Мутація вірусів характеристика мутагенів

Для перевірки цих пропозицій були проведені експерименти. -мутанты (вызывающие быстрый лизис). Бактеріальні клітини заражали фагом Т2 і підраховували бляшки, утворені мутантними частинками, - r-мутанти (викликають швидкий лізис). Потім знаходили розподіл за частотою клонів, що містять 1, 2, 3,. . .5, ... Мутантів, і порівнювали знайдене розподіл з розрахованим, яке було засноване на припущенні, що відтворення фагових генів - експонентний процес, що складається з послідовних дуплікацій, а ймовірність мутації гена при кожній реплікації - величина постійна. , с которой образуются клоны, содержащие Якщо ці припущення справедливі, то слід очікувати, що частота y, з якої утворюються клони, що містять

х (= 2) мутантів, буде такою:

– вероятность мутации, N – конечное число копий гена, а n – число генераций фаговых генов, полученных в данном опыте. де m - ймовірність мутації, N - кінцеве число копій гена, а n - число генерацій фагових генів, отриманих в даному досвіді. образования клонов, содержащих x или более мутантов: Оскільки на практиці геноми фага реплицируются несинхронно, зручніше аналізувати розподіл мутантів, виходячи з частоти Yx освіти клонів, що містять x або більше мутантів:

Розподіл, отриманий в експерименті дуже добре збігається з теоретичним, особливо якщо враховувати вплив, який чинить на результати досвіду обмежена величина кожного виходу фага - складання зрілих фагових частинок з фонду реплицируются елементів. З отриманих даних випливає, що реплікація генів фага - експонентний процес, аналогічний розмноженню будь-якого організму, яке відбувається шляхом повторних поділок. Звичайно, ця аналогія носить чисто формальний характер і є просто наслідком підлозі консервативного механізму реплікації фагової ДНК, тобто результатом освіти з кожної дволанцюжкової молекули ДНК двох нових дволанцюжкові молекул. [3]

Цікава ситуація була виявлена ​​при аналізі розподілу мутантів, що утворилися в результаті обробки фага Т4 мутагеном етілметілсульфонатом. Виявилося, що клони з 1, 2, 4, 8 мутантами зустрічалися приблизно з однаковою частотою. Відомо, що дія цього мутагену на фагів ДНК полягає в етилювання гуаніну. Тому отримані дані були інтерпретовані в тому сенсі, що для кожного етілгуаніна, що входить до складу ДНК, існує деяка постійна ймовірність заміни на неправильна основа. Отже, якась мутація може виникнути з рівною імовірністю в будь-який генерації фага і всі копії, які утворюються після цієї події, будуть мутантами. Результати цього досліду показали, що ланцюги ДНК початкових частинок фага Т4 неодноразово копіювалися всередині однієї зараженої бактеріальної клітини.

Модифікації, що викликаються господарем

На додаток до мутацій бактеріофаги піддаються негенетических змін, в яких основна роль належить клітини-господаря. , Human , 1952; Arber , 1965, 1974). Це явище отримало назву модифікацій, що викликаються господарем (Luria, Human, 1952; Arber, 1965, 1974). Важливість цих модифікацій для молекулярної біології полягає в тому, що вони продемонстрували здатність внутрішньоклітинного середовища викликати такі зміни у хімічному будову генетичного матеріалу, за допомогою яких можна ідентифікувати клітинні лінії, що синтезують ДНК. Подібні явища були вперше відкриті на фагової ДНК, проте вони вірні і для будь-якої ДНК бактеріальної клітини. Є також спостереження, згідно з якими цей феномен справедливий і для еукаріотичних клітин. В особливих випадках можуть виникнути більш складні ситуації. Двостороння обмеження фага двома господарями іноді спостерігається, але воно не є обов'язковим.

Фаг, який відкидається клітинами, здатний адсорбуватися на них і ін'єктувати свою ДНК. Однак частина останньої швидко руйнується і реплікації не відбувається. -нуклеазы), которые способны узнавать особые участки ДНК и расщеплять их, если они не были модифицированы под влиянием М-ферментов. Деградація ДНК обумовлена ​​специфічними ендонуклеази (рестриктаз, або R-нуклеази), які здатні впізнавати особливі ділянки ДНК і розщеплювати їх, якщо вони не були модифіковані під впливом М-ферментів. Після цього відбувається розщеплення ДНК екзонуклеазами до окремих нуклеотидів. -нуклеаз и одновременно М-ферменты, которые предохраняют собственную ДНК клетки. Бактеріальний штам може мати одну або декілька R-нуклеаз і одночасно М-ферменти, які оберігають власну ДНК клітини. Запропоновано зручна номенклатура цих ферментів. -нуклеаз не всегда совпадают с участками расщепления ДНК; возможно, фермент способен мигрировать вдоль цепи, прежде чем он найдет участок, где ДНК подвергнется расщеплению. Згідно з рядом даних, ділянки впізнавання R-нуклеаз не завжди збігаються з ділянками розщеплення ДНК; можливо, фермент здатний мігрувати вздовж ланцюга, перш ніж він знайде ділянку, де ДНК піддасться розщеплення. Модифікації зазвичай укладається в метилюванні аденіну або цитозину в специфічних ділянках ДНК. -аденозилметионин. Донором метильних груп при цьому служить S-аденозілметіонін. - и М-ферментами, часто являются палиндромами: Ділянки, які здатні розпізнаватися R - і М-ферментами, часто є паліндромами:

…3 5 ... pGpTpPupPypApCp ... 3

…5 3 ... pCpApPypPupTpGp ... 5

и Py обозначают соответственно пурины и пиримидины. де Pu і Py позначають відповідно пурини і піримідинові. Метилювання навіть одного ланцюга цілком достатньо для захисту послідовностей від дії рестриктаз. -активности входят в состав ферментного комплекса, построенного из нескольких субъединиц. М-і R-активності входять до складу ферментного комплексу, побудованого з декількох субодиниць. Останні кодуються системою з трьох генів. Одна з субодиниць відповідальна за розпізнавання нуклеотидної послідовності.

Функціональна роль модифікацій, що викликаються господарем, неясна. Вони здатні захистити даний штам бактерій від масивного руйнування фагами, що ростуть на різних бактеріях. У більш загальному вигляді роль модифікацій можна визначити як захист від попадання неприйнятною чужорідної ДНК в бактеріальну клітину і подальшого її «приживлення». Бактерія А, яка відкидає фаг, що розмножується на штамі В, відкидає також і ДНК бактерії В, якщо її вводити за допомогою кон'югації або трансдукції.

Мінливість вірусів при пасажах

Мінливість вірусів при пасажах на тваринах.

Основоположником цього методу зміни спадковості вірусів був Пастер (1882 рік), який вперше отримав живу антирабічною вакцину шляхом серійних пасажів через мозок кролика дикого (вірулентного) штаму вірусу сказу. Було продемонстровано, що мінливість вірулентності вірусу в процесі пасажів відбувається не відразу, а поетапно, шляхом послідовних спадкових змін. Так, при внутрішньомозковому зараженні кролика культурою вірусу десятого пасажу інкубаційний період коливався від 10 до 14 днів, після 21 пасажу він скоротився до 7 - 8 днів, а штам, виділений після 90-го пасажу, мав суворо фіксованим інкубаційним періодом (6 - 7 днів ) для кролика і був авірулентним для людини. Селекціоновані аттенуіровані варіант був використаний для імунізації людей проти сказу. Аттенуіровані штам при підшкірному введенні втратив патогенність для собак і кроликів, не проникав у слинні залози, більш активно розмножувався в мозку кролика, викликаючи при цьому менш виражені патоморфологічні зміни в ЦНС; як виняток викликав освіта тілець Бабеша - Негрі і, нарешті, швидко інактивувався гліцерином . Цими еследованіямі був відкритий один з методів експериментального одержання живих вакцин проти вірусних хвороб.

У ряді досліджень показано мінливість окремих властивостей вірусу осповакціни при пасажах на тваринах (кролях, телятах та інших тварин). Успішні досліди були проведені з вірусом жовтої лихоманки, що показали можливість значного посилення нейровірулентності для мишей при пасажах через мозок, з одночасною втратою вірулентності для мавп при підшкірному і введенні. У процесі чергуються підшкірних і внутрішньочеревно пасажів був селекціонувати авірулентний варіант для мишей, що зберіг імуногенні властивості. Після 260 пасажів селекціонованих мутаген використовували для приготування живої вакцини.

Мінливість вірулентності та інших ознак при пасажах на тварин спостерігали у вірусів ящуру, чуми свиней, істиною чуми птахів, хвороби Ньюкасла, грипу та ін

Мінливість вірусів при пасажах на курячих ембріонах.

Метод пасажів на курячих ембріонах отримав широке поширення при вивченні мінливості багатьох вірусів. При пасажах вірусу осповакціни спостерігалось посилення патогенності для курячого ембріона і для кролика при підшкірному введенні. Був виведений мутант з ряду генетичних ознак, схожих з вірусом натуральної віспи.

Вірус сказу після 30 пасажів на курячих ембріонах придбав здатність проникати в усі тканини і органи зародка, а після 75 пасажів втратив вірулентність для кролика при зараженні в мозок.

При пасажах в курячих ембріонах вірусу ящура спостерігали зниження вірулентності для великої рогатої худоби, а після 120 пасажу вірус втратив не лише патогенні, а й імуногенні властивості. Пасажами в курячих ембріонах був отриманий високоімуногенною штам Н вірусу ньюкаслської хвороби, знайшов широке застосування для приготування живої вакцини. При пасажах на качиних ембріонах було виділено кілька вакцинних штамів цього вірусу.

Однак при тривалих пасажах в курячих ембріонах не завжди відзначали зниження вірулентності (віруси ньюкаслської хвороби, інфекційного аборту коней, кінського енцефаломієліту, западнонільского і венесуельського енцефалітів, віспи птахів, класичної чуми птахів та ін) Так, з 16 штамів вірусу чуми великої рогатої худоби тільки один штам втратив вірулентність, зберігши імуногенні властивості. Мінливість вірусів при пасажах в курячих ембріонах залежить від ряду умов: властивостей штаму вірусу, віку ембріонів, способу їх зараження, чергування пасажів на сприйнятливому тварину і ембріоні і інших чинників.

Мінливість вірусів при пасажах на культурі клітин.

Культура клітин - одна з найбільш вживаних методів для зміни вірулентності та інших властивостей вірусів. Широке використання цього способу дало можливість отримувати спадково змінені варіанти вірусів і селекціонувати їх з генетично неоднорідною вірусної популяції. Крім первинно тріпсінізірованних тканин, з цією метою широко використовували перещеплюваних лінії клітин. Причому окремі клітинні лінії можуть бути високочутливими до певних вірусів, але тим не менше в них вірус не накопичується у високих титрах. Інші ж клітинні лінії, володіють зниженою чутливості до вірусів, забезпечує накопичення їх високих концентраціях.

Використовуючи перещеплюваних або первинні культури тканини, були виділені аттенуіровані штами вірусу класичної чуми птахів. Вірулентність вірусу японського інцефаліта була ослаблена пасирування в культурі клітин нирки Хомика з подальшими пасажами на мишах-шмаркачів. Виділений варіант вірусу втратив вірулентність для мишей при внутрішньомозковому зараженні і не передавався комарами.

За останні роки з'явилося багато обнадійливих повідомлень про отримання стабільних вірулентних штамів вірусу ящура при пасажі на різних типах культури тканин. Після багаторазових пасажів в культурі тканин курячого ембріона вірусу жовтої лихоманки спостерігали втрату нееротропних і вісцетропних властивостей для мавп із збереженням імуногенності. Цей варіант (штам 1917 Д) успішно використовується для приготування живої вакцини. [4]

При пасажах вірусу поліомієліту в культурі ниркової тканини мавп було виділено ряд мутантів, які не викликають у мавп паралічів при введенні в головний і спинний мозок. Авірулентние штами були отримані при швидко наступних один за одним пасажах, завдяки чому створюються сприятливі умови для відбору варіантів, що володіють найбільшою активністю розмноження. Поєднуючи відбір з багаторазовими пасажами, були виділені мутанти з спадково ослабленою нейровірулентностью для мавп. Для зниження вірулентності необхідно було виконати 20-40т пасажів.

Мінливість вірусів, що виникає в процесі пасажів при підвищених і знижених температурах.

Переконливі дані про послаблення вірулентності в процесі пасажів при зниженій температурі отриманих у дослідах з вірусом ящуру. Вірус пасеровану на первинних культурах нирки телят при 37 °, 28 ° і 22 °. Вірулентність перевіряли на свинях і мишах шмаркачів. Як з'ясувалося, всі авірулентние для свиней варіанти не розмножувалися в культурі клітин при 40 °. У той же час вірулентні і авірулентние штами однаково активно розмножувалися при 28 °, а при 22 ° активно репродукували тільки авірулентние варіанти. Проте не у всіх авірулентний для свиней штамів оптимум температури розмноження був нижче 37 °. Окремі варіанти більш активно розмножувалися при 37 ° і не розмножувалися при 22 °. Таким чином, не у всіх випадках ослаблення вірулентності для свиней і мишей супроводжувалося змінами активності репродукції при знижених температурах, що не дає підстави вважати підставу абсолютної взаємозв'язки у ящуру між вірулентністю та активністю репродукції за зниженою і зниженою температурах.

У ряді спостережень була так само показана можливість отримання авірулентний варіантів в інших вірусів в процесі пасажу їх при знижених температурах (грипу, чуми свиней, поліомієліту, кору, японського енцефаліту та ін.) Так, при пасажах віруси грипу на курячих ембріонах при знижених (32-25 ° С) температурах були селекціонування мутанти, більш активно розмножуються при 28 ° і 32 °, ніж при 36 °. У них закономірно спостерігалося ослаблення або втрата вірулентності і токсичних властивостей. І, навпаки, мутанти селекціоновані в процесі пасажів при підвищених температурах, більш активно розмножувалися при 39 ° і 41 °, ніж вихідні штами. Варіанти втратили властивості розмножуватися при 25-28 ° С.

Схожі результати були отримані в дослідах з іншими видами вірусів. На підставі проведених досліджень можна зробити висновки, що пасажі вірусів при знижених температурах, як правило, призводили до появи варіантів з ослабленою вірулентністю. Зниження або повна втрата її в ряді випадків корелювали з втратою здатності розмножуватися при підвищених температурах.

Причина мінливості вірусів при пасажах ще мало з'ясовані. Згідно селекційної теорії, культура вірусу генетично не однорідна і в процесі пасажів на тваринах або культурі клітин відбувається відбір і накопичення варіантів для якої ця умова культивування більш сприятливо. Інша можлива причина виникнення варіантів при пасажах - рекомбінація вірусів. [5]

Мінливість вірусів при пасажах принципово не відрізняється від мутації, що виникають при впливі фізичними і хімічними мутогенамі, тому що в обох випадках зміни ознак у вірусу пов'язані зі змінами в його генотипі. Відмінності між ними несуттєві, головним чином кількісні. Одна з особливостей мінливості при пасажах полягає в тому, що для зміни генетичних ознак, особливо таких складних полігінія ознак, як патогенність або репродуктивна активність, потрібно ряд мутацій, що виникають у серії пасажів. Такого типу багатоступінчасті мутації є відображенням процесу переходу кількісних змін у якісні. Слід при цьому зазначити, що зміни властивостей у вірусів при пасажах виникають раніше, ніж ми їх виявляємо. З моменту появи перших змін до виявлення їх проходить, якийсь період кількісних змін, які на якомусь етапі пасажів переходить у якісні, що істотно змінюють спадкові ознаки вірусу.

Хімічні мутагени

Запропоновано три класифікації хімічних мутагенів:

Рехборна, Фріза, Раппопорта.

Фриз запропонував розділити мутагени на дві основні групи:

мутагени, що реагують з нуклеїнової кислотою тільки під час її реплікації;

мутагени, що вступають у реакцію з спочиває молекулою нуклеїнової кислоти, але вимагають для формування мута подальших її реплікацій.

В основі молекулярних змін вірусної нуклеїнової кислоти, що призводять до мутації, лежать два основних процеси: заміна підстави або вставка підстави. Розрізняють два типи заміни підстав: просту (транзицію) - на місце одного пуринового підстави постає інше або одне пиримидиновое підстава замінюється іншим; складну (трансверсія) - замість пуринового підстави з'являється пиримидиновое або пірімідіновоє підстава замінюється пуріновим. Вставка підстави - ​​веде більш до глибоких змін генетичного коду, ніж проста заміна підстав. У той же час основою зміни генетичного ознаки, що має одне і те ж фенотипическое вираз, можуть бути мутаційні ушкодження різних генів.

Крім простих замін, алкілуючі агенти здатні індукувати складні заміни - пурин на піримідин. Мутагенну дію цих сполук було показано з вірусами ньюкаслської хвороби та кліщового енцефаліту.

Гідроксиламін індукує мутації за типом освіти простих замін підстав в нуклеїнової кислоти, напрям яких залежить від типу нуклеїнової кислоти, яку містить вірус. За допомогою гідроксиламіну були індуковані мутації у вірусів герпесу, ньюкаслської хвороби, поліомієліту.

Останнім часом був синтезований і вивчений один з аналогів гідроксиламіну - оксіметілгідроксіламін (ОМГА), що реагує тільки з цитозином, але не з урацилом РНК, а отже, володіє більш високу специфічність і однієї спрямованістю мутагенної дії.

Для вірусів людини і тварин мутагеном є і формальдегід, за допомогою якого були індуковані мутанти у вірусу поліомієліту та вірусу західного енцефаломіеліталошадей при впливі на очищену РНК і внутрішньоклітинний вірус. Механізм мутагенної дії формальдегіду недостатньо вивчений.

О2) как мутагена на нуклеиновые кислоты заключается в дезаминировании органических оснований, т. е. отщепление от их молекул аминогруппы ( NH 2). Механізм дії азотистої кислоти (Н N О2) як мутагену на нуклеїнові кислоти полягає в дезамінування органічних підстав, тобто відщеплення від їх молекул аміногрупи (NH 2).

Фізичні мутагени

Мутагенну дію ультрафіолетового випромінювання. Дія УФ променів як мутагенів полягає в тому, що вони взаємодіють з молекулами нуклеїнових кислот і поглинаються ними, особливо промені з довгої хвилі 260 - 280 нм. Потрапляючи в молекулу нуклеїнової кислоти, вони поглинаються входять до її складу органічними основами. Виявилося, що тимін, урацил, цитозин більш чутливі до ультрафіолетових променів, ніж аденін і гуанін. При опроміненні УФ-променями дві сусідні молекули тиміном з'єднуються один з одним у пари, утворюючи так звані тимінових димери.

-фенотипом в культуре клеток ФКЭ. Під впливом УФ-опромінення отримано мелкобляшечний мутант вірусу західного кінського енцефаломієліту, що володіє стабільним S-фенотипом в культурі клітин ФКЕ. Встановлено принципову можливість отримання мутацій при дії УФ-променів на репродукуються вірус і його нуклеїнових кислот, в якій відбуваються структурні порушення РНК: компонент її - урацил - утворює діаметр і гідрати.

Висновок

Не всі мутації, які утворюються під впливом мутагенів, однаково стабільні. Мутанти, отримані при дії підвищеної температури, кислого середовища, ультрафіолетових променів і ультразвукових хвиль, давали близько 20% реверсі, при впливі профлавіна всі мутанти виявилися повністю стабільними. Ці відмінності у стабільності пов'язані з неоднаковим молекулярним механізмом дії використаних мутагенів. Підвищена температура, кисле середовище, ультрафіолетові промені викликають головним чином локальні зміни вірусної нуклеїнової кислоти, які ведуть до заміни окремих підстав. При мутагенну дію профламіна, а також частково азотистої кислоти причиною мутацій є випадіння або вставки підстав. При отриманні вакцинних вірусних штамів шляхом впливу на вірус мутагенами доцільно використовувати мутагени, що викликають більш глибокі зміни генетичного коду - типу випадінь або вставок, тому що такі мутанти володіють стабільністю спадкових властивостей.

Еволюція вірусів в природі йде в різних напрямках, тобто зміна патогенності вірусу, спектра патогенності, антигенні, імуногенні властивості вірусів і т. д. Еволюція різних видів має свої особливості. Одне з важливих змін, це зміна кола господарів, пристосування до бактерій, грибів, комах, рослин.

Список літератури:

Сюрін В. Н. Ветеринарна вірусологія. - 2-е вид., Перераб. і доп. - М.: Агропромиздат, 1991. 431 з., З іл.

Горьскій Б. В. І ін Основи загальної ветеринарної вірусології. 2-е вид., М., «Колос», 1978., 192 с., З іл.

Гендон Ю. З. Загальна і приватна вірусологія. - М.: Світ, 1981. - 680 с., З іл.

Земсков М. В. І ін Основи загальної мікробіології, вірусології та імунології. - 2-е вид., Испр. і доп. М., «Колос», 1977., 312 с., З іл.

Під редакцією Сюрін В. М. Посібник з ветеринарної вірусології. - М., «Колос», 1966., 686С.