагають додаткових біохімічних і структурних досліджень.

Активні транспортні системи, пов'язані з процесом перенесення електронів або поглинанням світла

Є декілька цікавих прикладів активних транспортних систем, які використовують для своєї роботи зміна окислювально-відновного стану пов'язаної з білком просте-тичної групи або енергію світла, що поглинається простетичної групою. У цілому транспорт і в цьому випадку підпорядковується закономірностям, що обговорювалося раніше. Для його здійснення потрібно стабілізувати якусь нестабільну форму білка, яка є необхідною проміжною сполукою у транспортному циклі. Способи стабілізації можуть бути різними: фосфорилювання білка або навіть зв'язування АТР, про що ми вже говорили.

Цитохром с-оксидази: протонів редокс-НАСОС

Цей білок є найбільш яскравим прикладом ферменту, який, функціонуючи як іонний насос, сполучає іонний транспорт і реакції перенесення електронів. Оксид аза каталізує окислення цитохрому с, локалізованого в міжмембранну просторі мітохондрій, і відновлення Ог до води. У цій реакції беруть участь чотири іоіа Н ⁺ на кожну молекулу Ог; протони надходять з матриксу мітохондрій. Соотвтетствеіно на кожен електрон, що проходить через систему, через внутрішню мітохон-дріальную мембрану переноситься щонайменше один протон. Фермент містить дві простетичні групи гема а, а також два або три атома міді і один атом цинку. Цитохром з-оксидаза - дуже консервативний фермент, що мало змінився в ході еволюції. Ферменти, подібні до мітохондріальної цитохром с-оксидазой, виявляються в багатьох бактеріях. Субодиничний складу комплексу сильно варіює: він містить від двох субодиниць у деяких бактерій до 12 в оксидазі мітохондрій серця бика. По всій імовірності, в перенесенні Н ⁺ безпосередньо бере участь одна субодиниця, в.о. остаточно це питання ще не з'ясований. Згідно з даними електронної мікроскопії, окси-Даза не тільки пронизує бішар, іо і виходить на зовнішню поверхню мембрани. На жаль, до цих пір остаточно не встановлено не лише механізм іонного транспорту, але і розташування простетических груп у ферменті.

Для опису роботи оксидази можна використовувати дуже просту модель чотирьох станів. У цій моделі постулюється, що місце зв'язування Н ⁺ є з одного боку мембрани, коли іон металу в складі простетичної групи відновлений, і звернено до протилежної сторони мембрани, коли він окислен. Значення рК в окисленому і відновленому станах також можуть різнитися. Істотно, що в ході реакцій переносу електронів відбувається почергова стабілізація двох конформації ферменту, в яких місце зв'язування Н ⁺ звернено до різних сторін мембрани. Однак механізм цього явища на молекулярному рівні не встановлено.

⁺ . На закінчення слід зазначити, що існує щонайменше один приклад редокс-залежного транспорту Na ^+. Це означає, що такого роду системи не обмежуються перенесенням тільки іонів Н ^+.

Бактеріородопсин: Н ⁺ насосів, що використовують ЕНЕРГІЮ СВІТЛА

Функція бактериородопсина полягає в активному транспорті протонів через бактеріальну цитоплазматичну мембрану. Поглинання світла пов'язаної простетичної групою ретиналя запускає послідовність подій, які піддаються реєстрації оптичними методами. Ці реакції пов'язані з перенесенням двох Н ⁺ на кожен цикл роботи комплексу. ~. Галородопсін, білок з тієї ж бактерії, використовує аналогічний механізм для активного транспорту CI ~. По всій імовірності, мономерна форма бактериородопсина є самостійною функціональною одиницею, хоча всередині мембрани він перебуває у вигляді тримера. Показано, що ретиналь локалізована приблизно в середині бішару. Передбачається, що для нього характерний прямий механізм сполучення. Структура білка з сімома паралельними а-спіралями, що пронизують мембрану, не дає відповіді на питання про існування якого б то не було каналу. Як іон Н ⁺ досягає ретина-ля - невідомо, але, без сумніву, це одне з питань, який можна буде вирішити, використовуючи методи сайт-специфічного мутагенезу.

У лабораторії Корани за допомогою сайт-специфічного мутагенезу були отримані численні мутантні форми бактериородопсина. Виявилося, що більшість з них, в тому числі і з заміщенням кожного з 11 залишків тирозину, зберігають нормальну чи близьку до нормальної транспортну активність. Ці дані служать ще однією ілюстрацією використання генетичних методів дослідження структури і механізму дії білкового комплексу.

Мембранні пори, створювані екзогенними агентами

Ми розглядали процеси регуляції клітиною потоків речовин через мембрану за допомогою різних ендогенних транспортних систем. Однак в умовах in поры в биомембранах могут образовываться с помощью экзогенных веществ, а также под влиянием различных воздействий. vivo пори в біомембранах можуть утворюватися за допомогою екзогенних речовин, а також під впливом різних впливів. Багато пептиди і білки, створюючи неселективні пори в плазматичної мембрани клітини-мішені, вбивають клітину. Ми розглянемо різні способи утворення пор в біомембранах під дією специфічних агентів або фізичних факторів.

ТОКСИНИ-І цитолітичну БІЛКИ

У природі існують різні водорозчинні токсини, що взаємодіють зі специфічними клітинами-мішенями. Як мінімум, токсини повинні пізнавати певні рецептори на зовнішній поверхні мембрани і якимось чином проникати в цитоплазму. Одні токсини сприяють вивільненню в цитоплазму ферменту, який надає летальну дію, інші просто утворюють в мембрані неселективні пори, даючи можливість метаболітам, іонів, а іноді і макромолекулам вийти з клітки. Найбільш цікавим є питання про те, як ці водорозчинні гідрофільні білки спонтанно вбудовуються в мембранний бішар. Розглянемо основні властивості деяких з токсинів, що утворюють пори в біомембранах.

1. . Наиболее полно к настоящему времени охарактеризованы колицины Е1 и А. Очищенные белки спонтанно формируют в плоских мембранах потенциалзависимые каналы, достаточно большие, чтобы пропускать такие молекулы, как NAD ⁺ . Коліціни представляють собою поодинокі поліпептиди, і деякі з них утворюють неселективні канали в цитоплазматичній мембрані чутливих штамів Е. coli. Найбільш повно до теперішнього часу охарактеризовано коліціни Е1 і А. Очищені білки спонтанно формують в плоских мембранах потенціалзалежні канали, досить великі, щоб пропускати такі молекули , як NAD ^+. Нещодавно був виділений і охарактеризований каналообразующей ділянка, яка перебуває на С-кінці коліціна Е1. Його амінокислотна послідовність відмінна від такої у інтегральних мембранних білків. Під дією напруги відбувається перехід утвореною коліціном Е1 пори з відкритого стану в закрите, що супроводжується перенесенням через мембрану значної кількості білка. Пору утворює лише одна молекула коліціна.

2. Дифтерійний токсин є одиночним поліпетід, також продукується бактеріями, який при зв'язуванні з поверхневими рецепторами певних клітин утворює у мембрані канал і вивільняє в цитоплазму фермент, який надає летальну дію. Один фрагмент токсину формує в мембрані пори, розмір яких досить великий, щоб через них міг пройти сегмент токсину, що володіє ферментативною активністю. Однак остаточно не доведено, що саме такий механізм переносу. Схожі результати були отримані і для токсинів, що викликають правець та ботулізм. Холерний токсин складається з двох субодиниць, при цьому субодиниця У утворює у мембрані олігомер з центральним каналом, який використовується для перенесення А-субодиниці, яка має ферментативною активністю. , близкого по строению к дифтерийному токсину, что,однако, не помогло выяснить механизм спонтанного встраивания этого растворимого белка в мембрану и образования поры. За допомогою рентгенівської кристалографії була встановлена ​​структура екзотоксину А з Pseudomonas, близького за будовою до дифтерійного токсину, що, однак, не допомогло з'ясувати механізм спонтанного вбудовування цього розчинного білка в мембрану і освіти пори.

3. Комплекс комплементу і пороутворюючих білків з цито-токсичних Т-клітин. Ці родинні білки сироватки агрегує, утворюючи великі пори в мембрані клітин-мішеней. Первинним компонентом цього комплексу є білок С9, який після декількох актів самозбірки за участю інших компонентів системи комплементу формує велику пору, в результаті чого відбувається лізис клітини. Цей білок інтенсивно вивчали з використанням модельних систем плоских мембран і ліпосом. Проте механізм формування пори на молекулярному рівні до цих пір невідомий.

. aureus . Известно, что он образует гексамерную структуру, претерпевающую при связывании с мембраной конформационные изменения. Прикладом іншого токсину, який агрегує в мембрані, утворюючи велику пору, є а-токсин з S. Aureus. Відомо, що він утворює гексамерні структуру, перетерпіти при зв'язуванні з мембраною конформаційні зміни.

ПЕРМЕАБІЛІЗАЦІЯ ЗА ДОПОМОГОЮ Детергент

Сапонін і дигітоніну взаємодіють з холестеролом всередині мембран і утворюють агрегати у вигляді великих пор. Ці агенти широко використовуються для формування більших отворів в плазматичних мембранах клітин, через які всередину клітин можуть проходити як невеликі молекули, так і макромолекули.

ПЕРМЕАБІЛІЗАЦІЯ ЗА ДОПОМОГОЮ осмотичного шоку

Під дією осмотичного шоку в мембранах утворюються отвори. Так, в мембрані еритроцита з'являється одне велике отвір діаметром ~ 1 мкм, розмір якого потім зменшується до 14 280 О. Кінцевий розмір залежить від складу буфера. Деталі формування та будови цього гемолітичного отвори невідомі.

ПЕРМЕАБІЛІЗАЦІЯ ПІД ДІЄЮ ЕЛЕКТРИЧНОГО ПОЛЯ

Пори в плазматичної мембрани клітин тварин можуть утворюватися і під дією електричного поля. Дослідження, проведені на тінях еритроцитів, показали, що поблизу катода відбувається формування нестабільних великих пір, які потім швидко зменшуються до 10 А. Освіта пір під дією електричного поля іноді використовують для ініціації злиття клітин. Чи пов'язано спостережуване пороутворення зі структурними змінами, що викликають злиття мембран, невідомо.

ПЕРМЕАБІЛІЗАЦІЯ ЗА РАХУНОК ОСВІТИ ДЕФЕКТІВ УПАКОВКИ МЕМБРАННИХ КОМПОНЕНТІВ

Будь-яка обробка, яка змінює упаковку ліпідів і білків в мембрані, може призвести до порушення функції мембрани як бар'єру для гідрофільних речовин. Наприклад, проникність ли-посом при температурі фазового переходу істотно підвищується, стаючи еквівалентної проникності пори діаметром 18 л. До аналогічного ефекту може призвести і агрегація білків як у реконструйованих протеоліпосомах, так і при перехресному зшиванні мембранних білків усередині біомембран. Ці явища навряд чи беруть участь в природних фізіологічних процесах, однак вони вказують на те, що якісь зміни в організації мембранних компонентів несумісні з функцією мембрани.

Резюме

Транспорт більшості розчинних молекул через біологічні мембрани опосередковується переносниками або канальними білками. Канали полегшують транспорт іонів через мембрану, і перенесення через них здійснюється дуже швидко. Такі високі швидкості транспорту іонів пов'язані з тим, що канальні білки не зазнають конформаційних змін при перенесенні іона з одного боку мембрани на іншу. Такий швидкий транспорт іонів обумовлює таку високу мембранну провідність, що вдається виміряти іонний струм через окремий канал. На відміну від цього переносники, які беруть участь у транспортному циклі, зазнають конформаційні зміни. При цьому місце зв'язування стерпного речовини буває звернено спочатку до однієї, а потім до протилежної сторони мембрани. Як правило, опосередкований переносниками транспорт речовин через мембрану відбувається на кілька порядків повільніше, ніж транспорт по каналах.

Пасивні переносники просто полегшують дифузію речовин через мембрану, в той час як активні використовують енергію для транспорту речовин проти концентраційного градієнта. Відомі активні переносники, що сполучають транспорт речовини з перенесенням електронів, гідролізом АТР або фосфоенолпіруват, поглинанням світла або спільним транспортом іона.

Існують групи каналів і переносників, які об'єднають ють функціонально розрізняються білки, що мають подібну будову. Близькість їх амінокислотних послідовностей дозволяє припустити, що, незважаючи на відмінності в субстратної специфічності, канали і переносники однієї групи можуть фукнціоніровать за схожим механізму. Мабуть, білкові комплекси образу ють в мембрані пору, що знаходиться в центрі білкового кластера, що містить декілька копій однакових або близькоспоріднених поліпептидів або доменів одного поліпептиду. Ці пори можуть відкриватися або закриватися у відповідь на хімічний або електричний сигнал.