МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
ЗАПОРІЗЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
Реферат
«Мутаційна мінливість мікроорганізмів - виробників антибіотиків»
Підготував студент
Сніжко Євген
Запоріжжя
2010
План
Введення
1. Способи збільшення продуктивності штамів
1.1 Мутагенез і відбір
1.2. Гібридизація шляхом схрещування
1.3 Кон'югація у бактерій
1.4 Системи схрещування у грибів
2. Мутагенез і методи виділення мутантів
Висновок
Література
Введення
Різноманітні антибіотики синтезуються безліччю самих різних мікроорганізмів, однак таксономічне розподіл штамів-продуцентів не є ні безперервним, ні випадковим. Приблизно 80% відомих антибіотиків синтезується штамами, що належать тільки до одного порядку бактерій - актиноміцетів, причому головним чином до одного з родів цього порядку - Streptomyces. Дуже рідко утворюють антибіотики представники еубактеріі; виняток становлять лише деякі спорогенная бацили, які продукують поліпептидні антибіотики певного класу. Антибіотики синтезуються багатьма грибами, але їх структура менш різноманітна, ніж структура антибіотиків, утворених актиноміцетами.
Здатність до синтезу антибіотиків не є строго видоспецифічними ознакою. Один і той самий антибіотик може утворюватися організмами, що відносяться до різних видів, родів і навіть порядків. Справедливо і зворотне: штами, відносяться до одного виду, можуть синтезувати різні антибіотики. Однак, як правило, чим далі відстоять один від одного організми в таксономічному відношенні, тим менша ймовірність, що вони утворюють один і той самий антибіотик.
При оптимізації будь-якого промислового процесу, що протікає за участю живих організмів, основні зусилля бувають спрямовані на поліпшення їх генетично обумовлених властивостей. Традиційно для підвищення продуктивності штамів використовували мутагенез з наступним скринінгом і відбором відповідних варіантів. У «допастеровскій період» відбір при проведенні найбільш «стародавніх» процесів ферментації (наприклад, в пивоварінні або сироваріння) здійснювався, очевидно, несвідомо. Останнім часом для об'єднання бажаних властивостей різних штамів в одному організмі стали використовувати гібридизацію.
Необхідною передумовою створення більш продуктивних штамів шляхом відбору мутантів і рекомбінації є глибоке знання біохімії та фізіології процесу ферментації. Нам потрібна також інформація про те, які стадії метаболізму є лімітуючими, які термодинамічні межі підвищення виходу продукту. Зазвичай ефективність процесу вдається підняти, використовуючи прийоми як фізіології, так і генетики: при цьому можливості двох наук доповнюють один одного, а не протиставляються.
1. Способи збільшення продуктивності штамів
1.1 Мутагенез і відбір
У минулому для збільшення продуктивності штамів зазвичай використовували мутагенез і відбір: саме таким шляхом вдалося підвищити вихід антибіотиків, синтезованих грибами та актиноміцетами. Було послідовно відібрано понад двадцяти штамів, які продукують все більше пеніциліну, і, в кінцевому рахунку, продуктивність збільшилася в 55 разів. Як у цьому випадку, так і в багатьох інших прямого відбору не відбувалося, оскільки не вдавалося створити умови, при яких росли б тільки шукані штами. Замість цього довелося застосовувати метод скринінгу: клітини, що вижили після впливу великих доз мутагенів, розмножували в колбах на качалках, після чого в фільтрату культуральної середовища визначали кількість антибіотика.
Скринінг вимагає багато часу і напруженої праці. Часто штами, для яких був отриманий великий вихід при вирощуванні в колбах, виявлялися непродуктивними в умовах зростання в ферментере великого обсягу. Нерідко успіху сприяло знання «секретів майстерності»: так, виявляється, що велика продуктивність зазвичай властива особливим морфологічних варіантів.
Скринінг за використанням чашок з агаром замість колб на гойдалках дозволяє обстежити набагато більше мутантів. Освіта антибіотиків або метаболітів нерідко оцінюється методом біопроб, коли в агар вводять індикаторні організми. Розроблено пристрої для автоматичного скринінгу чашок. У них використовуються механічні пристосування для інокуляції і проводиться періодичне фотографування і подальший комп'ютерний аналіз зображень. Можна створити особливі умови, при яких мутанти з потрібними властивостями не ростуть. У цьому випадку застосовується так званий метод збагачення, коли активно ростуть клітини дикого типу гинуть, а нерастущіе мутантні виживають. Так, наприклад, пеніцилін або ністатин викликає загибель зростаючих клітин бактерій або грибів відповідно. При роботі з грибами недолік в середовищі инозитола призводить до автолизу зростаючих, але не лежать клітин.
Найбільш підходящим способом є, звичайно, прямий відбір, коли створюються умови для зростання тільки мутантних клітин. Цей підхід застосовувався для виділення штамів - сверхпродуцентов деяких метаболітів, наприклад амінокислот або цитрату. Оброблену мутагеном культуру вирощують у присутності інгібітора (наприклад, аналога амінокислоти), в результаті чого відбираються мутанти, котрі долають порушення обміну за рахунок утворення надлишку бажаного з'єднання.
Відбір на чашках з агаром заснований на тому, що частина організмів відповідає на вплив за принципом «все або нічого». Колонії мутантів ростуть, а диких клітин - ні. Однак при отриманні промислових штамів, особливо призначених для використання в тривалих процесах ферментації, нерідко прагнуть отримати для конкретних умов відносно невеликі відмінності в швидкості росту. У цьому випадку відбір відбувається при безперервному культивуванні. У хемостатах при тривалому вирощуванні культура весь час знаходиться в експоненційної фазі росту, і це дозволяє виділяти навіть ті мутанти, у яких спорідненість до субстрату, питома швидкість росту чи стійкість до токсичної дії високих концентрацій субстрату або продукту лише трохи перевищує вихідний рівень.
1.2 Гібридизація шляхом схрещування
Найбільш простий шлях створення організмів з бажаним комплексом генетично обумовлених ознак - це схрещування штамів, що належать до протилежних статевим типам. Як про-, так і еукаріотичні мікроорганізми схрещуються при контакті клітин, і цей процес використовується для отримання рекомбінантів.
1.3 Кон'югація у бактерій
У бактерій статевий процес називають кон'югацією. Контакт між двома клітинами здійснюється за рахунок утворення довгого кон югаційного містка, який служить для переносу ДНК з однієї клітини в іншу. Здатність до формування містка закодована в багатьох плазмідах (див. далі); по ньому вони переносять свої гени, а в деяких випадках і гени клітини-господаря в клітку-реципієнт. Плазміди, що здійснюють перенесення генів клітини-хазяїна, володіють, таким чином, здатністю до мобілізації хромосом. У Escherichia coli такі F-плазміди виступають в ролі фактора статі. Вони здатні мобілізувати хромосому не тільки Є. coli, але і споріднених ентеробактерій (Shigella, Klebsiella, Salmonella, Erwinia) і тому можуть використовуватися для перенесення генів між бактеріями різних родів. Деякі плазміди, виділені з Pseudomonas aeruginosa, ще більш «нерозбірливі». Так, плазміда R68.45 може переносити хромосомні гени між видами Pseudomonas, в тому числі і Pseudomonas putida, але крім цього, має здатність до мобілізації хромосом і таких пологів, як Rhizobium, Rhodopseudomonas, Azospiril-lum, Agrobacterium і Escherichia.
До числа найбільш широко використовуваних в промисловості мікроорганізмів відносяться різноманітні види Streptomyces: з їх допомогою отримують більше 60% різновидів застосовуються сьогодні антибіотиків. У цих організмів добре розвинені системи схрещування, які виявлені і в їхніх близьких родичів, видів Nocardia (вони синтезують антибіотики рифаміцин
1.4 Системи схрещування у грибів
У грибів існують різноманітні типи схрещування, які використовуються в генетичних дослідженнях. Багато гриби-аскоміцети і базидіоміцети володіють складноорганізованої системи схрещування, що перешкоджають самооплодотворению та іншими формами інбридингу. Статевий процес контролюється системою несумісності. У деяких грибів система несумісності біполярна; при цьому процес схрещування контролюється всього одним локусом, який існує у двох альтернативних алельних формах. У інших грибів (наприклад, Schizophyllum commune) система несумісності тетраполярна. У них тип спаровування визначається двома генами, кожен з яких має безліч алельних форм. Для успішного схрещування два партнери повинні володіти різними алелями кожного з двох локусів типу спарювання.
2. Мутагенез і методи виділення мутантів
Генетичне вивчення мікроорганізмів, що створило фундамент для сучасної селекції, стало можливим тільки, коли були розроблені способи виділення клонових культур, або клонів.
Клон - це генетично однорідне потомство однієї клітини, наприклад колонія, що виникла з однієї клітини за розсіві культури на щільному живильному середовищі. Досліджуючи властивості такої колонії, можна одержати уявлення і про ознаки породила її клітини.
Важливо відзначити, що при подальших пересіву клонової культури в результаті процесу мінливості можуть з'явитися варіанти, що відрізняються від початкового. І тоді клонова культура клітин перетворюється в генетично різнорідну клітинну популяцію. Клонова за походженням культура, спадкова однорідність якої підтримується відбором за специфічними ознаками, називається штамом. Отримання і підтримка високопродуктивних штамів - основне завдання селекційної роботи.
Найважливішим методом селекції мікроорганізмів є відбір мутантів, т. е. організмів із зміненими спадковими ознаками, які з'являються в результаті мутацій. У самому широкому сенсі мутацію можна визначити як раптово виникає успадковане зміна в генетичному матеріалі клітини. Слід розрізняти мутації цитоплазматичні, що зачіпають позахромосомних генетичні детермінанти, і ядерні, або хромосомні.
У свою чергу, хромосомні мутації можна розділити на три основні типи: 1) зміна числа хромосом, 2) зміна числа і порядку розташування генів (перебудови хромосом або структурні зміни), 3) зміни індивідуальних генів (внутрігенние зміни, або мутації в найбільш вузькому сенсі цього слова) (Ш. Ауербах, 1978). У селекції мікроорганізмів основне значення мають останні два типи мутацій.
Хромосомні перебудови включають: випадіння ділянок хромосоми (розподілі), подвоєння (дуплікації) або множення (ампліфікації) числа окремих генів або групи генів, вставки ділянок хромосом у нові місця (транспозиції), обмін ділянками між хромосомами (транслокації), зміни порядку розташування генів на хромосомі (інверсії). Такі мутації можуть викликати як втрату функцій, так і придбання нових ознак, зокрема у зв'язку зі злиттям генів, які можуть опинитися під контролем невластивих їм регуляторних елементів. При цьому можуть з'явитися гібридні білки, збільшитися (зменшитися) кількість продуктів певних генів. За винятком ампліфікації, псу хромосомні перебудови стабільні.
Внутрігенние мутації змінюють послідовність основ ДНК в межах одного гена. Це можуть бути випадання або вставки одного або декількох підстав, порушують порядок зчитування гена в процесі трансляції. У клітинах такого типу мутанта синтезується неактивний білок із зміненою послідовністю амінокислот. При транзицію відбувається заміна якого-небудь одного пурину або піримідину (тиміну або цитозину) на інший пурин або піримідин відповідно. При трансверсіях пуринові основи замінюються на одне з двох піримідинових і, навпаки, піримідинова підстава - на одне з двох пуринових.
Важливою характеристикою мутантів є їх здатність, до реверсії, тобто зворотному мутирование до вихідного фенотипу. Мутанти, які з'являються в результаті реверсії, називаються ревертанти. При істинних зворотних мутаціях в ДНК відновлюється вихідна послідовність підстав. Так ревертіруют точкові мутації - заміни підстав, вставки або випадання одного або декількох нуклеотидів.
Крім того, реверсії можуть відбутися завдяки супресорних мутацій. При внутрігенной супресії другий мутація виникає в тому ж гені, що і первинна мутація, і призводить до більш-менш повного відновлення функції білка. При внегенной супресії другий мутація торкається інший ген. Так, помилки кодування, пов'язані з нонсенсом-мутаціями і деякими мутаціями зі зсувом рамки, можуть частково виправлятися мутаціями в генах, що кодують РНК Відновлена активність пошкодженого білка при цьому зазвичай не перевищує 10% від вихідного рівня.
Коли неможливо провести прямий відбір мутантів, досліджують колонії на індикаторних чашках, застосовують тесткультури мікроорганізмів або передруковують колонії на різні середовища, тобто використовують метод відбитків, або реплік. Іноді доводиться вирощувати кожну колонію і визначати в культуральної рідини цікавить активність. Індикаторні чашки дають можливість розрізняти мутанти за кольором колоній і проводити тестування різноманітних фенотипів у великих популяціях. Такі чашки можуть містити середовища з індикатором, що виявляє різницю в рН між тими колоніями, які метаболізують певні вуглеводи, і тими, які не володіють такою здатністю. Так, на агарі з тріфенілтетразоліем колонії, не зброджують лактозу, набувають яскраво-червоний колір, а колонії, зброджують цей дисахарид, залишаються незабарвленими. Використовуються також спеціально приготовані субстрати, які розпадаються з утворенням барвника при їх гідролізі ферментами, наявність яких тестується на цих чашках. Іноді вносять субстрати, які змінюють прозорість середовищ, і спостерігають утворення навколо колоній мутантів зон просвітлення.
У 1952 р. Д. Ледербергом і Е. Ледербергом ввели для непрямого відбору мутантів метод відбитків (рис. 6). Відповідно до цього методу, чашки Петрі засіваються з таким розрахунком, щоб на кожній з них виросло 50-200 колоній. Стерильний оксамит або фільтрувальний папір натягують на металевий або дерев'яний циліндр і закріплюють металевим кільцем. Чашки з виросли колоніями перевертають і прикладають до оксамиту. Потім до цього ж оксамиту (з відбитками колоній на ньому) прикладають чисті чашки з різними середовищами. Після відповідної інкубації на них утворюються колонії в тому самому розташуванні, що і на вихідній (матричної) чашці. Якщо матрична чашка містила повноцінне середовище, то відбитками на мінімальні середовища можна виявити ауксотрофние мутанти. Різні модифікації цього методу широко використовуються для виділення мутантів з поживними потребами, а також мутантів, чутливих до різних фізичних, хімічних і біологічних агентів (температура, антибіотики, фаги і ін.)
Отримання ауксотрофних мутантів з допомогою методу відбитків може бути спрощене, якщо збагачувати ними популяцію клітин, використовуючи пеніцилін або його аналоги. Ці антибіотики вбивають тільки зростаючі клітини. Наприклад, ауксотрофние по треонін мутанти Є. coli не ростуть на мінімальній середовищі без треоніну. У цих умовах пеніцилін буде вбивати тільки прототрофние клітини. Однак повної селекції ауксотрофов ця процедура не забезпечує.
Іноді доводиться проводити кілька циклів обробки пеніциліном, поперемінно вирощуючи бактерії в середовищі з треонін без пеніциліну і в мінімальній середовищі без треоніну з пеніциліном. Після одного циклу досягається збагачення бажаними мутантами в 1000 і навіть в 10000 разів. Отже, якщо необхідна мутація виникає спонтанно з частотою 10 ~ 7, то достатньо переглянути кілька тисяч колоній, які вижили після обробки пеніциліном, щоб знайти колонію з потрібною мутацією.
Висновок
Сьогодні в цій області відбулися явні зміни: якщо раніше єдиним використовуваним генетичним методом був відбір поліпшених штамів, то сьогодні пропонуються зовсім нові підходи, засновані на технології рекомбінантних ДНК (генетична інженерія). З їх допомогою шляхом ферментації можна отримувати нові види продукції: білки і пептиди людини, антигени вірусів. Треба сказати, що великий інтерес до біотехнології в значній мірі обумовлений саме появою генетичної інженерії. Зараз широке застосування знаходять методи модифікації генетичного матеріалу як in vivo, так і in vitro для розробки нових і модернізації існуючих біотехнологічних процесів.
Література
1. Біотехнологія Принципи та застосування Пер з англ. / Под ред. І. Хтгенса, Д. Беста, і Дж.Джонса. М.: Світ, 1988.-480ст.
2. Екологічна біотехнологія. Під. ред. Форебера і Діс.Вайза. - Л.: Хімія. - 1991 - 120с.
3. Герасименко В.Г. Біотехнологія. - Київ.: Вища школа - 1989. - 342 с.
4. Білків В.А. Біотехнологія. Мікробіологічне виробництво біологічно активних речовин. - М.: Вища школа. - 1997. - 220 с.
5. Мільчук М.Д., Новак Т.В., Кунах В.А. Біотехнологія рослин. - Київ, Поліграфконсалтінг, 2003. - 250 с.
6. Рильський О.Ф. Короткий курс лекцій з біотехнології (для студ. Денного відділення біологічного факультету) .- Запоріжжя: ЗДУ, 1996 .- 75С.