Федеральне Агентство Науки та Освіти
Сибірський Федеральний Університет
Інститут Фундаментальною Біології і Біотехнології
Кафедра біотехнології
РЕФЕРАТ
На тему: Мікрохірургія
Виконав: студент групи Б-31
Холоділова Валентина
Перевірив: доцент кафедри
Біотехнології, д. б. н
Голованова Т.І.
Красноярськ, 2008 р.
Зміст
Введення
1. Реконструкція клітин - важливий прийом у вирішенні багатьох завдань біології
2. Злиття клітинних мембран
3. Метод електростімуліруемого злиття при реконструкції тваринних і рослинних клітин
4. Реконструкція зигот ссавців при поєднанні мікрохірургії та електростімуліруемого злиття клітин
5. Перспективи методу
Висновок
Література
Експериментальні методи стали застосовуватися цитологами вже в другій половині минулого століття. Перші мікрооперації проводилися на порівняно великих об'єктах, наприклад на розвиваються клітинах різних тварин, без використання будь-яких спеціальних пристосувань і при невеликих збільшеннях лупи або препаровальних мікроскопа. Мікрооперації на окремих клітинах дрібних розмірів стали проводити тільки на початку XX століття, коли був сконструйований прилад, званий мікроманіпуляторів. Мікроманіпулятори дозволяють проводити дуже тонкі операції над кліткою і її органоидами. Для цих операцій потрібні великі збільшення мікроскопа і спеціальні мікроінструменти, які найчастіше виготовляються самим експериментатором з тонких скляних ниток або паличок. Методи мікрургіі широко застосовуються і для виділення тканинних клітин або одноклітинних органоїдів при перенесенні їх у нову культуральну середу або в організм тварини, що особливо важливо для отримання клонів. Нарешті, до числа складних мікрохірургічних операцій, які почали застосовуватися порівняно недавно, відноситься вилучення та трансплантація ядер, ядерець та інших органоїдів клітини. Для цих операцій придатні головним чином великі клітини найпростіших та інших одноклітинних організмів, а також і великі клітини деяких багатоклітинних тварин, наприклад амфібій. Операції з пересадки ядер дають можливість вивчити роль ядра і цитоплазми в життя клітин, вивчити зміни, що відбуваються в без'ядерних клітинах, з'ясувати участь ядра і цитоплазми в передачі у спадок тих чи інших ознак.
Реконструкція ембріональних клітин і проблеми біології розвитку. Реконструкція ембріональних клітин, по суті включає в себе таку важливу задачу біології розвитку, як механізми реалізації генетичної інформації. Цей напрямок покликане вирішити такі важливі проблеми як дослідження реальної тотипотентності геному клітин різного рівня диференціювання, здатність геномів до репрограмування, дослідження підходів до отримання батьківських і материнських копій або клонування, отриманню гібридних тварин і міжвидових химер шляхом штучного злиття геномів і створення реконструйованих зигот і ранніх ембріонів . Реконструкція ембріональних клітин дозволяє поглянути на взаємодію ядра і цитоплазми, рецепторних структур мембрани і геному. Особливе місце займають досліди з пересадки ядер пухлинних клітин у енуклеірованние яйцеклітини. Реконструкція ембріональних клітин відкриває можливість для вивчення ролі внеядерной спадковості у розвитку.
Реконструкція диференційованих клітин і проблеми цитології. Подібні прийоми реконструкції вельми важливі для з'ясування механізмів розподілу, зокрема механізмів активації хроматину при реконструкції клітин з попередниць, що знаходяться на різних стадіях мітотичного циклу. Ці дослідження допомагають виявити механізми кореляції тих чи інших властивостей клітин, наприклад взаємозв'язок між збільшенням здатності клітини до метастазування і злоякісного росту із зменшенням здатності до формування міжклітинних дифузійних каналів. Нарешті, вони важливі для вивчення механізмів старіння клітини.
Реконструкція клітин і проблеми реалізації генетичної інформації кріоконсервованих геномів зникаючих видів тварин. При існуючих методах кріоконсервації і розморожування різних клітинних структур (гамети, гонади, зародки) в 30-50% випадків пошкоджується цитоплазматична мембрана. Цитоплазматична мембрана може також порушуватися при перекисном окисленні мембранних ліпідів. Разом з тим неодноразово вказувалося, що хромосоми набагато стійкіше до процесів заморожування і розморожування. У цьому зв'язку дуже істотна проблема заміни пошкодженої клітинної оболонки на клітинну оболонку зиготи від іншого, але близького виду. У ряді випадків дуже важлива можливість пересадки окремих хромосом, наприклад при необхідності перевизначення статі. Подібні ж проблеми постають при вирішенні задачі про ролі материнської цитоплазми для розвиваються організмів. Тут цікаві розробки методичних прийомів по заміні цитоплазми в цілому та її окремих елементів. Особливо цікаві зазначені завдання у зв'язку з реалізацією генетичної інформації кріоконсервованих геномів при міжвидових трансплантаціях ядер. Також важливі завдання з отримання міжлінійних і міжвидових химер шляхом заміни одного ядра в одній з клітин на стадії двох бластомерів. Отримання подібних химер може сприяти подоланню при міжвидової трансплантації ембріонів несумісності реципієнта і донора.
Реконструкція клітин та біотехнологічні завдання. У першу чергу маються на увазі такі комбінації частин реконструйованої клітини, коли можна буде отримувати клітини-продуценти, здатні до активного синтезу тих чи інших цінних біотехнологічних препаратів. Для вирішення різних завдань фізіології клітини дуже важливо отримання химер на клітинному рівні, коли штучно створюються клітини з таким поєднанням властивостей, яке не зустрічається в природних умовах. Наприклад, поєднання дуже великих розмірів клітини, що створює гарні умови для фізіологічного аналізу, із синтезом мембранних рецепторів, іонних каналів і т.д., наявність яких характерно лише для дрібних клітин, важкодоступних для фізіологічного аналізу. Крім того, вже описані можливості при використанні реконструйованих клітин, зокрема зигот тварин, або камбіальних клітин рослин, дозволяє підійти до клонування цінних для сільського господарства особин.
Це, мабуть, головна умова вдалої ізоляції ядер від цитоплазми для більшості клітин тваринного походження (в яких лінійні розміри не перевищують 100-150 мкм). Будь-яке порушення безперервності поверхневої клітинної мембрани при енуклеація, як правило, призводить до загибелі клітини у зв'язку з різким порушенням клітинного гомеостазу. Виключно сприятлива роль цітохалазіна В в різкому підвищенні клітинної стійкості до механічних пошкоджень в процесі енуклеація, ймовірно, визначається, головним чином тим, що за рахунок деконденсації мікрофіламентів клітинного цитоскелету різко підвищується автономність, а в силу цього, пластичність і адаптивність поверхневої клітинної мембрани до різних механічних пошкоджень.
Отже, ізоляція ядер, як правило, - процес штучного клітинного ділення. Це, у свою чергу, означає, що реконструкція нової клітини з цітопласта і каріопласта можлива тільки при щирому злиття клітинних мембран, при якому знову формується єдиний об'єм. Без такого процесу реальна реконструкція клітин неможлива.
У нас в країні ініціаторами даного цікавого напрямку з'явилися співробітники лабораторії, керованої Ю.А. Чізмаджевим в Інституті електрохімії АН СРСР. Цьому сприяли, по-перше, проведені в лабораторії теоретичні та експериментальні дослідження за механізмами електропробою штучних і природних мембран, явища, безсумнівно, лежить в основі процесу електросліянія, по-друге, теоретичні та експериментальні розробки безпосередньо з проблеми електросліянія мембран. Відповідні публікації та тісні наукові контакти співробітників Інституту електрохімії з біологічними інститутами сприяли використанню методу електростімуліруемого злиття клітин для їх реконструкції в інших лабораторіях країни
У згаданому огляді розглянуті роботи, в яких показано, що злиття клітин за допомогою електричного стимулу - явище досить універсальне. Так, було показано, що при накладенні імпульсів електричного поля тривалістю в 40 мкс і амплітудою 4-6 кВ / см на суспензію мікроорганізмів Dictyostelium discoideum призводить до їх злиття і появи значної кількості багатоядерних клітин (до 40 ядер). Важливо підкреслити, що ці клітини не вдається зливати двома широко поширеними для злиття методами: поліетиленгліколем і вірусом Сіндай. В інших роботах було показано, що аналогічний прийом з електростимуляції суспензії клітин призводить до збільшення частоти злиття протопластів дріжджів. При цьому наголошується, що злилися клітини здатні до поділу.
В описаних роботах, а також багатьох інших проводили злиття клітин в суспензії. У даному випадку попередньо перед сильним імпульсом струму, що викликає злиття, необхідно будь-яким способом викликати агрегацію клітин, щоб клітини контактували один з одним. Для цих цілей широко використовується метод діелектрофореза, при якому клітини у випадку достатньо високої їх концентрації в розчині, щільно контактують один з одним і створюють ланцюжки клітин уздовж силових ліній неоднорідного високочастотного електричного поля. Цікаві різні модифікації зазначеного підходу. Так, при злитті клітин мієломи і лімфоцитів мишей спочатку з допомогою діелектрофореза формували моношар клітин мієломи за допомогою спеціальної форми платинового електрода, а потім у клітинку вводили лімфоцити. При цьому встановлено, що виникають після електросліянія клітини-гібриди добре ростуть.
Для отримання соматичних гібридів при електростимуляції були використані й інші прийоми: створення щільної суспензії за допомогою центрифугування, стимулювання адгезії за допомогою різних хімічних агентів, культивування клітин в монослое, де природним чином формуються міжклітинні контакти, на електропровідного підкладці.
У деяких роботах було спеціально проведено порівняння ефективності електросліянія фібробластоподібних клітин при різних способах досягнення мембранного контакту:
1) у вигляді діелектрофореза клітин у змінному електричному полі,
2) за допомогою центрифугування і утворення щільного клітинного осаду,
3) шляхом вирощування клітин на провідній підкладці і формування подвійного клітинного шару. Показано, що найбільш ефективним виявився третій спосіб (індекс злиття 50-70%) і практично неефективним - перший. Автори пояснюють це виникненням в умовах природного формування подвійного клітинного шару (за даними електронної мікроскопії) великих міжклітинних контактів, що підвищує ймовірність злиття при впливі поля. Однак використання цього способу можливе тільки для клітин, здатних до росту і формування контактів, тому автори припускають, що найбільш універсальним може виявитися другою спосіб отримання мембранних контактів.
Інше важливе питання полягає в підборі оптимальної міжклітинного середовища, в якій проводиться електрообробки клітин. Так, є вказівки, що присутність в середовищі одновалентних іонів в концентрації вище 20 мМ значно знижує ефективність електросліянія. Проте в одній з робіт переконливо показано, що іонна сила розчину не впливає на величину порушення бар'єрних властивостей мембрани при електричному пробої, а, мабуть, змінює характер контактів між мембранами. У разі наявності добрих контактів між фібробластами, коли вони ростуть на плоскій підкладці, спостерігається високий індекс електросліяній при концентраціях Nad або КCl, що досягають 140 мМ.
У роботах Сухарєва, Бандріной, Барбул наголошується, що електрообробки клітин у середовищі, що містить 1-2 мМ Са 24 ", приводить практично до 100%-ної загибелі клітин. Мабуть, у цих умовах необоротно порушується іонний гомеостаз за рахунок значного входу іонів кальцію в цитоплазму. А при обробці клітин в середовищі з низьким вмістом кальцію (10 мкМ) виживання клітин різко зростає (до 40%). Ситуація покращується ще більше, якщо після електрообробки клітини містяться в середу, багату іонами натрію. У цих роботах також вказується , що важливим позитивним компонентом середовища електрообробки є сахароза (100-150 мМ), а також діалізованная проти безкальцієвому буфера сироватка (у кількості l / s за обсягом). Це дозволяє отримати максимальний вихід полікаріонов, які життєздатні протягом декількох днів.
У ряді досліджень вказується, що цитоскелет, ймовірно, не бере безпосередньої участі у процесі злиття клітин після їх електрообробки і злиття цитоплазми, характерний час якого для L-клітин ~ 90-120 хв, так як не цітохалазін В і Д, ніколцемід практично не впливають на швидкість і кінцевий індекс злиття. Також вказується, що розведення середовища після електрообробки дистильованою водою на Уз прискорює процес об'єднання цитоплазмі клітин. Передбачається, що це пов'язано зі зміною натягу поверхневої мембрани.
Отже, в даний час вже досить широко ведуться дослідження з пошуку оптимальних умов для електросліянія тварин клітин.
Метод електростімуліруемого злиття клітин починає широко використовуватися і для рослинних клітин. Для рослинних протопластів Petunia inflata встановлено, що отримані електростімуліруемим злиттям гібридні клітини здатні утворювати клітинні стінки і ділитися. Описано електросліяніе протопластів з листя диплоїдного виду картоплі з суспензійним протопластами махорки. Різна здатність до злиття протопластів з листя і суспензії дозволила підібрати умови для отримання 40-50% гетерологічної злиттів, 60-70% з яких складали бінарні (1:
1). Відзначається, що важлива модифікація методу електросліянія рослинних клітин полягає в можливості попереднього відбору пари протопластів, призначених для злиття. Це дозволяє по-новому підійти до вирішення важкої проблеми відбору гібридних продуктів при масовому злиття протопластів. Безсумнівна перевага електросліянія - контрольованість процесу, збільшення числа попарно злилися і, більше того, спеціально обраних для цього протопластів, залучає до зазначеного методу все більше дослідників.
Таким чином, на різноманітних типах тваринних і рослинних клітин показана ефективність використання для їх реконструкції методу електростімуліруемого злиття клітин. Не випадково метод отримує швидке поширення в різних лабораторіях.
Необхідно відзначити, що, як правило, в роботах, де використовують або суспензії клітин, або моношарова культуру, застосовують спосіб множинного злиття клітин. Площа електродів в цьому випадку завжди у багато разів перевищує розміри одиничної клітки. Разом з тим при реконструкції клітин у зв'язку з перенесенням генетичного матеріалу виявилося доцільним використовувати метод локального електросліянія, коли два електроди безпосередньо підводять до пари клітин, які передбачається зливати. Такі прийоми, наприклад, були використані при злитті бластомерів ранніх ембріонів ссавців з формуванням поліплоїдних клітин.
Проблема пересадки ядер зиготи або реконструкція клітини - одна з центральних у біології, так як дозволяє підійти до вирішення ряду принципових питань біології розвитку. Успіхи, в цій області, досягнуті на зародках амфібій, риб і безхребетних, вселяли, зокрема, впевненість у принципову можливість клонування організмів. Особливий інтерес представляють подібні дослідження на зародках ссавців. Проте досліди з пересадки ядер у зародків ссавців технічно істотно складніше, ніж у зародків риб та амфібій.
Яйцеклітини ссавців значно більш чутливі до мікрохірургічним маніпуляціям, пов'язаних з видаленням і введенням в них ядер. Ін'єкційний спосіб введення каріопластов призводить, як правило, клітку до загибелі. Подібні особливості зигот ссавців найімовірніше, пов'язані з тим, що їх об'ємні розміри у кілька тисяч разів менше, ніж об'ємні розміри зигот амфібій і риб. Відповідно до цього при проколі поверхневої мембрани мікроінструментів для видалення і введення ядер зиготи ссавців відчувають незрівнянно більше пошкодження, ніж зиготи риб і амфібій. Таке ушкодження поверхневої мембрани практично завжди призводить до загибелі клітини ссавців у зв'язку з необоротним порушенням гомеостазу.
Була запропонована методика, яка не вимагала пенетрації мікропіпеткою цитоплазматичної мембрани клітини. Введення ядра донора в енуклеірованних зиготу досягалося за допомогою вірусу Сендай.
Експерименти були проведені на мишах CBWA альбіноса-тетрагібрідах. В якості прийомних самок використовували гібриди Fi (свахи ХС57) (aqouti). Мишей отримували з розплідника "Світлі гори". Одноклітинні зародки на стадії пронуклеусов, практично позбавлені кумулюса, отримували від мишей CBWA першого дня вагітності. Для вимивання і культивування зигот використовували модіфізірованную середу Вітте. Для мікрохірургії цю середу розбавляли на 20% дистильованої водою з метою підтримки тургору клітин. Крім того, в середу для операцій додавали цітохалазін В в дозі 5мкг/мл. У спеціальну мікрокамеру типу Фонбрюна поміщали 10-15 зигот у середу для мікрохірургії. Час інкубації зигот у середовищі до операції не перевищувала 15 хв. Всі маніпуляції проводили при кімнатній температурі.
При проведенні мікрохірургічної операції з'ясувалося, що після проколу зони пеллюціда мікроінструмент впроваджується в глиб клітки, не ушкоджуючи поверхневу мембрану клітини. Це визначається головним чином дією цітохалазіна В. Клітка зберігає життєздатність до тих пір, поки не порушена цілісність цитоплазматичної мембрани. Каріопласт формується за рахунок всмоктування пронуклеусов разом з цитоплазмою і зовнішньої поверхневою мембраною в мікропіпетку. Відбувається як би штучний поділ клітин. Спроби повернути каріопласт назад в зиготу не вдаються. Мембрана каріопласта контактує з зиготи і може так зберігатися протягом досить довгого часу (1-2 діб), але злиття не відбувається. При цьому енуклеірованних зигота не ділиться, а каріопласт частково фрагментірует. Для реконструкції зиготи необхідно їх справжнє злиття. Для злиття такий клітинної пари були використані електричні стимули замість вірусу Сендай. Електросліяніе було проведено у тому ж середовищі, в якій оперували зиготи.
Припускають, що злиття двох сусідніх клітин при подачі на них зовнішнього електричного поля відбувається за рахунок незворотного електричного пробою контактуючих мембран. Очевидно, що вирішення цього завдання пов'язане з пошуками таких способів додатка електричного поля, при яких максимум падіння напруги припадає на мембрани в області контакту. Було випробувано декілька варіантів з використанням позаклітинних електродів.
Імпульс струму подавали в момент, коли каріопласт, що вводиться під зону пеллюціда, приходив в контакт з енуклеірованних зиготи. У всьому діапазоні використаних струмів злиття не досягалося. При подачі імпульсів струму всередині мікроінструменту виникали досить сильні і спрямовані електрофоретичні зміщення середовища, що призводило до руйнування каріопласта. Можливо, цьому сприяв і локальний нагрів.
Мікроелектрод підводили в область контакту і пропускали імпульси струму. При цьому спостерігали поодинокі випадки злиття каріопласта з енуклеірованних зиготи, однак при видаленні електрода, з області контакту або каріопласт, або зигота руйнувалися. Ймовірно, за рахунок високої щільності струму поблизу кінчика мікроелектроди відбувається локальне нагрівання і прилипання мікроелектроди до поверхні каріопласта або зиготи.
У наступному варіанті використовували великі електроди, коли самі електроди і відстань між ними в кілька разів перевищувало розміри клітини. У більшості випадків невдовзі після злиття спостерігали загибель реконструйованої зиготи. Очевидно, при такому способі незворотний пробою мембрани відбувався не лише в області контакту каріопласта з енуклеірованних зиготи.
Найбільш вдалим виявився останній варіант з електродами, в одного з яких діаметр торця був 70-100 мкм, в іншого 20-30 мкм, що приблизно відповідало розмірам енуклеірованних зиготи і каріопласта. Істотно, що електроди були ретельно ізольовані, за винятком торців. Частка вдалих електросліяній при цьому складала 75%, а з електродами без ізоляції тільки 25%.
При проведенні основної серії дослідів з використанням останнього варіанту прооперовану зиготу з введеним під зону пеллюціда каріопластом поміщали впритул між двома електродами таким чином, щоб площина контакту цітопласта і каріопласта була перпендикулярна прямій, що сполучає кінчики електродів. Кожну клітинну пару окремо піддавали дії електричних стимулів. Оптимальні параметри електростимуляції були наступними: напруга на виході стимулятора (ЕСЛ-2) 20 В, тривалість імпульсів 0,1 мс, відстань між електродами 100-150 мкм.
Спеціальні вимірювання показали, що у використовуваній середовищі при подачі імпульсу 20 В тривалістю 0,1 мс, при якому відбувається злиття на міжелектродному відстані, приблизно рівному діаметру об'єкта (100 мкм). падіння напруги становить 0,6 В. Ця величина зростала до 1 В при введенні між електродами об'єкта. Таким чином, на кожну з чотирьох мембран: двох в області контакту і двох, прилеглих до електродів, доводиться в середньому по 0,25 В в початковий момент подачі імпульсу струму (до пробою).
Можна припускати, що виникнення пробою в кожній із зазначених чотирьох мембран призведе до перерозподілу потенціалу, його зростанням на інших мембранах. Це буде сприяти виникненню пробою в них. Таким чином, при електросліяніі пробою, ймовірно, виникає у всіх чотирьох мембранах, і тільки в області тісного контакту мембран він незворотній.
Більшість клітин зливалося після одного імпульсу.
Можна назвати ряд моментів. Відразу ж після електричного стимулу спостерігається збільшення площі контакту між каріопластом і цітопластом, що є початковим етапом процесу злиття. Подальше протікання процесу злиття характеризується поступовим розмиванням або розчиненням контактують між собою мембран. Час між електричним стимулом і візуально спостерігаються ознаками початку процесу злиття варіює від 1-15 с до 20-30 хв, тобто на три порядки. Основна кількість клітин зливається протягом 1-10 хв. До мчали клітинам докладали додатково серію імпульсів (два-три імпульси з інтервалом у кілька секунд), що помітно збільшувало відсоток злиття.
Високий відсоток електросліяіій, що має місце в цих дослідах (до 75%), спостерігається у присутності цнтохалазіна В в концентрації 5 мкг / мл. Разом з тим у спеціальних дослідах було показано, що при цих концентраціях цітохалазіна У жорсткість кортекса зигот знижується в десятки разів, що свідчить про дуже сильною деполімеризації примембранних мікрофіламентів. Це означає, що процес електросліянія може ефективно здійснюватися без участі зазначених структур. Також було відзначено, що гіпотонія (розведення використовуваної нами середовища на 20-30% дистильованою водою) полегшує процес злиття. Можливо, це зумовлено не стільки зміною натягу мембрани, скільки тією обставиною, що початкові етапи злиття пов'язані з деяким збільшенням сумарного обсягу зиготи і каріопласта, а підвищення клітинного тургору сприяє вказаному процесу. Високий відсоток злиттів здійснюється в середовищі з високою іонною силою. Мабуть, формування великого адгезійного контакту не залежить від іонного складу середовища, оскільки зона пеллюціда забезпечує досить сильний механічний притиск зиготи і каріопласта один до одного.
Для перевірки життєздатності 30 зигот мишей CBWA, реконструйованих електросліяніем, були трансплантовані в яйцепроводи прийомним самкам Fi (свахи С57) по три-чотири клітини на приймальну миша. У трьох з восьми самок народилося по одному дитинчаті, які відрізнялися за кольором шерсті від власних мишенят. По зростанню і поведінці вони не відрізнялися в подальшому від власного потомства реципієнтів. Це дозволяє зробити висновок, що електросліяніе не вносить помітних порушень у геном і може бути використано у широкому колі завдань з клітинної інженерії.
Важлива особливість методу електросліянія - його універсальність. Дійсно, якщо в основі механізму електросліянія лежить процес пробою ліпідного бішару клітинної мембрани і утворення пор, то тоді явищу електросліянія повинні бути піддані всі клітинні мембрани без винятку. І дійсно існують типи клітин, які неможливо злити за допомогою поліетиленгліколю або вірусу Сендай, але які зливаються при електростимуляції. Звичайно, при цьому важливо пам'ятати, що необхідною умовою для електросліянія є можливість прямого контакту між мембранами клітин, які передбачається зливати.
Істотний позитивний момент методу електросліянія полягає в тому, що він не пов'язаний з хімічним впливом. Чинним початком тут є не будь-якої хімічний чи біологічний фактор, який необхідно вводити в розчин до досліджуваного об'єкта, а електричний струм, що пропускається через об'єкт. У середу для електросліянія нічого додаткового не вноситься, крім електродів, та й то на короткий час. При подачі необхідного для зливання електричного поля на клітини, як ми вже відзначали, по суті можливі два випадки: або обидві клітини або одна з зливаються клітин відразу ж руйнується (в межах 5-15 с), що означає утворення у мембрани незворотного пробою; або злиття проходить благополучно, що означає оборотність пробою. У другому випадку відбувається, мабуть, тимчасове порушення гомеостазу внутрішньоклітинного середовища за рахунок утворення пір. Принципово інша ситуація має місце при дії на клітини поліетиленгліколю або інактивованого вірусу Сендай. У цьому випадку використовуються фактори потрапляють всередину клітини і можуть там будь-яким чином досить довго і складно взаємодіяти з внутрішньоклітинними структурами. Не випадково є вказівки, що і поліетиленгліколь і вірус Сендай можуть знижувати життєздатність клітин.
Доречно також зазначити ще одну важливу позитивну особливість цього методу, яка стала важливим чинником у розвитку всієї електробіологіі. Це - великі експериментальні зручності в легкості і широкому діапазоні суворої кількісної дозування.
При сучасному використанні діелектрофореза і електросліянія в щільних клітинних суспензіях можна отримувати величезні багатоядерні клітини, що неможливо при інших способах злиття. Такі багатоядерні гігантські клітини, що досягають до 1 мм, можуть виявитися дуже корисними для вирішення різних експериментальних завдань.
За допомогою електростімуліруемого злиття можна вибірково зливати цілком певні клітини, що, мабуть, малореально при хімічному стимулюванні злиття. Наприклад, при отриманні химер необхідно злити Кріопластія від іншої лінії, введений під зону пеллюціда двухклеточного зародка, тільки з тим бластомерів, у якого попередньо віддалене ядро.
Таке виборче злиття може досить легко контролюватися розташуванням електродів по відношенню до досліджуваній групі клітинних структур. Якщо розташувати електроди таким чином, щоб лінія їх поздовжніх осей проходила перпендикулярно до області контакту тих клітин, які необхідно злити (бластомер / і каріопласт), то переважно буде зливатися саме ця пара клітин. Можливі й інші типи варіантів локального і спрямованого злиття у різних клітинних структур.
2. http://www.krugosvet.ru
Сибірський Федеральний Університет
Інститут Фундаментальною Біології і Біотехнології
Кафедра біотехнології
РЕФЕРАТ
На тему: Мікрохірургія
Виконав: студент групи Б-31
Холоділова Валентина
Перевірив: доцент кафедри
Біотехнології, д. б. н
Голованова Т.І.
Красноярськ, 2008 р.
Зміст
Введення
1. Реконструкція клітин - важливий прийом у вирішенні багатьох завдань біології
2. Злиття клітинних мембран
3. Метод електростімуліруемого злиття при реконструкції тваринних і рослинних клітин
4. Реконструкція зигот ссавців при поєднанні мікрохірургії та електростімуліруемого злиття клітин
5. Перспективи методу
Висновок
Література
Введення
МІКРОХІРУРГІЇ (гречок, mikros малий + хірургія) - напрям у хірургії, що поєднує звичайні хірургічні прийоми і техніку операцій під мікроскопом з використанням спеціальних мініатюрних інструментів і найтонших травматичних голок з упаяними в них нитками.Експериментальні методи стали застосовуватися цитологами вже в другій половині минулого століття. Перші мікрооперації проводилися на порівняно великих об'єктах, наприклад на розвиваються клітинах різних тварин, без використання будь-яких спеціальних пристосувань і при невеликих збільшеннях лупи або препаровальних мікроскопа. Мікрооперації на окремих клітинах дрібних розмірів стали проводити тільки на початку XX століття, коли був сконструйований прилад, званий мікроманіпуляторів. Мікроманіпулятори дозволяють проводити дуже тонкі операції над кліткою і її органоидами. Для цих операцій потрібні великі збільшення мікроскопа і спеціальні мікроінструменти, які найчастіше виготовляються самим експериментатором з тонких скляних ниток або паличок. Методи мікрургіі широко застосовуються і для виділення тканинних клітин або одноклітинних органоїдів при перенесенні їх у нову культуральну середу або в організм тварини, що особливо важливо для отримання клонів. Нарешті, до числа складних мікрохірургічних операцій, які почали застосовуватися порівняно недавно, відноситься вилучення та трансплантація ядер, ядерець та інших органоїдів клітини. Для цих операцій придатні головним чином великі клітини найпростіших та інших одноклітинних організмів, а також і великі клітини деяких багатоклітинних тварин, наприклад амфібій. Операції з пересадки ядер дають можливість вивчити роль ядра і цитоплазми в життя клітин, вивчити зміни, що відбуваються в без'ядерних клітинах, з'ясувати участь ядра і цитоплазми в передачі у спадок тих чи інших ознак.
1. Реконструкція клітин - важливий прийом у вирішенні багатьох завдань біології
За останні 15 років активно розвиваються роботи з реконструкції клітин, причому кількість публікацій лавиноподібно наростає. І це природно, тому що реконструюються клітини, що формуються з ядра і цитоплазми різного походження, можуть використовуватися для вирішення великої кількості найважливіших біологічних проблем. На даний момент проблема клітинної реконструкції вступає в новий етап у зв'язку з появою нового ефективного фізичного методу - електростімуліруемого злиття клітин.Реконструкція ембріональних клітин і проблеми біології розвитку. Реконструкція ембріональних клітин, по суті включає в себе таку важливу задачу біології розвитку, як механізми реалізації генетичної інформації. Цей напрямок покликане вирішити такі важливі проблеми як дослідження реальної тотипотентності геному клітин різного рівня диференціювання, здатність геномів до репрограмування, дослідження підходів до отримання батьківських і материнських копій або клонування, отриманню гібридних тварин і міжвидових химер шляхом штучного злиття геномів і створення реконструйованих зигот і ранніх ембріонів . Реконструкція ембріональних клітин дозволяє поглянути на взаємодію ядра і цитоплазми, рецепторних структур мембрани і геному. Особливе місце займають досліди з пересадки ядер пухлинних клітин у енуклеірованние яйцеклітини. Реконструкція ембріональних клітин відкриває можливість для вивчення ролі внеядерной спадковості у розвитку.
Реконструкція диференційованих клітин і проблеми цитології. Подібні прийоми реконструкції вельми важливі для з'ясування механізмів розподілу, зокрема механізмів активації хроматину при реконструкції клітин з попередниць, що знаходяться на різних стадіях мітотичного циклу. Ці дослідження допомагають виявити механізми кореляції тих чи інших властивостей клітин, наприклад взаємозв'язок між збільшенням здатності клітини до метастазування і злоякісного росту із зменшенням здатності до формування міжклітинних дифузійних каналів. Нарешті, вони важливі для вивчення механізмів старіння клітини.
Реконструкція клітин і проблеми реалізації генетичної інформації кріоконсервованих геномів зникаючих видів тварин. При існуючих методах кріоконсервації і розморожування різних клітинних структур (гамети, гонади, зародки) в 30-50% випадків пошкоджується цитоплазматична мембрана. Цитоплазматична мембрана може також порушуватися при перекисном окисленні мембранних ліпідів. Разом з тим неодноразово вказувалося, що хромосоми набагато стійкіше до процесів заморожування і розморожування. У цьому зв'язку дуже істотна проблема заміни пошкодженої клітинної оболонки на клітинну оболонку зиготи від іншого, але близького виду. У ряді випадків дуже важлива можливість пересадки окремих хромосом, наприклад при необхідності перевизначення статі. Подібні ж проблеми постають при вирішенні задачі про ролі материнської цитоплазми для розвиваються організмів. Тут цікаві розробки методичних прийомів по заміні цитоплазми в цілому та її окремих елементів. Особливо цікаві зазначені завдання у зв'язку з реалізацією генетичної інформації кріоконсервованих геномів при міжвидових трансплантаціях ядер. Також важливі завдання з отримання міжлінійних і міжвидових химер шляхом заміни одного ядра в одній з клітин на стадії двох бластомерів. Отримання подібних химер може сприяти подоланню при міжвидової трансплантації ембріонів несумісності реципієнта і донора.
Реконструкція клітин та біотехнологічні завдання. У першу чергу маються на увазі такі комбінації частин реконструйованої клітини, коли можна буде отримувати клітини-продуценти, здатні до активного синтезу тих чи інших цінних біотехнологічних препаратів. Для вирішення різних завдань фізіології клітини дуже важливо отримання химер на клітинному рівні, коли штучно створюються клітини з таким поєднанням властивостей, яке не зустрічається в природних умовах. Наприклад, поєднання дуже великих розмірів клітини, що створює гарні умови для фізіологічного аналізу, із синтезом мембранних рецепторів, іонних каналів і т.д., наявність яких характерно лише для дрібних клітин, важкодоступних для фізіологічного аналізу. Крім того, вже описані можливості при використанні реконструйованих клітин, зокрема зигот тварин, або камбіальних клітин рослин, дозволяє підійти до клонування цінних для сільського господарства особин.
2. Злиття клітинних мембран
У більшості випадків необхідним завершальним етапом для отримання реконструйованих клітин є процес злиття основних вихідних елементів - цітопласта і каріопласта. Добре відомо, що при енуклеація клітин після обробки їх цітохалазіном В з подальшим виділенням ядра, центрифугуванням або мікрохірургії вибраного ядро завжди оточене цитоплазмою і поверхневою мембраною, тобто, при цьому завжди формується каріопласт. У той же час без'ядерна частина клітини також зберігає безперервну цілісність поверхневої клітинної мембрани і утворює цітопласт. Таким чином, при штучному відділенні ядра від цитоплазми завжди відбувається по суті розподіл клітини, тобто цитоплазми разделяющихся частин завжди залишаються повністю відокремленими від зовнішнього середовища клітинної мембраною.Це, мабуть, головна умова вдалої ізоляції ядер від цитоплазми для більшості клітин тваринного походження (в яких лінійні розміри не перевищують 100-150 мкм). Будь-яке порушення безперервності поверхневої клітинної мембрани при енуклеація, як правило, призводить до загибелі клітини у зв'язку з різким порушенням клітинного гомеостазу. Виключно сприятлива роль цітохалазіна В в різкому підвищенні клітинної стійкості до механічних пошкоджень в процесі енуклеація, ймовірно, визначається, головним чином тим, що за рахунок деконденсації мікрофіламентів клітинного цитоскелету різко підвищується автономність, а в силу цього, пластичність і адаптивність поверхневої клітинної мембрани до різних механічних пошкоджень.
Отже, ізоляція ядер, як правило, - процес штучного клітинного ділення. Це, у свою чергу, означає, що реконструкція нової клітини з цітопласта і каріопласта можлива тільки при щирому злиття клітинних мембран, при якому знову формується єдиний об'єм. Без такого процесу реальна реконструкція клітин неможлива.
3. Метод електростімуліруемого злиття при реконструкції тваринних і рослинних клітин
Проблема мікрохірургії клітин за допомогою електростімуліруемого злиття - бурхливо розвивається напрямок. Її народження пов'язано з роботою Сеїд та ін, виконаної в 1979 р. У цій роботі було показано, що при пропусканні струму через внутрішньоклітинні електроди, введені в два сусідніх протопласта, може відбуватися їх злиття. А вже через кілька років вийшли огляди з даного питання. У них розглянуто вже безліч робіт з електросліянію. Щоправда, більше половини з них вийшло з лабораторії Ціммермана, родоначальника і одного з активних пропагандистів цього методу. До теперішнього часу кількість подібних робіт різко збільшилася. Розробка методу та його використання охоплює все нові й нові лабораторії світу.У нас в країні ініціаторами даного цікавого напрямку з'явилися співробітники лабораторії, керованої Ю.А. Чізмаджевим в Інституті електрохімії АН СРСР. Цьому сприяли, по-перше, проведені в лабораторії теоретичні та експериментальні дослідження за механізмами електропробою штучних і природних мембран, явища, безсумнівно, лежить в основі процесу електросліянія, по-друге, теоретичні та експериментальні розробки безпосередньо з проблеми електросліянія мембран. Відповідні публікації та тісні наукові контакти співробітників Інституту електрохімії з біологічними інститутами сприяли використанню методу електростімуліруемого злиття клітин для їх реконструкції в інших лабораторіях країни
У згаданому огляді розглянуті роботи, в яких показано, що злиття клітин за допомогою електричного стимулу - явище досить універсальне. Так, було показано, що при накладенні імпульсів електричного поля тривалістю в 40 мкс і амплітудою 4-6 кВ / см на суспензію мікроорганізмів Dictyostelium discoideum призводить до їх злиття і появи значної кількості багатоядерних клітин (до 40 ядер). Важливо підкреслити, що ці клітини не вдається зливати двома широко поширеними для злиття методами: поліетиленгліколем і вірусом Сіндай. В інших роботах було показано, що аналогічний прийом з електростимуляції суспензії клітин призводить до збільшення частоти злиття протопластів дріжджів. При цьому наголошується, що злилися клітини здатні до поділу.
В описаних роботах, а також багатьох інших проводили злиття клітин в суспензії. У даному випадку попередньо перед сильним імпульсом струму, що викликає злиття, необхідно будь-яким способом викликати агрегацію клітин, щоб клітини контактували один з одним. Для цих цілей широко використовується метод діелектрофореза, при якому клітини у випадку достатньо високої їх концентрації в розчині, щільно контактують один з одним і створюють ланцюжки клітин уздовж силових ліній неоднорідного високочастотного електричного поля. Цікаві різні модифікації зазначеного підходу. Так, при злитті клітин мієломи і лімфоцитів мишей спочатку з допомогою діелектрофореза формували моношар клітин мієломи за допомогою спеціальної форми платинового електрода, а потім у клітинку вводили лімфоцити. При цьому встановлено, що виникають після електросліянія клітини-гібриди добре ростуть.
Для отримання соматичних гібридів при електростимуляції були використані й інші прийоми: створення щільної суспензії за допомогою центрифугування, стимулювання адгезії за допомогою різних хімічних агентів, культивування клітин в монослое, де природним чином формуються міжклітинні контакти, на електропровідного підкладці.
У деяких роботах було спеціально проведено порівняння ефективності електросліянія фібробластоподібних клітин при різних способах досягнення мембранного контакту:
1) у вигляді діелектрофореза клітин у змінному електричному полі,
2) за допомогою центрифугування і утворення щільного клітинного осаду,
3) шляхом вирощування клітин на провідній підкладці і формування подвійного клітинного шару. Показано, що найбільш ефективним виявився третій спосіб (індекс злиття 50-70%) і практично неефективним - перший. Автори пояснюють це виникненням в умовах природного формування подвійного клітинного шару (за даними електронної мікроскопії) великих міжклітинних контактів, що підвищує ймовірність злиття при впливі поля. Однак використання цього способу можливе тільки для клітин, здатних до росту і формування контактів, тому автори припускають, що найбільш універсальним може виявитися другою спосіб отримання мембранних контактів.
Інше важливе питання полягає в підборі оптимальної міжклітинного середовища, в якій проводиться електрообробки клітин. Так, є вказівки, що присутність в середовищі одновалентних іонів в концентрації вище 20 мМ значно знижує ефективність електросліянія. Проте в одній з робіт переконливо показано, що іонна сила розчину не впливає на величину порушення бар'єрних властивостей мембрани при електричному пробої, а, мабуть, змінює характер контактів між мембранами. У разі наявності добрих контактів між фібробластами, коли вони ростуть на плоскій підкладці, спостерігається високий індекс електросліяній при концентраціях Nad або КCl, що досягають 140 мМ.
У роботах Сухарєва, Бандріной, Барбул наголошується, що електрообробки клітин у середовищі, що містить 1-2 мМ Са 24 ", приводить практично до 100%-ної загибелі клітин. Мабуть, у цих умовах необоротно порушується іонний гомеостаз за рахунок значного входу іонів кальцію в цитоплазму. А при обробці клітин в середовищі з низьким вмістом кальцію (10 мкМ) виживання клітин різко зростає (до 40%). Ситуація покращується ще більше, якщо після електрообробки клітини містяться в середу, багату іонами натрію. У цих роботах також вказується , що важливим позитивним компонентом середовища електрообробки є сахароза (100-150 мМ), а також діалізованная проти безкальцієвому буфера сироватка (у кількості l / s за обсягом). Це дозволяє отримати максимальний вихід полікаріонов, які життєздатні протягом декількох днів.
У ряді досліджень вказується, що цитоскелет, ймовірно, не бере безпосередньої участі у процесі злиття клітин після їх електрообробки і злиття цитоплазми, характерний час якого для L-клітин ~ 90-120 хв, так як не цітохалазін В і Д, ніколцемід практично не впливають на швидкість і кінцевий індекс злиття. Також вказується, що розведення середовища після електрообробки дистильованою водою на Уз прискорює процес об'єднання цитоплазмі клітин. Передбачається, що це пов'язано зі зміною натягу поверхневої мембрани.
Отже, в даний час вже досить широко ведуться дослідження з пошуку оптимальних умов для електросліянія тварин клітин.
Метод електростімуліруемого злиття клітин починає широко використовуватися і для рослинних клітин. Для рослинних протопластів Petunia inflata встановлено, що отримані електростімуліруемим злиттям гібридні клітини здатні утворювати клітинні стінки і ділитися. Описано електросліяніе протопластів з листя диплоїдного виду картоплі з суспензійним протопластами махорки. Різна здатність до злиття протопластів з листя і суспензії дозволила підібрати умови для отримання 40-50% гетерологічної злиттів, 60-70% з яких складали бінарні (1:
1). Відзначається, що важлива модифікація методу електросліянія рослинних клітин полягає в можливості попереднього відбору пари протопластів, призначених для злиття. Це дозволяє по-новому підійти до вирішення важкої проблеми відбору гібридних продуктів при масовому злиття протопластів. Безсумнівна перевага електросліянія - контрольованість процесу, збільшення числа попарно злилися і, більше того, спеціально обраних для цього протопластів, залучає до зазначеного методу все більше дослідників.
Таким чином, на різноманітних типах тваринних і рослинних клітин показана ефективність використання для їх реконструкції методу електростімуліруемого злиття клітин. Не випадково метод отримує швидке поширення в різних лабораторіях.
Необхідно відзначити, що, як правило, в роботах, де використовують або суспензії клітин, або моношарова культуру, застосовують спосіб множинного злиття клітин. Площа електродів в цьому випадку завжди у багато разів перевищує розміри одиничної клітки. Разом з тим при реконструкції клітин у зв'язку з перенесенням генетичного матеріалу виявилося доцільним використовувати метод локального електросліянія, коли два електроди безпосередньо підводять до пари клітин, які передбачається зливати. Такі прийоми, наприклад, були використані при злитті бластомерів ранніх ембріонів ссавців з формуванням поліплоїдних клітин.
4. Реконструкція зигот ссавців при поєднанні мікрохірургії та електростімуліруемого злиття клітин
Цікаві результати щодо застосування методу електростімуліруемого злиття клітин були отримані останнім часом на ембріональних клітинах ссавців.Проблема пересадки ядер зиготи або реконструкція клітини - одна з центральних у біології, так як дозволяє підійти до вирішення ряду принципових питань біології розвитку. Успіхи, в цій області, досягнуті на зародках амфібій, риб і безхребетних, вселяли, зокрема, впевненість у принципову можливість клонування організмів. Особливий інтерес представляють подібні дослідження на зародках ссавців. Проте досліди з пересадки ядер у зародків ссавців технічно істотно складніше, ніж у зародків риб та амфібій.
Яйцеклітини ссавців значно більш чутливі до мікрохірургічним маніпуляціям, пов'язаних з видаленням і введенням в них ядер. Ін'єкційний спосіб введення каріопластов призводить, як правило, клітку до загибелі. Подібні особливості зигот ссавців найімовірніше, пов'язані з тим, що їх об'ємні розміри у кілька тисяч разів менше, ніж об'ємні розміри зигот амфібій і риб. Відповідно до цього при проколі поверхневої мембрани мікроінструментів для видалення і введення ядер зиготи ссавців відчувають незрівнянно більше пошкодження, ніж зиготи риб і амфібій. Таке ушкодження поверхневої мембрани практично завжди призводить до загибелі клітини ссавців у зв'язку з необоротним порушенням гомеостазу.
Була запропонована методика, яка не вимагала пенетрації мікропіпеткою цитоплазматичної мембрани клітини. Введення ядра донора в енуклеірованних зиготу досягалося за допомогою вірусу Сендай.
Експерименти були проведені на мишах CBWA альбіноса-тетрагібрідах. В якості прийомних самок використовували гібриди Fi (свахи ХС57) (aqouti). Мишей отримували з розплідника "Світлі гори". Одноклітинні зародки на стадії пронуклеусов, практично позбавлені кумулюса, отримували від мишей CBWA першого дня вагітності. Для вимивання і культивування зигот використовували модіфізірованную середу Вітте. Для мікрохірургії цю середу розбавляли на 20% дистильованої водою з метою підтримки тургору клітин. Крім того, в середу для операцій додавали цітохалазін В в дозі 5мкг/мл. У спеціальну мікрокамеру типу Фонбрюна поміщали 10-15 зигот у середу для мікрохірургії. Час інкубації зигот у середовищі до операції не перевищувала 15 хв. Всі маніпуляції проводили при кімнатній температурі.
При проведенні мікрохірургічної операції з'ясувалося, що після проколу зони пеллюціда мікроінструмент впроваджується в глиб клітки, не ушкоджуючи поверхневу мембрану клітини. Це визначається головним чином дією цітохалазіна В. Клітка зберігає життєздатність до тих пір, поки не порушена цілісність цитоплазматичної мембрани. Каріопласт формується за рахунок всмоктування пронуклеусов разом з цитоплазмою і зовнішньої поверхневою мембраною в мікропіпетку. Відбувається як би штучний поділ клітин. Спроби повернути каріопласт назад в зиготу не вдаються. Мембрана каріопласта контактує з зиготи і може так зберігатися протягом досить довгого часу (1-2 діб), але злиття не відбувається. При цьому енуклеірованних зигота не ділиться, а каріопласт частково фрагментірует. Для реконструкції зиготи необхідно їх справжнє злиття. Для злиття такий клітинної пари були використані електричні стимули замість вірусу Сендай. Електросліяніе було проведено у тому ж середовищі, в якій оперували зиготи.
Припускають, що злиття двох сусідніх клітин при подачі на них зовнішнього електричного поля відбувається за рахунок незворотного електричного пробою контактуючих мембран. Очевидно, що вирішення цього завдання пов'язане з пошуками таких способів додатка електричного поля, при яких максимум падіння напруги припадає на мембрани в області контакту. Було випробувано декілька варіантів з використанням позаклітинних електродів.
Імпульс струму подавали в момент, коли каріопласт, що вводиться під зону пеллюціда, приходив в контакт з енуклеірованних зиготи. У всьому діапазоні використаних струмів злиття не досягалося. При подачі імпульсів струму всередині мікроінструменту виникали досить сильні і спрямовані електрофоретичні зміщення середовища, що призводило до руйнування каріопласта. Можливо, цьому сприяв і локальний нагрів.
Мікроелектрод підводили в область контакту і пропускали імпульси струму. При цьому спостерігали поодинокі випадки злиття каріопласта з енуклеірованних зиготи, однак при видаленні електрода, з області контакту або каріопласт, або зигота руйнувалися. Ймовірно, за рахунок високої щільності струму поблизу кінчика мікроелектроди відбувається локальне нагрівання і прилипання мікроелектроди до поверхні каріопласта або зиготи.
У наступному варіанті використовували великі електроди, коли самі електроди і відстань між ними в кілька разів перевищувало розміри клітини. У більшості випадків невдовзі після злиття спостерігали загибель реконструйованої зиготи. Очевидно, при такому способі незворотний пробою мембрани відбувався не лише в області контакту каріопласта з енуклеірованних зиготи.
Найбільш вдалим виявився останній варіант з електродами, в одного з яких діаметр торця був 70-100 мкм, в іншого 20-30 мкм, що приблизно відповідало розмірам енуклеірованних зиготи і каріопласта. Істотно, що електроди були ретельно ізольовані, за винятком торців. Частка вдалих електросліяній при цьому складала 75%, а з електродами без ізоляції тільки 25%.
При проведенні основної серії дослідів з використанням останнього варіанту прооперовану зиготу з введеним під зону пеллюціда каріопластом поміщали впритул між двома електродами таким чином, щоб площина контакту цітопласта і каріопласта була перпендикулярна прямій, що сполучає кінчики електродів. Кожну клітинну пару окремо піддавали дії електричних стимулів. Оптимальні параметри електростимуляції були наступними: напруга на виході стимулятора (ЕСЛ-2) 20 В, тривалість імпульсів 0,1 мс, відстань між електродами 100-150 мкм.
Спеціальні вимірювання показали, що у використовуваній середовищі при подачі імпульсу 20 В тривалістю 0,1 мс, при якому відбувається злиття на міжелектродному відстані, приблизно рівному діаметру об'єкта (100 мкм). падіння напруги становить 0,6 В. Ця величина зростала до 1 В при введенні між електродами об'єкта. Таким чином, на кожну з чотирьох мембран: двох в області контакту і двох, прилеглих до електродів, доводиться в середньому по 0,25 В в початковий момент подачі імпульсу струму (до пробою).
Можна припускати, що виникнення пробою в кожній із зазначених чотирьох мембран призведе до перерозподілу потенціалу, його зростанням на інших мембранах. Це буде сприяти виникненню пробою в них. Таким чином, при електросліяніі пробою, ймовірно, виникає у всіх чотирьох мембранах, і тільки в області тісного контакту мембран він незворотній.
Більшість клітин зливалося після одного імпульсу.
Можна назвати ряд моментів. Відразу ж після електричного стимулу спостерігається збільшення площі контакту між каріопластом і цітопластом, що є початковим етапом процесу злиття. Подальше протікання процесу злиття характеризується поступовим розмиванням або розчиненням контактують між собою мембран. Час між електричним стимулом і візуально спостерігаються ознаками початку процесу злиття варіює від 1-15 с до 20-30 хв, тобто на три порядки. Основна кількість клітин зливається протягом 1-10 хв. До мчали клітинам докладали додатково серію імпульсів (два-три імпульси з інтервалом у кілька секунд), що помітно збільшувало відсоток злиття.
Високий відсоток електросліяіій, що має місце в цих дослідах (до 75%), спостерігається у присутності цнтохалазіна В в концентрації 5 мкг / мл. Разом з тим у спеціальних дослідах було показано, що при цих концентраціях цітохалазіна У жорсткість кортекса зигот знижується в десятки разів, що свідчить про дуже сильною деполімеризації примембранних мікрофіламентів. Це означає, що процес електросліянія може ефективно здійснюватися без участі зазначених структур. Також було відзначено, що гіпотонія (розведення використовуваної нами середовища на 20-30% дистильованою водою) полегшує процес злиття. Можливо, це зумовлено не стільки зміною натягу мембрани, скільки тією обставиною, що початкові етапи злиття пов'язані з деяким збільшенням сумарного обсягу зиготи і каріопласта, а підвищення клітинного тургору сприяє вказаному процесу. Високий відсоток злиттів здійснюється в середовищі з високою іонною силою. Мабуть, формування великого адгезійного контакту не залежить від іонного складу середовища, оскільки зона пеллюціда забезпечує досить сильний механічний притиск зиготи і каріопласта один до одного.
Для перевірки життєздатності 30 зигот мишей CBWA, реконструйованих електросліяніем, були трансплантовані в яйцепроводи прийомним самкам Fi (свахи С57) по три-чотири клітини на приймальну миша. У трьох з восьми самок народилося по одному дитинчаті, які відрізнялися за кольором шерсті від власних мишенят. По зростанню і поведінці вони не відрізнялися в подальшому від власного потомства реципієнтів. Це дозволяє зробити висновок, що електросліяніе не вносить помітних порушень у геном і може бути використано у широкому колі завдань з клітинної інженерії.
5. Перспективи методу
При електростімуліруемом злитті клітин геном не пошкоджується. Факт повного і нормального ембріонального розвитку від зиготи до дорослих особин - переконливий аргумент на користь збереження геному. У першому наближенні ці дані, очевидно, можна поширити і на інші клітини тваринного і рослинного походження, реконструйовані електросліяніем.Важлива особливість методу електросліянія - його універсальність. Дійсно, якщо в основі механізму електросліянія лежить процес пробою ліпідного бішару клітинної мембрани і утворення пор, то тоді явищу електросліянія повинні бути піддані всі клітинні мембрани без винятку. І дійсно існують типи клітин, які неможливо злити за допомогою поліетиленгліколю або вірусу Сендай, але які зливаються при електростимуляції. Звичайно, при цьому важливо пам'ятати, що необхідною умовою для електросліянія є можливість прямого контакту між мембранами клітин, які передбачається зливати.
Істотний позитивний момент методу електросліянія полягає в тому, що він не пов'язаний з хімічним впливом. Чинним початком тут є не будь-якої хімічний чи біологічний фактор, який необхідно вводити в розчин до досліджуваного об'єкта, а електричний струм, що пропускається через об'єкт. У середу для електросліянія нічого додаткового не вноситься, крім електродів, та й то на короткий час. При подачі необхідного для зливання електричного поля на клітини, як ми вже відзначали, по суті можливі два випадки: або обидві клітини або одна з зливаються клітин відразу ж руйнується (в межах 5-15 с), що означає утворення у мембрани незворотного пробою; або злиття проходить благополучно, що означає оборотність пробою. У другому випадку відбувається, мабуть, тимчасове порушення гомеостазу внутрішньоклітинного середовища за рахунок утворення пір. Принципово інша ситуація має місце при дії на клітини поліетиленгліколю або інактивованого вірусу Сендай. У цьому випадку використовуються фактори потрапляють всередину клітини і можуть там будь-яким чином досить довго і складно взаємодіяти з внутрішньоклітинними структурами. Не випадково є вказівки, що і поліетиленгліколь і вірус Сендай можуть знижувати життєздатність клітин.
Доречно також зазначити ще одну важливу позитивну особливість цього методу, яка стала важливим чинником у розвитку всієї електробіологіі. Це - великі експериментальні зручності в легкості і широкому діапазоні суворої кількісної дозування.
При сучасному використанні діелектрофореза і електросліянія в щільних клітинних суспензіях можна отримувати величезні багатоядерні клітини, що неможливо при інших способах злиття. Такі багатоядерні гігантські клітини, що досягають до 1 мм, можуть виявитися дуже корисними для вирішення різних експериментальних завдань.
За допомогою електростімуліруемого злиття можна вибірково зливати цілком певні клітини, що, мабуть, малореально при хімічному стимулюванні злиття. Наприклад, при отриманні химер необхідно злити Кріопластія від іншої лінії, введений під зону пеллюціда двухклеточного зародка, тільки з тим бластомерів, у якого попередньо віддалене ядро.
Таке виборче злиття може досить легко контролюватися розташуванням електродів по відношенню до досліджуваній групі клітинних структур. Якщо розташувати електроди таким чином, щоб лінія їх поздовжніх осей проходила перпендикулярно до області контакту тих клітин, які необхідно злити (бластомер / і каріопласт), то переважно буде зливатися саме ця пара клітин. Можливі й інші типи варіантів локального і спрямованого злиття у різних клітинних структур.
Висновок
Розглянуті особливості методу електростімуліруемого злиття (безпека для геному, універсальність, чистота, технологічна простота, вибірковість, сувора дозованість і ряд інших) дозволяють вважати, що він дійсно різко розширить і прискорить дослідження в галузі клітинної інженерії.Література
1. Трайтака Д.І. Біологія: Довідкові матеріали. - М., Освіта, 1983. - 208 с., Іл.2. http://www.krugosvet.ru