Основи теорії та основні поняття процесу хроматографічного розділення
Процес хроматографічного поділу дуже складний, проте, його окремі стадії можуть бути змодельовані і представлені у вигляді рівнянь, досить точно і вірно відображають реальний процес. Без знання того, що таке утримання, ефективність, селективність, навантажувальна ємність, неможливо підійти до вирішення практичних завдань з ВЕРХ, постійно виникають перед дослідником незалежно від того, в якій області він працює.
1.1 ЕФЕКТИВНІСТЬ і селективні
Хроматографія - це метод розділення компонентів суміші, заснований на відмінності в рівноважному розподілі їх між двома несмешивающимися фазами, одна з яких нерухома, а інша рухома. Компоненти зразка рухаються по колонці, коли вони перебувають у рухомій фазі, і залишаються на місці, коли знаходяться в нерухомій фазі. Чим більше спорідненість компонента до нерухомій фазі і чим менше - до рухомої, тим повільніше він рухається по колонці і тим довше в ній утримується. За рахунок відмінності в спорідненості компонентів суміші до нерухомої і рухомої фаз досягається основна мета хроматографії - поділ за прийнятний проміжок часу суміші на окремі смуги (піки) компонентів по мірі їх просування по колонці з рухомою фазою.
З цих загальних уявлень ясно, що хроматографічне розділення можливо тільки в тому випадку, якщо компоненти зразка, потрапляючи в колонку при введенні проби, по-перше, будуть розчинені в рухливій фазі і, по-друге, будуть взаємодіяти (утримуватися) з нерухомою фазою. Якщо при введенні проби якісь компоненти знаходяться не у вигляді розчину, вони будуть відфільтровані і не будуть брати участь в хроматографическом процесі. Точно так само компоненти, що не взаємодіють з нерухомою фазою, пройдуть через колонку з рухомою фазою, не розділяючись на компоненти.
Приймемо умова, що якісь два компоненти розчиняються в рухливій фазі і взаємодіють з нерухомою фазою, тобто хроматографічний процес може протікати без порушень. У цьому випадку після проходження суміші через колонку можна отримати хроматограми виду а, б чи в (рис. 1.1). Ці хроматограми ілюструють хроматографічні поділу, що відрізняються ефективністю (а і б) при рівній селективності і селективністю (б і в) при рівній ефективності.
Ефективність колонки тим вище, ніж вже пік виходить при тому ж часу утримування. Ефективність колонки вимірюється числом теоретичних тарілок (ЧТТ) N: чим вище ефективність, тим більше ЧТТ, тим менше розширення піка
Рис. 1.1. Вид хроматограми залежно від ефективності і селективності колонки: а - звичайна селективність, знижена ефективність (менше теоретичних тарілок), б - звичайні селективність і ефекти-вність; в - звичайна ефективність, підвищена селективність (більше відношення часів утримування компонентів)
Рис. 1.2. Параметри хроматографічного піку і розрахунок числа теоретичних тарілок:
t R - час утримування піку; h - висота піку; W 1 / 2 - ширина піка на половині його висоти
спочатку вузької смуги в міру проходження її через колонку, тим вже шик на виході з колонки. ЧТТ характеризує число щаблів встановлення рівноваги між рухомою і нерухомою фазами. ЧТТ легко визначити за хроматограмме (рис. 1.2) наступною формулою:
N = 5,54 (t R / W 1 / 2) 2
Знаючи число теоретичних тарілок, що припадає на колонку, і довжину колонки L (мкм), а також середній діаметр зерна сорбенту dc (мкм), легко отримати значення висоти, еквівалентній теоретичної тарілці (ВЕТТ), а також наведеної висоти, еквівалентній теоретичної тарілці (ПВЕТТ ):
ВЕТТ = L / N ПВЕТТ = B Е TT / d з
Маючи значення ЧТТ, ВЕТТ і ПВЕТТ, можна легко порівнювати ефективність колонок різних типів, різної довжини, заповнених різними за природою і зернения сорбентами. Порівнюючи ЧТТ двох колонок однієї довжини, порівнюють їх ефективність. При порівнянні ВЕТТ порівнюють колонки з сорбентами однакового зернения, що мають різну довжину. Нарешті, величина ПВЕТТ дозволяє для двох будь-яких колонок оцінити якість сорбенту, по-перше, і якість заповнення колонок, по-друге, незалежно від довжини колонок, зернения сорбенту та його природи.
Селективність колонки відіграє велику роль у досягненні хромато-графічного поділу. Селективність колонки α визначається відношенням наведених часів утримування двох піків по наступному рівнянню:
α = (t R 2 - t 0) / (t R 1 - t 0)
де t 0 - час утримування несорбіруемого компонента; t R 1 і t R 2 - часи утримування компонентів 1 і 2.
Селективність колонки залежить від дуже багатьох чинників, і мистецтво експериментатора великою мірою визначається умінням впливати на селективність розділення. Для цього в руках хроматографіста знаходяться три дуже важливих фактори: вибір хімічної природи сорбента, вибір складу розчинника і його модифікаторів і облік хімічної структури і властивостей поділюваних компонентів. Іноді помітний вплив на селективність надає зміна температури колонки, що міняє коефіцієнти розподілу речовин між рухомою і нерухомою фазами.
При розгляді поділу двох компонентів на хроматограмі і його оцінкою важливим параметром є дозвіл Rs, яке пов'язує часи виходу і ширину піків обох поділюваних компонентів (рис. 1.3):
R S = 2 (t R 2 - t R 1) / (W 1 + W 2)
Дозвіл як параметр, що характеризує поділ піків, збільшується в міру зростання селективності, відображеної зростанням чисельника, і зростання ефективності, відображеної зниженням значення знаменника через зменшення ширини піків. Тому швидкий прогрес рідинної хроматографії привів до зміни поняття «рідинна хроматографія високого тиску» - воно було замінено на «рідинну хроматографію високого дозволу» (при цьому скорочений запис терміна англійською мовою збереглася HPLC як найбільш правильно характеризує напрямок розвитку сучасної рідинної хроматографії). Скорочення, прийняте у вітчизняній літературі, - ВЕРХ, розшифровується як «високоеффектіная рідинна хроматографія», для сучасної рідинної хроматографії дещо менш вдало, тому що не враховується найважливіший фактор поділу - селективність.
Рис. 1.2. Дозвіл піків і параметри утримування
Важливим параметром утримування в рідинної хроматографії є коефіцієнт ємності k ', що визначається як частка від ділення маси речовини в нерухомій фазі на масу речовини в рухливій фазі:
k '= m н / m п
Важливе рівняння в рідинної хроматографії, що зв'язує основні хроматографічні параметри поділу наступне:
RS = ј [(a-1) / a] [k 2 '/ (1 + k 2')] VN 2
Дозвіл, таким чином, визначається твором трехсомножітелей, перший з яких виражає залежність від селективності колонки, другий - від коефіцієнта ємності колонки і третій - від ефективності колонки (ЧТТ).
Розглянемо це найважливіше рівняння більш докладно. Якщо, α = 1, то дозвіл дорівнює 0, тобто поділу немає незалежна від числа теоретичних тарілок у колонці. Проте з характеру функції α в рівнянні видно, що невеликі зміни можуть привести до помітного збільшення дозволу, особливо для тих випадків, коли значення α близькі до 1. Якщо за рахунок підбору умов поділу вдається змінити α з 1,1 до 1,2, це призводить до поліпшення дозволу в два рази. Таким чином, на фактор селективності слід звертати основну увагу при підборі умов поділу, враховуючи відмінність у взаємодії поділюваних компонентів як в нерухомій, так і в рухомий фазі. На відміну від газової хроматографії, в якій взаємодії в рухомого (газової) фазі незначні і селективність системи в основному визначається тільки взаємодіями речовин з нерухомою фазою, в рідинної хроматографії рухома (рідка) фаза не є інертною, а може відігравати головну роль у процесі термодинамічної розподілу між нерухомою і рухомою фазами внаслідок селективного взаємодії поділюваних речовин з рухомою фазою. Тому у виборі умов для високоселективного поділу як вибір сорбенту, так і вибір розчинника грають однаково важливу роль, а мистецтво хроматографіста в ВЕРХ більш багатогранно і вимагає обліку більшого числа взаємодій між молекулами, ніж у ГХ.
Другий співмножник в рівнянні приймає значення, рівне 0 (при цьому дозвіл також дорівнює 0, тобто поділ відсутній) в тому випадку, коли коефіцієнт ємності для другого компонента дорівнює 0, тобто обидва поділюваних компонента елюіруются як несорбіруемие речовини (взаємодія з нерухомою фазою відсутній). Із зростанням значення k 'дозвіл збільшується, при цьому швидкість аналізу падає.
Нарешті, з третього сомножителя видно, що досягається дозвіл пропорційно кореню квадратному з числа теоретичних тарілок, тобто для збільшення дозволу вдвічі треба збільшити ефективність колонки в 4 рази (наприклад, використовувати колонку в 4 рази довше). Подовження колонки в 4 рази призводить до збільшення тривалості аналізу також вчетверо, тобто швидкість аналізу падає. Як правило, якщо ефективність колонки недостатня, а швидкість аналізу є важливим фактором, йдуть по іншому шляху для підвищення ефективності - використовують колонку з більш дрібним по зернения сорбентом. Однак у цьому випадку платою за більшу ефективність при тій же швидкості аналізу є підвищення тиску на колонці.
Слід зазначити, що, хоча з рівняння і очевидно, що ефективність колонки менше впливає на здатність, ніж її селективність і коефіцієнт ємності, так як дозвіл пропорційно кореню квадратному з ефективності, проте підвищення ефективності колонок надається велике значення і приділяється величезна увага як виробниками колонок, так і їх споживачами. Це пов'язано з тим, що для складних багатокомпонентних сумішей, особливо сумішей невідомого складу, часто не вдається підібрати умови так, щоб селективність була високою для всіх компонентів. У цьому випадку висока ефективність колонки дозволяє домогтися поділу для пар речовин з невеликим значенням α.
1.2 Розмивання в колонки і ПОЗА ЇЇ
Речовини вводяться в колонку у вигляді вузької зони, яка в міру її руху з рухомою фазою по колонці стає все ширше, тобто розмивається внаслідок дифузійних процесів. Мірою цього розмивання у колонці є висота, еквівалентна теоретичній тарілці (ВЕТТ). Встановлено, що розмивання смуги в хроматографічної колонці обумовлено трьома причинами: наявністю вихрової дифузії, молекулярної дифузії і опору массопередачі. Загальна ВЕТТ (H) колонки виходить шляхом підсумовування внесків всіх цих факторів, що викликають розмивання хроматографічної зони:
H = Hp + Hd + Hs + Hm,
де Нр - внесок у розмивання вихровий дифузії; На - внесок у розмивання молекулярної дифузії; Hs - Внесок, пов'язаний з опором массопередачи в нерухомій фазі; Нт - внесок, пов'язаний з опором массопередачи в рухливій фазі.
Не вдаючись у докладний розгляд цих вкладів у ВЕТТ, проте слід зауважити, що чим менше кожне з чотирьох складових, тим менше буде і сумарне значення ВЕТТ і, отже, ефективніше колонка. Величина Нр пропорційна діаметру частинок сорбенту і зменшується з поліпшенням рівномірності заповнення
Рис. 1.4. Залежність ВЕТТ від швидкості подачі розчинника (V, мл / хв).
Внесок у розмивання піка різних факторів колонки сорбентом. Величина Hd зростає при використанні дуже малих швидкостей потоку, при зазвичай використовуваних високих швидкостях Hd настільки мала, що нею можна знехтувати. Величина Нm зменшується при прискоренні процесів адсорбції - десорбції в нерухомій фазі, тобто при використанні часток малого розміру і тонких плівок нерухомої фази, при зменшенні швидкості потоку. Величина Нm зменшується при зменшенні розміру частинок (пропорційно квадрату діаметра частинок), більш рівномірному і щільному заповненні колонки сорбентом, менш в'язкому розчиннику, менших швидкостях потоку.
Якщо зобразити графічно залежність ВЕТТ від швидкості подачі розчинника, то вона буде мати вигляд, зображений на рис.1.4. На ньому можна бачити і оцінити внесок кожної зі складових у значення ВЕТТ.
Таким чином, розмивання у колонці зменшується і ефективність підвищується, коли використовують більш дрібний сорбент, більш рівномірний за складом (вузька фракція), більш щільно і рівномірно упакований у колонці, при використанні більш тонких шарів прищепленої фази, менш в'язких розчинників і оптимальних швидкостей потоку.
Однак поряд з розмиванням смуги хроматографічної зони в процесі поділу у колонці може відбуватися також і розмивання її в пристрої для введення проби, у сполучних капілярах інжектор - колонка і колонка - детектор, у клітинці детектора і в деяких допоміжних пристроях (мікрофільтри для уловлювання механічних частинок з проби, що встановлюються після інжектора, перед-колонки, реактори-змійовики та ін.) Розмивання при цьому тим більше, чим більше внеколоночний обсяг у порівнянні з дзвінком об'ємом піку. Має також значення і те, в якому місці знаходиться мертвий об'єм: чим вже хроматографічна зона, тим більше розмивання дасть мертвий об'єм. Тому особливу увагу слід приділяти конструюванню тієї частини хроматографа, де хроматографічна зона найбільш вузька (інжектор і пристрої від інжектора до колонки) - тут внеколоночное розмивання найбільш небезпечно і позначається найбільш сильно. Хоча вважається, що в добре сконструйованих хроматографах джерела додаткового внеколоночного розмивання повинні бути зведені до мінімуму, проте кожен новий прилад, кожна переробка хроматографа повинні обов'язково закінчуватися тестуванням на колонці і порівнянням отриманої хроматограми з паспортною. Якщо спостерігається викривлення піку, різке зниження ефективності, слід ретельно проінспектувати знову введені в систему капіляри та інші пристрої. Розмивання поза колонки і його неправильна оцінка можуть призвести до значної (більше 50%) втрати ефективності, особливо в тих випадках, коли щодо давно сконструйовані хроматографи намагаються використовувати для високошвидкісної ВЕРХ, мікроколоночной ВЕРХ та інших варіантів сучасної ВЕРХ, що вимагають мікроінжекторов, сполучних капілярів з внутрішнім діаметром 0,05-0,15 мм мінімальної довжини, колонок місткістю 10-1000 мкл, детекторів з мікрокюветамі ємністю 0,03-1 мкл і з високою швидкодією, високошвидкісних самописців і інтеграторів.
1.3 Утримання І СИЛА РОЗЧИННИКИ
Для того щоб аналізовані речовини поділялися на колонці, як уже згадувалося вище, коефіцієнт ємності k 'повинен бути більше 0, тобто речовини повинні утримуватися нерухомою фазою, сорбентом. Однак коефіцієнт ємності не повинен бути і занадто великим, щоб отримати прийнятний час елюювання. Якщо для даної суміші речовин обрана нерухома фаза, яка їх утримує, то подальша робота по розробці методики аналізу полягає у виборі такого розчинника, який забезпечив би в ідеальному випадку різні для всіх компонентів, але прийнятно не дуже великі k '. Цього домагаються, змінюючи елюірующую силу розчинника.
У разі адсорбційної хроматографії на силікагелі або оксиді алюмінію, як правило, силу двокомпонентного розчинника (наприклад, гексану з добавкою изопропанола) збільшують, збільшуючи в ньому вміст полярного компонента (изопропанола), або ж зменшують, зменшуючи вміст ізопропанол. Якщо зміст полярного компонента стає занадто малим (менше 0,1%), слід замінити його більш слабким по елюірующей силі. Так само роблять, замінюючи на інші або полярну, або неполярну складову і в тому випадку, якщо дана система не забезпечує бажаної селективності по відношенню до цікавлять компонентів суміші. При підборі систем розчинників беруть до уваги як розчинності компонентів суміші, так і елюотропние ряди розчинників, складені різними авторами.
Приблизно так само підбирають силу розчинника у разі використання щеплених полярних фаз (нітрил, аміно, діол, нітро та ін), враховуючи можливі хімічні реакції і виключаючи небезпечні для фази розчинники (наприклад, альдегіди і кетони для амінофази).
У разі звернення-фазної хроматографії силу розчинника збільшують, підвищуючи вміст у елюент органічної складової (метанолу, ацетонітрилу або ТГФ) і зменшують, додаючи більше води. Якщо не вдається досягнути бажаної селективності, використовують іншу органічну складову або намагаються змінити її за допомогою різних добавок (кислот, іон-парних реагентів та ін.)
При поділах методом іонообмінної хроматографії силу розчинника міняють, збільшуючи або зменшуючи концентрацію буферного розчину або змінюючи рН, в деяких випадках використовують модифікацію органічними речовинами.
Однак, особливо у випадку складних природних і біологічних сумішей, часто не вдається підібрати силу розчинника таким чином, щоб всі компоненти проби елюіровалісь за прийнятний термін. Тоді доводиться вдаватися до градиентному елюювання, тобто використовувати розчинник, елюірующая сила якого в процесі аналізу змінюється так, що вона постійно збільшується за заздалегідь заданою програмою. Таким прийомом вдається домогтися елюювання всіх компонентів складних сумішей за відносно короткий проміжок часу і їх поділу на компоненти у вигляді вузьких піків.
1.4 РОЗМІР ЧАСТИНОК СОРБЕНТУ, ПРОНИКНІСТЬ І ЕФЕКТИВНІСТЬ
Розглядаючи розмивання у колонці, ми вказували, що ефективність колонки (ВЕТТ) залежить від розміру часток сорбенту. У великій мірі бурхливий розвиток ВЕРХ за передні 10-12 років було обумовлено, по-перше, розробкою способів отримання сорбентів з розміром частинок від 3 до 10 мкм і з вузьким фракційним складом, що забезпечують високу ефективність при хорошій проникності, по-друге, розробкою способів заповнення цими сорбентами колонок і, по-третє, розробкою та серійним випуском рідинних хроматографів, мають розраховані на високий тиск насоси, інжектори і детектори з кюветами малого обсягу, здатні реєструвати піки малого обсягу.
Для добре упакованих суспензійним способом колонок наведено-ва висота, еквівалентна теоретичній тарілці (ПВЕТТ), може становити 2 незалежно від того, чи використовували для упаковки частинки з розміром 3, 5, 10 або 20 мкм. У цьому випадку ми отримаємо відповідно колонки (при стандартній довжині їх 250 мм) ефективністю 41670, 25000, 12500 і 6250 т.т. Здається природним вибрати найбільш ефективну колонку, заповнену частинками розміром 3 мкм. Однак за цю ефективність доведеться заплатити використанням при роботі дуже високого тиску і відносно невисокою швидкістю поділу, тому що наявний насос, швидше за все, буде нездатний прокачувати через таку колонку розчинник з високою об'ємною швидкістю. Тут ми якраз і стикаємося з питанням про зв'язок розміру часток сорбенту, ефективності і проникності колонок.
Рівняння, яке пов'язує тиск, розмір часток і інші важливі хроматографічні параметри, має такий вигляд:
u = K 0 p / ηL = pd c 2 / φ ηL
де u - Лінійна швидкість потоку, що визначається з рівняння t o = L / u; К 0 - Проникність колонки, р - тиск; η - в'язкість; L - довжина колонки; φ - Фактор опору колонки.
Якщо виразити звідси фактор опору колонки - безрозмірну величину, отримаємо таке рівняння:
φ = pd c 2 t o / ηL 2
Фактор опору для колонок, упакованих мікрочастинками одного виду за одним і тим же способом, змінюється незначно і складає такі значення:
Вид частинок. Неправильна форма Сферична форма
Суха упаковка 1000-2000 800-1200
Суспензійна упаковка 700-1500 500-700
Тиск на вході в колонку пропорційно лінійної швидкості потоку, фактору опору колонки, в'язкості розчинника і довжині колонки і назад пропорційно квадрату діаметра частинок.
Застосувавши цю залежність для вищеописаних колонок з частинками діаметром 3, 5, 10 і 20 мкм і припустивши постійними лінійну швидкість потоку, фактор опору колонки і в'язкість розчинника, отримаємо для колонок рівної довжини співвідношення тисків на вході 44:16:4:1. Таким чином, якщо для звернення-фазного сорбенту з розміром частинок 10 мкм при використанні систем розчинників метанол - вода (70:30) зазвичай на стандартній колонці при витраті розчинника 1 мл / хв тиск на вході в колонку становить 5 МПа, то для часток 5 мкм - 20 МПа і для 3 мкм - 55 МПа. При використанні силікагелю і менш в'язкою системи розчинників гексан - ізопропанол (100:2) значення будуть істотно нижче: відповідно 1, 4 і 11 МПа. Якщо у випадку звернення-фазного сорбенту застосування частинок розміром З мкм дуже проблематично, а 5 мкм можливо, але не на всіх приладах, то для нормально-фазного проблем з тиском не виникає. Слід зазначити, що для сучасної швидкісної ВЕРХ характерно використання більш високої витрати розчинників, ніж у вище розглянутому прикладі, тому вимоги до тиску зростають ще більше.
Однак у тих випадках, коли для поділу потрібен певний число теоретичних тарілок і бажано здійснити швидкісний аналіз, картина дещо змінюється. Так як довжини колонок з сорбентами зернового 3, 5, 10. мкм при рівній
ефективності будуть відповідно 7,5, 12,5 і 25 см, то і співвідношення тисків на вході в колонки зміниться до 3,3:2:1. Відповідно тривалість аналізу на таких колонках рівної ефективності буде співвідноситися як 0,3:0,5:1, тобто при переході від 10 до 5 і 3 мкм тривалість аналізу скоротиться в 2 і 3,3 рази. За це прискорення аналізу доводиться розплачуватися пропорційно більш високим тиском на вході в колонку.
Наведені дані справедливі для тих випадків, коли сорбенти різного зернения мають однакові криві розподілу часток за розміром, колонки набиті однаковим способом і мають однаковий фактор опору колонки. Слід мати на увазі, що складність отримання вузьких фракцій сорбенту зростає в міру зменшення розміру часток і що фракції від різних виробників мають різний фракційний склад. Тому фактор опору колонок буде змінюватися в залежності від зернения, типу сорбенту, способу упаковки колонок та ін
Література:
Колір М. С. / / Праці Варшавського товариства дослідників природи, від.
біології, 1903, т. 14, с. 20-32. 2 Snyder L До Kirkland JJ Introduction to Modern Liquid Chromato-graphy. 2-nd edition. J. Wiley, NY, 1979. 863 p.
Parris NA Instrumental Liquid Chromatography. 2-nd ed. Elsevier, Oxford, 1984. 270 p.
Bristow PA LC in Practice, hetp, Handforth, 1976. 267 p.
Кисельов А. В., Яшин Я-І. Адсорбційна газова і рідинна хроматографія. М., Хімія, 1979. 288 с.