Реферат
з біології
"Пептидні антибіотики тварин як біохімічні фактори протиінфекційного захисту"
2008
Пептиди, що здійснюють захист тварин від інфекції, широко представлені в природі від найпростіших до людини. Найбільш поширеним в еволюції типом антимікробних молекул є катіонні цістінсодержащіе поліпептиди. Найменшим за розмірами молекули представником цієї групи антибіотичних сполук є додекапептід з 1 дисульфідній зв'язком, виділений з нейтрофілів корів. Відкриті нами протегріни містять вже 2 дисульфідних містка, так само як і подібні до них сполуки з гемоцитів підковоподібного краба - тахіплезіни і гемолімфи скорпіона - андроктонін. - S -связи. Дефенсин людини, кролика, пацюки, миші та морської свинки, як і р-дефенсин корів і галлінаціни курей, містять у своєму складі 6 цистеїнових залишків, що утворюють 3 внутрішньомолекулярні S - S-зв'язку. -1 и eNAP -2 из нейтрофилов лошади, для структуры которых характерно наличие уже 4 дисульфидных групп. Замикають ряд, що розглядається антимікробні поліпептиди eNAP -1 і eNAP -2 з нейтрофілів коні, для структури яких характерна наявність вже 4 дисульфідних груп. Є підстави припускати, що дисульфідні зв'язки надають молекулам поліпептидів підвищену стійкість до перетравлює дії численних протеїназ лейкоцитарного і мікробного походження, забезпечуючи їх пролонговану функціонування як антибіотичних агентів при фагоцитозі і запаленні.
Слід підкреслити, що фагоцити і гемоцити є не єдиними клітинами організму, що містять дефенсин і структурно-родинні їм поліпептиди. Виявлено дефенсин в клітинах епітелію тонкої кишки мишей, кролика і людини, в епітелії трахеї та мови корів, у структурах сечостатевого і репродуктивного трактів людини.
Присутність дефенсин в клітинах слизової тонкого кишечника цікаво у зв'язку з уявленнями І.І. Мечникова про морфофізіологіческкх передумови формування фагоцитарної функції клітин в еволюції. Він розглядав фагоцитоз як антимікробну функцію спеціалізованих клітин організму, що виникла і розвинулася на основі травної активності цитоплазми. Антимікробна функція фагоцитів еволюційно виникла на основі здатності найпростіших поглинати і інактивувати бактерії, які є основним об'єктом їх живлення. Тому вже на зорі розвитку тварин перед ними стояло завдання інактивації потенційно патогенних мікроорганізмів, що є для них джерелом пластичних речовин і енергії. пептидов, структурно гомологичных NK -лизинам лимфоцитов, отражает генеральную линию развития механизмов противоинфекционной резистентности у животных. Є підстави припускати, що продукція найпростішим Entamoeba histolytica пептидів, структурно гомологічних NK-лізину лімфоцитів, відображає генеральну лінію розвитку механізмів протиінфекційного резистентності у тварин. В останні роки дефенсин описані і у вищих рослин, причому, незважаючи на наявність у них 4 дисульфідних зв'язків, вони мають вторинно-третинну структуру, подібну до такої дефенсин комах. Дані про єдність ряду молекулярних механізмів захисту від інфекції у тварин і рослин можуть служити свідченням спільності їх походження в еволюції.
Локалізація дефенсин в фагоцитах і клітинно-тканинних структурах організму, "прикордонних до інфекції", свідчить на користь їхньої участі у формуванні неспецифічної антимікробної резистентності в якості універсальних антибіотиків ендогенного походження. и стрекозы. Більш того, розглянутий молекулярний механізм захисту від мікробів є, мабуть, одним з найдавніших в еволюції тварин, оскільки поліпептиди дефенсіновой природи зустрічаються вже в гемолімфі імаго медоносної бджоли, личинок м'ясної мухи, жука Zophobas atratus і бабки.
Іншою поширеною в еволюції матрицею антибіотичних пептидів є цекропіни, виявлені спочатку в гемолімфі деяких комах, а пізніше в слизовій тонкого кишечнику свині. в лаборатории проф. Гени структурно-споріднених їм пептидів були клоновані і секвеіровани з асцидії Styela clava в лабораторії проф. Лерера. Ця гомологічних група пептидів представляє собою лінійні, не містять цистеїну молекули оснбвной природи.
При всьому структурній різноманітності більшості описаних в даний час антибіотичних пептидів всі вони є, як правило, одночасно основними і амфіпатіческімі молекулами, які проявляють спорідненість як до ліпофобним, так і ліпофільним середах і з'єднанням. Позитивний заряд і амфіфільних молекул антибіотичних пептидів лежать в основі їх функціональних проявів, 'зокрема антимікробної дії. Завдяки їм антибіотичні пептиди вступають в електростатичне і гідрофобна взаємодії з аніонними фосфоліпідами і ліпополісахаридами мембран мікробних клітин-мішеней, які призводять спочатку до їх адсорбції на поверхні мембран, а потім до впровадження в подвійний ліпідний шар, що порушує організацію і цілісність обол-точкові структур мікроорганізмів . Подібна дія АП на ци-топлазматіческую мембрану має наслідком незворотні пошкодження її структури і порушення її різноманітних функцій, результуючим ефектом яких є загибель клітин-мішеней. Окремим випадком цитотоксичності АП є їх дію на мікроорганізми. У силу мембранотропних механізму антибіотичної дії цих пептидів вони здатні в певних умовах проявляти ушкоджують ефекти у відношенні клітин тваринного організму, який їх продукує. У зв'язку з цим постає питання про те, які клітинно-молекулярні механізми забезпечують прицільність саме антимікробної дії АП, зводячи до мінімуму їх можливі аутоповреждающіе ефекти в процесах фагоцитозу і запалення, а також на поверхні бар'єрних епітеліїв макроорганізму. Як наразі встановлено, подібна вибірковість дії АП визначається низкою структурних та морфологічних чинників. До останніх належить, зокрема, компартменталізація дефенсин в лізосомоподобних гранулах лейкоцитів і клітин Панета, де вони пов'язані з кислими мукополисахаридами, які забезпечують нейтралізацію цитотоксичних молекул. Інші пептиди упаковані в гранулах у формі функціонально неактивних попередників, які піддаються обмеженому протеолізу зі звільненням антимікробного пептиду тільки в разі активації нейтрофільних гранулоцитів у процесі фагоцитозу. У разі звільнення вмісту лізосомоподобних гранул нейтрофільних гранулоцитів в позаклітинний простір цитотоксичність дефенсин нейтралізується внаслідок їх взаємодії з плазмовими білками, які є в своїй основній масі аніонними сполуками. В даний час встановлено, що добре відомі інгібітори серинових протеїназ - а2-макроглобулін, а 1-інгібітор протеїназ, а 1 - антіхімотріпсін, антитромбін Ш - володіють підвищеним спорідненістю до Дефенс-нам, завдяки чому утворюються нецітотоксічние комплекси серпіни-дефенсин.
Суттєво важливим фактором, що визначає вибірковість дії АП на мікроорганізми, є особливості поверхневих структур бактерій, нижчих грибів, оболонкових вірусів і, в меншій мірі, найпростіших. У клітинній стінці і цитоплазматичній мембрані бактерій і грибів локалізовані молекули, до яких АП виявляють підвищену спорідненість в ході міжмолекулярних електростатичних і гідрофобних взаємодій. Так, зокрема, до складу ліпідів цитоплазматичної мембрани більшості бактерій входять кислі фосфоліпіди в істотно більш високої концентрації, ніж у плазмалемма еукаріотичних клітин. Внаслідок підвищеного електростатичної взаємодії АП з мембранними структурами, збагаченими кислими фосфоліпідами, спостерігається їх переважна сорбція на бактеріальних клітинах як у фаголізосомах фагоцитів, так і в позаклітинному середовищі в осередках запалення і на поверхні слизових і шкірних покривів. Завдяки ионному взаємодії АП концентруються в областях цитоплазматичних мембран бактерій, збагачених кислими фосфоліпідами. Подібна властивість АП було неодноразово продемонстровано в модельних умовах з використанням штучних плоских мембран і ліпосом. Пошкоджуюча дію АП на мембрани-мішені також залежить і від інтенсивності гідрофобних взаємодій пептиду з вуглеводневими хвостами жирних кислот ліпідів. Амфіпатіческій характер будови молекул більшості АП забезпечує їх впровадження в подвійний ліпідний шар мембран і порушення структурної цілісності останніх. Відомо також, що присутність холестерину в складі ліпідів мембран еукаріотичних клітин підвищує резистентність останніх до ушкоджувальної дії таких пептидів, як магейнін і цекропін.
При аналізі розглядаються взаємодій важливо також враховувати ту обставину, що цитоплазматична мембрана бактерій безпосередньо недоступна для контакту з АП, оскільки покрита клітинною стінкою, до складу якої у грампозитивних бактерій входить пептидоглікану, а грамнегативних - пептидогликан і зовнішня мембрана, яка є додатковим захисним бар'єром мікробної клітини. грамположительную микрофлору, нежели грамотрицательную. Тому дефенсин, за винятком деяких кріптдінов, і мягейніни більш ефективно вражають in vitro грампозитивну мікрофлору, ніж грамнегативну. Однак це правило поширюється не на всі групи антибіотичних пептидів. Наприклад, цекропіни і деякі бактенеціни більш активні як цитотоксичні молекули щодо грамнегативних бактерій. Це властивість зазначених сполук зумовлено їх підвищеною здатністю до взаємодії з одним з типових представників структури зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій, яким є ліпополісахарид. Наявність ліпополісахариди в зовнішньому шарі зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій є однією з умов їх упізнання антибіотичними пептидами і білками.
Пенетрирующей ліпофільний бішар активність молекул антибіотичних пептидів у ряді випадків помітно залежить від трансмембранного електричного потенціалу клітин-мішеней, який, як відомо, у плазмалемми бактерій зазвичай в 1.5-2 рази вищий, ніж у мембран еукаріотичних клітин. Це властивість мембран є одним з умов, що полегшують проникнення АП через ліпідний бішар, особливо в тих випадках, коли ефекторні молекули помірно - або слабоосновние. -1 и NP -2, практически не зависит от мембранного потенциала клеток-мишеней. Проникаюча здатність високоосновних пептидів, таких як дефенсин кролика NP -1 і NP -2, практично не залежить від мембранного потенціалу клітин-мішеней. Напрямок електричного поля впоперек мембран від плюса на зовнішній поверхні мембрани до мінуса - на внутрішній забезпечує електрофорез позитивно заряджених молекул антибіотичних пептидів через мембрану всередину клітини. При цьому частина молекул самостійно або в асоціації один з одним впроваджується в мембрани, утворюючи в них пороподобние отвори різної молекулярної організації. Перфорація мембран, яка в ряді випадків носить транзиторний характер, призводить до витоку з клітин іонів і порушення іонної асиметрії між середовищем і клітинами. Наслідком цього є дисипація мембранного потенціалу клітин-мішеней і прагнення молекул води увійти до клітки. Результатами подібного руху води можуть бути розбухання клітин-мішеней та їх осмотичний лізис. Розсіювання мембранного потенціалу позбавляє клітини можливості здійснювати активний транспорт іонів і речовин проти градієнта концентрацій, що в результаті різко знижує їх життєздатність.
клетки-мишени, результатом которых является гибель последних. При типовій орієнтації електричного поля мембран катіонні АП можуть переноситися через цей бар'єр шляхом електрофорезу, подібно до того як це описано для мікробних пептидних антибіотиків поліміксину В і граміцидин., Що доповнює картину деструктуруючих впливів на v клітини-мішені, результатом яких є загибель останніх. Узагальнена схема передбачуваного механізму антимікробної дії одного з антибіотичних пептидів - цекропіна - представлена на рис. 20. Перша фаза дії пептиду пов'язана з адсорбцією димеру цекропіна на поверхні мембрани за рахунок електростатичних взаємодій з її негативно зарядженими сполуками. На наступній стадії відбувається дисоціація димеру та впровадження в ліпофільних фазу ліпідного бішару окремих молекул цекропіна за рахунок гідрофобних взаємодій. На заключній стадії упровадилися і орієнтовані поперек мембран молекули цекропінов формують каналоподобние пори з помірною селективної проникністю для аніонів.
Схема, що відображає основні етапи взаємодії цекропінов з ліпідної мембраною.
Таким чином, негативний заряд поверхні мікробних клітин поряд з набором специфічних структур їх оболонок і високим трансмембранним електричним потенціалом їх цитоплазматичних мембран забезпечує вибірковість антимікробної дії антибіотичних пептидів. Для розглянутого механізму вродженого імунітету тварин характерний відносно низький у порівнянні з молекулярними факторами набутого імунітету рівень розпізнавання "свого" і "чужого", а також відсутність пам'яті. Однак саме антибіотичні пептиди клітин і рідких середовищ значною мірою забезпечують виживання більшості видів безхребетних тварин у середовищі, що буяє мікробами, оскільки в них відсутні механізми набутого імунітету.
Необхідністю забезпечення надійної антимікробного захисту тварин пояснюється факт дивовижної структурної різноманітності молекулярних матриць АП, співіснуючих у клітинах і рідких середовищах одного і того ж організму. Так, у нейтрофілах корів представлені Р-дефенсин, бактенеціни і індоліцідін. У гемолімфі м'ясних мух зустрічаються дефенсин, цекропіни та інші АП. Один з провідних ідеологів розглянутої галузі досліджень - проф. X. Бома зі Стокгольмського університету - бачить основну причину такого широкого розмаїття молекулярних матриць антимікробних пептидів в особливостях, дуже часто вислизають з поля зору і аналізу вчених, сполученої еволюції екосистеми тваринний організм-мікробна флора. Іншими словами, саме мікроорганізми є одним з провідних природних біотичних факторів середовища, що визначають як підтримка стабільності молекулярно-генетичних структур, відповідальних за біосинтез антимікробних пептидів, так і напрямок можливих їх змін в еволюції тваринного світу. На думку X. Бома, саме в реальному різноманітті видів мікроорганізмів, з якими в природі взаємодіє конкретний вид тварин, криється одна з основних причин видового спектру антимікробних пептидів, які, з одного боку, забезпечують стерильність внутрішнього середовища макроорганізму, а з іншого - контролюють профіль його аутофлори.
Розуміння механізмів антимікробної дії АП є підставою для використання цих сполук як антибіотики нового покоління в медицині та ветеринарії. Вражаючі генетична мінливість і швидкість розмноження мікроорганізмів є чинниками, що забезпечують швидке формування у них антибіотикорезистентності. Ця обставина створює для людини серйозні проблеми в боротьбі з потенційно патогенними збудниками інфекційних захворювань. Останній новий клас антибіотиків - Налідіксова кислота - був впроваджений у практику більше 30 років тому. У зв'язку з цим пошук і створення нових антибіотичних речовин пептидної природи є нагальними завданнями сучасного медико-біологічної науки.
Традиційно застосовувані антибіотики мікробного походження, вирішуючи основне завдання, пов'язану з інактивацією мікроорганізмів, викликають, однак, у людини і тварин ряд небажаних побічних ефектів: по-перше, багато хто з них індукують в організмі стан імунодефіциту внаслідок імуносупресивної активності, по-друге, викликають у організмі ендотоксемії, по-третє, до них виробляється резистентність з боку мікроорганізмів.
Антимікробні пептиди позбавлені цих недоліків. Більш того, багато катіонні АП мають ендотоксіннейтралізующей і иммунорегулирующим-нього активністю. До них практично не виробляється резистентність з боку мікробів. Будучи факторами проникності, катіонні АП підсилюють дію традиційно використовуваних антибіотиків, для них поки що не описані анафілактоідоподобние реакції, оскільки вони неантигенних. Все це є передумовою для створення антимікробних препаратів на основі природних пептидних антибіотиків, сукупність яких представляє собою нагальну систему неспецифічної антимікробного захисту, що включається в дію без істотно помітного латентного періоду, з високою ефективністю і відносною вибірковістю розпізнавання "своє" - "чуже".
З метою оцінки терапевтичних властивостей дефенсин в умовах організму нами вперше було вивчено вплив сумарних дефенсин кролика і людини на перебіг експериментальної герпетичної інфекції на мишах лінії СВА. З цією метою мишей заражали интрацеребрально вірусом герпесу в дозі 2 ЛД 50 / 0.02 мл. Дефенсин випробовували по лікувально-профілактичної схемою з одноразовою концентрацією білка, яка дорівнює 100 мкг на тварину, що виявилося оптимальним у результаті попередньо проведених експериментів. У мишей внаслідок інфікування в мозок розвивається енцефаломієліт різного ступеня тяжкості. Причому за даними, отриманими в нашій лабораторії, максимальна продукція вірусу в клітинах організму-господаря має місце на 3-4-е добу інфекційного процесу. Тому саме в ці терміни нами внутрішньочеревно вводилися дефенсин інфікованим твариною. У результаті проведених дослідів отримані докази захисної дії дефенсин при експериментальній герпетичної інфекції у мишей, кількісно більш вираженого у разі використання препаратів кролика в порівнянні з пептидами нейтрофілів людини. Випробування активності дефенсин в цих умовах виявило в принципі ті ж тенденції, які були встановлені при оцінці їх прямого антивірусної дії. Найефективніше в обох випадках були дефенсин кролика, ніж людину, що певною мірою можна пов'язати з більш основним характером молекул перше, визначальним у значній мірі інтенсивність вірусоцідное активності препаратів. Необхідно підкреслити, що сумарна лікувальна доза препаратів становила в наших експериментах 10 мг поліпептидів на 1 кг ваги тварини, в той час як ЛД 50 дефенсин кролика, але нашим даними, знаходиться в межах 500-700 мг / кг, а дефенсин людини - 700 - 800 мг / кг. Співвідношення токсичної та терапевтичної доз дефенсин дозволяє вважати нетоксичними ці препарати у використовуваних концентраціях. Що стосується механізмів захисної дії цих поліпептидів в умовах організму, то разом з їх прямим антивірусну дію найбільш ймовірно їх стимулюючий вплив на клітини мононуклеарной фагоцитуючої системи, які є одним з визначальних факторів резистентності до герпетичної інфекції. Перевірка цих припущень є предметом наших триваючих робіт.
Результати даних експериментів дозволяють розглядати дефенсин в якості ефективних препаратів, що підвищують резистентність організму до вірусної інфекції. Принципова можливість їх використання в якості профілактично-терапевтичних засобів при інфекційній патології з неминучістю ставить питання про необхідність вивчення впливу дефенсин на гомеостатичні механізми організму.