Ігор Лалаянца, кандидат біологічних наук
Вивчення мікроРНК може відкрити нову сторінку в медицині
Зовсім недавно побачили світ дві книги - біографія Ф. Кріка, сооткривателя подвійної спіралі ДНК, і «Життя від РНК-світу: предок всередині» - про виникнення життя, на початку якої стояла РНК. У другій книжці на сучасному рівні викладається в общем-то стара ідея про те, що спочатку була РНК, а аж ніяк не ДНК. Ф. Крик був першим, хто постулював центральної догму молекулярної біології: ДНК - РНК - білок (малася на увазі іРНК, у відкритті якої вони брали діяльну участь). Догма зазнала долю міріадов інших. До честі Крику він спокійно визнав у 1970 р. крах свого ідеалу, коли у вірусів був відкритий фермент зворотна транскриптаза (ОТ, або ревертаза). На жаль, він не дожив до відкриття РНК-інтерференції, здійснюваної короткими молекулами РНК довжиною не більше 23-24 нуклеотидів. Саме цей найдавніший механізм регуляції активності генів став черговим доказом реальності існування колись РНК-світу, який набагато старше звичного нам ДНК-ового ...
Вірус і імунітет: хто кого?
Говорячи про «внежізненних» формах носіїв генетичної інформації, мають на увазі перш за все віруси, які виникли ще в первинному РНК-світі. РНК - «молодша сестра» ДНК - в силу квантово-фізичних обмежень не може бути довгою, оскільки при досягненні певного ліміту довжини ланцюжка просто ламається. Для її захисту віруси «придумали» білкові оболонки найрізноманітніших форм, багатство яких вражає. Але вірус тому й нежиттєві форма, що не має власного обміну а для реплікації повинен проникнути в клітинне ядро, в якому є не тільки ферменти синтезу нуклеїнових кислот, але також і запас тих самих нуклеотидів, з яких будуються останні. Вірус не може безперешкодно проникнути в клітину через її мембрану. Він, насамперед, повинен зв'язатися з особливими білковими молекулами - рецепторами. Після цього починається процес ендоцитозу, або втягування молекулярного комплексу в цитоплазму. У ендоцітной капсулі ферменти починають буквальним чином «роздягати» вірус, поступово звільняючи його нуклеіновокислотну геном. Тільки нуклеїнова кислота з невеликою кількістю ферментного білка може проникнути в цитоплазму клітини. У ВІЛ ензимний вантаж представлений складним ензимним комплексом ро1, виконують як мінімум три функції. Цей протеїн синтезує ДНК-копію на матриці РНК, тобто здійснює «зворотний» синтез, потім переміщує ДНК в ядро, де вбудовує її в клітинний геном (ДНК-копія ВІЛ може знаходитися в лімфоцит спочиваючому стані протягом декількох років, а вірусу гепатиту - і десятків років; те ж справедливо і щодо вірусу грипу).
Імунна противірусний захист, як відомо, включається досить пізно, в результаті чого, наприклад, ми кожні весну і осінь хворіють новою формою грипу. Справа в тому, що при всій своїй високій специфічності імунні Т-лімфоцити включають клітинний і антитільний відповідь лише після «ознайомлення» Т-хелперів з вірусними антигенами, що подаються їм мечніковских макрофагами (і так звані дендритні клітки, про фагоцітной ролі яких ще не так давно не підозрювали). Макрофаги ж дають неспецифічний імунну відповідь, тобто вони реагують на вірусні білки як на всяке чужорідна речовина. Віруси для здійснення свого «життєвого» циклу змушені вбудовувати в клітинну мембрану свої білки, на які і реагують макрофаги. Специфічність вірусних антигенів "оцінюють" лише Т-хелпери, а чинним клітинним початком імунної системи є В-лімфоцити, які синтезують протеїнові антитіла, і клітини, що отримали назву «натуральні кілери» (NK - Natural Killers) - такі собі природжені вбивці, які вбивають клітини, інфіковані вірусами (в процесі беруть також участь і цитотоксичні лімфоцити CTL). Про настільки радикальному вирішенні проблеми свідчить мокрота з мільярдами загиблих клітин слизової дихальних шляхів, яка відділяється при кашлі при тому ж грипі. На вироблення специфічного імунної відповіді йде приблизно 2 тижні, протягом яких людина відчуває дискомфорт і нездужання. Імунітет до даного вірусу зберігається протягом десятиліть, і вважається, що носіями імунної пам'яті є згадані клітини. З грипом вся проблема полягає в тому, що геноми його вірусів мутують кожні півроку, тому «стара» захист виявляється неефективною. Настільки швидкі зміни в геномі РНК-ових вірусів пов'язані саме з одноцепочную їх носія ген-інформації. Ферменту РНК-полімеразі дуже важко зберегти просторову стабільність, зв'язуючись лише з одним ланцюгом, в результаті чого при копіюванні замість «потрібних» нуклеотидів включаються зовсім інші, тим самим визначаючи високу Мутабельний РНК-ових геномів. Досить сказати, що частота мутацій геному ВІЛ як мінімум в 1000 разів перевищує швидкість мутації певних ділянок імунних генів в Т-лімфоцитах, в результаті чого ті в більшості випадків програють вірусу і в кінцевому підсумку гинуть, наслідком чого є розвиток імунодефіциту ...
Старіння як захист від раку
Впровадження вірусу - лише один вельми демонстративний приклад необхідності клітинної захисту проти зовнішніх викликів. Іншим прикладом суто клітинних «турбот», пов'язаних з повторюється необхідністю «перезавантаження» геномних програм, є розвиток організму, в ході якого плід обходиться без необхідності дихати атмосферним киснем. Зокрема, першою функцію кровотворення бере на себе ембріональна печінка, синтезує дуже важливий альфа-фетопротеїн (від fetus - плід). Для «вилучення» кисню, розчиненого в материнській крові, еритроцити плоду несуть фето-гемоглобін (НЬ F - від fetus, плід), квантові властивості іона заліза в якому відрізняються великим спорідненістю до кисню. Після народження дитини експресія генів обох зазначених білків вимикається, піддаючись замовчування, або сайленсінгу (англ. silence - тиша, мовчання). Але це зовсім не означає, що вони викидаються з клітинного геному. При раку вони в результаті загального геномного дисбалансу знову можуть працювати. У відомий період розвитку організмів починає працювати величезна кількість генів, в результаті чого включається функція статевих залоз і з'являються вторинні ознаки. У другій половині життя гени, що відповідають, зокрема, за поділ клітин, поступово «відключаються», щоб не допустити пухлинної трансформації, що досягається у трьох чвертей згідно із законом Менделя. Звідси такий важливий біологічний процес старіння можна розглядати як захист від раку. Довгі десятиліття вчені не могли зрозуміти сайленсінга природи, будуючи на цей рахунок самі фантастичні припущення.
У зв'язку з цим можна згадати початок 50-х, коли вивчення ДНК йшло буквально «на коліні». Це сьогодні дозвіл рентгеноструктурного аналізу завдяки бурхливому розвитку комп'ютерної техніки досягло мало не одного ангстрема (діаметра атома водню)! Розалінд Франклін отримала якісь туманні розмиті картинки якогось ДНК-ового «хреста» і нічого не знала про комплементарності пар азотистих основ. Невдаха Ф. Крик намагався якось застосувати закони улюбленої фізики до біології ДНК, не забиваючи собі голову тим, що вона може бути носієм генетичної інформації. Лише юним американцем Дж.Уотсоном володіла одна, але полум'яна пристрасть - довести, що це саме так! Він привіз до Кембрідж з іншого берега Атлантики результати «фагової школи» М. Дельбрюка і С. Луриа і американського мікробіолога О. Ейвері, говорили про те, що принаймні у пневмококів, що викликають пневмонію, і у бактеріофагів роль носія спадкової інформації виконує ДНК .
Одного разу туманним вранці Ф. Крик увірвався в кембриджський паб «Орел» ^ gle) зі словами "Ми розгадали таємницю життя»! Приблизно через місяць у квітневому номері журналу Nature з'явилося їх спільне з Дж.Уотсоном лист редактору, в якому було всього 900 слів. Вчені писали, що ДНК, по всій видимості, являє собою двуцепочную спіраль, малюнок якої зробила Оділь, дружина Крику, що займалася дизайном букетів. У листі зазначалося, що двуцепочность можливого носія генетичної інформації добре пояснює принцип самовідтворення всього живого на Землі. Ця ідея була потім більш детально проілюстрована в підручнику Дж.Уотсона з молекулярної біології гена: на картинці були представлені дві розбіжні нитки ДНК, на яких йде одночасний синтез нових ланцюгів. Адже до моменту виходу книги у світ вже було доведено, що синтез речовини генів напівконсервативному, тобто синтезується спочатку лише один ланцюг, а потім вже інша в зворотному напрямку, оскільки фермент ДНК-полімераза може «читати» послідовність лише в одному напрямку. Ілюстрація підкреслювала принцип самовідтворення живого, але забула про спадковість Дарвіна, постулював збереження видів, що еволюціонують вкрай повільно. Коли допитливі розуми намагалися дорікнути Уотсона в тому, що його схема відтворення (реплікації) ДНК невірна, той з усмішкою відповідав, що помилки - суть історії.
«Народ мовчить»
Але повернемося до сайленсінгу генів та регуляції їх активності. У хромосомах ядра клітини є численні некодуючі ділянки, які не відповідають за синтез білків. З цих послідовностей ДНК малої протяжності синтезуються короткі РНК, що утворюють двуцепочние структури. Рентгеноструктурний аналіз з роздільною здатністю менше 3 ангстрем дозволив побачити, що ці пре-мікроРНК (miR) утворюють комплекс з ядерним білком і ферментом, що розщеплює енергоносій типу АТФ. Природно, що білок, який здійснює «експорт» miR через пори ядерної оболонки, отримав назву експортін. Для захисту коротких РНК в протеїнової молекулі є тунель, надійно вкриває молекулу від «перетравлення» ферментами РНКаз. Потрапивши в цитоплазму, miR піддаються дії РНК-ази - ферменту, що розщеплює РНК, - що отримала назву «Дайсер» (Dicer - дослівно «формователь»), дія якого аналогічно діям, зробленим татом Карло над поліном, з якого він вирізав симпатичного Буратіно. Формоутворення сирої заготовки miR необхідно для її зв'язування з протеїном «Аргонавт» ^ go), на якому коротка РНК "упливає» в РИЗИК (RISC - RNA-Induced Silencing Complex). Останній являє собою великий протеїновий комплекс сайленсінга активності генів, функція якого включається РНК . Центральна роль Аргонавт в цьому комплексі полягає в тому, що саме цей протеїн пов'язує воєдино специфічну інформаційну РНК - копію даного гена-мішені - і розпізнавальної її miR. Зведення всіх компонентів древньої внутрішньоклітинної захисної системи призводить до того, що іРНК піддаються ферментативному розщепленню і команди гена не доходять до рибосом. Функція гена таким чином «замовчується», при цьому сам ген з генома не елімінується. Знаменита ремарка Пушкіна «Народ мовчить» найкращим чином ілюструє суть роботи коротких РНК, оскільки люди насправді голос не втратили.
Зараз це дивна властивість нового класу РНК активно використовується вченими в їх дослідженнях. Наведу зміст кількох останніх повідомлень. Нещодавно стало відомо, що процес самооновлення ембріональних стовбурових клітин регулюється «протиборчими» сімействами miR. Одні з них підтримують поділ клітин, а інші його припиняють, щоб почався процес диференціювання спеціалізованих клітин печінки, м'язів і т.д. МікроРНК допомагають здійснювати скринінг генів-мішеней, зокрема тих, білки яких необхідні для. зараження вірусом грипу та його розмноження в клітинах (таких генів ні багато ні мало майже три сотні!). У ході подібних досліджень відкрита незвичайна роль і численних ділянок ДНК, що відповідають за синтез рибосомних РНК, про які начебто було відомо буквально НД Втрата навіть деяких з них в експерименті веде до підвищення чутливості речовини життя до ДНК-пошкоджуючим агентам - ультрафіолету, рентгенівським променям і перекису водню. Ці ДНК-ові сайти дуже важливі для взаємодії хроматид боку батька або матері хромосом при мейозі. Відомо, що при перекресте відбуваються розриви обох ланцюгів ДНК, після чого їх необхідно відновлювати.
Наостанок згадаємо ще один клас РНК, а саме теломерні.
Теломера, що випливає з її грецької назви, являє собою кінцевий ділянку хромосом (кожна з них має, отже, дві теломери). Про роль теломер у підтримці цілісності хромосом необхідно розповідати особливо, тим більше, що за її відкриття нещодавно вручили Нобелівську премію. Довжина одноцепочной тіломірна ДНК вкорочується з кожним клітинним поділом, і досягнення критичного ліміту включає механізм апоптозу. Таким чином, теломери представляють собою чудові молекулярні годинник, який відраховує тривалість клітинної життя. Природно, що в ракових клітинах теломери при діленні не коротшають, відновлюючись до ембріональної довжини. При одній з форм раку білої крові (СМL, або хронічна мієлоїдна лейкемія) на піку загострення виявляється зниження рівня коротких РНК, який досить високий при хронічній стадії хвороби. Ген коротких РНК, введений в пухлинні клітини, які пересаджують мишам, «переводять» хворобу в хронічну стадію, чого не спостерігається без цього гена. Можна тільки додати, що РНК регулює активність клітинного ферменту, «родич» якого контролює синтез білків в дендритах - деревовидних відростках нервових клітин. Адже у білих клітин крові теж є відростки, за допомогою яких вони б'ються з «ворогами» організму. Раковим ж клітинам відростки потрібні для міграції та поширення ...
Приблизно така ж картина видно при вимиканні гена let (від лат. Lethum - смерть), короткі РНК якого пригнічують гени, відповідальні за самовідновлення клітин та підтримання їх у стволовому стані. Звідси зрозуміло, що в ембріональних стовбурових клітинах, як і в ракових, активність let пригнічена. Але короткі РНК проявляють себе і в інших областях. Відомо, що кінцевий шматок жіночої Х-хромосоми може відриватися, що призводить до розумової відсталості.
Сьогодні ми б'ємося над глобальною проблемою еволюції молекулярних процесів, що лежать в основі всього живого. І якщо раніше всі були спантеличені побудовою еволюційних древ з їх окремими гілками та гілочками, то ми намагаємося зрозуміти принципи інтегративності всього живого, яке буквально нанизано на найдавнішу молекулу, про деякі властивості якої ми до самого останнього часу і не підозрювали. Це загалом-то зрозуміло, оскільки науку роблять люди, яким властиво помилятися й шукати. Працюючи там, де світло, вони відкривають не те, що існує в живій природі, а те, що дозволяє сучасний їм рівень технологічного розвитку. Колись нуклеїнові кислоти виділяли з гною, дріжджів і тимуса. І ніхто не міг собі навіть уявити, що буде створена нова геномна індустрія, активно наближає нас до моменту, коли геном людини буде прочитуватися всього лише за день! А порівняльний скринінг геномів буде здійснюватися, зокрема, і за допомогою коротких мікроРНК.
За матеріалами Nature, Science.
Список літератури
Медична газета Ж 74 29.9. 2010