Цей файл узятий з колекції Medinfo http://www.doktor.ru/medinfo http://medinfo.home.ml.org E-mail: medinfo@mail.admiral.ru or medreferats@usa.net or pazufu @ altern. org FidoNet 2:5030 / 434 Andrey Novicov Пишемо реферати на замовлення - e-mail: medinfo@mail.admiral.ru
У Medinfo для вас найбільша російська колекція медичних рефератів, історій хвороби, літератури, навчальних програм, тестів.
Заходьте на http://www.doktor.ru - Російський медичний сервер для всіх!
ВСТУП
Якщо століття Х1Х по-праву увійшов в історію світової цивіліза-
ції, як Століття Фізики, то стрімко завершающемуся століття ХХ,
в якому нам пощастило жити, цілком ймовірно, уго-
Това місце Століття Біології, а може бути і Століття Генетики.
Дійсно, за неповних 100 років після повторного відкриття
законів Г. Менделя генетика пройшла тріумфальний шлях від на-
турфілософского розуміння законів спадковості та мінливості-
вості, через експериментальне накопичення фактів формальної
генетики до молекулярно-біологічного розуміння сутності ге-
на, його структури і функції. Від теоретичних побудов про
гені як абстрактної одиниці спадковості до розуміння його
матеріальної природи як фрагмента молекули ДНК, що кодує
амінокислотну структуру білка, до клонування індивідуа-
них генів, створення докладних генетичних карт людини і
тварин, ідентифікації генів, мутації яких пов'язані з
важкими спадковими недугами, розробки методів биотех-
нології та генної інженерії, що дозволяють направлено отримувати
організми із заданими спадковими ознаками, а також
проводити спрямовану корекцію мутантних генів людини, то
є генотерапія спадкових захворювань. Молекулярна ге-
нетіка значно поглибила наші уявлення про сутність
життя, еволюції живої природи, структурно-функціональних ме-
ханізмів регулювання індивідуального розвитку. Завдяки її
успіхам започатковано розв'язання глобальних проблем людства, свя-
чених з охороною його генофонду.
Природно, що можливість маніпуляції з індивідуаль-
вими генами людини і тварин ще недостатня для розумі-
ня функції всього геному, його організації в цілому, взаємо-
дії його частин у забезпеченні всього різноманіття механіз-
мов онтогенезу, тобто розвитку однієї клітини до цілого орга-
низма. Якщо додати до цього, що в геномі будь-якого виду за-
писана не лише програма індивідуального розвитку, але зако-
складованої і вся еволюція виду, тобто його філогенез, стано-
вится зрозумілим наскільки логічною і методично своєчасної
стала Міжнародна наукова програма "Геном людини". На-
ряду з аналогічними програмами для інших видів (лаборатор-
ні миші, нематоди) програма Геном людини, розпочата близько
10 років тому, вже до 2000 року дозволить повністю розшиф-
вать первинну структуру ДНК, тобто ідентифікувати всі
гени людини, їх регуляторні елементи. Захватиающая Одіссея
про спадковість, якої і є ця програма, безмірний-
але розширить наші уявлення про структуру та функції геному,
його еволюції, відкриє горизонти настільки захоплюючого, а, мож-
можна, і не менш небезпечного спрямованого впливу людини
на геном рослин, тварин і, що особливо ризиковано, на
свій власний геном. Важливо усвідомити, що це не завтрешній
день фундаментальної науки, не віддалені абстракції, але день
сегоднешний. Вона вже настала і став реальним незалежно від
нас, і, якщо не бути до них готовими концептуально і методи-
но, то мине крім нас.
Предлгаемая вашій увазі книга, дійсно,
являє собою введення в молекулярну генетику
спадкових хвороб і розрахована на досить широку
аудиторію медиків і біологів. Для більшості з вже складався-
шихся фахівців у цих областях - це реальна можливість
для самоосвіти, якій, на жаль, з роками ми так часто пре-
небрегаем, заплутавшись у повсякденних турботах. Для студентів
біофаку і особливо для студентів-медиків - ця книга цілком
може розглядатися в якості навчального посібника з молеку-
лярні основам медичної генетики. Однак, і для перших і
для других, на глибоке переконання авторів, багато років віддавши-
ших впровадження досягнень молекулярної біології в медіцінскуюя
практику, книга може служити в якості довідкового керів-
ництва з молекулярної генетики людини. Дійсно, ні
одна клінічна дисципліна (за винятком, може бути,
служби організації охорони здоров'я) не мислима сьогодні без
знань і певних навичок з молекулярної генетики. Ні
один біолог, зайнятий питаннями спадковості, мінливості-
вості, онтогенезу чи еволюції незалежно від конкретного біо-
логічного об'єкта, не може ігнорувати людини, як од-
ного з поки небагатьох біологічних видів з повністю
розшифрованої структурою геному. Швидко набирає сили мо-
лекулярная медицина, викладання азів якої все ще явно
недостатньо для майбутніх лікарів, насправді являє
собою принципово новий якісний рівень у розумінні
питань етіології, патогенезу, а, отже, і лікування
багатьох хвороб, як спадкової моногенної, так і муль-
тіфакторіальной природи.
На нашу думку, не тільки сучасний лікар і спеціа-
лист-біолог, але і кожна освічена людина сьогодні має
знати про тріумф Міжнародного Наукового Співтовариства в виконан-
нии програми Геном людини, в результаті якої успішно
розшифровуються всі гени людини, кожен з яких, будучи
виділеним з організму і проклонірованним може виступати в
як лікувального препарату для генотерапії. Про те, що вже
сьогодні ідентифіковано на генетичних картах більше 5 000
структурних генів і понад 60 000 поки невідомих смислових і
анонімних ДНК послідовностей. Про те, що всього за 5 років
після перших успішних спроб введення чужорідних маркерних
генів в клітини людини in vivo, число вже схвалених для
клінічних випробувань програм з генної терапії спадково-
них захворювань досягла понад 100! Ці підсумки представляються
особливо вражаюче якщо врахувати, що згідно з даними Все-
мирної Організації Охорони здоров'я близько 2,4% всіх новорож-
дених на земній кулі страждає тими чи іншими спадковими
порушеннями; близько 40% ранньої малюкової смертності та інва-
лідності з дитинства обумовлені спадкової патології-
їй. Не можна не згадати про реальні досягнення молекулярної
генетики в розшифровці спадкових факторів таких бичів
людства як ішемія серця, атеросклероз, діабет, онколо-
гические та інфекційні захворювання. Адекватно сприймати
відбувається на наших очах революцію в біології і в медици-
не, вміти скористатися її плодами привабливими і уникнути
небезпечних для людства спокус - ось що необхідно се-
годні і лікарям, і біологам, і представникам інших суміжних
спеціальностей, і просто освіченій людині.
Саме ця мета, ця надзавдання, поставлена перед дан-
ної монографією, що заповнює, на думку авторів, намітивши-
шійся у вітчизняній науковій літературі прогалину в області мо-
лекулярних аспектів медичної генетики і генетики людини.
Окремі огляди, монографії (Шишкін, Калінін, 1993), пере-
водна література з молекулярної біології і навіть грунтовний-
ні зведення, підводять щорічні підсумки робіт за програмою
"Геном людини" досить фрагментарні і стосуються лише від-
ділових аспектів проблем генодіагностікі і генотера-
пії. Розраховані переважно на фахівців з молекуляр-
ної біології. Завдання даної монографії не тільки висвітлити
сучасний стан справ в молекулярній діагностиці та ліку-
нии спадкових хвороб методами генної терапії, але,
головним чином, підготувати читачів, перш за все лікарів і
біологів, до розуміння і сприйняття цього методично і концеп-
туально досить складною обасті генетики.
Для досягнення поставленої мети нам уявлялося ло-
гічної почати виклад матеріалу з опису структури і сов-
ремінних методів аналізу ДНК, з загальних уявлень про її кло-
вання, секвенування, геномних бібліотека (Глава I).
Глава II повністю присвячена структурі генома людини, нової
трактуванні поняття "ген", генним домами, вариабильность
структурам геному. Генетичні карти, принципи їх побудови-
ня, функціональне і позиційне картування, молекулярні
маркери, сучасні досягнення в розробці фізичних і
хромосомних карт людини і в картуванні генів, відпові-
них за спадкові захворювання розглянуті в Главі III.
Глава IV цілком присвячена опису молекулярних методів де-
текціі як вже відомих мутаційних змін у структурних
генах, так і методів сканування передбачуваних мутацій оп-
ределенний генів. Опис прямих методів ідентифікації му-
Тацій доповнені непрямими методами, заснованими на молеку-
лярной маркування мутантних генів. Всі ці методи, як
прямі, так і непрямі, складають основу молекулярної ді-
агностики моногенних спадкових хвороб, широко викорис-
теризуються у генетиці людини при побудові генетичних карт,
дослідженні проблем філогенезу, у популяційної гентіке і в
геномної дактилоскопії, тобто для ідентифікації особи.
Докладного аналізу внутрішніх (ендогенних) чинників мутаген-
неза, а також принципам популяційного аналізу мутацій
присвячена Главі Y. Основні підходи, використовувані при вивче-
нии експресії генів у модельних безклітинних системах, на
рівні окремих клітин і цілих організмів наведені у Розділі
VI. Принципи молекулярної діагностики спадкових болез-
неї і, зокрема, пренатальної діагностики, а також осо-
вості виявлення гетерозиготного носійства в сім'ях
виского ризику, викладені у Розділі VII. Невелика за розміром,
але важлива також і для розуміння принципів генної терапії
Глава VIII стосується штучного створення генетичних мо-
делей спадкових захворювань, зокрема на базі
трансгенних жівоних. Описано використовувані при цьому методи
направленого перенесення чужорідних генів в еукаріотичні
системи. У Главі IX викладені основи генотерапії спадково-
них захворювань, розглянуті методи доставки чужорідної ДНК
в клітини людини in vitro і in vivo, переваги і не-
достатки існуючих векторних систем (фізичних, хіміч-
чних і біологічних), їх конструювання, преспективу
створення "ідеальних" векторних систем. Коротко розглянуто
підсумки вже проведених випробувань за генотерапії тих захворювань-
ний, для яких Програми клінічних випробувань вже схвалений-
ни або перебувають на стадії експерименту. У заключній
чолі (Глава X) ми вважаємо за доцільне підвести некото-
рие підсумки і більш докладно розглянути молекулярну діаг-
ностика трьох груп спадкових захворювань: (1) достатній-
але повно вивчену групу лізосомних хвороб накопичення;
(2) хвороби експансії (переважно нейродегенеративні
захворювання), що викликаються абсолютно новим раніше невідомим
типом так званих "динамічних" мутацій і (3) найбільш
часті, соціально значущі спадкові захворювання, за
пренатальної діагностики яких молекулярними методами вже
накопичено достатньо великий досвід в нашій лабораторії і в
інших медико-генетичних центрах Росії.
Отже, пропонована монографія розрахована на досить
широке коло читачів, але, перш за все, на медиків та біологіч-
гов, а також фахівців суміжних професій. Нам хотілося б
думати, що книга буде особливо корисною для студентів міді-
цінських інститутів та академій, лікарів курсів підвищення кваліфі-
фікації, співробітників медико-генетичних консультацій і цент-
рів, а також для студетнов-біологів, багато з яких, як
показує наш досвід, поповнюють ряди спеціалізованих діаг-
тичного лабораторій, медико-генетичних центрів та інсти-
Шовковичній.
ГЛАВА III
ГЕНЕТИЧНІ КАРТКИ, позиційних КЛОНУВАННЯ.
Розділ 3.1 Класифікація генетичних карт, оцінка
зчеплення.
Генетичні карти визначають хромосомну належ-
ність і взаємне розташування різних компонентів геному
відносно один одного. Можливість побудови таких карт
обумовлена двома фундаментальними характеристиками генома:
лінійним характером локалізації генів в хромосомах (це оп-
чається лінійністю молекули ДНК) і відносної ста-
бильности розташування облігатних елементів геному У МЕЖАХ
лах виду. При побудові генетичних карт використовують різні
підходи. У першу чергу, до них відносяться аналіз генети-
тичного зчеплення на основі визначення частот мейотичний
рекомбінації в інформативних сім'ях та вивчення особливостей
успадкування ознак, зчеплених з маркерними хромосомними
перебудовами. По-друге, дослідження експресії генів або
пошук специфічних послідовностей ДНК у клітинних гинув-
рідах, що містять лише частину генома людини - одну або
кілька хромосом або їх фрагменти. У ряді випадків з цією
метою використовують механічний сортінг цілих хромосом і навіть
їх відносно невеликих участковв. Ці прийоми дозволяють
прив'язати картіруемий ген до певної хромосомі і навіть до
певному фрагменту хромосоми. За допомогою комплексу весь-
ма тонких методів хромосомного аналізу, перш за все, мето-
дов гібридизації in situ (див. Главу I) вдається картировать
окремі гени на хромосомах людини часто з точністю до
одного бенду. І, нарешті, методами молекулярного аналізу
здійснюють фізичне картування послідовностей
ДНК, локалізованих в специфічних ділянках хромосом. Потім
проводять ідентифікацію в цих послідовностях транскр-
біруемих областей, тобто генів, з наступною ізоляцією і
клонуванням відповідних їм повнорозмірних молекул
кДНК. Кожен з розглянутих етапів аналізу структури гено-
ма завершується побудовою карт генів, що розрізняються за оди-
ніцам вимірювання відстаней між окремими елементами цих
карт, масштабами, за насиченістю або ступеня деталізації на
різних ділянках геному. Відповідно розрізняють карти
зчеплення, генетичні карти, цитогенетичні карти інді-
Індивідуальних хромосом і фізичні або молекулярні карти оп-
ределенний ділянок ДНК. Для повної молекулярної ідентифікації-
ції окремих елементів геному, тобто визначення їх гра-
ниць, структури і нуклеотидної послідовності, необхідно
поєднання всіх типів карт в місцях локалізації цих елементів-
тов.
Першим кроком на шляху побудови генетичних карт є-
ється формування груп зчеплення генів, контролюючих
різні спадкові ознаки, і дослідження їх взаємної-
ного розташування в цих групах. На наступному етапі визна-
начають відповідність між генетичними групами зчеплення
і цитогенетичних ідентифікованими хромосомами або їх
фрагментами. Цитогенетичну ідентифікацію хромосом прово-
дять з використанням методів диференціальної забарвлення
(Див.розділ 3.2). У міру появи все більшого числа лока-
лізованних ознак ефективність побудови генетичних
карт значно зростає, оскільки збільшується число
маркованих ділянок хромосом і, таким чином, появля-
ється можливість комбінованого використання різних
експериментальних підходів для більш докладного досліджень-
ня цих ділянок.
Принципова схема картування невідомих генів,
представлена на Рис.3.1, включає наступні етапи. 1. Ви-
яснень групи зчеплення; 2. Пошук найближчих фланкують
маркерів; 3. Визначення фізичної області (ДНК-послідовно-
ності), що включає шуканий ген; 4. Клонування набору
фрагментів ДНК, що перекривають досліджувану область; 5. Виокрем-
ня з цього набору клонів, що містять транскрибуються
ДНК-послідовності, імовірно відповідні
гену або його фрагментом; 6. Аналіз специфічних мРНК і кло-
нирование кДНК-послідовності; 7. Секвенування і
ідентифікація самого гена (Wicking, Williamson, 1991).
Розглянемо докладніше цю схему.
Побудова карт зчеплення засноване на вивченні про-
процесів розбіжності і рекомбінації гомологічних хромосом у
мейозі. Генетичні ознаки, локалізовані в різних хро-
мосом, не зчеплені один з одним, тобто передаються від
батьків дітям незалежно, і частота їх рекомбінації (Q)
складає 0.5. Це обумовлено випадковим характером
розбіжності гомологічних хромосом у мейозі під час редук-
ційного поділу. Гени, локалізовані в одній хромосомі,
рекомбінують за рахунок кросинговеру, тобто за рахунок обміну
ділянками гомологічних хромосом у процесі їх спаровування в
мейозі (Рис.3.2). При цьому порядок генів не порушується, але
відповідний екзоном 23-34 F8VWF-гена (Mancuso et al.,
1991). Ідентифіковані в ньому сплайсінговие і нонсенс му-
тації перешкоджають утворенню функціонального транскрипту.
Найбільше число мутацій ідентифіковано при типі II
хвороби Віллебранда. Переважна більшість з них - заміни
амінокислот, найчастіше відбуваються в результаті транзицію
в CpG динуклеотид (Cooney et al., 1991; Randi et al.,
1991; Donner et al., 1992). Мутації при хворобі типу IIA
кластеріровани в A2 домені, де імовірно локалізована
сайт протеолетіческого відщеплення, в той час, як при типі
IIB - в домені, що забезпечує взаємодію з тромбоцітар-
вим глікопротеінові комплексом (Ib-IX рецептором). Велика
група мутацій при формі захворювання IIB локалізована в сег-
менти з 11 амінокислот всередині єдиного дисульфідного
вигину (loop), що з'єднує цистеїну в 509 і 695 положеннях.
При формі захворювання Нормандського типу, мімікріющей гемофі-
лію A, фактор Віллебранда структурно і функціонально норма-
льон, за винятком того, що порушено його взаємодія з
чинником YIII. У таких пацієнтів дійсно ідентифікує-
ються міссенс мутації, розташовані в області гена, кодую-
щей сайти зв'язування фактора VIIIR з фактором VIIIС
(Mazurier, 1992).
Тип III представляє собою найбільш важку форму забо-
левания, при которй фактор VIIIR, як правило, відсутня.
Отримано докази, що такі пацієнти є гомоз-
готами або компаундами по нонсенс мутацій, що виявляється в
одній дозі у хворих типу I (Zhang et al., 1992). При цьому
ж типі захворювання виявлено кластер мутацій зі зсувом рамки
зчитування, вознікаюшіх в результаті делеції одного з 6 ци-
тозінов в положенні 2679-2684 екзона 18. Саме така мута-
ція була виявлена в сім'ї, зареєстрованої вперше фон
Віллебранда в 1926 році. У деяких членів цієї родослов-
іншої як було встановлено нещодавно, вона перебувала в компаунді
з мутацією P1266L, що виникла в результаті рекомбінації між
геном F8VWF і псевдогенами (див. вище) (Zhang et al., 1993).
Вибір адекватного методу молекулярної діагностики бо-
лезни Віллебранда в значній мірі зумовлюється пра-
вильность попередньої клінічної та лабораторної діаг-
стики і результатами медико-генетичного консультірова-
ня, що дозволяє досить чітко визначити характер Насл-
нання захворювання в родині високого ризику та встановити його
форму. На жаль, досягти цього далеко не завжди можливо,
а відсутність характерних мажорних мутацій значно знижує
ет ефективність прямої молекулярної діагностики. Разом з
тим, принаймні, в деяких популяцій (Фінляндія, Шве-
ція) виявлені "гарячі" точки мутацій, якими є
Екзони 18 і 42, при типі II хвороби Віллебранда (Holmberg et
al, 1993). У популяціях Росії такі "гарячі" точки поки не
виявлено, хоча дослідження в цьому напрямку ведуться
(Асєєв, Шауі Абдельрхані, 1995). Значно більш перспек-
тивної на сучасному етапі є непряма діаг-
ностика. У промоторної частини гена, в інтрони
15, 17, 23, 40, 41, 49, а також у екзона 26, 35, 39 ідентифікації
ваних численні поліморфні сайти рестрикції з
досить високим рівнем поліморфізму. Особливо перспек-
тивним для діагностики є поліморфізм інтрони
40, що представляє собою дві області варіюють за кількістю
тетрамерних повторів ТСТА на відстані 212 п.о. Ампліфікації-
ція цієї частини інтрони 4О за допомогою ПЛР, рестрикція AluI з
подальшим електрофоретичного розділення дозволяє іден-
тіфіціровать до 98 алельних варіантів цього поліморфізму
(Mercter et al., 1991). Настільки виражений поліморфізм позволя-
ет з високою ефективністю маркувати мутантних хромосому
(Ген) і простежити її передачу в потомстві.
Відомості про генокоррекціі хвороби Віллебранда в доступ-
ної літературі не виявлені.
10.4.6 Фенілкетонурія.
Фенілкетонурія (ФКУ) - одне з найбільш частих аутосом-
но-рецесивних захворювань, обумовлених спадковим де-
тів фенілаланінгідроксилази, що призводить при відсутності
своєчасної терапії до важкої розумової відсталості. У Єв-
ропе одна хвора дитина зустрічається в середньому серед 10 -
17 000 новонароджених. В Ірландії та Шотландії частота ФКУ
досягає 1 на 4500 новоржденних (DiLella et al., 1986).
Поширена ФКУ також у Польщі і в Білорусії. У Росії
частота захворювання коливається в межах 1: 8 - 10 000.
Дуже важлива рання діагностика ФКУ, так як при своєчасне
ном призначення пацієнту дієти, яка не містить фенілаланін,
розумова обмеженість, як правило, не розвивається або
має дуже стерті форми. Розроблено біохімічні скрін-
рующие тести діагностики ФКУ у новонароджених.
Гідроксилювання фенілаланіну є досить
складним процесом, в якому беруть участь, принаймні, 3
ферменту. Фенілаланінгідроксилази (РАН), ГОМОПОЛІМЕРНА фер-
мент, що складається з субодиниць з молекулярною вагою 52 кД,
продукується клітинами печінки і регулює перетворення L-фе-
нілаланіна в L-тирозин. Його дефіцит призводить до накопичення
фенілаланіну в сироватці крові. Гіперфенілаланінемія може
виникати також при дефіциті дігідроптерідінредуктази і при
дефектах синтезу біоптеріна. Однак, ці захворювання, хоча і
супроводжуються зниженням активності РАН, значно відрізнялися
ються від класичної ФКУ і не корегуються дієтою, позбавленої
фенілаланіну.
PAH-ген транскрибується в гепатоцитах з утворенням
мРНК розміром 2.4 кб. Найбільш поширений тип мутацій
- Однонуклеотдние заміни (міссенс, нонсенс, мутації в сайтах
сплайсингу), причому часто ці мутації є результатом
транзицію в 22-х виявлених у PAH-гені CpG динуклеотидами.
Великих структурних перебудов не знайдено, хоча є не-
великий відсоток точкових делецій. Відзначається нерівномірний
характер внутрігенной локалізації мутацій (Scriver et
al., 1989). Так, найбільше число міссенс мутацій зустрічається
в центральній частині гена: у екзоні 7, що кодує ділянку
зв'язування білка з кофактором, де располжено 5 CpG дуплі-
тов, а також у екзона 9 і 12. Переважний район лока-
лізації делецій - Екзони 1, 2 і 3.
Втурі РАН-гена локалізованоно більше 10 поліморфних сай-
тов рестрикції, причому розподілу гаплотипів за цими мар-
керам серед представників різних рас і етнічних груп
значно різняться. Виявлено сильне нерівновага по
зчепленню між певними мутаціями в PAH-гені і гапло-
типами за внутрігенним сайтів рестрикції. Так, кожна з 5-и
найбільш частих у європейських популяціях мутацій асоційова-
вана тільки з одним з більш, ніж 70 гаплотипів по 8 рест-
рікціонним поліморфізмом (Eisensmith et al., 1992). Мажорна
в західно-європейських популяціях сплайсінговая мутація в до-
норнам сайті 12-го інтрони зчеплена з гаплотипом 3 (DiLella
et al., 1986). У той же час інша мутація в екзоні 12 -
R408W, найбільш поширена на сході Європи, в част-
ності в Білорусії і Росії, і не знайдена в Японії та Кі-
тає, пов'язана з гаплотипом 2 (DiLella et al., 1987). Мажорна в
Європі мутація R158Q в 40% зчеплена з гаплотипом 4, найбільш
частим серед жителів Японії і Китаю. Поширена в Тур-
ції сплайсінговая мутація в інтроні 10, призводить до
9-і-нуклеотидної інсерцій, асоційована з "південними" гаплоті-
пами 6, 10 і 36.
Зіставлення частот різних гаплотипів по поліморфи-
вим сайтів рестрикції і мутацій в PAH-гені у різних популя-
ціях, національності і етнічних групах дозволяє зробити
висновок, що більшість з них, або навіть всі, відбулися вже
після дивергенції рас. Поширення мажорних мутацій гена
РАН у різних популяціях та етнічних групах пов'язано з
ефектом засновника. За деякими оцінками ці мутації віз-
никнули одноразово від декількох сотень до декількох тисяч років
тому. Проте, у ряді випадків розподіл мутацій не
може бути пояснити в генетичних термінах, порівнянних з
демографічної історією. Безсумнівно доведеними є
приклади незалежного та рекурентного виникнення в різних
популяціях таких мутацій, як R261Q або R158Q. Високі попу-
коізоляційні частоти специфічних мутацій у PAH-гені пов'язані,
мабуть, не тільки з ефектом засновника та / або з сущест-
вованіе ендогенних механізмів підвищеного мутагенезу, а й
з перевагою гетерозигот. Висловлено припущення, що
носійство РАН - мутацій підвищує стійкість організму до
токсичного ефекту охратоксину А, що продукується деяких-
ми видами грибкової цвілі (Aspergillus, Penicillium), раз-
розвиваючих при зберіганні зерна та інших продуктів
(Woolf, 1986). Передбачається, що вагітні жінки, Гете-
розіготние пл РАН-мутацій мають меншу ймовірність набор-
та, індукованого дією цих мікотоксинів. Можливо,
висока частота ФКУ в Ірландії і Шотландії частково може
бути пояснила м'яким і вологим кліматом цих країн,
сприяючому зростанню таких грибів.
У медичній практиці використовується як пряма, так і
непряма діагностика мутацій в PAH-гені. Розроблено дуже
швидкий і ефективний метод ПЛР / StyI-діагностики Cамой
частої в Росії (понад 70%) мутації R408W (Ivaschenko,
Baranov, 1993; Іващенко та ін, 1993). Дігностіка інших ма-
жорна мутацій в PAH-гені здійснюється методами ПЛР + АСО,
аллель-специфічної ампліфікації (ARMS), методом одноногого-
вого конформаційного поліморфізму (SSCP) (див. Главу IY).
При первинному обстеженні родини надзвичайно зручно викорис-
вувати три поліморфні нейтральні мутації в кодонах 232,
245 і 385, зчеплені в Кавказьких популяціях з визначені-
ми ПДРФ-гаплотипами, а значить і зі специфічними мутантними
алелями. Кожна з цих мутацій створює новий сайт рестрік-
ції і тому їх алельному стан може бути легко проти-
бенкетував з допомогою ампліфікації і рестрикції (Kalaydjieva et
al., 1991). При аналізі сім'ї, в якій відсутні легко
ідентифікуються прямими методами мутації, молекулярна ді-
агностика може бути проведена за допомогою внутрігенних полі-
морфних сайтів рестрикції. Зручний, зокрема, Msp1-полі-
морфізм у 8-му екзоні, аналіз якого може бути здійснений
методом ПЛР / рестрикції (Wedmeyer et al., 1993). Останнім
часом з'явилися дані про наявність високополіморфних сайтів
всередині інтронів гена РАН, які виявилися особливо зручні-
ми для молекулярного маркування мутантних алелей (Goltzov
et al.1994).
Генокоррекція ФКУ успішно здійснена в дослідах in
vitro і в даний час знаходиться на стадії експеримен-
ментальною розробки (Табл.9.2. Глава IX).
10.4.7 Синдром Леш-Ніхана.
Синдром Леш-Ніхана - рецесивне зчеплене зі статтю за-
болевание, обумовлене спадковою недостатністю ги-
поксантін-гуанін фосфорибозилтрансферази (HPRT) і супроводжується
дающееся важкими ураженнями центральної нервової системи.
Фермент HPRT бере участь у регуляції метаболізму пуринів,
контролюючи перетворення гуаніну і інозину у відповідні
рибонуклеотиди. Ген HPRT експресується в усіх типах клітин-
струм з утворенням мРНК розміром 654 п.н.. Культивовані
лінії клітин, дефектні по HPRT, стійкі до 8-азагуаніну і
6-тіогуанін, і таким чином, можуть бути відібрані на відповід-
відних селективних середовищах. Гетерозиготні носії му-
Тацій по HPRT-гену можуть бути легко виявлені за наявності 2-х
типів клітин - стійких і чутливих до 8-азагуаніну, в
первинній культурі фібробластів або в клітинах волосяних лу-
ковіц. У більшості мутантних клітинних ліній кількість
мРНК нормально, а білок відсутній. У частини пацієнтів хоча
і транскрибується досить багато мРНК, але в цих молеку-
лах виявляються структурні та функціональні аномалії. У
невеликому відсотку випадків у хворих не вдається виявити ні
білка, ні мРНК.
У 15% хромосом у хворих з синдромом Леш Ніхана ген
HPRT залучений у великі структурні перебудови, корторие
можуть бути виявлені методами Саузерн або Нозерн блот-Гібрит-
дізаціі. Синдром Леш Ніхана одне з перших моногенних
спадкових захворювань, для яких була проведена молі-
кулярного ідентифікація точкових мутантних алелей. Саме на
цій моделі вперше був розроблений і випробуваний метод аналізу
мутацій, заснований на розщепленні РНК-ДНК гібридів рібонук-
леазой А в місцях негомологічноно спарювання (метод розщепів-
лення рибонуклеази А - см.главу VI, Gibbs, Caskey, 1987).
Комбінація методів блот-гібридизації та розщеплення рібонук-
леазой А дозволяє виявити до 50% мутацій. В даний час
в гені HPRT знайдено більше 100 спорадичних мутацій, полови-
на яких - Однонуклеотидний заміни типу міссенс, нонсенс і
в сайтах сплайсингу. Близько 40% мутантних хромосом мають
структурні аномалії, у тому числі великі делеції, браку
окремих зкзонов і мікроделеціі одного або декількох нук-
леотідов. У HPRT-гені, практично, відсутні мутації, до-
мінінірующіе за частотою у будь-яких популяціях. Виняток
складає нонсенс мутація R170TER, яка становить близько
15% всіх нуклеотидних замін (Gibbs et al., 1989). Також як
і при гемофілії мутації гена HPRT частіше виникають у сперма-
патогенезу, ніж в оогенезі. Вірогідність мутації зростає
з віком батька. Ідентифіковано 3 HPRT-псевдогени в хро-
мосом 3, 5 і 11 (Stout, Caskey, 1984).
Описані поодинокі випадки синдрому Леш Ніхана у гетерозі-
Готня дівчаток. При цьому, як правило, хвороба розвивається
внаслідок невипадковою інактивації X-хромосоми, не утримуючи-
щей мутації (Ogasawara et al., 1989). Однак, у 3-х жінок -
облігатних носійок мутацій в HPRT-гені, селективний тест
не виявив присутності мутантних клітин в культивованих фиб-
робластах і волосяних цибулинах. У зв'язку з цим висловлено
припущення, що певні мутації гена HPRT знаходяться
в нерівноважному зчепленні з неідентифікованої летальної
мутацією в X-хромосомі, що і призводить до селекції клону кле-
струм тільки з одного (мутантної або немутантной по гену HPRT)
X-хромосомою (Marcus et al., 1992).
Молекулярна діагностика хвороби Леш-Ніхана можлива
прямими і непрямими методами. Прямий варіант заснований на про-
веденні зворотної транскрипції мРНК, її ампліфікації,
SSCP-аналізі одноланцюгових ДНК фрагментів з їх подальшим
секвенуванням (см.главу VI). Непряма діагностика пре-
редбачає маркування мутантної хромосоми за допомогою по-
ліморфних сайтів (зокрема, локусу DXS52 - зонд
St14/TaqI).
Як ми вже зазначали (Глави VII, VIII), перша Трансген-
ва тваринна модель спадкового захворювання людини,
сконструйована шляхом направленого перенесення мутації в
культивовані ембріональні стовбурові клітини, була отримана
для синдрому Леш-Ніхана (Hooper et al., 1987; Kuehn et al.,
1987). На цій моделі вперше була проведена генокоррекція
спадкового дефекту in vivo. Ці успіхи значною
мірою пов'язані з існуванням селективних середовищ, дозволяю-
щих вести автоматичний відбір мутантних клітин. Взагалі,
синдром Леш-Ніхана являє собою ідеальну систему не
тільки для вивчення пуринового метаболізму, але і для вирішення
багатьох теоретичних питань біології та медицини
(Seegmiller, 1989; Maraus et al., 1993; Boyel et al., 1993).
Складність генокоррекціі захворювання, однак, полягає в
необхідності забезпечення ефективної доставки гена HPRT
(Або його кДНК) безпосередньо в мутантні нервові кліти-
ки. Ця проблема ще не вирішена. Тому реальні клінічні
програми генотерапії цього захворювання на сьогоднішній день
відсутні (см.главу IX).
10.4.8 Хвороба Вільсона-Коновалова.
Хвороба Вільсона-Коновалова (БВК) - гепатолентикулярна
дегенерація - аутосомно-рецесивне захворювання, обумовлений-
ве спадковим дефектом однієї з мідь-транспортувальних
АТФаз. У хворих різко знижена концентрація основного
мідь-яке містить білка плазми крові - церулоплазміну і в
меншою мірою - цитохромоксидази, ще одного білка, учас-
вующего у метаболізмі міді. Виділяють, принаймні, 3
форми БВК (Cox et al., 1972). При рідкісної атипової формі,
імовірно Німецького походження, у гетерозигот
зміст церулоплазміну знижено, принаймні, в два
рази. При двох інших, типових формах - слов'янської та юве-
нільной, зміст церулоплазміну у гетерозигот знаходиться в
межах норми. Слов'янський тип БВК характеризується порівняй-
тельно пізнім початком і переважно неврологічної
симптоматикою. Ювенильная форма частіше зустрічається в Західній
Європі та провідними в етіології захворювання є печеноч-
ні порушення. Серед євреїв-ашкеназі зустрічається БВК з позд-
ним початком і майже нормальним вмістом церулоплазміну в
сироватці крові хворих.
Ген БВК, ідентифікований у 1993р. незалежно відразу в
2х лабораторіях США, являє собою мідь-транспортують-
щую АТФазу P типу з 6-ма метал-зв'язуючими районами. Ген
має 60% гомології по нуклеотидного складу з раніше ідентифікації
ваних геном АТФ-ази (АТР7А), мутантні при хворобі
Менкеса (Bull et al., 1993; Petruchin et al., 1993; Tanzi et
al., 1993). За аналогією з геном хвороби Менкеса, також
обумовленої порушенням транспорту міді, ген БВК названий
АТР7В. Два пацієнти з БВК виявилися гомозиготними по 7-нукл-
отідной делеції в кодує області гена ATP7B, що дока-
зувати його ідентичність гену БВК (Petruchin et al, 1993).
Ген експресується у клітинах печінки, мозку, нирках, лімфо-
вузлах. Типовим для експресії АТР7В виявився альтернативний
сплайсинг двох і більше екзонів центральної частини гена
(6, 7, 8, 12 і 13).
Кодований ATP7B-геном білок містить кілька мемб-
ранних доменів, АТФ-консенсусну послідовність, сайт
фосфорилювання і, принаймні, 2 мідь-зв'язуючих сай-
ту. У мозку, печінці, нирках і ломфоузлах виявлені ізоформи
білка, відповідні продуктам альтернативного сплайсингу
гена АТР7В. Їх призначення та функції поки невідомий. У гені
АТР7В ідентифіковані поліморфні мікросателітних маркери,
а також близько 10 поліморфних сайтів рестрикції. У даний
час в гені АТР7В ідентифіковані більше 30 мутацій, у тому
числі 14 дрібних делецій / інсерцій, 2 - нонсенс мутації, 15 -
міссенс мутацій, 3 - сплайсінговие мутації. Діагностичну
цінність для європейців представляють мутації His1070Gln і
Gly1267Lys, зареєстровано у 28% і 10% всіх мутантних хро-
мосом, відповідно (Thomas et al., 1995).
Наприкінці даного розділу представляється доцільно із
різним коротко розглянути інші досить часті моног-
ні захворювання, для яких показана і проводиться молеку-
лярная діагностика, в тому числі і пренатальна, в інших ме-
дико-генетичних центрах Росії і, перш за все, в Лабора-
торії молекулярної діагностики Інстітутата клінічної гені-
тики РАМН (Москва).
10.4.9 Адрено-генітальний синдром.
Адрено-генітальний синдром - (вроджений дефіцит
21-гідроксилази) - досить поширене аутосомно-ре-
цессівное захворювання. Частота "класичних" форм 1:10 000
новоржденних, "некласичної" - близько 1% в популяції. В за-
лежно від характеру порушення функції гена і, відповід-
повідно клінічних проявів "класична форма" під-
разделляется на два варіанти: 1. летальна сольтеряющая фор-
ма; 2. нелетальна - вірілізірующая форма, пов'язана c з-
Битків андрогенів (Morel, Miller, 1991).
У локусі 6р21.3, всередині складного супергенетіческого
комплексу HLA ідентифіковані два тандемної розташованих
21-гідроксилазних гена - функціонально активний CYP21B і
псвдоген - CYP21А, неактивний внаслідок делеції в 3-м екзо-
не, інсерцій зі зсувом рамки зчитування у 7-му екзоні і
нонсенс мутацій - у 8-му екзонів. Ген і псевдоген розділені
смислової послідовністю гена С4В, що кодує 4-й фак-
тор комплементу. Обидва гена складаються з 10 екзонів, мають довжину
3,4 кб і відрізняються тільки по 87 нуклеотидам. Висока сте-
пень гомології і тандемною розташування указвают на спільність
еволюційного походження цих генів. Цікаво відзначити,
що такі ж тандемної розташовані гени 21-гідроксилази
(Звані також Р450с21) виявлені і в інших ссавців-
щих, причому у мишей, на відміну від людини, активний тільки
ген CYP21A, але не CYP21B, тоді як у великої рогатої ско-
та функціонально активні обидва гени.
Білок-21-гідроксилази (Р450с21-мікросомальних цітох-
ром 450) забезпечує перетворення 17-гидроксипрогестерона в
11-дезоксикортизола і прогестерону - у дезоксикортикостерон.
У першому випадку виникає дефіцит глюкокортикоїдів і, перш
за все, кортизолу, що в свою чергу стимулює синтез
АКТГ, і веде до гіперплазії кори надниркових залоз (вірілірующая
форма). Порушення перетворення прогестерону в дезоксіпрогесте-
рон веде до дефіциту альдостерону, який у свою чергу нару-
щує здатність нирок утримувати іони натрію і призводить до
швидкої втрати солі плазмою крові (сіль втрачає форма).
Як і у випадку гемофілії А, наявність поруч з кодований
геном гомологічною ДНК послідовності часто веде до
порушень спаровування в мейозі і, як наслідок цього, до
конверсії генів (переміщення фрагмента активного гена на
псевдоген), або до делеції частини смислового гена. В обох
випадках функція активного гена порушується. На частку делецій
припадає близько 40% мутацій, на частку переходів - 20% і при-
мірно 25% складають точкові мутації. Згідно отечествен-
вим даними в разі найбільш важкої сольтеряющей форми АГС,
на частку переходів припадає понад 20% мутантних хромосом,
на частку делецій - близько 10% (Evgrafov et al., 1995).
Непряма діагностика АГС можлива за допомогою типування
тісно зчеплених з геном CYP21B алелів HLA A і HLA B генів,
а також алелей гена HLA DQA1. Пряма ДНК діагностика АГС
заснована на ампліфікакціі за допомогою ПЛР окремих фрагментів
генів CYP21B і CYP21A, їх рестрикції ендонуклеаза HaeIII
або RsaI та аналізі отриманих фрагментів після електрофорезу
(Evgrafov et al., 1995).
10.4.10 Спинальная м'язова атрофія.
Спінальна м'язова атрофія (СМА) - аутосомно-рецесію-
ве захворювання, характеризується ураженням моторних нейро-
нов передніх рогів спинного мозку, в результаті чого роз-
вають симетричні паралічі кінцівок і м'язів тулуба.
Це - друга після муковісцидозу найбільш часте летальну
моногенне захворювання (частота 1: 6 000 новонароджених).
СМА підрозділяється на три клінічні форми. Тип I. Гостра
форма (хвороба Вердніга-Гоффмана), проявляється в перші 6 ме-
сяців життя і призводить до смерті вже в перші два роки; Тип
II. Середня (проміжна) форма, пацієнти не можуть стояти,
але зазвичай живуть більше 4-х років; Тип III. Ювенильная форма
(Хвороба Кугельберга-Веландера) - прогресуюча м'язова
слабкість після 2-х років. Всі три форми являють собою ал-
паралельний варіанти мутацій одного гена SMN (survival motor
neurons), картіровано в локусі D5S125 (5q13) і ідентифі-
товки методом позиційного клонування (см.главу III)
в 1995р (Lefebvre et al. 1995). У цієї поки єдиною ра-
Боте показано, що ген SMN розміром всього 20 000 п.о.состоіт
з 8 екзонів. мРНК цього гена містить 1 700 п.о. і кодує
раніше невідомий білок з 294 амінокислотних залишків з
молекулярним вагою 32 кілодальтон.
Ген дуплицировать. Його копія (можливо варіант псевдогени-
на) розташовується трохи ближче до Центромера і відрізняється
від гена SMN наявністю 5-та точкових мутацій, що дозволяють отли-
чить обидва гени шляхом ампліфікації екзонів 7 і 8 і їх дослід-
ристанням методом SSCP аналізу (см.главу IV). Ген названий
сBCD541, за аналогією з первісним варіантом назви для
тіломірна копії, т 4о 0Е 4сть 0гена SMN, tBCD541. Ген cBCD541
експресується, але на відміну від гена SMN його сДНК подверга-
ється альтернативного сплайсингу з втратою екзона 7.
Відсутність гена SMN (tBCD541) у 93% хворих (213 з 229),
його розірвана (interrupted) структура у 13 обстежених
пацієнтів (5.6%) і наявність серйозних мутацій у решти
3-х хворих дали підставу саме дану тіломірна копію
гена вважати відповідальною за захворювання. Істотно отме-
тить, що Центромерна копія гена виявлена у 95 4. 05% біль-
них, 4тогд 0а 4как 0 отсутств 4ует вона 0 тільки в 4,4% 4 пацієнтів 0.
У безпосередній близькості від тіломірна кінця гена
SMN ідентифікований ще один ген - ген білка-інгібітора зап-
рогаммірованной загибелі нейронів (neuronal apoptosis
inhibitory protein-NAIP). При важких клінічних формах
СМА (Тип I), обумовлених делеція, мабуть, нерідко
відбувається втрата гена NAIP.
Відповідно до гіпотези авторів СМА виникає при гомозигот-
ном стані мутацій (звичайно-делецій) в гені SMN, 4прі цьому
различ 4ія між 0форм 4амі 0СМА визначаються двома основними фак-
торами: 1. кількістю копій гена cBCD541 (дві - у разі Типу I
і чотири (що виникають внаслідок конверсії між SMN і
cBCD541) - у разі Типу III), 2. наявністю або відсутністю
ген 4а 0NAIP. 4С 0реді всіх обстежених СМА-хворих 4Не
4обнаружени 0случа 4 і одночасної 0делеціі обох гомологічних
генів 4 - 0SMN (tBCD541) і сBCD541 4, що 0указивает, на думку
авторів, 4на те, 0что така аберація повинна виявлятися як
домінантна леталей ще в ембріогенезі.
Деякі положення цієї, безумовно, основоположною
роботи французьких авторів, мабуть, ще потрібно уточнити-
ня, проте, вже зараз вона зробила можливою пряму молеку-
лярні діагностику СМА у 98,6% хворих. З цією метою прово-
диться ампліфікація еконо 7, який відсутній у придушую-
ного більшості хворих. Нормальний екзон 7 (ген SMN) диф-
ференціруют від мутантного варіанта (ген cBCD541) c допомогою
SSCP аналізу. При необхідності можлива непряма діаг-
ностика - ПЛР аналіз дінуклеотідних (CA) повторів ДНК ло-
кусов D5S125; D5S112; D5S127; ПДРФ-аналіз з фланкирующие
ДНК-зондами MU, 105-153RA; 153-6741 GT.
10.4.11 Атаксія Фридрейха.
Атаксія Фридрейха (АФ) - порівняно рідкісне (1: 22
-25000) Аутосомно-рецесивне захворювання, характерізующе-
еся прогресивної дегенерацією нервових клітин мозочка. Ген
АФ не ідентифікований, але досить точно картірован на
хромосомних (9q13-q21) і фізичних картах ДНК-маркерів. На-
амо тісне зчеплення гена АФ показано для локусу D9S5
(Зонд 26р). Сконструйовані космідние бібліотеки та
складені докладні фізичні карти області 4 0геномной ДНК
хромосоми 9, що включає локус D9S7 і, імовірно, ген
АФ. Визначено положення гена ФА по відношенню до інших флан-
кірующім молекулярним маркерами (Fujita etal., 1991; Wilkes
et al., 1991) 4. 0В даний час відомо, принаймні,
5 таких ДНК маркерів: GS4, MCT-112, GS2-дистальні і мік-
росателлітние маркери FD1 (на відстані 80 кб 4) 0і MLS1 (на
відстані 150 кб) - проксимальні. Вивчено особливості ал-
лельного поліморфізму цих систем для різних популяцій
Західної Європи. Для всіх 5 молекулярних маркерів з'ясовані
гаплотипи, зчеплені із захворюванням. Гаплотипи обох мік-
росателлітних маркерів опинилися в абсолютному генетичному
нерівновазі з АФ, що доказивет їх дуже близьке розта-
ються на генетичній карті по відношенню до мутантному гену
АФ (Pianese et al., 1994).
Діагностика АФ поки можлива тільки непрямими методами.
ПДРФ аналіз за допомогою ДНК-зондів на дистальні поліморфні
сайти, або ПЛР аналіз поліморфізму проксимальних по відношенню-
ням до гену АФ мікросателітних маркерів MLS1 або FD1.
Нами розглянуті лише деякі моногенні спадково-
ні хвороби, умовно розділені на три підгрупи, виходячи,
головним чином, з того наскільки вони вивчені з молекулярно
-Генетичних позицій, їх актуальності для пренатальної ді-
агностики і якою мірою вони важливі для медико-генетичної
служби нашої країни. Більше того, історично склалося так,
що саме такі захворювання як муковісцидоз, міодистрофія
Дюшенна, гемофілія А, фенілкетонурія, то 4 0есть 4 0соціально най-
більш значущі, раніше за інших генних хвороб стали предме-
тому детального молекулярного аналізу в нашій лабораторії і в
інших медико-генетичних центрах і науково-практичних
підрозділах Росії (див. Баранов, 1991, 1994;
Baranov, 1993; Євграфов, Макаров, 1987).
Природно, що розглянутими нозологіями аж ніяк не
вичерпується список тих хвороб, які є об'єкта-
ми молекулярних досліджень у нашій країні. Наприклад, з
огляду випали такі моногенні 4 0болезні як гіперхолестеріне-
мія, гемоглобінопатії, дефіцит альфа-1 антитрипсину, мито-
хондріальние хвороби. 4 0Для багатьох з них розроблені й широко
застосовуються ефективні методи молекулярної діагностики, ве-
дутся дослідження з генотерапії. 4 0Ми не торкалися також ра-
бот проводяться, 4 0главним чином, 4 0в очолюваної професором
Є. І. Шварцем лабораторії молекулярної діагностики ПІЯФ РАН і
присвячених молекулярному аналізу мультифакторіальних забо-
левание, 4 0такіх як діабет, гіпертонія, ішемія серця. Ре-
зультати цих 4 0ісследованій 4 0будут, мабуть, предметом
наступних оглядів і монографій.
ГЛАВА I
СТРУКТУРА І МЕТОДИ АНАЛІЗУ ДНК.
Розділ 1.1 Загальні уявлення, центральна догма, гені-
тичний код.
Універсальна генетична субстанція або "енциклопедія
життя ", ДНК, містить інформацію, необхідну для синтезу
білків і нуклеїнових кислот, присутніх у всіх типах
клітин як про-так і еукаріот. Дезоксирибонуклеїнові киць-
лоти (ДНК) - це ниткоподібні молекули, що складаються з чотирьох
розташованих в варьирующей порядку нуклеотидів: пуринів -
аденіну та гуаніну, і піримідинів - цитозину та тиміну, з'єднанням
наних у полінуклеотидний ланцюг з остовом з чергуються ос-
татков цукру - дезоксирибози, і фосфату. Послідовність
нуклеотидів ДНК або пар основ становить інформаційну
ємність молекули, визначаючи порядок синтезу і амінокислотну
послідовність білків відповідно до універсальним для
всіх живих істот трьохбуквені - триплетні, генетичним
кодом (Табл.1.1). Дезоксирибонуклеїнові кислоти представля-
ють собою єдиний тип молекул, здатних до самовоспроіз-
ництво або реплікації, що і забезпечує спадкоємність
генетичної інформації в ряді поколінь. Записується
послідовність ДНК зліва направо (5 '- 3') першими заг-
лавнамі літерами відповідних нуклеотидів, є од-
новременно одиницями вимірювання молекули. Розміри ДНК можуть
змінюватися в гігантських межах від декількох нуклеотидів до
мільярдів пар основ (п.о.). В якості одиниць виміру
розмірів ДНК використовуються також кілобази (kb) і Мегабаза
(Mb) - послідовності, відповідні тисячі і мільйону
пар основ, відповідно.
ДНК можуть існувати як у вигляді однониткових, так і в
вигляді двухнитевой молекул. Двухнитевой або дволанцюжкові мо-
молекули утворюються за рахунок хімічного комплементарного спа-
рення між аденіном та тиміном (А - Т) і між гуаніном і
цитозином (Г - Ц). Ці водневі зв'язку між парами нуклео-
тідов досить неміцні, так що ланцюги ДНК можуть легко
диссоциировать - розділятися, і асоціювати - з'єднуватися,
при зміні температури або сольових концентрацій. При каж-
будинок циклі асоціації - дисоціації або, як ще кажуть, від-
жіге - плавленні, буде точно відтворюватися двухнитевой
структура - дуплекс, стійкість якого визначається зі-
відповідальний нуклеотидних пар. Найбільш стійкі структури,
представлені повністю комплементарними нитками ДНК. Про-
цес освіти дуплексів носить назву гібридизації. Спо-
можності до комплементарного спаровування підстав - одне з
найчудовіших властивостей ДНК, що визначають можливість її
самореплікаціі і точного вибору специфічних ділянок акти-
вації молекули в процесі зчитування генетичної інформації
ції. Це свойтво широко використовується в молекулярній біології
для пошуку та ідентифікації потрібних послідовностей в ог-
ромни молекулах ДНК при використанні як зондів її
порівняно невеликих мічених фрагментів.
У людини велика частина ДНК-3.2 мільярди пар основа-
ний, знаходиться в ядрах клітин у вигляді 46 щільно упакованих,
суперскрученому за рахунок взаємодій з ядерними білками
структур, званих хромосомами. Порівняно невелика
частина ДНК - близько 5%, прістствует в мітохондріях - органел-
лах цитоплазми, що забезпечують процеси дихання і енерегеті-
тичного обміну клітин еукаріот. У більшості соматичних
клітин ДНК представлена у двох копіях - по одній в кожній
хромосомі. Таким чином, в клітинах присутні 23 пари
хромосом, 22 з яких гомологічних один одному - аутосоми, і
одна пара (X і Y) - статеві хромосоми. Наявність Y хромосоми
визначає чоловічу стать особини. При записі нормального Каріо-
типу індивідуума вказується загальна кількість хромосом і тип по-
лових хромосом. Таким чином, нормальний каріотип чоловіки -
46, XY, а жінки -46, XX. У процесі гаметогенезу відбувається
випадкове розбіжність гомологічних хромосом у мейозі і в
кожної зрілої статевій клітині - гамете, залишається тільки 23
хромосоми, тобто гаплоїдний набір хромосом. При цьому в
кожній гамете зберігається лише одна статева хромосома - го-
носом. У яйцеклітинах це X хромосома, тоді як сперматозо-
Іди з рівною імовірністю несуть як X, так і Y хромосому, то
є підлога майбутньої особини детермінується геномом сперматозоі-
так. При заплідненні диплоїдний набір хромосом восстанав-
ливается. Відповідно до сучасних уявлень ге-
ном людини складається з 25 хромосом, 22 з яких аутосоми,
2 статеві хромосоми і одна мітохондріальна. У кожній кліть-
ках присутній порядку 1000 мітохондрій, а в кожному мито-
хондріоне міститься близько 10 кільцевих мітохондріальних
хромосом, схожих з хромосомами бактерій. Таким чином, в
клітинах присутні близько 1000 копій мітохондріальних хро-
мосом.
У хромосомах еукаріотів ДНК знаходиться в двухнитевой формі,
що забезпечує можливість її точного реплікації при кожному
циклі поділу клітини. Одна нитка кодує або смислова,
комплементарна їй нитка - антисмислової. Декодування ін-
формації, укладеної в молекулі ДНК, або процес транскріп-
ції, здійснюється за рахунок виборчого синтезу молекул
РНК, комплементарних певних ділянок ДНК, так званий
мих первинних РНК транскриптів. Транскрибуються ділянки ДНК
носять назву генів. РНК (РНК) за своєю
структурі дуже подібні з молекулами ДНК. Вони також складаються
з чотирьох нуклеотидів, тільки одне з піримідинових основа-
ний - тимін, замінено на урацил і в сахарозний кістяку замість
дезоксирибози представлена рибоза. Молекули РНК існують
тільки в однониткових формі, але можуть утворювати дуплекси з
молекулами ДНК. Після синтезу молекули РНК зазнають
досить складну модифікацію - процесинг. При цьому про-
виходять зміни в кінцевих ділянках молекул та вирізають
області, гомологічні інтрони - некодуючих частинам гена.
Цей процес називається сплайсингом. У результаті з первинних
них РНК транскриптів утворюються молекули інформаційної або
матричної РНК (мРНК), що представляють собою безперервну
послідовність нуклеотидів, гомологічні тільки екзоном
- Смисловим ділянках гена. Молекули мРНК у вигляді рібонуклео-
протеїнових гранул виходять з ядра в цитоплазму і з'єднують-
ся з рибосомами, де відбувається процес трансляції - синтез
поліпептидного ланцюга. Трансляція мРНК відбувається в точній зі-
ності з генетичним кодом, згідно з яким послідовно-
вательность з трьох нуклеотидів РНК - кодон, відповідає
певній амінокислоті або сигналом термінації синтезу по-
ліпептідной ланцюга (Табл.1.1). Реалізація генетичного коду
здійснюється за участю 20-ти типів транспортних РНК
(ТРНК), єдиних нуклеїнових кислот, що містять у своєму
складі поряд з нуклеотидами одну з амінокислот. тРНК име-
ють кленовообразную форму, в хвостовій частині молекули розпо-
Викладено певна амінокислота, у точній відповідності з
послідовності з трьох нуклеотидів в області, званої
антикодоном. Проходження мРНК у рибосоме є сигналом
наближення до рибонуклеопротеїдними комплексу тієї тРНК, у
якої послідовність нуклеотидів в антикодоном компле-
ментарное кодує триплети мРНК. Таким чином транспор-
тується відповідна амінокислота і здійснюється пос-
ледовательно синтез поліпептидного ланцюга. Мітохондрії мають
свою автономну систему білкового синтезу: рибосомальні
РНК, мРНК і транспортні РНК.
Генетичний код універсальний для всіх живих істот -
це одна з його головних властивостей. Невеликі відмінності в струк-
турі коду знайдені тільки для мітохондріальної ДНК. Так в мі-
тохондріальном генетичному коді стоп кодонами є
триплети АГА і АГЦ, що кодують аргінін в ядерній ДНК
(Табл.1.1). Універсальність генетичного коду служить най-
леї вагомим аргументом на користь гіпотези про єдиний джерелі
виникнення життя на землі і про філогенетичному спорідненість
всіх видів живих істот. Крім того, саме це властивість
забезпечує можливість прочитання в будь-яких модельних клеточ-
них системах штучно введеної генетичної інформації,
сконструйованої з фрагментів ДНК різного видового про-
ісхожденеія. Таким чином, вся генна інженерія заснована на
універсальності генетичного коду. Іншою властивістю генетично-
тичного коду є його вирожденність, що полягає в
тому, що всі амінокислоти крім двох кодуються кількома
варіантами кодонів. Дійсно, з 64 можливих комбі-
націй нуклеотидних триплетів РНК три відповідають терміни-
ючий кодонам - ochre, amber і opal, інші варіанти
(61) кодують 20 амінокислот, причому триплети, що кодують
одну і ту ж амінокислоту, як правило, розрізняються за
третій нуклеотиду у кодоні. Таким чином, знаючи нуклеотид-
ву послідовність кодує ділянки ДНК, можна однозначного око-
почну прогнозувати амінокислотну послідовність відповід-
ветствующего поліпептидного фрагмента, тоді як одна і та
ж амінокислотна послідовність може кодуватися раз-
особистим чином. При цьому, число можливих варіантів кодую-
щих ДНК різко зростає зі збільшенням довжини поліпептиду.
На наступному етапі поліпептидні ланцюги транспортуються
до специфічних органел клітини і модифікуються з утворенням
ристанням зрілого функціонально активного білка. У деяких
випадках інформація з молекул РНК може назад транскрибує-
тися в молекули ДНК. Зокрема, при зворотній транскріп-
ції мРНК утворюються молекули комплементарної ДНК - кДНК, в
якої залежно від повноти процесу представлені
частково або повністю всі смислові кодують послідовно-
ності гена. Розглянута схема реалізації однонаправ-
ленного потоку інформації ДНК-РНК-Білок складає основу
центральної молекулярно-біологічної догми - рис.1.1.
Більш детально з процесами реплікації, транскрипції,
процесингу і трансляції можна ознайомитися в численних
посібниках з молекулярної біології, цитології і генетики
(Стент, Келіндер, 1981; Зенгер, 1987; Льюин, 1987).
1.2 Виділення ДНК, її синтез і рестрикція.
ДНК може бути ізольована з будь-якого типу тканин і клітин-
струм, що містять ядра. Етапи виділення ДНК включають швидкий
лізис клітин, видалення за допомогою центрифугування фрагмент-
тов клітинних органел і мембран, ферментативне руйнування
білків та їх екстрагування з розчину з допомогою фенолу і
хлороформу, концентрування молекул ДНК шляхом преципітації
в етанолі. З 1 грама сирої тканини або з 10! 9 клітин зазвичай
отримують 2 міліграма ДНК. У людини ДНК, частіше за все, ви-
начають з лейкоцитів крові, для чого збирають від 5 до 20 мл
венозної крові в стерильну пробірку з розчином, пре-
твердої перешкоди коагуляції (наприклад, з глюгеціром або Гепарил-
ном). Потім відділяють лейкоцити і руйнують клітинні і ядер-
ні мембрани додаванням буферних розчинів, що містять де-
натурірующіе агенти. Найкращі результати при виділенні ДНК
дає застосування протеїнази-К з наступною фенол - хлоро-
формної екстракцією зруйнованих білків. ДНК беруть в облогу в ця-
нулі і розчиняють в буферному розчині. Оцінку якості екс-
трагірованной ДНК проводять на підставі вимірювання оптичної
щільності розчину ДНК в області білкового та нуклеїнового
спектрів поглинання. У чистих зразках ДНК співвідношення
А (260) / A (280)> 1.8. В іншому випадку процедуру очищення
необхідно повторювати, тому що для успішного використання та
зберігання ДНK білки повинні бути повністю видалені. Більше під-
робно з методами виділення та очищення ДНК з різних тканин
можна ознайомитися в роботах і посібниках, наведених у
Наприкінці книги (Маниатис та ін, 1984; Дейвіс, 1990; Горбунова і
ін, 1991).
У процесі складного і різноманітного функціонування
різні ділянки хромосом і ДНК зазнають різноманітні
регульовані і, в основі своїй, оборотні зміни. Ці мо-
діфікаціі здійснюються за допомогою спеціальних білків - фер-
ментів. Опис ферментативного апарату реплікації, транс-
кріпціі, репарації - системи захисту та відновлення пошкоджень
дених ділянок ДНК, рекомбінації, тобто обміну ділянками
гомологічних хромосом і ДНК, далеко виходить за рамки нашого
викладу. Ми коротко ознайомимося тільки з двома класами
ферментів ДНК - полімеразами і рестріктазами, особливо важ-
вими для розуміння основ сучасної молекулярної діагностики-
ки.
Ферменти, що здійснюють синтез ДНК, називаються ДНК-по-
лімеразамі. І в бактеріальних клітинах, і в клітинах еукаріот
містяться три різні форми ДНК-полімераз, всі вони обла-
дають синтезуючої активністю і здатні подовжувати ланцюга ДНК
у напрямку 5 '- 3', послідовно нарощуючи по одному
нуклеотиду до 3'-OH кінця, причому точність синтезу визначаються-
ється специфічністю спарювання підстав. Таким чином, для
роботи ДНК-полімерази необхідна однониткових матрична ДНК з
двухнитевой ділянкою на 3'-кінці молекули. Крім того, в
середовищі повинні бути присутніми чотири типи трифосфат (dATP,
dCTP, dGTP і dTTP) - молекул, що складаються з основи-A, C, G
або T, цукру - дезоксирибози (d) і трьох фосфатних залишків
(P). У клітинах еукаріотів реплікацію здійснює ДНК-поліме-
рази альфа, а в клітинах E. coli - ДНК-полімераза 111.
ДНК-полімерази різними активностями, в тому числі
і екзонуклеазну в напрямку 3 '- 5', що дозволяє їм
виправляти - репарирувати, дефекти, допущені при підборі
комплементарних підстав. ДНК-полімераза 1 E. coli здатна
ініціювати реплікацію в місці розриву ДНК і заміщати гомо-
логічний ділянку в подвійного ланцюга ДНК. Це властивість використовують-
ється для введення у ДНК мічених нуклеотидів методом
нік-трансляції.
Відкриття бактеріальних ферментів, які мають ендонукле-
азной активністю - рестрикційних ендонуклеаз або рестрік-
таз, значно просунуло дослідження структури ДНК і
можливості генноинженерном маніпулювання з молекулами
ДНК. In vivo ці ферменти беруть участь в системі распознования
і захисту "своїх" і знищення чужорідних ДНК. Рестріктази
дізнаються специфічні послідовності з 4 - 6, рідше 8 -
12 нуклеотидів в дволанцюжковій молекулі ДНК і розрізають її
на фрагменти в місцях локалізації цих послідовностей,
званих сайтами рестрикції. Кількість які виникають рест-
рікціонних фрагментів ДНК визначається частотою встречаемос-
ти сайтів рестрикції, а їх розмір - характером розподілу
цих сайтів по довжині вихідної молекули ДНК. Чим частіше розпо-
дити сайти рестрикції, тим коротше фрагменти ДНК після
рестрикції. В даний час відомо більше 500 різних
типів рестриктаз бактеріального походження, причому кожен
з цих ферметов дізнається свою специфічну послідовник-
ність. Рестріктази виділяють шляхом біохімічного очищення з
різних видів бактерій і позначають трьома літерами, від-
логічного першим трьом буквам латинської назви виду
бактерій, і римською цифрою, що відповідає хронології отк-
криття цього ферменту у даного виду бактерій. У залежності
від частоти зустрічальності сайтів рестрикції в молекулі ДНК
розрізняють три класи рестриктаз часто-, середньо-і редкощепя-
щие. Природно, що рестриктаз, узнающие довгі специфі-
ческие послідовності (8-12 п.о.), як правило, є
редкощепящімі (наприклад Nor1), а узнающие короткі (4-5
п.о.) - частощепящімі (Taq1, EcoR1).
Сайти рестрикції можуть бути використані в якості
генетичних маркерів ДНК. Дійсно, що утворюються в ре-
зультатае рестрикції фрагменти ДНК можуть бути впорядковані за
довжині шляхом електрофорезу в агарозному або поліакріломідном
гелі, і тим самим може бути визначена їх молекулярна мас-
са, а, значить, і фізична відстань між сайтами. Нагадування-
ним, що звичайним методом виявлення ДНК в гелі, також як і
РНК, є її специфічне забарвлення, частіше за все ці-
діумом бромідом, і перегляд гелю в прохідному ультрофиолетом.
При цих умовах місця локалізації ДНК мають червону окрас-
ку. При використанні для рестрикції декількох ендонуклеаз
з подальшим електрофоретичного аналізу перекриваються
адитивних по довжині фрагментів ДНК можна домогтися повного
упорядкування сайтів впізнавання для кожного з ферментів від-
носительно один одного і якихось інших маркерів, присутній-
щих в досліджуваній молекулі ДНК. Процес цей називається фі-
топогеодезичних картуванням і є обов'язковим елементом
аналізу плазмідних, вірусних, бактеріальних ДНК і відноси-
тельно невеликих фрагментів ДНК еукаріотів. На рис.1.2. предс-
ний найпростіший приклад такого картування в тому випадку,
коли в досліджуваній молекулі ДНК присутня по одному сай-
ту рестрикції для двох ендонуклеаз. Після обробки вихідної
ДНК окремо кожною з рестриктаз утворюється два фрагменти,
відповідних по довжині відстані від кінців молекули ДНК
до сайтів рестрикції. При спільній обробці обома ендо-
нуклеазами на електрофореграмме з'являється новий фрагмент,
розмір якого відповідає відстані між сайтами рест-
рікціі. Очевидно, що ці дані ще не дозволяють однозначно
визначити положення сайтів рестрикції по відношенню до кінців
молекули ДНК. Проте, досить знати розташування хоча б
маркера для того, щоб зробити точне фізичне
картування вихідної молекули ДНК незалежно від кількості
локалізованих в ній сайтів рестрикції.
При обробці тотальної геномної еукаріотичної ДНК, в
Зокрема ДНК людини, часто-або среднещепящімі ендонукле-
азами утворюється так багато фрагментів різної довжини (у
середньому, близько 1 мільйона), що їх не вдається розділити з
допомогою електрофорезу, тобто не вдається візуально ідентифікації
ваних окремі фрагменти ДНК на електрофореграмме.
Після електрофорезу рестрцірованной геномної ДНК виходить
рівномірне фарбування по всій довжині гелю - так званий
шмер. Ідентифікація потрібних фрагментів ДНК в такому гелі віз-
можна тільки шляхом гібридизації з міченими ДНК-зондами. Це
досягається за допомогою методу блот-гібридизації за Саузерн.
1.3. Блот-гібридизація по Саузерн, гібридизація in situ.
Одним з найбільш ефективних методів ідентифікації
певних молекул ДНК серед електрофоретичної розділений-
них фрагментів є став вже класичним метод
блот-гібридизації за Саузерн, на прізвище автора Edцuard So-
uthern, який запропонував цей метод в 1975р. Послідовник-
ні етапи даного методу представлені на рис.1.3. Суть мето-
та полягає в тому, що геномна ДНК піддається рестрік-
ції однієї або декількома рестріктазами, після чого утворю-
щиеся фрагменти поділяються за молекулярною вагою в агарози-
ном чи акріламідном гелях. Потім ДНК піддається денатура-
ції in situ і переноситься з гелю на щільний носій (зазвичай
нітроцелюлозні фільтр або нейлонову мембрану). Сам пере-
ніс (блот) здійснюється за рахунок дії капілярних
сил, електричного поля чи вакууму. Фіксовану на філь-
тре ДНК гибрідизуючою з радіоактівномеченим ДНК або РНК зон-
будинок. Методом авторадіографії визначають положення шуканого
фрагмента геномної ДНК на електрофореграмме. Блот-гибрідизуючою-
ція - високо чутливий метод ідентифікації специфічні-
ких послідовностей ДНК. При досить тривалої екс-
позиції (протягом кількох днів) і при високій питомої
радіоактивності ДНК-зонда (більше 10! 9 роз / хв / Мікроген) цей
метод дозволяє виявляти менш, ніж 0,1 пікоГ ДНК. Так при
використанні зонда розмірами у кілька сот підстав уні-
Кальна послідовність в 1 000 п.о. може бути виявлена
в 10 Мікроген геномної рестріцірованной ДНК у вигляді окремої
смуги на радіоавтографе після його експозиції протягом 12
годин. Метод дозволяє працювати і з дуже короткими оліго-
нуклеотидними зондами (20 п.о.), однак вимагає особливо хо-
рошего мічення і тривалої експозиції фільтра. Необхід-
тість роботи з чистими препаратами ДНК, застосування високоме-
чених радіоактивних зондів, тривалість і трудомісткість всієї
процедури роблять її досить дорогим. Тим не менш, в
ряді випадків і сьогодні метод не втратив свого значення в
тому числі і для діагностики генних хвороб. Останнім
час для цих цілей нерідко використовують різні варіанти
нерадіоактивного мічення або забарвлення ДНК азотно-кислим се-
ребром.
Гібридизація з міченим ДНК-зондом препаратів ДНК або
РНК, завданих крапельно на твердий матрикс без попереднього-
тельной рестрикції та електрофорезу носить назву дот-або
слот-гібридизації залежно від конфігурації плями ДНК на
фільтрі, округлої або довгастої, відповідно. На
рис.1.3 також зображені послідовні етапи цих мето-
дов. Принагідно зауважимо, що метод гібридизації ДНК-зондів з
електрофоретичної розділеними молекулами РНК носить назва-
ня Нозерн блот, тоді як Вестерн блот або імуноблот - це
зв'язування електрофоретичної розділених білків, фіксовано-
ванних на фільтрах, з міченими антитілами. Назва цих ме-
тодов - данина поваги молекулярних генетиків професору Сау-
зерну, який зробив неоціненний внесок у розробку експеримен-
тальних підходів, що використовуються для аналізу ДНК.
У ряді випадків для проведення гібридизації з ДНК зонда-
ми не вимагається попереднього виділення і очищення ДНК.
Процедуру гібридизації можна проводити не тільки на гелі, на
фільтрах або в розчині, але і на гістологічних або хромо-
сомно препаратах. Цей метод носить назву гібридизації in
situ. Варіант методу, при якому в якості зондів викорис-
зуются препарати ДНК або РНК, мічені флюорохромами, називаючи-
ється FISH (flurescein in situ hybridization). Мічений
ДНК-зонд наносять на препарати диференційно забарвлених і
підготовлених для гібридизації (денатурованих) метафаз-
них хромосом. Попередня обробка хромосом спрямована
на полегшення доступу зонда до геномної ДНК. Важливе значення
має також підбір умов, максимально сприяють про-
цедури гібридизації. Після відмивання незв'язаних молекул ДНК
і нанесення світлочутливої емульсії (при використанні
радіоактивності), або проведення відповідної обра-
лення (при використанні біотин-або флюоресцеіна-мічених ДНК
зондів) місця локалізації послідовностей ДНК, компле-
плементарним використаному ДНК-зонду, можна безпосередньо
спостерігати в мікроскоп у вигляді характерних крапок над соответс-
діючим ділянками певних хромосом (Рис.1.4).
Гібридизація in situ, є одним з найбільш еф-
тивних методів картування комплементарних ДНК-зонду
послідовностей ДНК на хромосомах. Ця методика особливо
ефективна при дослідженні розподілу по геному пов-
ющіхся послідовностей ДНК, клонованих послідовник-
ностей ДНК анонімного походження, при визначенні не
тільки хромосомної належності, а й внутрішньо-хромосомної
локалізації унікальних генів у тих випадках, коли є
відповідні ДНК-зонди. При цьому роздільча здатність
методу може досягати декількох хромосомних бендів. СОГ-
ласно останніми даними, в експериментах на спеціально запро-
товлених і розтягнутих інтерфазних хромосомах людини раз-
вирішальна здатність методу FISH може досягати 50 kb, що
становить всього близько 1 / 20 величини середнього хромосомного
бенду. Проблеми взаєморозташування клонованих фрагментів
ДНК навіть у межах одного хромосомного локусу також з успі-
хом вирішуються методом FISH.
Гібридизація in situ між молекулами РНК і кДНК-овимі
зондами, що проводиться на гістологічних препаратах, є
одним з найбільш ефективних методів аналізу тканеспеціфі-
тичного розподілу і внутрішньоклітинної локалізації мРНК
(Манк, 1990). Докладно з цим та іншими сучасними мето-
будинок молекулярного і цитогенетичного аналізу, а також з їх
численними модифікаціями і варіантами можна ознайо-
митися в серії робіт, посібників та оглядів (Маниатис та інших,
1984; Дейвіс, 1990; Sambrook et al., 1989).
1.4 ДНК-зонди, клонування, векторні системи.
ДНК-зондом може служити будь-яка однониткових ДНК огра-
чених розміру, використовувана для пошуку комплементарних
послідовностей у молекулі більшого розміру або серед
пулу різноманітних молекул ДНК. У ряді випадків в якості
зондів використовують штучним чином синтезовані олі-
гонуклеотідние послідовності ДНК, розмір яких зазвичай
не перевищує 30 нуклеотидів. Зондом також можуть служити ви-
ділені з генома послідовності ДНК. Однак значною
але частіше такі послідовності попередньо клонують,
щоб мати можливість отримувати їх у будь-який час і в неоген-
зпечних кількості. Клонування припускає вбудовування
(Інсерцій) чужорідної екзогенної ДНК у векторну молекулу
ДНК, що забезпечує проникнення цієї конструкції в бакте-
ріального клітини господаря (Рис 1.5). Химерні молекули ДНК,
складені з фрагментів різного походження, носять наз-
вання рекомбінантних ДНК. Як клонуючим векторів
використовують модифіковані плазміди, фаги, косміди, ретро-
і аденовіруси, а також деякі інші генетичні конс-
ції. Розміри клонованих ДНК-зондів становлять від со-
тен до кількох тисяч нуклеотидів, що визначається, глав-
ним чином, здатністю вектора утримувати чужорідний
фрагмент ДНК. Особливо широко застосовують як векторів
плазмідну ДНК.
Плазміди - це невеликі кільцеві дволанцюжкові мо-
молекули ДНК, які можуть бути присутніми в різній кількості
копій в бактеріальних клітинах. Відкриття плазмід пов'язано з
вивченням генетичної природи резистентності до антибіотиків. Ока-
залось, що саме плазміди можуть нести гени, що повідомляють
клітинам стійкість до різних антибіотиків, і втрата
чутливості інфекційних бактерій до їх дії як раз
і відбувається за рахунок відбору тих штамів, в яких є
плазміди з відповідною генетичною інформацією. Замі-
тім, що присутність плазміди в бактеріальній клітині зовсім
не обов'язково для забезпечення її життєдіяльності, так як
при відсутності антибіотиків в середовищі існування бактерій штам-
ми, що не містять плазмід, цілком життєздатні. Плазміди
мають автономну систему контролю реплікації, що забезпечує
підтримання їх кількості в клітці на певному рівні -
від одного до декількох сотень плазмідних геномів на клітину.
Зазвичай для клонування вибирають плазміди з ослабленим
контролем реплікації, що дозволяє їм накопичуватися в кліть-
ке у великому числі копій. Конструювання плазмідних клони-
ючий векторів полягає у внесенні змін до системи
контролю реплікації й у додаванні або вирізуванні генів анти-
біотікоустойчівості або зручних для клонування інших гені-
тичних елементів: специфічних сайтів рестрикції, ініціати-
ції і регуляції транскрипції і т.п. Частіше за все для клонування
вання використовують плазміди pBR322, ColE1 або їх похідні.
Кільцеву молекулу плазмідної ДНК можна легко перевести
в лінійну форму шляхом одиничного розриву в місці локалізують-
ції унікального сайту рестрикції. Приєднання (вбудовуючи-
ня, інсерцій) фрагмента чужорідної ДНК до кінців лінійної
молекули здійснюється за допомогою специфічних ферментів
-Лігази, після чого гібридна плазміда знову приймає коли-
цевую форму. Розроблено досить прості та ефективні
методи трансформації бактерій, тобто штучного введе-
ня плазмід в бактеріальні клітини. При цьому, присутні
в плазмідах гени резистентності до антибіотиків використовують в ка-
честве маркерів трансформованих бактерій для їх відбору на
відповідних селективних середовищах. При розмноженні
трансформованих бактерій відбувається збільшення числа ко-
пий інсертірованного фрагмента ДНК. Таким чином, цей чу-
жеродний для бактерій генетичний матеріал може бути напів-
чен, практично, в будь-яких кількостях. Виділена з бакте-
рій плазмідна ДНК або ізольований з плазміди інсертіро-
ний фрагмент можуть бути в подальшому використані в ка-
честве ДНК-зондів.
Для деяких цілей як клонуючим векторів
виявилося зручніше використовувати фаги - бактеріальні віруси.
Фагів ДНК існує тільки в лінійній формі, тому при
її рестрикції утворюються два фрагменти, які зшивають з
чужорідної ДНК з утворенням химерного фага. Чисто техніч-
но ця операція простіше, ніж інсерцій в плазміду. Однак,
розміри встраімовой ДНК обмежені пакующей здатністю го-
спритні фага. Тому при конструюванні вектора вирізають
послідовності фагової ДНК, що не мають критичного зна-
чення для життєзабезпечення фага. Такий бактеріофаг може су-
ществовать тільки в тому випадку, якщо в нього вбудована чуже-
рідна ДНК, за розмірами порівнянна з вирізаною фагової
ДНК. Найбільш вдалі конструкції векторів були отримані на
основі фага лямбда - лямбда gt10, лямбда gt11, лямбда Zap.
Багато проблем молекулярної генетики успішно вирішуються
з використанням експресійна векторів, що містять у своєму
складі регуляторні послідовності, що забезпечують син-
тез чужорідних білків в клітинах господаря. Так у випадку лямбда
gt11 фаги можуть бути вирощені в, так званих, реплікатів-
них умовах, що забезпечують експресію інсертірованной ДНК.
Оскільки зазвичай ДНК вбудовують в район локалізації маркерного
гена, що дозволяє вести селекцію химерних фагів, то
експресуватися буде злитий білок, в якому частина полі-
пептидного ланцюга буде відповідати маркерного білка, а
частину ланцюга транслюватиметься у відповідності з інформаційних
їй, укладеної у вбудованому фрагменті ДНК. Цей білок мо-
жет бути ідентифікований шляхом детекції фрагмента маркерного
білка або за допомогою антитіл до специфічних ділянок, коди-
ються чужорідної ДНК.
Останнім часом великого поширення набуло
клонування в космідах - конструкціях, що об'єднує в собі
переваги плазмід і фагів. Косміди отримані на основі
плазмід, але в них введено генетичні елементи фага лямбда,
відповідають за упаковку ДНК у фагової частинці. Такі вектори
можуть існувати не тільки у вигляді плазмід, але і у вигляді фа-
гових частинок in vitro. Косміди мають більшу клонуючої
здатністю в порівнянні з плазмідними і фагів векторами
і можуть нести до 40-45 тисяч пар основ інсертірованной
ДНК. Всі перераховані вище вектори використовуються для клонування
чинення у прокаріотичних системах.
Вектори, придатні для спрямованого переносу в еука-
ріотіческіе клітини, конструюють на основі прокаріотичних
або дріжджових плазмід - єдиних плазмід, знайдених у
клітинах еукаріот, а також використовують різні еукаріоти-
ческие віруси, найчастіше ретровіруси, аденовіруси або аде-
ноассоціірованние віруси. При використанні плазмід в ка-
честве клонуючим векторів у них вводять вірусні послідовно-
ності, відповідальні за початок реплікації. Введення століття-
торів в еукаріотичні клітини часто здійснюють шляхом
ко-трансформації, тобто одночасно вводять плазміду і
сегмент чужорідної ДНК. Векторні послідовності, вве-
денние в клітини еукаріотів, можуть зберігатися там протягом
декількох днів у вигляді суперскрученому кільцевих молекул -
ЕПІС. У рідкісних випадках можлива інтеграція екзогенної ДНК
в хромосомну ДНК. У цих випадках введені послідовник-
ності стійко зберігаються в геномі клітин господаря і Насл-
дуються за менделевської типу (див. Глава VIII).
Для клонування субхромосомальних фрагментів ДНК, з-
тримають цілі гени, розроблена система дріжджових мініхро-
мосом. Штучні дріжджові хромосоми (YAC - artificial
yeast chromosomes) конструірют на основі плазмідних вектора-
рів, що містять у своєму складі відомі Центромерна і те-
ломерние послідовності хромосом дріжджів, необхідні
для підтримки і реплікації векторів у клітинах господаря. Та-
Електричні системи здатні утримувати фрагменти чужорідної ДНК
розміром у кілька сотень тисяч і навіть мільйонів пар осно-
ваний.
Зупинимося коротко на методах введення векторів у клітки
господаря. Але перш за все, визначимо основні терміни. Як
вже згадувалося, введення плазмідної ДНК в бактеріальні
клітини має назву трансформацією. Якщо перенесення генів здійснювала-
нюється за допомогою фага, то говорять про трансдукція. Процес
введення екзогенної ДНК в еукаріотичні клітини називається
трансфекції. Всі ці методи засновані на підборі умов,
полегшують проходження плазмідної або фагової ДНК через
клітинні і ядерні мембрани. Для підвищення проникності
мембран використовують два різних підходи. У першому випадку про-
водять обробку векторної ДНК і клітин господаря буферними
розчинами, що підвищують проникність клітинних і ядерних
мембран (метод кальцій-фосфатної преципітації,
DEAE-декстран-опосередкована трансфекція). У другому випадку
використовують короткострокове фізичний вплив на клітини
для створення в мембранах мікропор, прохідних для макромоле-
кул ДНК (метод електропорації - вплив високовольтним
електричним полем, "бомбардування" частинками золота і
тощо). Більш докладно проблеми векторів і методи генетічес-
кою трансфрмаціі (трансдукції) розглянуті в Главі IX. Воп-
росам молекулярного клонування також присвячена велика
література (Гловер, 1988; 1989; Шишкін, Калінін, 1992; Мані-
Атис та ін, 1984; Дейвіс, 1990; Sambrook et al., 1989).
1.5 Геномні та к-ДНК-ові бібліотеки генів, їх скринінг.
Розглянемо більш детально методи виділення та ідентифі-
кації фрагментів ДНК, необхідних для аналізу або для
використання як ДНК-зондів. Основним джерелом
цих фрагментів є штучним чином сконструює-
ванні бібліотеки генів, в яких здійснюють пошук або
скринінг потрібних послідовностей ДНК різними методами в
Залежно від специфічних особливостей цих послідовно-
ність. Бібліотека генів це повний набір клонованих
перекриваються фрагментів ДНК, отриманих в результаті
рестрикції чи механічного розрізання тотальної ДНК, виокрем-
ленній з якого-небудь специфічного джерела. У залеж-
ності від походження ДНК розрізняють геномні та кДНК-ові
бібліотеки генів. Для конструювання геномних бібліотек ис-
товують ДНК, виділену з тканин, культур клітин, з від-
слушних хромосом або з їх фрагментів. При створенні кДНК
-Ових бібліотек виділяють тотальну мРНК з тканин або куль-
тівіруемих клітин, в яких явно експресуються інте-
ресующіе дослідника гени. На наступному етапі методом про-
ратної транскрипції (РНК-ДНК) синтезують кДНК. Потім її
розрізають і упаковують у вибраний для клонування вектор.
Схема конструювання геномних і кДНК-ових бібліотек предс-
полягає у наданні на рис.1.6. Як видно на схемі у геномних бібліоте-
ках присутні не тільки кодують послідовності ге-
нов, але також несмисловие внутрігенние послідовності -
інтрони і міжгенних ділянки ДНК, причому питома вага Некодиних-
ючий фрагментів ДНК значно вище. кДНК-ові бібліотеки
складаються тільки з кодують - екзонів, областей генів. На-
амо зручний розмір інсертіруемой ДНК можна порівняти з середовищ-
ним розміром гена ссавців і становить 15 - 25 тисяч
пар основ (kb). Оптимальний за розміром набір перекривають-
щихся послідовностей геномної ДНК людини виходить
після її перетравлення частощепящімі рестріктазами Sau3a або
Mbo1. Інформаційна ємність кожної бібліотеки, тобто ко-
лічество клонів з різними інсертірованнимі фрагментами
ДНК, визначається розмірами вихідного геному і необхід-
мостью присутності кожній його послідовності хоча б у
одному клоні. Тому досить представницькі геномні
бібліотеки ссавців зазвичай містять не менш 8 * 10! 5 -
10! 6 різних клонів.
Найчастіше бібліотеки конструюють на основі фагових або
космідних клонуючим векторів, тому що в такому вигляді легше
зберігати великі кількості химерних ДНК. Для створення біблії-
набряк генів людини особливо зручні вектори, отримані на
основі фага лямбда, такі як EMBL3 або EMBL4. Пакующая
здатність цих векторів від 9 до 23 кб, вони містять багато
зручних клонуючим сайтів, так що для інсерцій ДНК можуть
бути використані різні рестріктази. Крім того, ці вектора-
ри не містять послідовностей плазмід, найбільш часто
використовуваних для клонування: pBR322 і ColE1. Це позволя-
ет проводити відбір потрібних клонів за допомогою фагової ДНК, не
вирізаючи попередньо інсертірованний в неї фрагмент. Для
створення бібліотек клонів, що містять великі райони ДНК,
використовується технологія штучних дріжджових хромосом
-YAC. Останні являють собою великі (до 1 млн п.о.)
фрагмент геномної ДНК людини, зшиті з Центромерна райо-
нами хромосом дріжджів. Після ідентифікації в таких бібліоте-
ках потрібних клонів з інсертірованнимі фрагментами чужорідних
ДНК останні можуть бути субклоніровани в фагових або
космідних бібліотеках.
Скринінг бібліотек проводять шляхом гібридизації на
фільтрах з олігонуклеотидно, кДНК-овимі або будь-якими іншими
ДНК-зондами, а також за допомогою антитіл, якщо бібліотека
сконструйована на основі експресійна вектора (ріс.1.7).
Для цього химерні фаги, складові бібліотеку, висівають
на щільно зростаючий в чашках Петрі газон бактерій таким обра-
зом, щоб утворилися окремі літичні бляшки в ре-
док зараження клітин одним рекомбінантним фагом.
Усі культури дублюють шляхом відбитка - репліки, на інші
чашки Петрі. Потім на вихідні культури накладають фільтри
і переносять на них ростуть і спеціалізовані колонії, проводять
їх руйнування, фіксацію білків і ДНК на фільтрі і блот гинув-
рідізацію з міченим ДНК-зондом або імуноблот з міченими ан-
очисники (для експресійна бібліотек). Після відмивання філь-
центрів від непов'язаних мічених зондів і радіоавтографіі на
рентгенівській плівці проявляться темні плями в місцях локалі-
зації колоній, що містять у інсертірованном фрагменті ДНК
послідовності, комплементарні зонду, або специфічні
антигени. Відбір позитивних колоній фагів на дубльованих
культурах виробляють саме в тих місцях, де сталося по-
темненность плівки. Щоб уникнути можливого забруднення,
відібрані колонії розмножують і знову піддають скрінірова-
нію. Зазвичай, інсертірованную ДНК ізолюють з бактеріофага і
субклоніруют в плазмідної векторі, що дозволяє нарощувати
великі кількості цієї ДНК.
1.6 Секвенування послідовностей ДНК.
Наступними етапами аналізу відібраного і клонованого
ДНК фрагмента є його фізичне картування і визна-
ня нуклеотидної послідовності, тобто секвенірова-
ня. Методологія секвенування достатня проста і полягає
ється в тому, щоб отримати серію комплементарних молекул
ДНК, що розрізняються по довжині на одну підставу. На практиці,
однак, визначення нуклеотидної послідовності протя-
лених молекул ДНК є досить трудомістку за-
дачу. Існує два основні методи секвенування: хі-
тичне - метод Максама-Гільберта і дідезоксісеквенірованіе -
метод Сенджер. У першому випадку використовують хімічне
розщеплення ДНК по одній підставі, в другому - синтезують
потрібну ланцюг ДНК in vitro, специфічно зупиняючи синтез
на заданому підставі.
Найчастіше при секвенування використовують метод Сенджер, так
як він більш надійний і простий у виконанні. Принцип данно-
го методу показаний на рис.1.8. На першому етапі ДНК денатурі-
ють, щоб отримати однониткових молекули. Потім додають
секвеніруют праймер - штучно синтезовану оліго-
нуклеотидну послідовність, комплементарную визначено-
ному ділянці вихідної молекули ДНК. Створюють умови для гинув-
рідізаціі праймера, тобто для утворення дволанцюжкової
ділянки, і ініціюють синтез ДНК, додаючи в реакційну
суміш ДНК-полімеразу та трифосфати - dATP, dCTP, dGTP і dTTP,
один з яких є радіоактивним. Синтез ведуть в чоти-
рьох паралельних пробірках, в кожну з яких додають
один із специфічних дідезоксінуклеотідов або термінаторів
- DdATP, ddCTP, ddGTP або ddTTP. При вбудовуванні ddNTP на
місце відповідного нуклеотиду синтез ДНК припиняється.
Таким чином, у кожній з пробірок отримують набір розрізняю-
щихся по довжині радіоактівномечених фрагментів ДНК з одним і
тим же специфічним для даної пробірки дідезоксітермінато-
ром на кінці молекули. Після одночасного електрофореті-
тичного поділу цих фрагментів на чотирьох сусідніх до-
ріжках і радіоавтографіі, розмір синтезованих фрагментів
може бути визначений, а значить і визначена локалізація ді-
дезоксинуклеотидов і порядок відповідних їм нуклеотидів
у вихідній молекулі ДНК (рис.1.9). На кожному секвеніруют
гелі може бути визначена первинна послідовність все-
го близько 500 пар основ. У своєму первісному варіанті
цей метод є досить трудомістким і дорогим.
Достатньо зауважити, що ціна однієї ланки (кроку) у ланцюзі ДНК
у Міжнародній Програмі "Геном людини" ще кілька років
тому оцінювалася в 1 $.
Як модифікацій методу Сенджер використовують перед-
редньої клонування ДНК у векторах, сконструйованих
на основі фага M13, для отримання протяжних однониткових
ділянок ДНК, які можуть бути безпосередньо секвеніруют-
ником без денатурації і праймування. Дуже ефективною ока-
залась система векторів mp8 і mp9, що дозволяють вести сиквенсу
одовременно в обох напрямках і прочитувати ділянки біль-
ший протяжності. Інтенсивно розробляється методологія
автоматичного ДНК секвенування. Особливо перспективним
для масового секвенування в автоматичному режимі оказ-
лось застосування мічених різними флюорохромами дідеоксі-
нуклеотидів. У цьому варіанті кожному з нуклеотидів відповід-
ветствует свій колір смуги в гелі, який легко враховується
автоматично. Цей метод знайшов особливо широке застосування
в реалізації програми Геном людини. За останніми даними,
розробка автоматичних секвенатори дозволила знизити
вартість однієї ланки до 0,5 $ і різко підвищити ефек-
ність цього процесу. Так, на 30 автоматичних секвенатори
фірми Applied Biosystems за один тиждень роботи в 1994г.мож-
але було просеквеніровать до 1 млн пар основ.
В останні роки активно розробляються принципово
нові, більш ефективні і економічні методи секвенірова-
ня. Особливо перспективним на сьогоднішній день представля-
ється метод секвенування шляхом гібридизації досліджуваної
послідовності ДНК з набором олігонуклеотидів, так називаються
ваемой олігонуклеотидно матрицею (Мірзабеков, 1990; Барський
та ін, 1994; Southern, et al, 1992). Найбільш зручними для
цієї мети є набори матриць - чіпи, в осередках яких
пришиті (іммобілізовані) октануклеотіди. Суть даного підхо-
та в тому, що пришивається набір всіх можливих варіантів пе-
рестановок з 4-х стандартних нуклеотидів (А, Г, Ц, Т) визначається
діленої довжини, при цьому у разі октануклеотідов кількість
можливих варіантів нуклеотидів становить 65536. Секвеніруют-
емий фрагмент ДНК мітять радіоактивним фосфором і гибрідизуючою
з октануклеотідной матрицею. Фрагмент ДНК гибрідизуючою
тільки з тими октануклеотідамі, послідовності яких
комплементарні його ділянках. Таким чином, визначається на-
бор всіх можливих октануклеотідов, присутніх в досліджуваних
дуємо фрагменті ДНК. Після цього, за допомогою спеціальної
комп'ютерної обробки упорядковується розташування цих ок-
Тамер в досліджуваному фрагменті ДНК. Цей перспективний метод
дозволяє значно прискорити час секвенування за рахунок
автоматизації процесу.
1.7 Полімеразна ланцюгова реакція.
До недавнього часу гібридизація з ДНК-зондами і клони-
вання були єдиними способами пошуку і виділення
специфічних геномних або до-ДНК-ових послідовностей
ДНК з метою їх подальшого дослідження. Не кажучи вже про
велику трудомісткість цих методів, вони мають ряд принципових-
альних недоліків і обмежень. По-перше, досліджувані
фрагменти значно перевершують по довжині ДНК-зонди і слиш-
ком великі для прямого молекулярного аналізу. Кінці цих
послідовностей не можуть бути обрані довільно, так
як визначаються наявністю відповідних рестрикційних
сайтiв у ісследуеммой молекулі ДНК. По-друге, для проведе-
ня успішної рестрикції і гібридизації необхідна велика
кількість добре очищеної високомолекулярної геномної ДНК
(Не менше 10 Мікроген на одну реакцію). Така кількість ДНК
зазвичай отримують з 3 - 5 мл крові. Часто це кількість ока-
зується надто великим, якщо врахувати, що мова йде про дітей
і про важко хворих людей. Крім того, необхідність негайної
ленного використання зібраної крові для виділення ДНК або
зберігання її до використання при -20 С ускладнює досліджень-
ня нетранспортабільних пацієнтів або родичів, прожи-
вающих на віддаленій відстані від дослідницьких цент-
рів. По-третє, для геномної гібридизації, як правило, не-
необхідно радіоактивні ДНК-зонди з високою питомою актив-
ністю, не менше 10! 8-10! 9 імп. / хв / мкГ., причому вони повинні
бути використані протягом дуже короткого періоду після їх
приготування. Крім того, робота з радіоактивним матеріалом
вимагає дотримання необхідної техніки безпеки і наяв-
чия спеціально обладнаного ізотопного блоку, що можливо
лише для деяких діагностичних центрів. По-четверте, не-
обходимость тривалої експозиції автографів значно уд-
линяє час отримання результатів, що також обмежує
використання методів блот-гібридизації для пренатальної ді-
агностики плоду, специфіка якої багато в чому визначається
терміном вагітності.
Запропонований у 1983р. американським дослідником
Каррі Мулліс, удостоєним за цей винахід Нобелівської
премії у 1993р., альтернативний метод аналізу геномної ДНК -
метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), з'явився епохальним
відкриттям молекулярної біології нашого століття. Метод ПЛР або
специфічної ампліфікації ДНК дозволяє вибірково синте-
зировать in vitro відносно невеликі ділянки ДНК, довжиною
від кількох десятків до кількох сотень пар нуклеотидів,
рідше до 1000 - 2000 п.о., використовуючи як матрицю будь-які
зразки ДНК, що містить ампліфікується послідовність.
Необхідною умовою для проведення ПЛР є знання нук-
леотідной послідовності ампліфікується області ДНК,
так як специфічний вибір цієї ділянки здійснюють шляхом
гібридизації матричної ДНК з двома штучно синтезую-
ванними праймерами - олігонуклеотднимі послідовностями
ДНК, довжиною, звичайно, від 15 до 30 п.о., комплементарними 3'-
кінців ампліфікується ділянки на смисловий і антисмислової
нитках ДНК, відповідно. Таким чином, відстань між
праймерами определяяет довжину синтезованих молекул. У ка-
честве матриці для синтезу може бути використаний будь-який тип
ДНК - геномна ДНК окремих індивідуумів різних видів
про-і еукаріотів; ДНК, виділена з культур клітин, бактери-
альних клонів, бібліотек генів або з інших джерел. Для
проведення специфічної ампліфікації не потрібно великих
кількостей матричної ДНК і, в принципі, достатньо навіть однієї
молекули (Li et al., 1988). Успіх у розробці методу ПЛР в
значною мірою пов'язаний з використанням як фермен-
та, що забезпечує синтез ДНК, термофільною ДНК полімерази,
виділеної з бактерій, що живуть у гарячих джерелах, і по-
того стійкою до дії високих температур (Kogan et al.,
1987).
Принципова схема полімеразної ланцюгової реакції поки-
зана на ріс.1.10. На першому етапі досліджувана двухнитевой
матрична ДНК переводиться в однониткову форму шляхом її наг-
рівання протягом декількох хвилин до температури, що перевищує-
щей +95 - +98 С. Подальша схема проведення ПЛР досить
проста і полягає в чергуванні циклів (1) гібридизації
або відпалу ДНК з праймерами, (2) синтезу послідовності,
комплементарної матричної ДНК, і (3) денатурації утворивши-
шихся двухнитевой структур. При гібридизації, що досягається за
рахунок зниження температури реакційної суміші до +30 - + 50
С, відбувається утворення двухнитевой ділянки ДНК в строго
специфічних областях, комплементарних праймера. При темпі-
ратурі, оптимальною для роботи ДНК-полімерази - +60 - +70 С,
починається синтез ДНК у напрямку 5 '- 3' з двухнитевой
ділянки, утвореного праймерами. Потім при нагріванні
розчину приблизно до +80 - +90 С синтез припиняється і двох-
Стек гілок ділянку між матричними і знову синтезованими
молекулами ДНК розплавляється (денатурує). У першому циклі
олігопраймери гибрідизуючою з вихідною матричної ДНК, а за-
тим у наступних циклах і з знову синтезованими молеку-
лами ДНК у міру їх накопичення в розчині. У останньому слу-
чаї синтез ДНК закінчується не при зміні температурного
режиму, а після досягнення ДНК-полімеразою кордону ампліфікує-
ванного ділянки, що і визначає, в Кончно рахунку, розмір
знову синтезованого ділянки ДНК з точністю до одного
нуклеотиду.
Таким чином, при кожному циклі відбувається двухкрат-
ве збільшення числа синтезованих копій обраного для
ампліфікації ділянки ДНК і вміст продуктів ампліфікації
в розчині наростає в геометричній прогресії. Кожна з
процедур циклу визначається двома параметрами - температурою
реакції і її тривалістю, змінюється в діапозоні від десят-
ков секунд до 1 - 3 хвилин, так що повний цикл триває
від однієї до кількох хвилин. За 25 - 30 циклів число синте-
зований копій ДНК досягає кількох мільйонів. ПЛР
зазвичай проводять в автоматичному режимі, використовуючи для цього
спеціальні прилади - термоциклер або ампліфікатора ДНК.
Такий прилад дозволяє задавати потрібну кількість циклів і
вибирати оптимальні тимчасові і температурні параметри для
кожної процедури циклу з великої та часто безперервної шкали
можливих варіантів. У технічному виконанні ПЛР дуже
проста. Всі компоненти реакції - матричну ДНК, олігопрайме-
ри, суміш трифосфато і термофільних ДНК полімеразу Додам-
ють в специфічний буфер (часто одномоментно), нашаровують
невеликий об'єм вазелінового масла для запобігання раст-
злодія від висихання, потім поміщають пробірку з реакційною
сумішшю в автоматичний термоциклер і вибирають необхідну
програму циклічної зміни температури і тривалості каж-
дого кроку реакції. Загальний об'єм реакційної суміші, зазвичай,
становить від 10 до 50 - 100 мікролітрів. Вибір оптимального
режиму роботи визначається довжиною і специфічністю ампліфі-
ціруемого ділянки. Слід підкреслити, що, реально, для
кожній полімеразної реакції в звісімості від типу праймерів,
довжини ампліфікованої фрагмента, особливостей його привчає-
ної нуклеотидної структури, а також від типу використовуваної
термофільною ДНК-полімерази оптимальні режими температури і
склад ампліфікаціонной суміші можуть істотно варіювати
і часто підбираються емпірично.
За допомогою ПЛР можна безпосередньо дослідити місця
локалізації передбачуваних мутацій або поліморфних сайтів, а
також вивчати наявність будь-яких інших специфічних особ-
ностей ДНК. Підбір системи олігопраймеров виробляють на
підставі аналізу нуклеотидної послідовності ампліфіці-
тованого ділянки. Розроблено різні варіанти автомати-
тичного пошуку послідовностей ДНК, використання кото-
яких в якості праймерів оптимізує процедуру ампліфікації
специфічної ділянки ДНК геному. Для того, щоб Гібрит-
дізація проходила суворо специфічно, праймери не повинні з-
тримати повторюваних послідовностей ДНК. Ми вже отме-
Чалі, що для проведення ПЛР досить мінімального колі-
пра ці ДНК, аж до однієї молекули. Крім того, різні
органічні компоненти клітин, такі як білки, ліпіди, уг-
леводи, фрагменти клітинних органел або мембран помітно не
перешкоджають процесу ампліфікації. Тому в якості
джерела матричної ДНК може бути використаний будь-який, навіть
деструктурированной біологічний матеріал, що зберіг в
своєму складі достатньо повний набір фрагментів вихідних
молекул ДНК. Для специфічної ампліфікації поряд з очищені
ної ДНК використовують висушені на фільтрувальному папері плями
крові, невеликі шматочки тканин, наприклад, такі як ворсини
хоріона, змиви з порожнини рота, цибулини коренів волосся, куль-
тури клітин і сливи середовища з клітинних культур, що містять не
прикріпилися і не дали зростання клітини, зіскрібаючи з цітоге-
генетичних препаратів і, що особливо дивно, отриманий-
ні при паталогоанатомічної аналізі і довго зберігати-
еся фіксовані тканини (Higuchi, R. et al., 1988). Більше
докладні відомості про постановку ПЛР можна отримати в ряді
спеціальних керівництв та інструкцій.
Існують різні модифікації ПЛР, які викорис-
теризуються у залежності від конкретних цілей проведення реакції
або від характеру подальшого молекулярного аналізу ампліфі-
катів. Так, для трудноампліфіціруемих ділянок ДНК (утримуючи-
щих різні повторювані послідовності або незвичайні
структурні елементи), а також у тих випадках, коли матріч-
ва ДНК присутня в слідових кількостях, ПЛР проводять в
два раунди, використовуючи як матричної ДНК на другому
етапі ампліфікації, або як ще говарят при доампліфікаціі,
продукти ПЛР, синтезовані в першому раунді. Часто в цих
випадках для підвищення специфічності праймування використовують
систему, так званих вмонтованих (nested) праймерів,
тобто при доампліфікаціі в якості праймерів вибирають
послідовності, локалізовані всередині ампліфікується в
першому раунді ділянки ДНК.
У ряді випадків зручно проводити мультиплексну ПЛР,
тобто одночасну ампліфікацію кількох ділянок мат-
ричной ДНК. Можна отримувати мічені продукти ПЛР, додаючи в
реакційну суміш мічені трифосфати. Особливої уваги зас-
лужівает можливість проведення ПЛР з молекулами кДНК.
На основі цієї реакції розроблено методи аналізу експресії
генів і отримання великих кількостей кДНК. Доречно зауважити,
що реакцію ампліфікації можна проводити не тільки в розчині
рах, але й безпосередньо на хромосомних препаратах, при
цьому у разі використання мічених нуклеотидів продукти
ампліфікації будуть гібрідізоваться і виявляти комплементарності-
ні їм ділянки ДНК на хромосомах (метод PRINS - polymerase
reaction in situ). До теперішнього часу доступними ампліфі-
кації були ділянки ДНК, що не перевищують за довжиною 5 kb. У
Останнім часом, завдяки внесенню ряду кардинальних усо-
лення (особливий підбір праймерів, використання сра-
зу двох різних ДНК полімераз, тріцінового буфера, спеці-
ального температурного режиму полімеразної циклів), можливо
проведення ампліфікації фрагментів ДНК, що досягають 35 kb. У
Зокрема, таким чином вдалося ампліфікувати плазміду з
вставкою 8.5 kb, рівної цілого геному вірусу HIV 1 (Cheng et
al., 1994). І це ще не межа. Надалі ми неоднократ-
але будемо повертатися до опису різних модифікацій ПЛР,
так як цей метод по праву став один з основних у молеку-
лярной діагностиці спадкових хвороб (Erlich, 1993;
Rolfs et al., 1993; RT-PCR, Methods and Applications, 1991).
Можливість дуже точного і специфічного вибору учас-
ка ДНК для ампліфікації, невеликі розміри синтезованих мо-
молекул, їх величезна кількість надзвичайно полегшують молеку-
лярні аналіз продуктів ПЛР. Як правило, ампліфікованих
ДНК можна безпосередньо спостерігати в прохідному ултрофіоле-
ті у вигляді червоної смуги після електрофоретичного кон-
рірованія і звичайного фарбування гелю етідіумом бромідом.
Крім того, можлива ідентифікація цих молекул шляхом блот
гібридизації зі специфічними олігонуклеотидно зондами.
При наявності сайтів рестрикції в ампліфікованих ділянках
ДНК після їх обробки ендонуклеаза та електрофорезу колі-
кість і положення забарвлених смуг на гелі змінюється в
Відповідно до положення цих сайтів (Мал. 1.11). Шляхом
електрофорезу можуть бути виявлені невеликі відхилення в
розмірах синтезованих молекул, які виникають за рахунок
делецій або інсерцій декількох нуклеотидів у вихідній мат-
ричной молекулі ДНК; конформаційні зміни в однониткових
молекулах ДНК, що виникають при заміні підстав; а також
структурні зміни в дуплексу між нормальними і му-
тантнимі варіантами ампліфікованих фрагментів ДНК. І, на-
кінець, можливо визначення повної нуклеотидної послідовності
ності синтезованих молекул з ідентифікацією всіх му-
Тацій в досліджуваному районі матричної ДНК (див. Главу IV).
Розроблено варіанти ПЛР, при яких синтезуються переваж-
нням однониткових фрагменти ДНК, що в последуюшем зна-
ключно полегшує їх секвенування. Надалі ми більше
докладно розглянемо методи генотипування мутацій за допомогою
ПЛР, що дозволяють проводити повний молекулярний аналіз
певних ділянок ДНК у окремих індивідуумів. При цьому
відпадає необхідність спостереження малих кількостей ДНК пу-
тим їх гібридизації з міченими геномними або кДНК-зондами.
Це не означає, звичайно, що методи блот гібридизації та
клонування втратили свою актуальність. Без їх використанням
ня неможлива молекулярна ідентифікація генів, предшеству-
ющая розробці методів молекулярної діагностики з вико-
ристанням ПЛР.
ГЛАВА VI.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИЙ АНАЛІЗ експресії генів.
Розділ 6.1 Диференціальна активність генів, вибір
адекватних біологічних моделей.
Молекулярна ідентифікація гена, порушення роботи кото-
рого призводить до розвитку спадкового захворювання, ство-
ет передумови для подальшого більш детального аналізу ге-
генетичних і біохімічних основ патогенезу і розробки на
цій базі найбільш ефективних методів лікування. Початкові
етапи вирішення поставленого завдання включають в себе іссследо-
вання механізмів тканиноспецифічною експресії та регулювання
активності генів у нормальних клітинах, оцінку клінічного
вираження різних типів порушень гена, виявлення первин-
ного біохімічного дефекту, а також зіставлення молеку-
лярних основ роботи генів у нормальних і мутантних клітинах.
Природно, що в різних тканинах організму
експресується не всі, а лише певні групи генів.
Виняток становлять лише так звані гени домашнього хо-
дарства (house-keeping genes), генопродукти яких забезпе-
чивают життєдіяльність всіх типів клітин (см.главу II). За
дуже орієнтовними оцінками в тканинах ссавців і че-
ловека працюють в середньому близько 2-3% всіх генів, в клітинах
печінки - основний біохімічної лабораторії організму - близь-
ло 5%, тоді як у клітинах мозку - приблизно 9-10% (Корочкін,
1977). Це означає, що в різних соматичних клітинах
еукаріот транскрибується від 5 до 20 тисяч генів (Льюин,
1987). Значна частина контрольованих ними білків необ-
дима для забезпечення життєдіяльності самих клітин. У про-
процесі онтогенезу і клітинної диференціювання в різних тканинах
організму відбувається виборча активація багатьох інших
специфічних генів, що, в кінцевому підсумку, обумовлює
значні міжклітинні розходження в наборі білків і в ско-
рости їх синтезу.
Контроль генної активності здійснюється за рахунок диф-
диференціальних транскрипції і процесингу РНК в клітинних яд-
рах, різної стабільності мРНК в цитоплазмі, виборчої
трансляції мРНК. Диференціальна експресія генів, кінцевим
результатом якої є синтез функціонально активного
білка, передбачає не тільки адекватну регуляцію генної
активності, але і повноцінність всіх наступних етапів,
включаючи сам білковий продукт, його стійкість, здатність
до посттрансляційним модифікаціям, правильну локалізації та
коректна взаємодія з іншими компонентами клітини. Ре-
шує значення для успішного аналізу всього цього складного
комплексу має вибір адекватних біологічних моделей, по-
позов і цілеспрямоване конструювання яких представляє
цілком самостійну наукову задачу.
Найбільш доступними модельними системами для аналізу
експресії генів in vitro є культури клітин. Для кло-
вання, генноинженерном маніпулювання, спрямованого
введення сайт специфічних мутацій, отримання великого ко-
кількостей клонованих послідовностей ДНК, специфі-
чних молекул мРНК, а також білкового продукту гена зазвичай
використовують генетично добре вивчені прокаріотів
системи (Хеймс, Хіггінс, 1987). Для дослідження процесів
трансляції, посттрансляційних модифікацій білка, його внут-
ріклеточной локалізації та функціонування частіше використовують
культури клітин еукаріот і, зокрема, специфічні куль-
тури клітин людини. Особлива роль у вивченні початкових ця-
пов розвитку патологічного процесу, обумовленого
присутністю генних мутацій, а також у розробці терапевти-
чних методів, включаючи генноінженерних корекцію метаболіт-
тичного дефекту, належить культурам мутантних клітин. Це
можуть бути первинні або перещеплюваних культури клітин, напів-
ченние зі специфічних тканин хворої людини, або виокрем-
лені з тканин лінійних тварин, службовців генетичної
моделлю спадкового захворювання.
Ідентифікація гомологічних генів у експериментальних
тварин у багатьох випадках значно полегшує і прискорюють
дослідження функціональної активності нормальних і мутант-
них генів людини. Велика роль у вивченні молекулярних ме-
ханізмів розвитку патологічних процесів in vivo принале-
жит генетичним лініях тварин. Це можуть бути лінії, по-
жані в результаті відбору спонтанно виникли або індуці-
ваних мутацій, а також штучно сконструйовані мо-
діли на базі трансгенних тварин, у геном яких введено
чужорідний ген або фрагмент ДНК. Розглянемо основні експе-
риментальном підходи, які використовуються для аналізу експресії
генів.
Розділ 6.2 Аналіз регуляторних елементів гена, ізоляція
і дослідження мРНК, штучні
транскрипційні системи.
Регуляція експресії генів у ланцюжку ДНК - РНК - білок
може здійснюватися на різних молекулярних рівнях. У
Відповідно до цього дослідження диференціальної активності
генів в різних типах клітин і тканин включають оцінку роботи
контролюючих елементів генів, аналіз молекул РНК на всіх
етапах від появи первинного транскрипту до зрілої мРНК і
вивчення відповідного білкового продукту, включаючи його
процесинг (дозрівання), внутрішньоклітинну локалізацію, тка-
неспецифічне розподіл.
Дослідження регуляторних цис-діючих елементів ге-
нома, таких як промотори, інхансери, ділянки ДНК, стримую-
щие транскрипцію, є складовою частиною аналізу молеку-
лярной структури будь-якого гена. Ідентифікацію таких елементів
проводять з використанням різноманітних сучасних методів
молекулярної генетики. Зокрема, послідовності ДНК в
5'-фланкирующей області гену, відповідальні за тканеспеці-
чних індукцію генної активності, можуть бути локалізовані
шляхом дослідження транскрипції в різних лініях клітин
при введенні в них генів з штучними делеція цих
ділянок ДНК. Для оцінки активності ідентифікованих регу-
регуляторну послідовностей їх зливають з чужорідними добре
вивченими неіндуцібельнимі клонованими генами, так називаються
зламні "репортерами". Такі генетичні конструкції в
складі векторних послідовностей вводять в культивуючи-
мі клітини еукаріот і спостерігають за зміною рівня
експресії. У якості "репортера" часто використовую ген хло-
рамфенікол-ацетил-трансферази (CAT-ген), який у естест-
ських умовах експресується тільки в клітинах прокаріотів.
Сам фермент (CAT) володіє високою активністю, що позволя-
ет не тільки легко виявляти її мінімальні кількості в
клітці, але і з високою точністю проводити кількісну
оцінку. Для підвищення чутливості аналіз експресії хі-
мірних генів часто проводять в культурі фібробластів нирок
африканської зеленої мавпи (COS-клітини). Ці клітини моди-
ваних таким чином, що в них після трансфекції про-
виходить ампліфікація копій сконструйованих певним
чином ЕПІС (позахромосомних генетичних конструк-
ций (див. Главу X), що веде до значного посилення сиг-
лів експресії введених генів (трансгенів). Перенесення генів
(Трансгенозу) може бути здійснений і на рівні цілого орга-
низма, зокрема, зиготи. Отримані в результаті подібних
маніпуляцій трансгенні тварини можуть бути також вико-
мендовані як модельної системи для аналізу механізмів
тканиноспецифічною активації генів in vivo.
Матрична РНК є найбільш зручним об'єктом для
вивчення регуляції транскрипції генів і Посттранскрипційна
модифікацій РНК. Тотальна клітинна РНК сото на 90 - 95%
з рибосомальних і транспортних РНК, тоді як частка трансліт-
ються або poly (A) + РНК не перевищує 5% (Льюин, 1987). При
цьому, концентрація РНК-транскриптів індивідуальних генів
серед всіх молекул мРНК, в середньому, коливається в межах від
0.01% до 0.001% (Гайцхокі, 1978). Тому для виявлення
індивідуальних типів мРНК повинні використовуватися високо-
чутливі методи. Звичайним методом ідентифікації мРНК на
тканинному і клітинному рівнях є гібридизація in situ
РНК-та ДНК-зондів з молекулами мРНК на гістологічних
зрізах (Хаффнер, Уіллісон, 1990). Як ДНК-зондів
використовують клоновані послідовності кДНК і синтетичні-
ческие олігонуклеотиди. Після інкубації мічених зондів на
цитологічних препаратах з наступним ретельним відмиванням
незв'язаних молекул положення комплементарних РНК-пос-
вательность в клітинах визначають радіоавтографіческімі, чи-
бо в разі біотінового мічення - імуногістохімічними ме-
тодамі. Оптимальні умови гібридизації дають можливість не
тільки виявляти присутність специфічних мРНК, але і визна-
лити їх внутрішньоклітинну локалізацію (Манк, 1990; Хаффнер,
Уіллісон, 1990; Boehringer, Mannual, 1994).
Аналіз індивідуальних РНК включає ізоляцію з тканин
пулу непошкоджених біологічно активних мРНК і ідентифікації-
цію серед них специфічних молекул шляхом використання раз-
особистих варіантів ДНК-РНК гібридизації. Для генів з високим
рівнем транскрипції можуть бути придатні дот або слот блоту
(См.главу I). Коли джерелом РНК служать клітини, які не
можуть бути отримані у великій кількості, використовують цітоп-
лазматіческій дот-блот. При цьому цілі клітини лизируют, і
фіксують безпосередньо на тих мембранах, на яких про-
водять гібридизацію. Значно велику чутливість
володіє, так званий Northern blot (Нозерн-блот) - гинув-
рідізація з ДНК-зондами на фільтрах попередньо скон-
центрованих з фракціонованих шляхом електрофорезу молі-
кул РНК (Sambrook et al., 1987). Електрофорез проводять в
агарози з додаванням формальдегіду, денатуруючого РНК. У
цих умовах швидкість просування молекул РНК через гель
знаходиться в логарифмічній залежності від довжини послідовно-
ності, що дозволяє точно визначити розмір РНК
транскрипту. Основна маса РНК на гелі представлена у вигляді
двох домінуючих бендів, що відповідають двом типам рибосом-
мальної РНК - 28S і 18S. Всі молекули мРНК сконцентровані
в погано помітною, слабо забарвленої області гелю, в якій
окремі типи мРНК можуть бути виявлені тільки шляхом Гібрит-
дізаціі з відповідними ДНК-зондами. Нозерн-блот має те
перевагу, що при електрофорезі можуть бути розділені мо-
молекули РНК, що дають перехресну гібридизацію з ДНК-зондом.
Крім того, характер електрофоретичного поділу позво-
ляєт візуально оцінити якість ізольованою РНК. При дуже
низьких концентраціях специфічних мРНК або в тих випадках,
коли ДНК-зонди дають перехресну гібридизацію з іншими
компонентами (не мРНК), проводять збагачення ізольованою
тотальної РНК трансльованими мРНК шляхом відбору на колонках
фракцій, що містять полі-A "хвости". Для цього виділену
РНК пропускають через коротку колонку з пришитими полі-T
олігонуклеотидно послідовностями і високої концентра-
єю солей в буферному розчині, так щоб молекули мРНК, зі-
тримають полі-A "хвости", затримувалися на колонці. При
зниження концентрації солей в буфері відбувається розплавлення
AT дуплексів і вивільнення молекул мРНК. Таким способом
частка цих молекул в певних сольових фракціях може бути
збільшена на два порядки. Звичайно, полі-A селекція застосовна
в тих випадках, коли є достатньо велика кількість
тотальної РНК. Іншим методом для дослідження структури РНК
транскриптів є S1-аналіз. У цьому випадку ДНК-РНК гинув-
рідізацію ведуть в розчині, куди і додають S1 нуклеазу для
перетравлення однониткових незв'язаних молекул як ДНК, так
і РНК, після чого проводять електрофоретичної очищення дуп-
плексів, які потім елюіруют з гелю для подальшого ана-
лізу (Sambrook et al., 1989). Цей метод дуже зручний для
аналізу стартових сайтів і 3'-решт генів, для визначення
напрямки транскрипції і картування інтронів.
Рівень мРНК в клітині визначається декількома кінетики фазо-
тичними параметрами - швидкістю первинного синтезу, ефек-
активністю процесингу РНК-транскриптів та періодом полураспа-
та зрілих молекул мРНК. Останній параметр визначають за ді-
намики зникнення мРНК після додавання до клітин актин-
міціна D, специфічним чином супрессірующего транскріп-
цію.
Дослідження механізмів транскрипції і процесингу пер-
первинних РНК-транскриптів проводять in vitro з використанням
штучним чином сконструйованих транскрипційних
систем (Manley et al., 1986; Dignam et al., 1983;
Gutierrez-Hartmann et al., 1987; Хеймс, Хіггінс, 1987). Для
цього можуть бути обрані два різних підходи. У першому
випадку ізолюють ядра і як транскрипционной матриці
використовують неушкоджений хроматин. Синтез РНК проводять з
додаванням усіх необхідних реагентів і, зокрема, три-
фосфатів, в один з яких (зазвичай в урацил) вводять ради-
оактівную позначку. При цьому знову синтезовані молекули РНК
виявляються міченими. Вибір специфічних молекул РНК прово-
дять шляхом ДНК-РНК гібридизації, проте, на відміну від раніше
описаних методів аналізу мРНК, використовують немічених
кДНК-зонди, попередньо нанесені на фільтри. Великим
перевагою цієї транскрипционной системи є її
максимальна наближеність до природних процесів. При
другому підході транскрипція ведеться з клонованих фрагмент-
тов ДНК, а ядерні екстракти служать джерелом ферментів і
регуляторних білків.
Розділ 6.3 Аналіз трансляції, ДНК-експресійна систе-
ми.
Традиційні методи аналізу регулювання трансляції і
посттрансляційних модифікацій білків засновані на викори-
вання модельних систем, що представляють собою цітоплазматі-
ческие вільні від мРНК неядерних екстракти клітин, що містить
жащие рибосомальної апарат, транспортні РНК, набір аміно-
кислот і ферментів, необхідних для трансляції і процесингу
білків (Хеймс, Хіггінс, 1987; Клеменс, 1987). Після додавання
лення до такої системи специфічної мРНК відбувається синтез
відповідної поліпептидного ланцюга in vitro. При введенні
мічених амінокислот у систему знову синтезовані білки
після електрофоретичної очищення можуть бути ідентіфіцірова-
ни шляхом радіоавтографіі або імунологічними методами,
за наявності відповідних антитіл (Клеменс, 1987). Однак,
для значного числа моногенних спадкових захворювань-
ний первинний біохімічний дефект невідомий, а слідові-
тельно, не ідентифіковані і мРНК транскрипти. Біохімічних
тичне вивчення багатьох білків утруднено через їх мінорного
змісту і відсутності ефективних методів виділення і
очищення. Остання обставина значною мірою від-
носиться до нерасворімим білкам, асоційованим з мембранними
структурами клітин.
ДНК-експресійна системи, тобто клітинні культу-
ри, які синтезують чужорідні білки, є дуже потужним
засобом аналізу структури, функції та синтезу білків
(Sambrook et al., 1989). Такі системи конструюють на осно-
ве експресійна векторів, що містять у своєму складі силь-
ні промотори і регуляторні послідовності, які забезпечу-
ющие високий, але в той же час регульований рівень
експресії. Кодуючі послідовності чужорідних генів
інсертіруют (вставляють) за допомогою відповідних генно-ін-
нерних прийомів в область дії цих промоторів. Конеч-
але, такі системи повинні містити і трансляційні сигнали,
зокрема, сайти зв'язування рибосом, що забезпечують роботу
рибосомальному апарату клітин господаря. У деяких випадках
експресійна вектори вводять в мутантні за протеазной ге-
нам клітинні культури, з тим щоб запобігти деградації
чужорідних білків в клітинах.
Існує три типи експресійна систем - бактеріаль-
ні, сконструйовані зазвичай на основі E.coli, дріжджові і
експресійна культури клітин ссавців. Кожна з цих
систем має свої переваги і недоліки. Бактеріальні
системи найбільш зручні для клонування, володіють високим
рівнем експресії (до 1-2 грам білка на літр культури) і
їх використовують, зазвичай, для виробництва великої кількості
чистого білка, необхідного для отримання антитіл або для
фармацевтичних цілей. Зручні також ці системи для введе-
ня змін у різні райони поліпептидного ланцюга шляхом
сайт-спрямованого мутагенезу в нуклеотидної послідовності
ності чужорідної ДНК. Отримання та дослідження таких "му-
тантних "білків дуже важливо для оцінки функціональної значи-
мости різних ділянок білка.
Рівень експресії чужорідних білків в дріжджових кліть-
ках вдвічі, а в клітинах ссавців в десятки разів нижче, ніж
в бактеріальних. Однак, в бактеріальних клітинах відсутні
ферментативні системи, що забезпечують процесинг еукаріоти-
ческих білків. Тому еукаріотичні системи зручніше
використовувати для вивчення посттрансляційних модифікацій
білка - глікозилювання, тобто приєднання до поліпеп-
тідной ланцюга вуглеводних залишків; скручування білка з утворенням
ристанням третинної структури, часто, за рахунок виникнення
дисульфідних зв'язків; і N-кінцевих модифікацій, стабілізують-
щих структуру білка. У ДНК-експресійна системах може
бути синтезовано досить багато білка, щоб отримати
його в кристалічній формі і досліджувати просторову
структуру та функціональне призначення окремих доменів
(Хеймс, Хіггінс, 1987).
Використання експресійна бібліотек для ізоляції ко-
дірующіх послідовностей гена розглядалося раніше (див.
Глава II). Після секвенування кДНК можна, виходячи з гені-
тичного коду, прогрозіровать амінокислотний склад білка і
провести компьюторние пошук в банку даних гомологічних
послідовностей у складі білків з уже відомою струк-
турою та функціями. Виявлення споріднених білків, близьких за
своєму поліпептидному складу, значно прискорює і обліг
чає подальший молекулярний аналіз функціонування дослі-
дуємо білка в клітині. Амінокислотна послідовність
білка дозволяє прогнозувати його третинну структуру,
ідентифікувати домени, оцінювати функціональну значимість
цілого білка і окремих його компонентів. Не менш важливим
практичним наслідком цих даних є також можли-
ність отримання антитіл до строго специфічним ділянкам біл-
ка. Для цього можуть бути використані два підходи - біохімічних
чний та молекулярно-генетичний. У першому випадку для имму-
нізації використовують штучно синтезовані поліпептиди,
які пришивають до білкової молекулі-носія (гаптеном).
Розміри таких поліпептидів, зазвичай, не перевищують 30 аміно-
кислот - вони не можуть бути дуже великими через високу сто-
имости і трудомісткості синтезу довгих молекул. При другому
підході екзоні ділянки гена інсертіруют в експресійна
вектор в область, кодірующіую селектіруемий білок. У резуль-
таті експресії такої конструкції отримують злитий білок, в
якому поряд з амінокислотною послідовністю селект-
тованого маркера міститься певний фрагмент досліджуваної-
го білка. Цю химерні молекулу і використовують для імунізації
тварин та отримання моновалентних або моноклональних анти-
тел. При наявності антитіл можуть бути застосовані різні им-
мунологіческіе подхооди для аналізу тканиноспецифічною і
внутрішньоклітинного розподілу білка, дослідження його моди-
сифікацію, а також для отримання нативного білка в препаратів-
них кількостях.
Наступний кроком на шляху аналізу молекулярних механізмів
регуляції експресії гена є ідентифікація тих пору-
ний в структурі, локалізації та активності молекул мРНК і
білка, які виникають внаслідок генетичних мутацій. Ми
вже згадували про величезне значення культур мутантних клітин
для подібних досліджень. Проте, багато патологічні
процеси, що протікають в організмі хворого, не можуть бути
досліджено in vitro. З іншого боку, можливості отри-
ня необхідної кількості клітин і тканин пацієнта і випро-
танія in vivo різних схем лікування значно обмежені.
Тому для багатьох спадкових хвороб ефективність
вивчення основ патогенезу істотним чином залежить від
наявності адекватних біологічних моделей. Способи конструювання-
вання таких моделей детально викладені в Главі YIII.
РОЗДІЛ II.
ГЕНОМ ЛЮДИНИ, СТРУКТУРА ГЕНІВ.
Розділ 2.1. Визначення геному і його основних елементів-
тов.
Термін геном використовується для позначення повної гені-
тичної системи клітини, що визначає характер онтогенеті-
тичного розвитку організму і спадкову передачу в ряду
поколінь всіх його структурних та функціональних ознак.
Поняття генома може бути застосоване до таксономічної груп-
пе, увазі, окремої особини, клітці, мікроорганізму чи ви-
Русу. Так, можна говорити про структуру геному еукаріот і про-
каріота, порівнювати геноми різних видів, вивчати особливості
будови генома у конкретних індивідуумів або стежити за з-
зміни, що відбуваються в геномі специфічних клітин в
процесі їх онтогенетичної диференціювання. Часто геном
визначається як генетична інформація, укладена в мо-
молекули ДНК однієї клітини. Однак, такі факти, як
відсутність зв'язку між кількістю ДНК в розрахунку на Гаплоїд-
ний геном і таксономічним статусом видів, а також багато-
чисельні приклади існування величезних відмінностей у утримуючи-
нии ДНК між близькоспорідненими видами (так званий
"З-парадокс") свідчать про те, що далеко не всі
ділянки ДНК зв'язані з інформаційними функціями. Поняття ге-
нома і ДНК в значній мірі тотожні, тому що
основні принципи організації і функціонування геному це-
ликом визначаються властивостями ДНК. Притаманні цих молекул
потенційні можливості практично необмеженого струк-
турного різноманітності визначають все різноманіття світу живих
істот, як на рівні міжвидових, так і індивідуальних раз-
відмінностей в межах одного виду (Баєв та ін, 1990; Ратнер, 1985).
Процес еволюції та диференціювання окремих видів, як
правило, супроводжувався накопиченням змін у структурі ге-
нома. Це стосується, перш за все, таких параметрів, як ло-
калізація і характер упаковки ДНК в клітинах; кількість ДНК,
припадає на гаплоїдний геном, типи, співвідношення і функ-
ції кодують і некодуючих нуклеотидних послідовник-
ностей; регуляція експресії генів; міжпопуляційної Варіано-
нестабільність і філогенетичний консерватизм первинної структу-
ри геному. У межах одного виду основні параметри геному
досить постійні, а внутривидовое різноманітність забезпечують-
ється за рахунок мутаційної мінливості, тобто випадіння,
вставки або заміни нуклеотидів на порівняно невеликих
ділянках ДНК. Найчастіше такі зміни стосуються не-
експресуються елементів геному (інтронів, псевдогенами,
міжгенних спейсерних ділянок ДНК і т.д.).
Геноми еукаріот, по-суті, можна розглядати як
мультігеномние сімбіотческіе конструкції, що складаються з обли-
Гатне і факультативних елементів (Golubovsky, 1995). Основу
облігатних елементів складають структурні локуси, колі-
якість та розташування яких у геномі досить постійно.
Присутність в хромосомах деяких видів повторюваних ДНК,
ампліфікованих ділянок, ретровірусних послідовник-
ностей, псевдогенами, також як наявність у клітці ЕПІС, рет-
ротранскріптов, амплікон, додаткових B-хромосом і раз-
особистих цітосімбіонтов (вірусів, бактерій, найпростіших) є-
ється не строго обов'язковим, їх кількість і стан може
значно варіювати, тобто ці елементи є фа-
культатівнимі. У той же час участь факультативних елементів-
тов в спадкової передачі ознак, у формуванні му-
ційної мінливості і в еволюційних перетвореннях ви-
дов безсумнівно доведено. Крім того, існує безперервний
перехід від одних станів до інших за рахунок інсерцій
екстрахромосомних ДНК в хромосоми і вибудовування транспозо-
ноподобних мобільних елементів з хромосом. Отже,
незважаючи на значні відмінності факультативних послідовно-
ності від облігатних за характером основних інформаційних
них процесів (реплікації, транскрипції, трансляції та Сегре-
гаціі), вони також повинні розглядатися, як найважливіші елементи якої
менти геному.
Зупинимося тепер більш детально на основних принципах
організації геному людини. У кожній диплоїдної клітці з 46
хромосомами міститься близько 6 пикограмм ДНК, а загальна довжина
гаплоїдного набору з 23 хромосом становить 3.5 * 10! 9 пар
нуклеотидів (Kao, 1985). Цієї кількості достатньо для ДНК
кодування декількох мільйонів генів. Однак, за багатьма
незалежними оцінками справжнє число структурних генів зна-
диться в межах від 50 000 до 100 000. У розділі 2.4 виклад-
ни сучасні підходи, які використовуються для підрахунку загального ко-
кількостей генів, з яких випливає, що найбільш вірогідна
оцінка їх числа складає близько 80 000. Зіставляючи це
значення з середніми розмірами гена і співвідношенням між ве-
личиною їх екзонів і інтрони областей, можна заклю-
чити, що кодують послідовності ДНК займають не більше
10-15% всього генома (McKusick, Ruddle, 1977). Таким чином,
основна частина молекул ДНК не несе інформації про аміно-
кислотної послідовності білків, що складають основу будь-
бого живого організму, і не кодує структуру рібосомаль-
них, транспортних, ядерних та інших типів РНК. Функції цієї
"Надлишкової" (junk) ДНК не ясні, хоча її структура вивчена
досить докладно. Передбачається, що ця ДНК може
брати участь у регуляції експресії генів і в процессингу
РНК, виконувати структурні функції, підвищувати точність гомо-
логічного спаровування і рекомбінації, сприяти успішній
реплікації ДНК і, можливо, є носієм принципово
іншого генетичного коду з невідомою функцією.
Найбільш загальна характеристика геному може бути отримана
за допомогою аналізу кінетики реассоціаціі молекул ДНК. Динамік-
ка плавлення геномної ДНК виявляє присутність по край-
ній мірі трьох розрізняються за хімічною складності фракцій
(Льюин, 1987; Газарян, Тарантул, 1983). Швидко ренатурірую-
щая фракція ДНК складається з відносно коротких високопов-
торуючи послідовностей; в проміжну фракцію вхо-
дит безліч помірно повторюваних ДНК - більш протяжен-
них, але представлених меншою кількістю копій, повільно рена-
турірующая фракція об'єднує в собі унікальні послідовно-
ності ДНК, що зустрічаються в геномі не більше 1-2 разів.
За допомогою молекулярного аналізу проведена ідентифікація
основних класів повторюваних послідовностей ДНК,
становлять більше 35% всього геному людини та які включають
сателітних ДНК, інвертовані повтори, помірні і низько-
копійний повтори, а також міні-і мікро пос-
сті ДНК. Класифікація цих типів повторів достатній-
але умовна і заснована, головним чином, на двох характе-
ристиками: довжині повторюваних корови одиниць, яка може
варіювати від 1-2 до більш, ніж 2000 п.о., і числі їх ко-
пий, також змінюються в дуже широких межах - від десятка
до мільйона на гаплоїдний геном. Не менш важливими характе-
тиками різних класів повторюваних ДНК є нук-
леотідная послідовність "корови" одиниць повтору, спе-
цифічні їх організації, хромосомна локалізація, внутрішньо-
і міжвидова стабільність, а також можливі функції цих
типів ДНК.
Розділ 2.2. Повторювані послідовності ДНК.
Сателітна ДНК це клас високоповторяющіхся пос-
вательность, що становлять близько 10% всього геному людини
(Kao, 1985). При центрифугуванні геномної ДНК в градієнті
щільності CsCl ці послідовності утворюють чотири від-
слушних сателітних піка з різними середніми значеннями
плавучої щільності. Методом гібридизації in situ показано
присутність сателітної ДНК переважно в центромірних,
теломерна і гетерохроматинових районах більшості хро-
мосом, при цьому характер гібридизації подібний для всіх чоти-
рьох груп і не залежить від приналежності ДНК-зондів до се-
мейства повторів, що утворюють різні сателітні піки. У
кожної з цих груп, проте, присутня невелика кіль-
кість послідовностей, що мають специфічну хромосом-
ву локалізацію. Так наприклад, близько 40% довгого плеча Y
хромосоми становить сімейство послідовностей, тандемної
повторюваних більше 3000 разів і не знайдених в інших хро-
мосом.
Виділяють три основні типи сателітної ДНК: (1) короткі
- Від 2 до 20 п.о., стабільні тандемні повтори з кратністю
у кілька десятків тисяч разів, які іноді перемежовуються
з неповторяющимися послідовностями, (2) кластери більше
протяжних повторів, злегка розрізняються по нуклеотидної
послідовності, (3) складні, що досягають декількох со-
тен пар нуклеотидів, що повторюються послідовності раз-
особистої ступеня гомології (Газарян, Тарантул, 1983). До послід-
нього типу відносяться альфа-сателітні або альфоідние ДНК,
серед яких знайдено багато хромосом-специфічних пос-
вательность. Розміри повтрояющіхся "корови" одиниць альфа-
идной ДНК складають близько 170-200 п.н. У геномі людини і
інших приматів ці мономери організовані в кластери по 20 і
більш "корови" одиниць. Після розщеплення рестриктазою BamHI
в альфоідной ДНК виявляється серія фрагментів, довжиною близько 2
000 п.о., у складі яких виявляються альфоідние після-
послідовності, специфічні для гетерохроматинових районів
різних хромосом людини (1, 3, 4, 5, 9, 6, 7, 11, 17, 19,
Х). У деяких випадках ці повтори гомологічних двом різним
хромосомами (9 і 15, 13 і 21, 18 і Х) (Willard, Waye, 1987).
Хромосом-специфічні послідовності сателітної альфа-
идной ДНК знайшли широке застосування в молекулярній цітогене-
тику в якості ДНК-зондів, зручних для маркування індиві-
дуальних хромосом у метафазних і інтерфазних клітинах челове-
ка (Юров, 1987). Передбачається, що сателітні ДНК відіграють
важливу роль у підтримці структур хромосом і, можливо, в
їх спарюванні в процесі мейозу (Charlesworth et al., 1994).
Особливе місце серед сателітних ДНК займають мікро-і
мінісателітних послідовності, що представляють собою
численну групу розсіяних по всьому геному щодо відповідності-
але коротких тандемних повторів. Мікросателіти - це клас
дінуклеотідних повторів. Розмір повторюваних одиниць в мі-
нісателітних послідовностях може змінюватися від 3 - 4 до
10 - 15 нуклеотидів. Відмінною особливістю мікро-і ми-
нісателлітов є наявність серед них великої кількості
ділянок, вариабильность за кількістю копій в кластері.
Інвертовані або звернені повтори становлять до 5%
геному. Вони складаються з двох тотожних копій довжиною близько
300 п.о., орієнтованих в протилежних напрямках на
однієї нитки ДНК і лежать на відстані від нуля до десятка
тисяч пар нуклеотидів один від одного (в середньому - 1,6 кб).
Близько 1 / 3 звернених повторів не розділені проміжними
послідовностями і носять назву паліндромів. Середнє
відстань між двома різними парами інвертованих
повторів близько 12 кб, та їх розподіл по геному носить
випадковий характер. Комплементарні пари легко асоціюють
при відпалі, утворюючи шпилькові структури з дуплексним ніжкою
і однониткових петлею, довжина якої відповідає відстані
між парою звернених повторів. Внаслідок цього надаючи-
ються приблежения досить віддалені один від одного учас-
ки ДНК, що важливо для роботи ряду ферментів, що забезпечують
процеси реплікації і транскрипції. Важливо відзначити і те, що
однониткових ділянка ДНК, утворює петлю, стає
доступним для дійства нуклеази S1, специфічно руйнує
однониткову ДНК.
Група помірно повторюваних послідовностей дуже
гетерогенна за довжиною і кількістю копій і становить близько 20%
геному людини. Як правило, вони розподілені дисперсно по
всім хромосомами, причому відносно короткі послідовник-
ності ДНК до 500 п.о., так звані короткі диспергируют-
ванні повтори - Sine, повторюються більше 100 000 разів, у
середньому, через кожні 2.2 кб. Число копій довших
диспергованих послідовностей - Line, не перевищує 10
000. Помірні повтори знайдені у всіх структурних компонен-
тах геному за винятком кодують областей генів. Два
головних сімейства помірних повторів, Alu і Kpn1, займають,
принаймні, 10% геному і практично стільки ж зайнято
кількома сотнями інших родин повторів цього класу.
Основною одиницею Alu сімейства є коротка
послідовність з 300 п.о., повторена в геномі челове-
ка кілька сот тисяч разів, в середньому, через кожні 5 кб чи
через кожні 2 - 3 диспергованих повтору, що належать
інших сімейств (Kao, 1985; Льюин, 1987). При цьому,
кластери Alu-повторів, як правило, лежать всередині R-дисків
метафазних хромосом - Гімза негативних (G-дисків). Роз-
ределеніе Alu-повторів по геному вельми нерівномірно як
між хромосомами, так і за їх довжиною. Так, в хромосомах 14,
16, 21 Alu-послідовності концентруються в області
центромери, а в хромосомах 4, 19, 20, Х і У виражені
кластери Alu повторів не знайдені. Члени Alu сімейства не
повністю ідентичні один одному. Проте, всі вони містять
сайт рестрикції для ферменту AluI і мають димерную структу-
ру, тобто складаються з двох прямих повторів довжиною близько 130
п.о. з багатою аденіном вставкою з 31 нуклеотиду у другому
мономере. Кожна Alu послідовність фланковані прямими
повторами довжиною від 7 до 20 п.о., різними для різних чле-
нов сімейства і мають велику ступінь гомології з
транспозоноподобнимі елементами про-і еукаріотів. Деякі
члени Alu сімейства можуть транскрибувати за допомогою фер-
мента РНК-полімерази 111. Передбачається, що при певних
них умовах утворюються при цьому молекули РНК можуть зворотня
але транскрибувати, що в свою чергу, може призвести до
появи в клітинах Alu-містять кДНК, що володіють
властивостями ретропазонов, тобто здатних інсертіроваться в
геномної ДНК. У літературі описані випадки інсерційного му-
тагенеза Alu повторів, що призводять до гемофілії В та нейрофіб-
роматозу типу 1. Проте, частота таких подій, мабуть,
невелика. Передбачається, що короткі помірні повтори,
подібні Alu сімейства, беруть участь у регуляції транскрипції,
в процессингу РНК і в ініціації реплікації ДНК. Крім того,
виявлений високий ступінь гомології Alu послідовностей
з одним із видів низькомолекулярної РНК (7 S РНК), які займаються питаннями
щей в секреції білків.
До числа Line повторів відноситься Kpn1 сімейство, яке
складається з більш довгих і значно більш гетерогенних
послідовностей, розсіяних по всьому геному. У ряді слу-
чаїв члени Kpn1 сімейства группірются в кластери, утворюючи
довші структури, що повторюються декілька тисяч разів.
Для деяких членів цієї родини також доведена можли-
ність інсерцій кДНК-ових копій Kpn1-РНК-транскриптів в ге-
автономних ДНК і виникнення мутацій. Таке явище було попере-
ружено в одному випадку гемофілії А. Деякі Kpn1-пос-
сті не тільки транскрибуються, але й здатні
транслюватиметься (Charlesworth et al., 1994).
Розділ 2.3 Мультігенние сімейства, псевдогени, онко-
ни.
Багато генів людини повторені в геномі від декількох
одиниць до декількох сотень разів і утворюють мультігенние се-
мейства (Газарян, Тарантул, 1983; Босток, Самнер, 1981; Kao,
1985; Льюин, 1987). Ці гени зазвичай згруповані в кластери
в певних районах однієї, або декількох хромосом. Під
багатьох мультігенних сімействах поряд з функціонально актив-
вими генами містяться псевдогени - мутаційно змінені
послідовності, не здатні транскрибувати або про-
дуцірующіе функціонально неактивний генний продукт. Прімера-
ми мультігенних сімейств можуть служити гени рибосомальних,
транспортних і ядерних РНК, гени альфа-і бета-глобіну, ту-
булін, міоглобіну, актину, інтерферону та багатьох інших. У
ряді випадків, можлива виборча ампліфікація деяких
сімейств генів у процесі їх експресії, як, наприклад, ге-
нов рибосомних РНК. При цьому число здатних транскрібі-
рова копій генів збільшується за рахунок їхньої виборчої
ампліфікації в сотні і навіть тисячі разів, що супроводжується
лавиноподібним наростанням частки відповідного генопродук-
та в клітинах. Особливе місце серед мультігенних сімейств зани-
мают супергени - дуже великі кластери з сотень функціо-
нально і структурно родинних генів, розташованих в сег-
ментах окремих хромосом. Класичним прикладом супергена
може служити HLA комплекс, контроліруюшій головні антигени
гістосумісності. Він займає район більше 6000 кб на ко-
Ротко плечі хромосоми 6р21 і складається з серії тісно зчеп-
лених генів, відповідальних за синтез білків безлічі,
включають клітинні поверхневі антигени, молекули імунної-
ного відповіді і деякі компоненти комплементу. До суперген-
вим домами відносяться три комлексу розташованих на раз-
них хромосомах мультігенов, контролюючих синтез важких і
легких ланцюгів імуноглобулінів. Цікаво, що в процесі
діффіренціровкі B лімфоцитів, які продукують імуноглобуліни,
відбувається структурна перебудова цих родин. При цьому
окремі послідовності ДНК елімінуються, тоді як
інші зливаються, так що структура генів імуноглобулінів у
зрілих B лімфоцитах значно відрізняється від початкової, то
Тобто від тієї, яка спостерігається в зародкових клітинах.
Однією з важливих структурних особливостей геному челове-
ка є наявність так званих псевдогенами, унікальних
послідовностей, дуже схожих за своєю структурою з оп-
ределенном нормальними генами, але в силу присутності в ко-
дірующіх послідовностях цілого ряду мутацій не спосіб-
них транскрибувати або правильно транслюватиметься з обра-
зованием структурно і функціонально активного продукту.
Псевдогени виявлені для багатьох генів. Їх кількість варь-
ірует від однієї до кількох десятків копій на геном і в
цьому випадку вони, як правило розташовані тандемної. Іноді
псевдогени тісно зчеплені з нормальними генами, у багатьох
випадках псевдогени і гени локалізовані в різних хромосомах.
Для деяких моногенних захворювань ідентифіковані му-
тантние алелі, подібні з мутаціями у відповідних псев-
догенах. У цих випадках обговорюється можлива роль псевдогени-
нов в спнтанном мутаційному процесі.
У геномі людини присутні також нуклеотидні
послідовності, гомологічні генам деяких вірусів.
Вперше ці послідовності були ідентифіковані в гено-
ме вірусів, індукують розвиток пухлин у тварин і че-
ної людини, і тому вони були названі онкогенами. Гомологічні
послідовностей в геномі людини носять назву прото-
онкогенів. В даний час вже ідентифіковано більше 100
протоонкогенів. Білкові продукти протоонкогенів, по-мабуть-
му, відіграють важливу роль у нормальній проліферації клітин осо-
ливо на ранніх стадіях ембріонального розвитку, контролюючи
клітинний цикл і вибір геномної програми розвитку клітини.
При виникненні специфічних мутацій у протоонкогенах, а
також при порушеннях регулювання їх роботи, що виражаються в гі-
перпродукціі або в зкспрессіі в нетіпічномном місці або в
невластивий момент життєдіяльності клітини, вони починають
вести себе як онкогени, стимулюючи неконтрольоване размн-
ються і проліферацію певних клітинних клонів, що і
може, в кінцевому рахунку, привести до формування пухлини.
Розділ 2.4 Сучасне визначення поняття "ген",
транскрипція, регуляторні елементи генів.
Близько 10-15% геному людини представлено унікальними
транскрипційного послідовностями, що складають основу
структурних генів (Льюин, 1987). В даний час в поняття
"Ген" включається не тільки його транскрипційного область -
Екзони + інтрони, але навіть фланкирующие послідовності -
лідерних, що передує початку гена, і хвостова нетранслі-
ються область, розташовані на 3 'кінці гена (Рис.2.1). У
відміну від генів прокаріотів гени людини рідко представлені
однієї безперервної послідовністю і в переважній біль-
шинстве мають переривчасту структуру. Щодо короткі
кодують ділянки - зкзони, чергуються з довгими інтрони-
ми, що транскрибуються і входять до складу первинного
РНК-продукту, але потім під час процесинга первинного РНК
-Транскрипту вони вирізаються і не беруть участь в трансляції.
Процес вирізання інтронів з первинних транскриптів отримав
назва сплайсингу. Таким чином, в зрілої мРНК інтрони
області відсутні, а Екзони складають безперервну кодир-
ющую послідовність. Розміри зрілих мРНК нерідко в
десятки разів менше первинних РНК-транскріпов і, відповід-
повідно, розмірів самого гена.
Згідно класичним уявленням ген - це локус,
на хромосомі, мутації в якому реалізуються на рівні фено-
типу. У молекулярній біології ген трактується як асоційова-
ний з регуляторними послідовностями фрагмент ДНК,
відповідний певної одиниці транскрипції. Слідові-
тельно, уявлення про гені формальних генетиків далеко не
повністю тотожні його фізичної одиниці та співвідношення
між цими двома поняттями досить заплутані. Відзначимо
деякі причини цих протиріч. Відомо, що мутації
одного гена можуть призводити до зовсім різних і навіть у ря-
де випадків до комплементарним фенотипам. Результати прямого
секвенування генома свідчать про присутність у ньому
значного більшого числа генів, ніж можна очікувати від ре-
татів мутаційного аналізу. Одна і та ж послідовник-
ність ДНК в геномі може кодувати кілька різних біл-
ков, що досягається за рахунок так званого альтернативного
сплайсингу (освіту різних мРНК з одного первинного
РНК-транскрипту). У великих інтрони ряду генів виявлено
смислові послідовності інших генів ("ген в гені"),
зчитувальні в протилежному напрямку. Транскрипційні
одиниці генома можуть перекриватися за рахунок наявності різних
промоторів. Нарешті, завдяки соматичної рекомбінації
структура транскрипційного последовательнстей деяких ге-
нов може бути різною в різних клонах клітин одного орга-
низма (Т-клітинні рецептори). Ситуація з визначенням поня-
ку "ген" ще більше ускладнюється, якщо в це поняття вклю-
чать численні регуляторні послідовності. Метушні-
кає питання: "Як далеко від гена можуть розташовуватися ці
послідовності, щоб їх можна було включати в структуру
гена? ". Для багатьох цілей виявляється зручним введене в
Останнім часом поняття "рахований ген" - counting gene.
Останній розглядається як окрема транскрипційного
одиниця ДНК або її частина, яка може транслюватися в
одну або кілька взаємопов'язаних амінокислотних послідовно-
ність. Тому послідовність, що дає дві
транскрипційні одиниці за рахунок альтернативного сплайсингу
і, як наслідок, два різних білки враховується як один ген.
Однак, якщо ступінь гомології двох генопродуктов, що мають
загальний транскрипційного ділянку, невелика, то ці послідовно-
ності розцінюються як два різних гена (Fields et
al., 1994).
За своїм функціональним призначенням гени можуть бути
розділені на дві групи. Група I представлена генами, коди-
ючий власне білки; група II - генами, контролюючого-
ми синтез рибосомних, транспортних і ядерних РНК. За ха-
рактеру експресії гени також можуть бути поділені на дві
групи - гени "домашнього господарства" (housekeeping genes),
продукти яких необхідні для забезпечення жізнедеятель-
ності будь-якого типу клітин, і тканиноспецифічною гени, що забез-
печує спеціалізовані функції клітин, тобто гени,
функціонально активні тільки в певних типах клітин
(Тканин) і тільки на певних стадіях онтогенезу, так
звані гени термінальної диференціювання.
Вважається, що середні розміри гена людини складаючи-
ють, приблизно, від 10 до 30 кб. Однак, ця величина може ко-
Леба від декількох десятків до мільйонів пар нуклеоті-
дов. Згідно з останніми даними, найменший з відомих
генів-МСС-7, має розміри всього 21 п.о. (Gonzales-Pastor
et al., 1994), а самий болшой - ген дистрофина -2.2 Мегабаз.
Гени відокремлені один від одного протяжними проміжками -
спейсерами, що містять у своєму складі велику кількість
повторюваних послідовностей ДНК і нетранскрібіруемие
унікальні послідовності.
Розглянемо більш детально сучасні дані про число
генів в геномі людини. Отримані різними методами оцінки
цієї величини наведені у табл.2.1. Виходячи з розміру геному
(Близько 3 000 000 000 п.о.), та середнього розміру одного гена
близько 10 - 30 тис.п.о. (Gilbert, 1992), загальне число генів
повинно бути близько 100 000. При цьому, як уже зазначалося,
розподіл генів на хромосомах вкрай нерівномірно. Уста-
новлено, що більше 90% генів знаходиться в Гімза-негативний
них районах метафазних хромосом, в так званих R-бендах
(Antequera, Bird, 1993). Проведені нещодавно прямі дослід-
вання методом секвенування показують, що в R-бендах їх
число досягає 43-50 на один бенд, а в Гімза-позитивних
районах хромосом (G бендах), - лише 1-2 на 75-80 кілобаз,
тобто всього в геномі можна очікувати близько 70 000 генів.
Оцінка числа генів за часткою транскрипційного частини геному
(Всього 12%) дає зовсім маленьку величину - 20 000 генів
(Wagner et al., 1993). Методом дослідження кінетики реассо-
ціація РНК в культурі клітин число генів оцінюється між
20 - 40 000 (Lewin, 1990). У той же час в клітинах мозку
число різних мРНК за деякими даними досягає 97 000
(Wagner et al., 1993). Найбільш точні підрахунки числа генів
людини проведені останнім часом і засновані на оцінці
числа CpG острівців (табл.2.1). Відомо, що в промоторної
області всіх генів "домашнього господарства" і приблизно у 40%
генів термінальної диференціювання, що забезпечують спеціалі-
зірованние функції диференційованих клітин, перебувають про-
ласті коротких дінуклеотідних CpG повторів. Розроблено мо-
лекулярние методи точної реєстрації цих ділянок, які
показали, що їх число в геномі близько 45 000, звідси число
структурних генів оцінюється в 67-70 000 (Antequera, Bird,
1993). Практично таке ж число генів (64 000) визначено
недавно методом обліку маркерних експресують послідовно-
ності (exdivssed sequence tags) (Fields et al., 1994).
Таким чином, підсумовуючи вищевикладене, можна зробити висновок,
що в геномі людини міститься, в середньому, близько 70-80 000
окремих транскрипційного ДНК послідовностей, тобто
генів.
Транскрипція гена починається з 5 'кінця першого екзона,
де розташований сайт ініціації транскрипції. Певною
гомології між стартовими сайтами різних генів не спо-
ється, але частіше за все вони починаються з нуклеотиду А, оточений-
ного піримідинових основ. На кордонах між екзонами
і интронами є консервативні канонічні послідовно-
ності, які відіграють істотну роль у забезпеченні точності
вирізання інтронів під час сплайсингу РНК. Всі інтрони
послідовності починаються з дінуклеотід GT і закінчуючи-
ються динуклеотид AG, званими, відповідно, донорно-
ми і акцепторними сайтами сплайсингу. На 3-кінці багатьох
структурних генів ідентифікована полі (А)-сигнальна після-
довність (AATAAA), що бере участь у процесі модифікації
первинного РНК транскрипту і відповідальна за альтернативний
сплайсинг мРНК, що забезпечує синтез різних зрілих мРНК з
одного і того ж первинного РНК транскрипту.
Транскрипція генів здійснюється за допомогою ферменту
РНК-полімерази. Близько 50-70% клітинного синтезу РНК забезпе-
чивается РНК-полімеразою I, локалізованої в ядерцях і від-
дальну за синтез генів рибосомальної РНК. РНК-полімеру-
за II забезпечує транскрипцію генів, що кодують власне
структурні білки. Цей фермент локалізований в ядрі (але не в
ядерцях). На його частку припадає 20 - 40% синтезу РНК.
РНК-полімераза III контролює синтез ядерних і транспорт-
них РНК (Льюин, 1987). На 1-му етапі РНК-полімераза пов'язуючи-
ється з двухнитевой ділянкою ДНК і, розплітаючи його, робить
доступним спаровування смислової нитки ДНК з рибонуклеотидов
(Мал. 2.2). Після того, як перший нуклеотид РНК інкорпорує-
ється в сайт ініціації транскрипції, полімераза починає
просуватися по нитки ДНК в напрямку 5'-3 ', розплітаючи
подвійні нитки ДНК поперед себе і заплітаючи їх позаду. Цей
процес продовжується до досягнення терминирующего сигналу,
представляє собою один чи кілька терминируются кодо-
нов. Потім молекули РНК і ферменту вивільняються і подвійна
спіраль (дуплекс) ДНК повністю відновлюється.
Для правильного початку синтезу РНК необхідне точне
взаємодія РНК-полімерази з молекулою ДНК. Цей процес
контролюється промотором - спеціальної регуляторної після-
довність ДНК розмірами близько 75 п.о., локалізованої,
як правило, в 5'-фланкирующей області гена. Іноді під
контролем одного промотора зчитується кілька генів c про-
яними єдиного первинного РНК-транскрипту. Промоторні
області різних генів досить різноманітні за своїм нук-
леотідному складу. Проте, майже для всіх промоторів харак-
Терно наявність консервативної послідовності з 7 основа-
ний на відстані 19-27 нуклеотидів ліворуч від сайту ініціації
транскрипції. Це, так званий, TATA-бокс (блок Хог-
Несс), що забезпечує коректне розташування РНК полімеру-
зи по відношенню до стартового сайту. На відстані 70 - 80
п.о. у напрямі 5-кінця від початку транскрипції часто
розташована інша консервативна послідовність з 9
п.о. - CAAT-бокс, контролюючий початкове зв'язування
РНК-полімерази. Мутації в TATA-чи в CAAT-боксах можуть су-
нням впливати на швидкість синтезу РНК. У 5'-фланкирующей
області гена на відстані до тисячі пар підстав від початку
його кодує частини розташовуються інші регуляторні
послідовності, так звані інхансери (підсилювачі),
здатні різко збільшувати продукцію гена за рахунок збільшен-
ня швидкості транскрипції. Ці контролюючі елементи можуть
працювати незалежно від їх орієнтації по відношенню до сайту
ініціації. Для деяких генів знайдені ділянки ДНК, пригнічуючи-
ющие транскрипцію, а також так звані атенюатори (осла-
зультатами) - послідовності, що лежать між сайтом ініціації
транскрипції і власне геном. Вони можуть блокувати прод-
ДОРОЗІ РНК-полімерази. Завдяки такому складному механізму
контролю, досягається дуже тонка і ефективна регуляція
експресії генів практично на всіх етапах транскрипції,
трансляції і освіти функціонально зрілого білка. Ці
механізми більш детально розглянуті в інших розділах.
Розділ 2.5 Мінливість геному, поліморфні сайти рест-
рікціі, ПДРФ-аналіз.
Кодуючі і регуляторні області структурних генів на-
амо консервативні в процесі еволюції, так як мутації в
них піддані тиску жорсткого природного відбору.
Дійсно, невеликі зміни в цих послідовник-
ності, навіть заміна однієї підстави, делеція або інсерцій
декількох нуклеотидів, можуть призвести до припинення синтезу
білка або до втрати його функції, що, як правило, драматичні
ного чином позначається на життєздатності особин, несу-
щих подібні мутації. Однак, близько 90% геному людини
складається з некодуючих послідовностей, подібних Сателіт-
тних ДНК, помірним повторам, інтрони і спейсерним проме-
моторошна між генами. Ці ділянки значно більш мінливі
і містять безліч, так званих нейтральних мутацій або
поліморфізмів, що не мають фенотипического вираження і не
надають помітного впливу на життєздатність чи репро-
дуктивних властивості особин і, таким чином, не підданих
прямого тиску природного відбору. Поліморфні локуси
є зручними генетичними маркерами. На основі аналізу
родоводів можна прослідкувати їх спадкування у ряду покоління-
ний, проаналізувати зчеплення один з одним, з відомими
генами і з анонімними послідовностями ДНК, тобто
використовувати в якості звичайних Менделя ознак у
класичному генетичному аналізі. Інформативність поліморфи-
них локусів визначається рівнем їх генетичної мінливості-
вості в різних популяціях.
Експериментально легко виявляються два варіанти геномно-
го поліморфізму. Кількісні зміни в області локалізують-
ції міні-і мікро послідовностей ДНК і ка-
зняні заміни окремих нуклеотидів, що призводять до появ-
ленію поліморфних сайтів рестрикції. У першому випадку зрад-
тична за кількістю повторених "корови" одиниць створює серію
алелів, характер і частота яких є унікальними для кожного
вариабильность локусу. Поліморфізм в сайтах рестрикції пов'язаний
з присутністю точкових нейтральних мутацій, локалізованість,
як правило, в унікальних послідовностях некодуючих
ділянок ДНК. Подібні мутації в силу вирожденність генети-
тичного коду (см.главу 1) можуть виникати і в кодують
послідовностях генів. Спонтанні мутації, що виникають у
сайтах впізнавання для певних рестриктаз, роблять їх ре-
зістентнимі до дії цих ферментів. Аналогічним чином,
при таких замінах можуть створюватися нові сайти рестрикції.
Показано, що поліморфні локуси зустрічаються у всіх хро-
мосом з частотою приблизно один поліморфний сайт на
300-500 п.н. Цей тип мінливості ДНК було виявлено і викорис-
поклику для молекулярної маркування специфічних ділянок ге-
нома історично раніше порівняно з вариабильность Сателіт-
тних повторами (Botstein et al., 1980).
Мутаційна мінливість в сайтах рестрикції може бути
легко виявлена по зміні довжини рестрикційних фрагмент-
тов ДНК, гибрідизуючою зі специфічними ДНК-зондами. Ана-
ліз поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів, так називаються
ваемий ПДРФ-аналіз (Restriction Fragment Length Polymorphism
-RFLP analysis), включає наступні етапи: виділення геном-
ної ДНК, її рестрикції специфічної ендонуклеаз, елекро-
форетічеського поділ утворюються фрагментів ДНК і іден-
тіфікацію фрагментів ДНК, які містять поліморфний сайт рест-
рікціі, шляхом блот-гібридизації за Саузерн (см.главу 1).
При відсутності рестрикції в поліморфноядерних сайті на електрофени-
реграммах або радіоавтографах (залежно від типу мічення
ДНК-зонда) буде виявлятися один великий фрагмент, чи від-
ний по довжині послідовності ДНК між двома
сусідніми константними сайтами рестрикції для тієї ж ендо-
нуклеази. При наявності рестрикції за поліморфними локусами на
електрофореграмме буде присутній менший за розмірами
фрагмент, що дорівнює відстані між поліморфним сайтом рест-
рікціі і одним з найближчих константних сайтів рестрикції. З
яким саме з двох фрагментів, прилеглих до поліморфної
локусу, буде відбуватися гібридизація залежить від локалізують-
ції використовуваного для аналізу ДНК-зонда. В окремому випадку
можлива гібридизація одночасно з двома сусідніми рест-
рікціоннимі фрагментами, якщо обраний ДНК-зонд комплемен-
тарен послідовності, яка містить поліморфний сайт рест-
рікці. Однак, такі зонди дуже рідко використовуються на прак-
тику, так як довжина рестрикційних фрагментів зазвичай в
десятки разів більше довжини ДНК-зондів і далеко не завжди вда-
ється виділити і проклоніровать фрагмент ДНК, що містить по-
ліморфний сайт рестрикції. Тому надалі для простоти
викладу ми будемо розглядати тільки більш загальну ситуацію
і вважати, що за відсутності рестрикції в поліморфноядерних сайті
ДНК-зонд гибрідизуючою з одним довгим фрагментом, а при на-
явності рестрикції гибрідизуючою фрагмент має меншу дли-
ну. Таким чином, при аналізі ДНК особин, в обох хромосом-
мах яких присутня сайт рестрикції в поліморфної про-
ласті, на електрофореграмме буде виявлений тільки один бенд в
нижній області гелю, що відповідає більш коротким фраг-
менту ДНК. У особин, гомозиготних по мутації, що змінює по-
ліморфний сайт рестрикції, буде спостерігатися один бенд в
верхньої частини гелю, відповідний фрагменту більшої довжини,
тоді як у гетерозигот проявляться обидва ці бенду (Мал. 2.3а).
ПДРФ-аналіз може бути значно спрощений в тому випадку,
якщо можлива специфічна ампліфікація ділянки ДНК, що містить
жащего поліморфний сайт рестрикції. Тестування стану
цього локусу можливо шляхом проведення ПЛР і рестрикції амп-
ліфікованих фрагмента. При відсутності сайту впізнавання в
досліджуваної області ДНК розміри ампліфікованої фрагмента
не зміняться після його обробки відповідної ендонуклеа-
зою, тоді як при повній відповідності поліморфної області
сайту рестрикції утворюються два фрагменти меншої довжини
(Ріс.2.3б). У гетерозигот будуть присутні 3 фрагмента,
один з яких по довжині буде відповідати розміру амп-
ліфіката до рестрикції, плюс 2 маленьких фрагмента з тією ж
сумарною довжиною. Таким чином, як і у випадку викорис-
ня для аналізу блот гібридизації за Саузерн, трьом можли-
вим варіантів генотипу будуть відповідати три різні
варіанту Електрофореграма.
Необхідно підкреслити, що первинна ідентифікація по-
ліморфних сайтів рестрикції, зчеплених з певними ге-
нами, можлива тільки при наявності відповідних ДНК-зон-
дов. Подальша тактика полягає в пошуку рестрикційної
нуклеази, що виявляє поліморфізм. З цією метою використовують
широкий набір ендонуклеаз для рестрикції геномної ДНК, виокрем-
ленній з групи неспоріднених індивідуумів, що представляють
собою репрезентативну вибірку популяції. Потім проводять
ПДРФ-аналіз окремо для кожної з рестриктаз з набором име-
ющіхся ДНК-зондів. Після виявлення поліморфізму в одній з
популяцій аналогічні дослідження проводять в інших популя-
ціях.
Слід враховувати, що поліморфні сайти рестрикції
завжди являють собою двухаллельную систему, тому да-
ж при найвищій вариабильность такого сайту, число ге-
терозіготних за даним локусом особин у популяції не буде
перевищувати 50% Тим часом, тільки за наявності поліморфного
сайта у гетерозиготному стані можна відрізнити мутантний
аллель від нормального, тобто здійснити його молекулярну
маркування. Отже, інформаційна ємність такого по-
ліморфізма відносно невелика (див. Глави Y і VII).
Розділ 2.6 вариабильность мікро-і мінісателітних ДНК.
Гіперваріабільние сателітні повтори є набагато
більше інформтівнимі маркерами в порівнянні з поліморфними
сайтами рестрикції, тому що являють собою мультіаллель-
Сенсорні системи з рівнем гетерозиготності, що досягає 70 -
90%. Крім того, виявилося, що кількість високоізменчівих
мікроі мінісателітних послідовностей в геномі челове-
ка, мабуть, перевищує кілька десятків тисяч, вони
досить щільно і рівномірно розташовані в кожній з хро-
мосом. Так більше 90% з 5000 ідентифікованих (CA)-повто-
рів є поліморфними, причому в більшості з них уро-
вень гетерозиготності значно перевищує 50% (Weissenbach
et al, 1992). Серед гіперваріабільних міні-сателітних
послідовностей розрізняють варіюють за кількістю тандемні
повтори - VNTR, три-, тетра-і пентануклеотідние повтори, а
також деякі інші класи повторів. Загальна кількість високо-
поліморфних мінісателітних послідовностей в геномі
перевищує 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,
1994). VNTR (variable number tandem repeats - варіюють по
числу тандемні повтори)-характеризуються наявністю 10 - 15 -
ти нуклеотидних "корови" послідовностей, схожих з
контролюючими елементами рекомбінації E.coli (Jeffreys et
al., 1985). За допомогою ДНК-зондів, сконструйованих на осно-
ве тандемної повторюваних "корови" послідовностей,
можна аналізувати індивідуальну мінливість в одиничних
або множинних високополіморфних локусах, несучих одно-
тіпную корову послідовність. Прикладом може служити
VNTR, виявлена в інтроні міоглобінового гена, що включає
чотири тандемних повтору з 33 п.о., фланкованому прямими
повторами з 9 п.о. Отримані з цього району ДНК-зонди з
успіхом використовуються для ідентифікації особистості методом
ДНК-Фінгерпринт, тому що ймовірність збігу алелів у
двох неспоріднених індивідуумів по всіх гіперваріабільним
локусами, гібрідізующіхіся з цим ДНК-зондом, значно
менше 10! -7 (Jeffreys et al., 1991). Високополіморфние VNTR
знайдені також в гені інсуліну, в області глобинового псевдо-
гена і в Х-хромосомі, що містить послідовності, Гомоле-
гічне ДНК вірусу гепатиту В (Nakamura et al., 1985). У
Останнім часом численні VNTR-послідовності про-
дуть виявлені в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien, 1992).
Пошук нових гіперваріабільних локусів заснований на систе-
зації скринінгу клонованих послідовностей ДНК з по-
міццю штучно синтезованих "корови" зондів. Особ-
але зручні для такого скринінгу геномні бібліотеки,
сконструйовані на основі попередньо фракціонованих
за величиною Mbo1 або Sau3A1 фрагментів ДНК, так як великі
фрагменти збагачені довгими і більше вариабильность мінісате-
тних послідовностями (Armour, et al., 1990). Хороші
результати були отримані також при скрінірованія космідних
бібліотек за допомогою G-багатих синтетичних ДНК-зондів і
використання хемолюмінесцентного методу в поєднанні з ПЛР
(Decorte, Cassiman, 1990). У деяких випадках з цією метою
застосовують також послідовності ДНК, виділені з фага
М13, що має в своєму складі подібні структури (Armour
etal., 1990).
Одним з варіантів мінісателітних послідовностей
є тримерной і тетрамерние короткі тандемні повтори
-STR (short tandem repeats), які стабільно успадковуються і
також володіють високим рівнем поліморфізму за кількістю корови
одиниць (Edwards et al., 1991). У X хромосомі такі повтори
виявлені через кожні 300 - 500 кб, тоді як в інших
частинах геному вони зустрічаються на відстані 10 кб один від
одного. За деякими оцінками їх частота може досягати 1 / 20
кб (Charlesworth et al., 1994). Можливо, справжнє число три-
і тетрамерних повторів в геномі людини ще більше, так як
вони виявлені в багатьох генах. Подібно до інших повторам STR
зазвичай зустрічаються в некодуючих частинах генів. Останнім
час, проте, виявлена група структурних генів, які несуть
тримерной повтори у регуляторних і навіть у трансльованих
частинах генів. Зміни числа цих внутрігенних повторів у
бік їх збільшення може призводити до порушення функції
цих генів аж до повного блоку експресії і бути при-
ної ряду важких спадкових захворювань - хвороби
експансії (см.главу X). В якості зондів для виявлення ко-
ротких тандемних повторів використовують синтетичні олігонук-
леотіди, побудовані з простих повторів трьох або чотирьох
нуклеотидів.
Останнім часом для виявлення різних класів
мікросателітних послідовностей та STR-повторів застосовують
ють ефективні методи, засновані на використанні ПЛР
(Edwards et al., 1991). Для цих локусів характерна велика
число алелей, які розрізняються за кількістю корови одиниць.
Продукти ампліфікації цих сайтів можуть відрізнятися один від
друга числом ді-три-чи тетрануклеотидна повторів. Для
зручності ідентифікації різних алелів полімеразну ланцюгову
реакцію проводять у присутності мічених нуклеотидів, а для
електрофоретичного розділення продуктів ампліфікації
використовують спеціальні секвеніруют гелі. Багато STR-локуси
настільки поліморфні, що знайшли застосування в судовій міді-
ціне для ідентифікації особи. Для підвищення достовірності
результатів з цією метою використовують мультиплексні варіанти
ПЛР, що дозволяють встановлювати генотип індивідуума одночасним-
сно з кількох STR-сайтів (Weber, May, 1994; Асєєв та
ін, 1995). Можливість точного генотипування особистості з
використанням полімеразної ланцюгової реакції, тобто на міні-
мальном кількості ДНК, є важливим методичним переваж-
ществом STR перед раніше розглянутими VNTR, для аналізу до-
торих частіше використовують блот-гібридизацію по Саузерн.
Висока частота коротких тандемних повторів, уні-
ність комбінацій числа тетра-, три-і димерів в різних сай-
тах в поєднанні з їх великою вариабильность та порівняльної
легкістю ідентифікації алелів дозволяє широко вико-
ти ці повтори для генетичного і фізичного картірова-
ня в якості найбільш зручних індексних маркерів геномних
ДНК-послідовностей (см.главу III). Такі маркерні сай-
ти отримали назву STS (sequence tagged sites). У настою-
ний час в геномі людини вже ідентифіковано близько 10
000 STS, переважна більшість яких є
тандемні повтори 2 - 4 нуклеотидів. Завдяки вираженій
індивідуальної специфічності і досить стабільному менде-
Левського типом успадкування STS-сайти знайшли широке застосування-
ня і в молекулярній діагностиці генних хвороб, перш
все в якості молекулярних маркерів для ідентифікації му-
тантних хромосом в родинах високого ризику (див. Главу VII).
Наявність великої кількості гіперваріабільних мікро-і мінісател-
тних послідовностей ДНК є характерною особ-
ністю геному людини. Аналогічні послідовності, про-
нням виявлених в геномі приматів, значно більш однорідні,
що доводить можливість істотного збільшення Варіано-
стабільності цих ділянок ДНК за порівняно короткий Евола-
ційний період (Юров, 1988; Gray et al., 1991).
Відомості про мутабільності високополіморфних послідовно-
ності в геномі людини дуже суперечливі. Показано,
проте, що в найбільш вариабильность мінісателітних локусах
частота мутацій може досягати 5% на гамету (Jeffreys et
al., 1988). Передбачається, що однією з головних функцій ги-
перваріабільних мікро-і мінісателітних послідовностей
ДНК може бути контроль гомологічною рекомбінації в мейозі.
На культурах клітин показано стимулюючий вплив Мініс-
теллітних послідовностей ДНК на гомологичную рекомбіна-
цію. Так, інсерцій синтезованою послідовності,
складеної на основі гіперваріабільних минисателлитах в
геномної ДНК призводить до більш, ніж 10-кратному збільшенню
числа реципрокних обмінів, причому ступінь цього впливу про-
ратно пропорційна відстані між STR і сайтом рекомбі-
нації (Wahls et al., 1990). Разом з тим, багато авторів про-
звертати увагу на досить високу стабільність Мініс-
теллітних алелів, що дозволяє їх широко використовувати як
для генетичного маркування, так і для популяційних
досліджень та ідентифікації особистості методом ДНК-фінгерп-
Рінта (Decorte, Cassiman 1993; Edwards et al., 1991; Іва-
нов, 1989).
Для багатьох мутацій, локалізованих в некодуючих
частинах геному, характерні високі рівні популяційного по-
ліморфізма. Необхідно, проте, підкреслити, що ця зрад-
тична не зачіпає загальної структури геному, визначальною
відмінності між видами. Більш того, сопосталеніе первинних
нуклеотидних послідовностей порівняно протяжних
секвенувати ділянок ДНК (області Т-рецепторних генів
довжиною близько 100 кб) виявило збереження високого ступеня
гомології не тільки в кодують, але і, що особливо здивуй-
тельно, в некодуючих частинах цих послідовностей. Якщо
врахувати, що еволюційно чоловік і миша розділені майже 80
мільйонами років еволюції, ці дані розглядаються як сві-
детельствует функціональної значимості некодуючих частин
цих генів Мабуть, далеко не всякі мутації в некодуючих-
чих районах ДНК є нейтральними і в певних слу-
чаях вони можуть негативно впливати на життєздатність. До
жаль, в даний час нічого або майже нічого неиз-
Вестн про функції некодуючих ДНК-послідовностей.
Висловлювалося навіть припущення, що їх єдиною функ-
єю є реплікація. Звідси виникло уявлення про
"Егоїстичної" або "паразитичної" ДНК. Звичайно, повністю
виключити наявність подібних паразитичних послідовник-
ностей ДНК в будь-якому геномі не можна. Тим не менш, представля-
ється малоймовірним, що значна частина генома людини,
також як і інших видів, відноситься до егоїстичної ДНК.
Мабуть, наші знання про роль некодирующей або, як ще
кажуть, "надлишкової" ДНК все ще явно недостатні. Ста-
вважають нестабільність структурної організації генома в межах виду
свідчить скоріше про важливу еволюційної ролі некодуючих-
щих ДНК-послідовностей і про їх участь у процесах он-
патогенезу. Можна припускати, що відповідь на це інтригуюче
питання в якійсь мірі буде отриманий при розшифровці і порів-
нении повної первинної нуклеотидної послідовності гено-
мов у тварин різних видів і, перш за все, у людини і
миші, де прогрес у секвенування генома ДНК особливо
значний (см.главу III). Доречно зауважити, що проведений
недавно комп'ютерний аналіз генома людини дозволяє перед-
вважати наявність в його некодирующей частини особливого, поки ще
незрозумілого генетичного коду, зміст і значення якого
залишаються загадковими (?).
Розділ 2.7 Мобільність геному, облігатні і факульта-
тивні елементи геному.
До цих пір ми розглядали основні структурні еле-
менти геному людини, положення яких відповідно до
уявленнями класичної генетики досить постійно.
Починаючи з 50-х років стали накопичуватися дані про істота-
вання великого числа мобільних генетичних елементів,
присутність яких у геномі не є обов'язковим, а їх
топографія і кількість може варіювати в різних кліть-
ках, тканинах і у різних індивідуумів (McClintock, 1984; Berg,
Howe, 1989). У прокаріотів такі елементи отримали назву
транспозонов. Їх структура і функції досить добре вивчений
печені. Відмінною особливістю мобільних елементів є-
ється здатність існувати як в інтегрованому з хро-
мосом вигляді, так і у вигляді окремих макромолекул - ЕПІС,
плазмід, вірусних частинок. Майже 50 різних сімейств мо-
більних елементів описано у дрозофіли. Разом ці пос-
сті складають близько 12% гаплоїдного набору
(Golubovsky, 1995). У геномі ссавців міститься до 50
000 диспергованих копій ретропозонів LINE розміром близько
6500 пар основанійю. Сімейство Alu-повторів, що містить від
300 до 500 тисяч копій, також належить до мобільних
елементів геному (Сharlesworth et al., 1994). Явище лізоге-
панії, тобто присутність вірусних послідовностей в
складі ДНК людини та наявність фрагментів генів людини в
вірусних геномах, служить одним із прикладів мобільності ДНК і
можливості "горизонтальної" передачі спадково закріплення
лених ознак між видами. Мобільні ДНК, як правило,
відносяться до факультативним елементам. Як вже зазначалося, не
існує чітких меж між облігатними і факультативними
елементами геному, так як може бути взаємний перехід від од-
ного стану до іншого. Структурні локуси або сегменти
хромосом можуть трансформуватися в факультативні елементи
за рахунок ампліфікації, інтеграції в мобільні елементи або
шляхом утворення цитоплазматичних ретротранскріптов. Про-
ратний перехід від факультативних елементів до облігатним здійсню-
ється за допомогою інсерцій, транспозон-індукованих
перебудов і зворотної транскрипції.
Факультативні елементи існують в геномі як популя-
ції інформативних макромолекул. Зміни, що виникають у них
під впливом зовнішніх чинників, носять зовсім інший ха-
рактер порівняно з класичними мутаціями в структурних
локусах. Для опису змін у факультативних елементах
запропонований термін "варіації" (Голубовський, 1985). Цей тер-
хв вперше використаний Жакобом і Воллманом для опису по-
ведення ЕПІС (Jacob, Wollman, 1961). Варіації можуть приво-
дить до змін на генотипической рівні, тобто до мута-
ціям, внаслідок простого переміщення факультативних елементів-
тов чи зсуву в співвідношенні між факультативними і обли-
Гатному елементами. У цих випадках мутації зустрічаються од-
новременно у багатьох індивідуумів. Подібні зміни упо-
дочени, можуть відбуватися відразу в багатьох локусах і відріз-
ються високою сайт-специфічністю. Локалізація структурних
перебудов, які виникають в результаті варіацій, зумовлений-
на початковій топографією факультативних елементів на
хромосомах. І нарешті, самі варіації можуть бути індуковані
звичайними "не-мутагенними" факторами, такими як температура
або міжлінійні кроси (Golubovsky, 1995). Факультативні
елементи можуть розглядатися як оперативна пам'ять гено-
ма, тому що в багатьох випадках спонтанне виникнення мута-
ції в облігатних елементах опосередковано їх активацією. Вва-
шається, зокрема, що но інсерційні мутагенез є
причиною спонтанного виникнення 70% видимих мутацій в
природних популяціях дрозофіли. Однак, у людини поки за-
зареєстовані лише поодинокі випадки виникнення мутацій
внаслідок переміщення мобільних елементів геному (Vidaud et
al., 1993).
Розділ 2.8 ізохорами, метилювання, гіперчутливість
сайти.
Перераховані вище компоненти генома не випадковим обра-
зом пов'язані з послідовностями нуклеотидів. І в цьому
сенсі можна говорити про існування в геномі людини
структур більш високого ієрархічного порядку. Прикладом
служать ізохорами - довгі, у середньому, понад 300 кб сегменти
ДНК, гомогенні по композиції підстав або за GC-рівням.
62% геному складається з GC-бідних ізохорами і в них локалізовано
близько 34% генів, 31% геному представлений GC-багатими ізохорами-
ми, що містять 38% генів, і в 3% ізохорами, збагачених
GC-послідовностями (так званих H3 ізохорами), знахо-
диться 28% генів (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,
1993). Таким чином, існують відносно невеликі
ділянки ДНК, в яких щільність генів в 10 -20 разів вище,
ніж в інших послідовностях.
Іншою загальною рисою геному людини є те, що in
vivo значна частка цитозинових залишків у молекулі ДНК
метиловано, тобто перебуває у формі 5-метілдезоксіціті-
дина. Експериментальне вивчення характеру метилування
грунтується на зіставленні рестрикційних фрагметов, утворю-
щихся після обробки ДНК ендонуклеаза, для яких сайти
впізнавання однакові і містять у своєму складі цитозин, але
діють ці ферменти по-різному, в залежності від того,
знаходиться це підстави в етиловому стані або
немає. Зокрема, рестріктази - Msp1 і Hpa11, дізнаються після-
довність CCGG, але на відміну від Msp1, Hpa11 не розщеплюючи-
ет ДНК в тих сайтах, де внутрішній CpG дінуклеотід мітили-
ваний. Деякі сегменти геному, особливо це стосується
повторюваним послідовностей, повністю метиловані в
місцях 5'-CCGG-3 'і частково метиловані в 5'-GCGC-3' -
сайтах рестрикції для Hha1. В інших сегментах спостерігається
характерний малюнок часткового метилювання в 5'-CCGG-3 '
послідовностях (Behn-Krappa et al., 1991). Різні
індивідууми, незалежно від їх етнічного походження,
практично не розрізняються за характером метилювання ДНК в
одних і тих же типах тканин, тоді як в процесі онтогенія-
тичної диференціювання відбуваються значні зміни
малюнків метилювання. У перещеплюваних культурах клітин опу-
холевой походження число метильованих сайтів різко
зменшено.
Висловлено припущення про наявність прямого зв'язку між
метилюванням ДНК і станом генетичної активності в
клітинах. Існує клас білків, які специфічним про-
разом зв'язуються з метилованими ділянками ДНК, роблячи їх
недоступними для дії низки ферментів, у тому числі, віз-
можна, і для полімераз. Отримано багато прямих експеримен-
тальних доказів ролі метилювання ДНК в інактивації
еукаріотичних промоторів, а, значить, і в регуляції актив-
ності генів. Навпаки, гіпометілірованіе промоторної області
генів, особливо CpG острівців, як правило, свідчить, що
чить про функціональної активності генів. Показано, що
незвичайні структури в молекулі ДНК, також як екзогенна
ДНК, інкорпорована в процесі генетичної трансформа-
ції, нерідко піддаються метилюванні. Відомо, що мети-
лювання грає важливу роль в інактивації X хромосоми у са-
мок, у регуляції експресії генів в процесі розвитку, а
також безпосередньо залучено до феномен хромосомного (ге-
автономних) імпринтингу, пов'язаного з відмінностями пенетрантності
деяких алелів в залежності від їх походження, тобто
проходження через материнський чи батьківський гаметогенез (Ба-
нів, 1991).
У GC-багатих ізохорами локалізовано велика кількість
CpG острівців - послідовностей від 500 до 2000 п.о., ха-
рактеризуються дуже високим вмістом гуаніну і цитозину
(G + C> 60%), представлених у вигляді кластерів Неметиловані-
них CpG дуплетів і, так званих, G / C боксів - локусів,
родинних сайту впізнавання для одного з транскрипційних
факторів Sp1 - (G) 4C (G) 4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;
Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова містять багато сайтів
впізнавання для чутливої до метилюванні ендонуклеази
HpaII, а також сайти для редкощепящіх рестриктаз, котрі дізнаються
Неметиловані CpG дуплети. Зокрема, більше 80%
Nor1-сайтів пов'язано з CpG-багатими острівцями. Як правило,
CpG острівці локалізовані в 5'-фланкують послідовник-
ності, 5'-зкзонах і 5-інтрони всіх вивчених хаузкі-
пінг-генів і 40% тканиноспецифічною генів. CpG острівці яв-
ляють характерною особливістю транскрипційного ділянок
геному. Їх ідентифікація в клонованих послідовностях
геномних бібліотек істотно полегшує пошук конкретних
структурних генів (див.розділ 2.4). Найбільша щільність CpG
острівців спостерігається в теломерна ділянках хромосом 1, 9,
15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis, 1994). Точні молекуляр-
тивні методи реєстрації СрG острівців показали, що їх число
в геномі людини наближається до 45000 (
Antequera, Bird, 1993).
Можна також відзначити існування в геномі людини
сайтів, гіперчутливість до діючої ДНК-ази 1 і структур-
але відрізняються від основної маси хроматину. Присутність та-
ких сайтів показано для багатьох генів ссавців і, по-ви-
дімому, це необхідна, але не достатня умова їх
експресії. Локалізація гіперчутливою сайтів може ме-
няться в процесі розвитку і під дією гормонів. У недо-
торих випадках ці ділянки маркують положення транскрипційно-
них регуляторних елементів геному, що діють як в поклади-
вальному, так і в негативному напрямках. В інших випад-
ях це області функціонально активних генів, що знаходяться в
деспіралізованном стані і мають однониткову структуру.
Саме такі однониткових ділянки ДНК особливо виска чутливих-
тельно до ДНК-азе 1. На цьому їх властивості заснований метод
нік-трансляції in situ, що дозволяє безпосередньо на хро-
мосомних препаратах візуалізувати функціонально активні
райони хромосом. З цією метою хромосомні препарати обро-
робляють ДНК-Азою 1, після чого безпосередньо на них з по-
міццю ДНК-полімерази проводять синтез ДНК в присутності мечі-
них нуклеотидів. При цьому мітка включається переважно
тільки в ті ділянки хромосом, де знаходяться функціонально ак-
тивні гени (Verma, Babu, 1989).
РОЗДІЛ II.
ГЕНОМ ЛЮДИНИ, СТРУКТУРА ГЕНІВ.
Розділ 2.1. Визначення геному і його основних елементів-
тов.
Термін геном використовується для позначення повної гені-
тичної системи клітини, що визначає характер онтогенеті-
тичного розвитку організму і спадкову передачу в ряду
поколінь всіх його структурних та функціональних ознак.
Поняття генома може бути застосоване до таксономічної груп-
пе, увазі, окремої особини, клітці, мікроорганізму чи ви-
Русу. Так, можна говорити про структуру геному еукаріот і про-
в потомстві можуть з'явитися нові комбінації батьківських
алелів. Імовірність кросинговеру між двома генами за-
висить від відстані між ними. Чим ближче гени розташовані
один до одного, тобто чим більше вони зчеплені, тим ця ве-
роятность менше.
Оцінку зчеплення між генами проводять на підставі
статистичного аналізу сегрегації ознак в сім'ях з
розгалуженими родоводами. Частіше за все при цьому використовують
метод максимальної правдоподібності (Kao, 1983), тобто
підраховують десятковий логарифм шансів - lod (log of the
odds), де шанси (odds) виражаються як відношення імовірність
ності спостерігається родоводу за умови, що два гени
зчеплені (0 <Q <0.5), до тієї ж ймовірності при відсутності
зчеплення (Q = 0.5). Якщо значення lod> +3, гени локалізованих
ником в одній хромосомі, причому максимально правдоподібна
оцінка відповідає максимальному значенню lod. При значен-
пах lod <-2 гени не зчеплені, тобто локалізовані в раз-
них хромосомах або на різних кінцях однієї хромосоми. Ста-
статистично обробку родоводів зазвичай проводять за допомогою
комп'ютерних програм, найбільш відомі з яких прог-
Рамі LIPED, CRIMAP і LINKAGE (Ott, 1985; Ott, 1991;
Terwilliger, Ott, 1994). На генетичних картах зчеплення
відстань між генами визначається в сантіморганах (СМ).
1 см відповідає 1% рекомбінації. Загальна довжина геному че-
ловека в цих одиницях складає близько 3300 см. Зіставлення
ляя цю величину з розміром гаплоїдного набору молекул ДНК,
можна зробити висновок, що 1 см приблизно еквівалентний 1
мільйону пар нуклеотидів. Такі розрахунки, проте, вельми
приблизні, тому що частоти рекомбінації, а значить і
реальна довжина одного см, можуть сильно варіювати в раз-
особистих частинах геному. Існують, так звані, гарячі
точки рекомбінації, також як і райони геному, де рекомбі-
нація пригнічена (Центромерна і теломерні ділянки хро-
мосом, блоки конститутивного гетерохроматину та ін.) З-
Вестн також, що частота рекомбінації у чоловіків менша, ніж
у жінок, так що загальна довжина чоловічого генома, виміряна в
одиницях рекомбінації, становить лише 3000 см. Таким обра-
зом, генетична відстань може дати лише дуже оріен-
тіровочную інформацію про фізичному (реальному) відстані,
виражається в парах нуклеотидів.
Розділ 3.2 Соматична гібридизація, цитогенетичний
аналіз, картування анонімних послідовно-
ності ДНК.
До початку 70-их років побудова генетичних карт че-
ловека просувалося дуже повільними темпами. Невеликий раз-
заходів сімей, тривалий період одного покоління, обмежене
число інформативних родоводів і відсутність методів ефек-
тивного цитогенетичного аналізу всіх пар хромосом складною
ло цілеспрямоване картування генів людини. Достатній-
але сказати, що 1-й ген людини - ген кольоровий сліпоти був
картірован на Х-хромосомі в 1911р., а 1-й аутосомний ген-
тільки в 1968р. До 1973р. на хромосомах людини було карти-
ровано всього 64 гена, а до 1994 на генетичних картах чоло-
століття було локалізовано вже понад 60 000 маркерних ДНК
послідовностей, у тому числі близько 5 000 структурних
генів - Рис.3.3. Настільки стрімкий прогрес у картірова-
нии генів людини пов'язаний з появою нових технологій у
цитогенетики, в клітинних культурах і особливо в молекуляр-
ної генетики.
Техніка соматичної гібридизації, тобто можливість
експериментального конструювання здатних до розмноження
міжвидових клітинних гібридів, стала одним з найбільш
потужних інструментів для знаходження зв'язків між групами
зчеплення і цитогенетичних ідентифікованими хромосомами і
навіть їх окремими сегментами. Гібридні клони отримують пу-
тим штучного злиття культивованих соматичних клітин-
струм різних видів, зокрема, клітин людини і різних
гризунів - китайського хом'ячка, миші, щура (Шия, 1985).
Культивування таких соматичних гібридів, як виявилося,
супроводжується втратою хромосом людини. Так були отримані
панелі гібридних клітинних клонів, що містять лише одну
або кілька хромосом людини і повний набір хромосом
іншого виду. Виявлення людських білків, специфі-
чних мРНК або послідовностей ДНК в таких клонах поз-
воляет однозначно визначити хромосомну приналежність
відповідних генів. Таким способом вдалося локалізувати
більше 250 аутосомним генів людини (Kao, 1983).
Подальший прогрес у сфері генетичного картірова-
ня значною мірою асоціюється з діяльністю
багатьох науково-дослідних центрів і лабораторій з
створення банків клітинних культур, що представляють найбільш
цікаві і обширні родоводи. Так, у Центрі по Вивченню
Поліморфізму Людини (CEPH) (Париж, Франція) була створена
унікальна колекція перещеплюваних клітинних культур від усіх
членів сімей, багатоступінчасті родоводи яких насчіти-
ють багато десятків і навіть сотні індивідуумів (CEPH-сім'ї)
(Todd, 1992; Weissenbach et al, 1992). Перещеплюваних лінії кле-
струм отримували з первинних культур, трансфорірованних вірусом
Епштейн-Барра, після чого такі лімфобластозние клітини ста-
ють "безсмертними", тобто можуть необмежено довго
підтримуватися в умовах культивування. CEPH-сім'ї
представляють собою ідеальні системи для генетичного ана-
лізу спадкових ознак. У результаті дослідження
цих клітинних ліній визначено генотипи членів CEPH-сімей
одночасно по тисячах поліморфних локусів і побудовані
відповідні генетичні карти. Крім того, спільними
зусиллями багатьох лабораторій світу були створені Банки клеточ-
них Культур, в яких підтримуються колекції лімфоб-
ластозних ліній клітин, отриманих від членів найбільш інфор-
ментації сімей, в яких спостерігається сегрегація за різноманіт-
вим спадковим ознаками, в тому числі по моногенних за-
болеваниях. Матеріал цих ліній у вигляді клітинних клонів або
зразків ДНК використовується, зокрема, для аналізу зчеплення-
ня сегрегуються генів з відомими генетичними маркерами
або з знову описаними поліморфними локусами. Таким чином,
у багатьох випадках при картуванні генів людини вдається
подолати обмеження, пов'язані з недоліком великих ін-
формативне родоводів.
Нарешті, на початку 70-х років з'явилася реальна можли-
ність точної ідентифікації не тільки всіх хромосом у Каріо-
типі людини, але і їх окремих сегментів. Це пов'язано з
появою методів диференціального фарбування препаратів
метафазних хромосом, які, по суті, зробили революцію в
цитогенетики і хромосомологіі. Для отримання диференціальних-
ної забарвлення хромосомні препарати забарвлюють деякими флю-
орохромамі, або, після відповідної протеолітичної про-
ництва або нагрівання, - барвником Гімза. При цьому на хро-
мосом виявляється характерна поперечна смугастість, так
звані бенди, розташування яких специфічно для кожної
хромосоми. На метафазних хромосомах малому ступені спіралізуются-
ції ідентифікується близько 750 таких смуг, на прометафазних
хромосомах 2 500 - 3 000. Отже, величина невеликих
бендів на прометафазних хромосомах приблизно відповідає 1
см на цитогенетичних картах або 1 мільйону пар основ
на фізичних картах. Такі орієнтовні розрахунки, як
вже згадувалося, виявляються корисними при зіставленні
масштабів різних генетичних карт.
Відповідно до офіційно затвердженої номенклатурі
(ISCN, 1971) кожна хромосома людини після диференціальної
забарвлення може бути розділена на сегменти, нумерація яких
починається від Центромерна району вгору (коротке плече -
р), або вниз (довге плече - q) (Рис.3.4). Смуги в кожному
сегменті також пронумеровані в аналогічному порядку. Великі
смуги часто поділяються на кілька частин, від-
відних більш дрібним бенду, що виявляються тільки при ок-
раск малоспіралізованних прометафазних хромосом. Запис за-
дання гена на цитогенетичної карті включає номер хро-
мосом, плече, а також номер сегмента, гурту та його суб'еді-
Ниці. Наприклад, запис 7q21.1 означає, що ген локалізований
в субодиниці 1, 1-го бенду 2-го сегменту довгого плеча
хромосоми 7.
Така детальна запис особливо зручна при використанні
нии для цитогенетичного картування методу гібридизації
in situ (см.главу I), що дозволяє локалізувати ген з точ-
ністю до одного гурту та навіть його субодиниці. Основу данно-
го методу, як вже вказувалося становить гібридизація ге-
автономної ДНК цілих хромосом на різних стадіях їх спіралізаціі
з попередньо міченими специфічними ДНК-зондами.
Джерелом останніх можуть служити геномні послідовності
ності ДНК, зчеплені з картіруемим геном, або кДНК-ові
послідовності. В даний час з тканиноспецифічною
бібліотек генів виділено близько 20 000 анонімних послідовно-
ності кДНК, що представляють більше 10 000 різних генів
людини (Sikela, Auffray, 1993). Ці кДНК складають при-
мірно 10-15% всіх кодують послідовностей геному. Ме-
дом гібридизації in situ вже ідентифіковано більше 2000
генів, для багатьох з яких поки не знайдено зчеплення з по-
ліморфнимі маркерами (Poduslo et al., 1991). Такі кодую-
щие послідовності присутні на карті генів людини,
але їх поки немає на картах зчеплення.
Розділ 3.3 Генетичні індексні маркери.
Як ми вже зазначали раніше, успішна локалізація неиз-
вестной спадкової ознаки (гена) значною сте-
пені визначається присутністю на карті фланкують марці-
рів, що знаходяться на відносно невеликій відстані по обидва
сторони від гена. Як генетичних маркерів специфі-
чних ділянок хромосом можуть бути використані будь-лока-
лізованних в цих ділянках елементи геному з високим рівнем
легко ідентифікованої популяційної мінливості або полі-
морфізма. Відбір зчеплених з картіруемим ознакою генети-
чних маркерів роблять за результатами спільного аналі-
за їх сегрегації в інформативних сім'ях.
Значні успіхи в геномном картуванні були связа-
ни з використанням як генетичних маркерів широко
поширеною у багатьох популяціях мінливості з ізо-
ферментного спектру різних білків. Виявилося, що багато
ферменти у різних індивідуумів, в різних тканинах та на різних
стадіях онтогенезу можуть перебувати в різних ізоформах.
Такі варіанти одного і того ж білка зазвичай не відрізняються
по специфічної активності, але мають змінену електрофени-
ретіческую рухливість. Популяційний аналіз ізоферментів
виявив існування поліморфізму для дуже багатьох білкового син-
вих систем, контрольованих різними генами, локалізованими
в багатьох хромосомах. Таким чином, для цих хромосом були
знайдені генетичні маркери, за допомогою яких були ідентифікації
ваних відповідні групи зчеплення.
Удосконалення молекулярних методів аналізу специфі-
чних послідовностей ДНК привело до виявлення велико-
го числа високоізменчівих ділянок геному - поліморфних сай-
тов рестрикції, гіперваріабельних міні-і мікро
послідовностей (см.главу II) Ця мінливість також би-
ла використана для маркування ділянок хромосом з метою
встановлення більш точного взаєморозташування локусів. Вско-
ре після виявлення поліморфних сайтів рестрикції були
опубліковані теоретичні розрахунки, згідно з якими від 10
до 20 таких локусів, розташованих рівномірно на кожній хро-
мосом на відстані близько 20 см один від одного, досить
для визначення хромосомної належності генів, від-
них за будь-який тип спадкової мінливості
(Botstein et al, 1980). За цими оцінками близько 200 таких ін-
дексних маркерів дозволять побудувати карти зчеплення для всіх
відомих генів на підставі аналізу сегрегації відповідними
чих ознак в сім'ях з великою кількістю мутантів. Для визна-
ділення порядку розташування генів на хромосомах і оцінки
генетичних відстаней між ними досить близько 400 рав-
номерно розподілених поліморфних маркерів.
Ідентифікація в геномі людини великого числа полі-
морфних сайтів рестрикції і розробка простих методів ана-
лізу індивідуальної мінливості за цими локусами істотно
підвищили можливості локалізації невідомих ознак на
геномних картах. Вже до 1989р. були картіровани більше 2000
клонованих послідовностей ДНК, що виявляють полі-
морфізм по довжині рестрикційних фрагментів (ПДРФ) у різних
них популяціях (Kidd et al., 1989). Більше 1000 з них типи-
ровано в CEPH-колекціях родоводів. У значній мірі
це анонімні послідовності, зв'язок яких із специфікою-
тичними генами не встановлена. Їх найменування найчастіше
відповідають назві відібраного з бібліотеки генів кло-
на. Надалі була розроблена стандартна генетична
номенклатура для позначення використовуються як марке-
рів сегментів ДНК з невідомою функцією. Перша літера D,
що значить ДНК, потім номер хромосоми, далі S для уні-
них і Z для повторюваних послідовностей і в кінці но-
заходів, що ідентифікує даний зонд в певному районі ДНК.
Застосування поліморфних сайтів рестрикції в якості ге-
генетичних маркерів має два обмеження: порівняльно низ-
кая інформативність (частота гетерозигот не може перевищує
50% - див Глави II, Y) і нерівномірний розподіл
ПДРФ-сайтів по хромосомах. Цих недоліків практично ли-
шени гіперваріабельні STR-сайти (ді-, три-і тетрануклеа-
тідние повтори). Використання мікро-і мінісателітних ДНК
послідовностей в якості індексних генетичних марці-
рів відкрило нову еру в побудові карт зчеплення геному че-
ловека. В даний час робота з ідентифікації високопо-
ліморфних маркерів, що перекривають весь геном і рівномірно
розподілених по хромосомах практично завершенаа
(Weissenbach et al., 1992; Reed et al., 1994). Ця система
побудована на базі дінуклеотідних (CA) n повторів.
(CA) n * (GT) n являють собою найбільш частий клас
простих повторів, виявлених в геномі людини (за винятком-
ченіем An * Tn мультімеров). Такі повтори присутні при-
мірно в 1% колоній з геномних бібліотек, сконструйованих
на базі фрагментів довжиною 300 - 500 п.о., які утворюються
після перетравлення геномної ДНК ендонуклеаз Alu1. Більше
90% з них виявляються поліморфними за кількістю копій в класти-
ре, причому в 70% локусів присутні більше трьох алелів. У
1992р. групі французьких вчених під керівництвом Жана
Вайссенбаха вдалося розробити систему ідентифікації з по-
міццю ПЛР індивідуальної мінливості в місцях локалізації
(CA) n повторів і на цій основі створити геномну карту з
814 високополіморфних індексних маркерів із середнім відст-
ням між ними близько 5 см, що отримала назву
Genethon-колекції мікросателітних маркерів (Weissenbach et
al., 1992). Для цього були просеквеніровани більше 12 000
фрагментів ДНК, виділених з геномної Alu1-бібліотеки шляхом
її скринінгу poly (dC-dA) * poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймери
для ампліфікації підбирали з послідовностей ДНК, навко-
жающим повтори, використовуючи для цього комп'ютерні програми.
Для подальшого аналізу було відібрано близько 3 000
(CA) n-сайтів і проведена специфічна ампліфікація цих
ділянок у чотирьох неспоріднених CEPH-індивідуумів. На сле-
ступному етапі була визначена хромосомна приналежність по-
лутара тисяч найбільш інформативних маркерів шляхом їх іден-
тіфікаціі в панелі з 18 соматичних гібридних клонів, зі-
тримають різні набори хромосом людини. Детальна карта
зчеплення індексних маркерів побудована за результатами їх ге-
нотіпірованія в колекції 8 найбільш великих CEPH-родоводів.
Запропонована система маркерів перекриває всі хромосоми, а
сумарна відстань між ними відповідає приблизно 90%
всього геному людини.
До 1994р. число індексних STR-маркерів було збільшено до
2066, а середній інтервал між сусідніми локусами зменшений
до 2,9 см (Gyapay et al., 1994). Останнім часом перспекти-
ви широкомасштабного картування всього геному людини ста-
Чи ще більш значні. Групою англійських авторів під ру-
проводом Дж.Тодда була розроблена система автоматичного
скрінірованія 254 дінуклеотідних маркерів, що перекривають
весь геном людини з середньою відстанню між сусідніми
маркерами близько 13 см. 80% цих повторів було відібрано з
Genethon-колекції маркерів, решта - з інших джерел
ков (Genome Data Base, Baltimore). Ампліфікацію всіх 254 по-
ліморфних сайтів проводили в 39 мультиплексний ПЛР (мпцр),
причому використовуються для цих цілей олігопраймери були мічені
чотирма типами флюорохромом, так що алелі навіть однаково-
го молекулярного ваги можна було розрізнити на електрофорег-
Рамі за кольором. У кожній з 39 мпцр скрініровалі 7 - 9
STR-сайтів якоїсь певної хромосоми. Такі мпцр-набо-
каріота, порівнювати геноми різних видів, вивчати особливості
будови генома у конкретних індивідуумів або стежити за з-
зміни, що відбуваються в геномі специфічних клітин в
процесі їх онтогенетичної диференціювання. Часто геном
визначається як генетична інформація, укладена в мо-
молекули ДНК однієї клітини. Однак, такі факти, як
відсутність зв'язку між кількістю ДНК в розрахунку на Гаплоїд-
ний геном і таксономічним статусом видів, а також багато-
чисельні приклади існування величезних відмінностей у утримуючи-
нии ДНК між близькоспорідненими видами (так званий
"З-парадокс") свідчать про те, що далеко не всі
ділянки ДНК зв'язані з інформаційними функціями. Поняття ге-
нома і ДНК в значній мірі тотожні, тому що
основні принципи організації і функціонування геному це-
ликом визначаються властивостями ДНК. Притаманні цих молекул
потенційні можливості практично необмеженого струк-
турного різноманітності визначають все різноманіття світу живих
істот, як на рівні міжвидових, так і індивідуальних раз-
відмінностей в межах одного виду (Баєв та ін, 1990; Ратнер, 1985).
Процес еволюції та диференціювання окремих видів, як
правило, супроводжувався накопиченням змін у структурі ге-
нома. Це стосується, перш за все, таких параметрів, як ло-
калізація і характер упаковки ДНК в клітинах; кількість ДНК,
припадає на гаплоїдний геном, типи, співвідношення і функ-
ції кодують і некодуючих нуклеотидних послідовник-
ностей; регуляція експресії генів; міжпопуляційної Варіано-
нестабільність і філогенетичний консерватизм первинної структу-
ри геному. У межах одного виду основні параметри геному
досить постійні, а внутривидовое різноманітність забезпечують-
ється за рахунок мутаційної мінливості, тобто випадіння,
вставки або заміни нуклеотидів на порівняно невеликих
ділянках ДНК. Найчастіше такі зміни стосуються не-
експресуються елементів геному (інтронів, псевдогенами,
міжгенних спейсерних ділянок ДНК і т.д.).
Геноми еукаріот, по-суті, можна розглядати як
мультігеномние сімбіотческіе конструкції, що складаються з обли-
Гатне і факультативних елементів (Golubovsky, 1995). Основу
облігатних елементів складають структурні локуси, колі-
якість та розташування яких у геномі досить постійно.
Присутність в хромосомах деяких видів повторюваних ДНК,
ампліфікованих ділянок, ретровірусних послідовник-
ностей, псевдогенами, також як наявність у клітці ЕПІС, рет-
ротранскріптов, амплікон, додаткових B-хромосом і раз-
особистих цітосімбіонтов (вірусів, бактерій, найпростіших) є-
ється не строго обов'язковим, їх кількість і стан може
значно варіювати, тобто ці елементи є фа-
культатівнимі. У той же час участь факультативних елементів-
тов в спадкової передачі ознак, у формуванні му-
ційної мінливості і в еволюційних перетвореннях ви-
дов безсумнівно доведено. Крім того, існує безперервний
перехід від одних станів до інших за рахунок інсерцій
екстрахромосомних ДНК в хромосоми і вибудовування транспозо-
ноподобних мобільних елементів з хромосом. Отже,
незважаючи на значні відмінності факультативних послідовно-
ності від облігатних за характером основних інформаційних
них процесів (реплікації, транскрипції, трансляції та Сегре-
гаціі), вони також повинні розглядатися, як найважливіші елементи якої
менти геному.
Зупинимося тепер більш детально на основних принципах
організації геному людини. У кожній диплоїдної клітці з 46
хромосомами міститься близько 6 пикограмм ДНК, а загальна довжина
гаплоїдного набору з 23 хромосом становить 3.5 * 10! 9 пар
нуклеотидів (Kao, 1985). Цієї кількості достатньо для ДНК
кодування декількох мільйонів генів. Однак, за багатьма
незалежними оцінками справжнє число структурних генів зна-
диться в межах від 50 000 до 100 000. У розділі 2.4 виклад-
ни сучасні підходи, які використовуються для підрахунку загального ко-
кількостей генів, з яких випливає, що найбільш вірогідна
оцінка їх числа складає близько 80 000. Зіставляючи це
значення з середніми розмірами гена і співвідношенням між ве-
личиною їх екзонів і інтрони областей, можна заклю-
чити, що кодують послідовності ДНК займають не більше
10-15% всього генома (McKusick, Ruddle, 1977). Таким чином,
основна частина молекул ДНК не несе інформації про аміно-
кислотної послідовності білків, що складають основу будь-
бого живого організму, і не кодує структуру рібосомаль-
них, транспортних, ядерних та інших типів РНК. Функції цієї
"Надлишкової" (junk) ДНК не ясні, хоча її структура вивчена
досить докладно. Передбачається, що ця ДНК може
брати участь у регуляції експресії генів і в процессингу
РНК, виконувати структурні функції, підвищувати точність гомо-
логічного спаровування і рекомбінації, сприяти успішній
реплікації ДНК і, можливо, є носієм принципово
іншого генетичного коду з невідомою функцією.
Найбільш загальна характеристика геному може бути отримана
за допомогою аналізу кінетики реассоціаціі молекул ДНК. Динамік-
ка плавлення геномної ДНК виявляє присутність по край-
ній мірі трьох розрізняються за хімічною складності фракцій
(Льюин, 1987; Газарян, Тарантул, 1983). Швидко ренатурірую-
щая фракція ДНК складається з відносно коротких високопов-
торуючи послідовностей; в проміжну фракцію вхо-
дит безліч помірно повторюваних ДНК - більш протяжен-
них, але представлених меншою кількістю копій, повільно рена-
турірующая фракція об'єднує в собі унікальні послідовно-
ності ДНК, що зустрічаються в геномі не більше 1-2 разів.
За допомогою молекулярного аналізу проведена ідентифікація
основних класів повторюваних послідовностей ДНК,
становлять більше 35% всього геному людини та які включають
сателітних ДНК, інвертовані повтори, помірні і низько-
копійний повтори, а також міні-і мікро пос-
сті ДНК. Класифікація цих типів повторів достатній-
але умовна і заснована, головним чином, на двох характе-
ристиками: довжині повторюваних корови одиниць, яка може
варіювати від 1-2 до більш, ніж 2000 п.о., і числі їх ко-
пий, також змінюються в дуже широких межах - від десятка
до мільйона на гаплоїдний геном. Не менш важливими характе-
тиками різних класів повторюваних ДНК є нук-
леотідная послідовність "корови" одиниць повтору, спе-
цифічні їх організації, хромосомна локалізація, внутрішньо-
і міжвидова стабільність, а також можливі функції цих
типів ДНК.
Розділ 2.2. Повторювані послідовності ДНК.
Сателітна ДНК це клас високоповторяющіхся пос-
вательность, що становлять близько 10% всього геному людини
(Kao, 1985). При центрифугуванні геномної ДНК в градієнті
щільності CsCl ці послідовності утворюють чотири від-
слушних сателітних піка з різними середніми значеннями
плавучої щільності. Методом гібридизації in situ показано
присутність сателітної ДНК переважно в центромірних,
теломерна і гетерохроматинових районах більшості хро-
мосом, при цьому характер гібридизації подібний для всіх чоти-
рьох груп і не залежить від приналежності ДНК-зондів до се-
мейства повторів, що утворюють різні сателітні піки. У
кожної з цих груп, проте, присутня невелика кіль-
кість послідовностей, що мають специфічну хромосом-
ву локалізацію. Так наприклад, близько 40% довгого плеча Y
хромосоми становить сімейство послідовностей, тандемної
повторюваних більше 3000 разів і не знайдених в інших хро-
мосом.
Виділяють три основні типи сателітної ДНК: (1) короткі
- Від 2 до 20 п.о., стабільні тандемні повтори з кратністю
у кілька десятків тисяч разів, які іноді перемежовуються
з неповторяющимися послідовностями, (2) кластери більше
протяжних повторів, злегка розрізняються по нуклеотидної
послідовності, (3) складні, що досягають декількох со-
тен пар нуклеотидів, що повторюються послідовності раз-
особистої ступеня гомології (Газарян, Тарантул, 1983). До послід-
нього типу відносяться альфа-сателітні або альфоідние ДНК,
серед яких знайдено багато хромосом-специфічних пос-
вательность. Розміри повтрояющіхся "корови" одиниць альфа-
идной ДНК складають близько 170-200 п.н. У геномі людини і
інших приматів ці мономери організовані в кластери по 20 і
більш "корови" одиниць. Після розщеплення рестриктазою BamHI
в альфоідной ДНК виявляється серія фрагментів, довжиною близько 2
000 п.о., у складі яких виявляються альфоідние після-
послідовності, специфічні для гетерохроматинових районів
різних хромосом людини (1, 3, 4, 5, 9, 6, 7, 11, 17, 19,
Х). У деяких випадках ці повтори гомологічних двом різним
хромосомами (9 і 15, 13 і 21, 18 і Х) (Willard, Waye, 1987).
Хромосом-специфічні послідовності сателітної альфа-
идной ДНК знайшли широке застосування в молекулярній цітогене-
тику в якості ДНК-зондів, зручних для маркування індиві-
дуальних хромосом у метафазних і інтерфазних клітинах челове-
ка (Юров, 1987). Передбачається, що сателітні ДНК відіграють
важливу роль у підтримці структур хромосом і, можливо, в
їх спарюванні в процесі мейозу (Charlesworth et al., 1994).
Особливе місце серед сателітних ДНК займають мікро-і
мінісателітних послідовності, що представляють собою
численну групу розсіяних по всьому геному щодо відповідності-
але коротких тандемних повторів. Мікросателіти - це клас
дінуклеотідних повторів. Розмір повторюваних одиниць в мі-
нісателітних послідовностях може змінюватися від 3 - 4 до
10 - 15 нуклеотидів. Відмінною особливістю мікро-і ми-
нісателлітов є наявність серед них великої кількості
ділянок, вариабильность за кількістю копій в кластері.
Інвертовані або звернені повтори становлять до 5%
геному. Вони складаються з двох тотожних копій довжиною близько
300 п.о., орієнтованих в протилежних напрямках на
однієї нитки ДНК і лежать на відстані від нуля до десятка
тисяч пар нуклеотидів один від одного (в середньому - 1,6 кб).
Близько 1 / 3 звернених повторів не розділені проміжними
послідовностями і носять назву паліндромів. Середнє
відстань між двома різними парами інвертованих
повторів близько 12 кб, та їх розподіл по геному носить
випадковий характер. Комплементарні пари легко асоціюють
при відпалі, утворюючи шпилькові структури з дуплексним ніжкою
і однониткових петлею, довжина якої відповідає відстані
між парою звернених повторів. Внаслідок цього надаючи-
ються приблежения досить віддалені один від одного учас-
ки ДНК, що важливо для роботи ряду ферментів, що забезпечують
процеси реплікації і транскрипції. Важливо відзначити і те, що
однониткових ділянка ДНК, утворює петлю, стає
доступним для дійства нуклеази S1, специфічно руйнує
однониткову ДНК.
Група помірно повторюваних послідовностей дуже
гетерогенна за довжиною і кількістю копій і становить близько 20%
геному людини. Як правило, вони розподілені дисперсно по
всім хромосомами, причому відносно короткі послідовник-
ності ДНК до 500 п.о., так звані короткі диспергируют-
ванні повтори - Sine, повторюються більше 100 000 разів, у
середньому, через кожні 2.2 кб. Число копій довших
диспергованих послідовностей - Line, не перевищує 10
000. Помірні повтори знайдені у всіх структурних компонен-
тах геному за винятком кодують областей генів. Два
головних сімейства помірних повторів, Alu і Kpn1, займають,
принаймні, 10% геному і практично стільки ж зайнято
кількома сотнями інших родин повторів цього класу.
Основною одиницею Alu сімейства є коротка
послідовність з 300 п.о., повторена в геномі челове-
ка кілька сот тисяч разів, в середньому, через кожні 5 кб чи
через кожні 2 - 3 диспергованих повтору, що належать
інших сімейств (Kao, 1985; Льюин, 1987). При цьому,
кластери Alu-повторів, як правило, лежать всередині R-дисків
метафазних хромосом - Гімза негативних (G-дисків). Роз-
ределеніе Alu-повторів по геному вельми нерівномірно як
між хромосомами, так і за їх довжиною. Так, в хромосомах 14,
16, 21 Alu-послідовності концентруються в області
центромери, а в хромосомах 4, 19, 20, Х і У виражені
кластери Alu повторів не знайдені. Члени Alu сімейства не
повністю ідентичні один одному. Проте, всі вони містять
сайт рестрикції для ферменту AluI і мають димерную структу-
ру, тобто складаються з двох прямих повторів довжиною близько 130
п.о. з багатою аденіном вставкою з 31 нуклеотиду у другому
мономере. Кожна Alu послідовність фланковані прямими
повторами довжиною від 7 до 20 п.о., різними для різних чле-
нов сімейства і мають велику ступінь гомології з
транспозоноподобнимі елементами про-і еукаріотів. Деякі
члени Alu сімейства можуть транскрибувати за допомогою фер-
мента РНК-полімерази 111. Передбачається, що при певних
них умовах утворюються при цьому молекули РНК можуть зворотня
але транскрибувати, що в свою чергу, може призвести до
появи в клітинах Alu-містять кДНК, що володіють
властивостями ретропазонов, тобто здатних інсертіроваться в
геномної ДНК. У літературі описані випадки інсерційного му-
тагенеза Alu повторів, що призводять до гемофілії В та нейрофіб-
роматозу типу 1. Проте, частота таких подій, мабуть,
невелика. Передбачається, що короткі помірні повтори,
подібні Alu сімейства, беруть участь у регуляції транскрипції,
в процессингу РНК і в ініціації реплікації ДНК. Крім того,
виявлений високий ступінь гомології Alu послідовностей
з одним із видів низькомолекулярної РНК (7 S РНК), які займаються питаннями
щей в секреції білків.
До числа Line повторів відноситься Kpn1 сімейство, яке
складається з більш довгих і значно більш гетерогенних
послідовностей, розсіяних по всьому геному. У ряді слу-
чаїв члени Kpn1 сімейства группірются в кластери, утворюючи
довші структури, що повторюються декілька тисяч разів.
Для деяких членів цієї родини також доведена можли-
ність інсерцій кДНК-ових копій Kpn1-РНК-транскриптів в ге-
автономних ДНК і виникнення мутацій. Таке явище було попере-
ружено в одному випадку гемофілії А. Деякі Kpn1-пос-
сті не тільки транскрибуються, але й здатні
транслюватиметься (Charlesworth et al., 1994).
Розділ 2.3 Мультігенние сімейства, псевдогени, онко-
ни.
Багато генів людини повторені в геномі від декількох
одиниць до декількох сотень разів і утворюють мультігенние се-
мейства (Газарян, Тарантул, 1983; Босток, Самнер, 1981; Kao,
1985; Льюин, 1987). Ці гени зазвичай згруповані в кластери
в певних районах однієї, або декількох хромосом. Під
багатьох мультігенних сімействах поряд з функціонально актив-
вими генами містяться псевдогени - мутаційно змінені
послідовності, не здатні транскрибувати або про-
дуцірующіе функціонально неактивний генний продукт. Прімера-
ми мультігенних сімейств можуть служити гени рибосомальних,
транспортних і ядерних РНК, гени альфа-і бета-глобіну, ту-
булін, міоглобіну, актину, інтерферону та багатьох інших. У
ряді випадків, можлива виборча ампліфікація деяких
сімейств генів у процесі їх експресії, як, наприклад, ге-
нов рибосомних РНК. При цьому число здатних транскрібі-
рова копій генів збільшується за рахунок їхньої виборчої
ампліфікації в сотні і навіть тисячі разів, що супроводжується
лавиноподібним наростанням частки відповідного генопродук-
та в клітинах. Особливе місце серед мультігенних сімейств зани-
мают супергени - дуже великі кластери з сотень функціо-
нально і структурно родинних генів, розташованих в сег-
ментах окремих хромосом. Класичним прикладом супергена
може служити HLA комплекс, контроліруюшій головні антигени
гістосумісності. Він займає район більше 6000 кб на ко-
Ротко плечі хромосоми 6р21 і складається з серії тісно зчеп-
лених генів, відповідальних за синтез білків безлічі,
включають клітинні поверхневі антигени, молекули імунної-
ного відповіді і деякі компоненти комплементу. До суперген-
вим домами відносяться три комлексу розташованих на раз-
них хромосомах мультігенов, контролюючих синтез важких і
легких ланцюгів імуноглобулінів. Цікаво, що в процесі
діффіренціровкі B лімфоцитів, які продукують імуноглобуліни,
відбувається структурна перебудова цих родин. При цьому
окремі послідовності ДНК елімінуються, тоді як
інші зливаються, так що структура генів імуноглобулінів у
зрілих B лімфоцитах значно відрізняється від початкової, то
Тобто від тієї, яка спостерігається в зародкових клітинах.
Однією з важливих структурних особливостей геному челове-
ка є наявність так званих псевдогенами, унікальних
послідовностей, дуже схожих за своєю структурою з оп-
ределенном нормальними генами, але в силу присутності в ко-
дірующіх послідовностях цілого ряду мутацій не спосіб-
них транскрибувати або правильно транслюватиметься з обра-
зованием структурно і функціонально активного продукту.
Псевдогени виявлені для багатьох генів. Їх кількість варь-
ірует від однієї до кількох десятків копій на геном і в
цьому випадку вони, як правило розташовані тандемної. Іноді
псевдогени тісно зчеплені з нормальними генами, у багатьох
випадках псевдогени і гени локалізовані в різних хромосомах.
Для деяких моногенних захворювань ідентифіковані му-
тантние алелі, подібні з мутаціями у відповідних псев-
догенах. У цих випадках обговорюється можлива роль псевдогени-
нов в спнтанном мутаційному процесі.
У геномі людини присутні також нуклеотидні
послідовності, гомологічні генам деяких вірусів.
Вперше ці послідовності були ідентифіковані в гено-
ме вірусів, індукують розвиток пухлин у тварин і че-
ної людини, і тому вони були названі онкогенами. Гомологічні
послідовностей в геномі людини носять назву прото-
онкогенів. В даний час вже ідентифіковано більше 100
протоонкогенів. Білкові продукти протоонкогенів, по-мабуть-
му, відіграють важливу роль у нормальній проліферації клітин осо-
ливо на ранніх стадіях ембріонального розвитку, контролюючи
клітинний цикл і вибір геномної програми розвитку клітини.
При виникненні специфічних мутацій у протоонкогенах, а
також при порушеннях регулювання їх роботи, що виражаються в гі-
перпродукціі або в зкспрессіі в нетіпічномном місці або в
невластивий момент життєдіяльності клітини, вони починають
вести себе як онкогени, стимулюючи неконтрольоване размн-
ються і проліферацію певних клітинних клонів, що і
може, в кінцевому рахунку, привести до формування пухлини.
Розділ 2.4 Сучасне визначення поняття "ген",
транскрипція, регуляторні елементи генів.
Близько 10-15% геному людини представлено унікальними
транскрипційного послідовностями, що складають основу
структурних генів (Льюин, 1987). В даний час в поняття
"Ген" включається не тільки його транскрипційного область -
Екзони + інтрони, але навіть фланкирующие послідовності -
лідерних, що передує початку гена, і хвостова нетранслі-
ються область, розташовані на 3 'кінці гена (Рис.2.1). У
відміну від генів прокаріотів гени людини рідко представлені
однієї безперервної послідовністю і в переважній біль-
шинстве мають переривчасту структуру. Щодо короткі
кодують ділянки - зкзони, чергуються з довгими інтрони-
ми, що транскрибуються і входять до складу первинного
РНК-продукту, але потім під час процесинга первинного РНК
-Транскрипту вони вирізаються і не беруть участь в трансляції.
Процес вирізання інтронів з первинних транскриптів отримав
назва сплайсингу. Таким чином, в зрілої мРНК інтрони
області відсутні, а Екзони складають безперервну кодир-
ющую послідовність. Розміри зрілих мРНК нерідко в
десятки разів менше первинних РНК-транскріпов і, відповід-
повідно, розмірів самого гена.
Згідно класичним уявленням ген - це локус,
на хромосомі, мутації в якому реалізуються на рівні фено-
типу. У молекулярній біології ген трактується як асоційова-
ний з регуляторними послідовностями фрагмент ДНК,
відповідний певної одиниці транскрипції. Слідові-
тельно, уявлення про гені формальних генетиків далеко не
повністю тотожні його фізичної одиниці та співвідношення
між цими двома поняттями досить заплутані. Відзначимо
деякі причини цих протиріч. Відомо, що мутації
одного гена можуть призводити до зовсім різних і навіть у ря-
де випадків до комплементарним фенотипам. Результати прямого
секвенування генома свідчать про присутність у ньому
значного більшого числа генів, ніж можна очікувати від ре-
татів мутаційного аналізу. Одна і та ж послідовник-
ність ДНК в геномі може кодувати кілька різних біл-
ков, що досягається за рахунок так званого альтернативного
сплайсингу (освіту різних мРНК з одного первинного
РНК-транскрипту). У великих інтрони ряду генів виявлено
смислові послідовності інших генів ("ген в гені"),
зчитувальні в протилежному напрямку. Транскрипційні
одиниці генома можуть перекриватися за рахунок наявності різних
промоторів. Нарешті, завдяки соматичної рекомбінації
структура транскрипційного последовательнстей деяких ге-
нов може бути різною в різних клонах клітин одного орга-
низма (Т-клітинні рецептори). Ситуація з визначенням поня-
ку "ген" ще більше ускладнюється, якщо в це поняття вклю-
чать численні регуляторні послідовності. Метушні-
кає питання: "Як далеко від гена можуть розташовуватися ці
послідовності, щоб їх можна було включати в структуру
гена? ". Для багатьох цілей виявляється зручним введене в
Останнім часом поняття "рахований ген" - counting gene.
Останній розглядається як окрема транскрипційного
одиниця ДНК або її частина, яка може транслюватися в
одну або кілька взаємопов'язаних амінокислотних послідовно-
ність. Тому послідовність, що дає дві
транскрипційні одиниці за рахунок альтернативного сплайсингу
і, як наслідок, два різних білки враховується як один ген.
Однак, якщо ступінь гомології двох генопродуктов, що мають
загальний транскрипційного ділянку, невелика, то ці послідовно-
ності розцінюються як два різних гена (Fields et
al., 1994).
За своїм функціональним призначенням гени можуть бути
розділені на дві групи. Група I представлена генами, коди-
ючий власне білки; група II - генами, контролюючого-
ми синтез рибосомних, транспортних і ядерних РНК. За ха-
рактеру експресії гени також можуть бути поділені на дві
групи - гени "домашнього господарства" (housekeeping genes),
продукти яких необхідні для забезпечення жізнедеятель-
ності будь-якого типу клітин, і тканиноспецифічною гени, що забез-
печує спеціалізовані функції клітин, тобто гени,
функціонально активні тільки в певних типах клітин
(Тканин) і тільки на певних стадіях онтогенезу, так
звані гени термінальної диференціювання.
Вважається, що середні розміри гена людини складаючи-
ють, приблизно, від 10 до 30 кб. Однак, ця величина може ко-
Леба від декількох десятків до мільйонів пар нуклеоті-
дов. Згідно з останніми даними, найменший з відомих
генів-МСС-7, має розміри всього 21 п.о. (Gonzales-Pastor
et al., 1994), а самий болшой - ген дистрофина -2.2 Мегабаз.
Гени відокремлені один від одного протяжними проміжками -
спейсерами, що містять у своєму складі велику кількість
повторюваних послідовностей ДНК і нетранскрібіруемие
унікальні послідовності.
Розглянемо більш детально сучасні дані про число
генів в геномі людини. Отримані різними методами оцінки
цієї величини наведені у табл.2.1. Виходячи з розміру геному
(Близько 3 000 000 000 п.о.), та середнього розміру одного гена
близько 10 - 30 тис.п.о. (Gilbert, 1992), загальне число генів
повинно бути близько 100 000. При цьому, як уже зазначалося,
розподіл генів на хромосомах вкрай нерівномірно. Уста-
новлено, що більше 90% генів знаходиться в Гімза-негативний
них районах метафазних хромосом, в так званих R-бендах
(Antequera, Bird, 1993). Проведені нещодавно прямі дослід-
вання методом секвенування показують, що в R-бендах їх
число досягає 43-50 на один бенд, а в Гімза-позитивних
районах хромосом (G бендах), - лише 1-2 на 75-80 кілобаз,
тобто всього в геномі можна очікувати близько 70 000 генів.
Оцінка числа генів за часткою транскрипційного частини геному
(Всього 12%) дає зовсім маленьку величину - 20 000 генів
(Wagner et al., 1993). Методом дослідження кінетики реассо-
ціація РНК в культурі клітин число генів оцінюється між
20 - 40 000 (Lewin, 1990). У той же час в клітинах мозку
число різних мРНК за деякими даними досягає 97 000
(Wagner et al., 1993). Найбільш точні підрахунки числа генів
людини проведені останнім часом і засновані на оцінці
числа CpG острівців (табл.2.1). Відомо, що в промоторної
області всіх генів "домашнього господарства" і приблизно у 40%
генів термінальної диференціювання, що забезпечують спеціалі-
зірованние функції диференційованих клітин, перебувають про-
ласті коротких дінуклеотідних CpG повторів. Розроблено мо-
лекулярние методи точної реєстрації цих ділянок, які
показали, що їх число в геномі близько 45 000, звідси число
структурних генів оцінюється в 67-70 000 (Antequera, Bird,
1993). Практично таке ж число генів (64 000) визначено
недавно методом обліку маркерних експресують послідовно-
ності (exdivssed sequence tags) (Fields et al., 1994).
Таким чином, підсумовуючи вищевикладене, можна зробити висновок,
що в геномі людини міститься, в середньому, близько 70-80 000
окремих транскрипційного ДНК послідовностей, тобто
генів.
Транскрипція гена починається з 5 'кінця першого екзона,
де розташований сайт ініціації транскрипції. Певною
гомології між стартовими сайтами різних генів не спо-
ється, але частіше за все вони починаються з нуклеотиду А, оточений-
ного піримідинових основ. На кордонах між екзонами
і интронами є консервативні канонічні послідовно-
ності, які відіграють істотну роль у забезпеченні точності
вирізання інтронів під час сплайсингу РНК. Всі інтрони
послідовності починаються з дінуклеотід GT і закінчуючи-
ються динуклеотид AG, званими, відповідно, донорно-
ми і акцепторними сайтами сплайсингу. На 3-кінці багатьох
структурних генів ідентифікована полі (А)-сигнальна після-
довність (AATAAA), що бере участь у процесі модифікації
первинного РНК транскрипту і відповідальна за альтернативний
сплайсинг мРНК, що забезпечує синтез різних зрілих мРНК з
одного і того ж первинного РНК транскрипту.
Транскрипція генів здійснюється за допомогою ферменту
РНК-полімерази. Близько 50-70% клітинного синтезу РНК забезпе-
чивается РНК-полімеразою I, локалізованої в ядерцях і від-
дальну за синтез генів рибосомальної РНК. РНК-полімеру-
за II забезпечує транскрипцію генів, що кодують власне
структурні білки. Цей фермент локалізований в ядрі (але не в
ядерцях). На його частку припадає 20 - 40% синтезу РНК.
РНК-полімераза III контролює синтез ядерних і транспорт-
них РНК (Льюин, 1987). На 1-му етапі РНК-полімераза пов'язуючи-
ється з двухнитевой ділянкою ДНК і, розплітаючи його, робить
доступним спаровування смислової нитки ДНК з рибонуклеотидов
(Мал. 2.2). Після того, як перший нуклеотид РНК інкорпорує-
ється в сайт ініціації транскрипції, полімераза починає
просуватися по нитки ДНК в напрямку 5'-3 ', розплітаючи
подвійні нитки ДНК поперед себе і заплітаючи їх позаду. Цей
процес продовжується до досягнення терминирующего сигналу,
представляє собою один чи кілька терминируются кодо-
нов. Потім молекули РНК і ферменту вивільняються і подвійна
спіраль (дуплекс) ДНК повністю відновлюється.
Для правильного початку синтезу РНК необхідне точне
взаємодія РНК-полімерази з молекулою ДНК. Цей процес
контролюється промотором - спеціальної регуляторної після-
довність ДНК розмірами близько 75 п.о., локалізованої,
як правило, в 5'-фланкирующей області гена. Іноді під
контролем одного промотора зчитується кілька генів c про-
яними єдиного первинного РНК-транскрипту. Промоторні
області різних генів досить різноманітні за своїм нук-
леотідному складу. Проте, майже для всіх промоторів харак-
Терно наявність консервативної послідовності з 7 основа-
ний на відстані 19-27 нуклеотидів ліворуч від сайту ініціації
транскрипції. Це, так званий, TATA-бокс (блок Хог-
Несс), що забезпечує коректне розташування РНК полімеру-
зи по відношенню до стартового сайту. На відстані 70 - 80
п.о. у напрямі 5-кінця від початку транскрипції часто
розташована інша консервативна послідовність з 9
п.о. - CAAT-бокс, контролюючий початкове зв'язування
РНК-полімерази. Мутації в TATA-чи в CAAT-боксах можуть су-
нням впливати на швидкість синтезу РНК. У 5'-фланкирующей
області гена на відстані до тисячі пар підстав від початку
його кодує частини розташовуються інші регуляторні
послідовності, так звані інхансери (підсилювачі),
здатні різко збільшувати продукцію гена за рахунок збільшен-
ня швидкості транскрипції. Ці контролюючі елементи можуть
працювати незалежно від їх орієнтації по відношенню до сайту
ініціації. Для деяких генів знайдені ділянки ДНК, пригнічуючи-
ющие транскрипцію, а також так звані атенюатори (осла-
зультатами) - послідовності, що лежать між сайтом ініціації
транскрипції і власне геном. Вони можуть блокувати прод-
ДОРОЗІ РНК-полімерази. Завдяки такому складному механізму
контролю, досягається дуже тонка і ефективна регуляція
експресії генів практично на всіх етапах транскрипції,
трансляції і освіти функціонально зрілого білка. Ці
механізми більш детально розглянуті в інших розділах.
Розділ 2.5 Мінливість геному, поліморфні сайти рест-
рікціі, ПДРФ-аналіз.
Кодуючі і регуляторні області структурних генів на-
амо консервативні в процесі еволюції, так як мутації в
них піддані тиску жорсткого природного відбору.
Дійсно, невеликі зміни в цих послідовник-
ності, навіть заміна однієї підстави, делеція або інсерцій
декількох нуклеотидів, можуть призвести до припинення синтезу
білка або до втрати його функції, що, як правило, драматичні
ного чином позначається на життєздатності особин, несу-
щих подібні мутації. Однак, близько 90% геному людини
складається з некодуючих послідовностей, подібних Сателіт-
тних ДНК, помірним повторам, інтрони і спейсерним проме-
моторошна між генами. Ці ділянки значно більш мінливі
і містять безліч, так званих нейтральних мутацій або
поліморфізмів, що не мають фенотипического вираження і не
надають помітного впливу на життєздатність чи репро-
дуктивних властивості особин і, таким чином, не підданих
прямого тиску природного відбору. Поліморфні локуси
є зручними генетичними маркерами. На основі аналізу
родоводів можна прослідкувати їх спадкування у ряду покоління-
ний, проаналізувати зчеплення один з одним, з відомими
генами і з анонімними послідовностями ДНК, тобто
використовувати в якості звичайних Менделя ознак у
класичному генетичному аналізі. Інформативність поліморфи-
них локусів визначається рівнем їх генетичної мінливості-
вості в різних популяціях.
Експериментально легко виявляються два варіанти геномно-
го поліморфізму. Кількісні зміни в області локалізують-
ції міні-і мікро послідовностей ДНК і ка-
зняні заміни окремих нуклеотидів, що призводять до появ-
ленію поліморфних сайтів рестрикції. У першому випадку зрад-
тична за кількістю повторених "корови" одиниць створює серію
алелів, характер і частота яких є унікальними для кожного
вариабильность локусу. Поліморфізм в сайтах рестрикції пов'язаний
з присутністю точкових нейтральних мутацій, локалізованість,
як правило, в унікальних послідовностях некодуючих
ділянок ДНК. Подібні мутації в силу вирожденність генети-
тичного коду (см.главу 1) можуть виникати і в кодують
послідовностях генів. Спонтанні мутації, що виникають у
сайтах впізнавання для певних рестриктаз, роблять їх ре-
зістентнимі до дії цих ферментів. Аналогічним чином,
при таких замінах можуть створюватися нові сайти рестрикції.
Показано, що поліморфні локуси зустрічаються у всіх хро-
мосом з частотою приблизно один поліморфний сайт на
300-500 п.н. Цей тип мінливості ДНК було виявлено і викорис-
поклику для молекулярної маркування специфічних ділянок ге-
нома історично раніше порівняно з вариабильность Сателіт-
тних повторами (Botstein et al., 1980).
Мутаційна мінливість в сайтах рестрикції може бути
легко виявлена по зміні довжини рестрикційних фрагмент-
тов ДНК, гибрідизуючою зі специфічними ДНК-зондами. Ана-
ліз поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів, так називаються
ваемий ПДРФ-аналіз (Restriction Fragment Length Polymorphism
-RFLP analysis), включає наступні етапи: виділення геном-
ної ДНК, її рестрикції специфічної ендонуклеаз, елекро-
форетічеського поділ утворюються фрагментів ДНК і іден-
тіфікацію фрагментів ДНК, які містять поліморфний сайт рест-
рікціі, шляхом блот-гібридизації за Саузерн (см.главу 1).
При відсутності рестрикції в поліморфноядерних сайті на електрофени-
реграммах або радіоавтографах (залежно від типу мічення
ДНК-зонда) буде виявлятися один великий фрагмент, чи від-
ний по довжині послідовності ДНК між двома
сусідніми константними сайтами рестрикції для тієї ж ендо-
нуклеази. При наявності рестрикції за поліморфними локусами на
електрофореграмме буде присутній менший за розмірами
фрагмент, що дорівнює відстані між поліморфним сайтом рест-
рікціі і одним з найближчих константних сайтів рестрикції. З
яким саме з двох фрагментів, прилеглих до поліморфної
локусу, буде відбуватися гібридизація залежить від локалізують-
ції використовуваного для аналізу ДНК-зонда. В окремому випадку
можлива гібридизація одночасно з двома сусідніми рест-
рікціоннимі фрагментами, якщо обраний ДНК-зонд комплемен-
тарен послідовності, яка містить поліморфний сайт рест-
рікці. Однак, такі зонди дуже рідко використовуються на прак-
тику, так як довжина рестрикційних фрагментів зазвичай в
десятки разів більше довжини ДНК-зондів і далеко не завжди вда-
ється виділити і проклоніровать фрагмент ДНК, що містить по-
ліморфний сайт рестрикції. Тому надалі для простоти
викладу ми будемо розглядати тільки більш загальну ситуацію
і вважати, що за відсутності рестрикції в поліморфноядерних сайті
ДНК-зонд гибрідизуючою з одним довгим фрагментом, а при на-
явності рестрикції гибрідизуючою фрагмент має меншу дли-
ну. Таким чином, при аналізі ДНК особин, в обох хромосом-
мах яких присутня сайт рестрикції в поліморфної про-
ласті, на електрофореграмме буде виявлений тільки один бенд в
нижній області гелю, що відповідає більш коротким фраг-
менту ДНК. У особин, гомозиготних по мутації, що змінює по-
ліморфний сайт рестрикції, буде спостерігатися один бенд в
верхньої частини гелю, відповідний фрагменту більшої довжини,
тоді як у гетерозигот проявляться обидва ці бенду (Мал. 2.3а).
ПДРФ-аналіз може бути значно спрощений в тому випадку,
якщо можлива специфічна ампліфікація ділянки ДНК, що містить
жащего поліморфний сайт рестрикції. Тестування стану
цього локусу можливо шляхом проведення ПЛР і рестрикції амп-
ліфікованих фрагмента. При відсутності сайту впізнавання в
досліджуваної області ДНК розміри ампліфікованої фрагмента
не зміняться після його обробки відповідної ендонуклеа-
зою, тоді як при повній відповідності поліморфної області
сайту рестрикції утворюються два фрагменти меншої довжини
(Ріс.2.3б). У гетерозигот будуть присутні 3 фрагмента,
один з яких по довжині буде відповідати розміру амп-
ліфіката до рестрикції, плюс 2 маленьких фрагмента з тією ж
сумарною довжиною. Таким чином, як і у випадку викорис-
ня для аналізу блот гібридизації за Саузерн, трьом можли-
вим варіантів генотипу будуть відповідати три різні
варіанту Електрофореграма.
Необхідно підкреслити, що первинна ідентифікація по-
ліморфних сайтів рестрикції, зчеплених з певними ге-
нами, можлива тільки при наявності відповідних ДНК-зон-
дов. Подальша тактика полягає в пошуку рестрикційної
нуклеази, що виявляє поліморфізм. З цією метою використовують
широкий набір ендонуклеаз для рестрикції геномної ДНК, виокрем-
ленній з групи неспоріднених індивідуумів, що представляють
собою репрезентативну вибірку популяції. Потім проводять
ПДРФ-аналіз окремо для кожної з рестриктаз з набором име-
ющіхся ДНК-зондів. Після виявлення поліморфізму в одній з
популяцій аналогічні дослідження проводять в інших популя-
ціях.
Слід враховувати, що поліморфні сайти рестрикції
завжди являють собою двухаллельную систему, тому да-
ж при найвищій вариабильность такого сайту, число ге-
терозіготних за даним локусом особин у популяції не буде
перевищувати 50% Тим часом, тільки за наявності поліморфного
сайта у гетерозиготному стані можна відрізнити мутантний
аллель від нормального, тобто здійснити його молекулярну
маркування. Отже, інформаційна ємність такого по-
ліморфізма відносно невелика (див. Глави Y і VII).
Розділ 2.6 вариабильность мікро-і мінісателітних ДНК.
Гіперваріабільние сателітні повтори є набагато
більше інформтівнимі маркерами в порівнянні з поліморфними
сайтами рестрикції, тому що являють собою мультіаллель-
Сенсорні системи з рівнем гетерозиготності, що досягає 70 -
90%. Крім того, виявилося, що кількість високоізменчівих
мікроі мінісателітних послідовностей в геномі челове-
ка, мабуть, перевищує кілька десятків тисяч, вони
досить щільно і рівномірно розташовані в кожній з хро-
мосом. Так більше 90% з 5000 ідентифікованих (CA)-повто-
рів є поліморфними, причому в більшості з них уро-
вень гетерозиготності значно перевищує 50% (Weissenbach
et al, 1992). Серед гіперваріабільних міні-сателітних
послідовностей розрізняють варіюють за кількістю тандемні
повтори - VNTR, три-, тетра-і пентануклеотідние повтори, а
також деякі інші класи повторів. Загальна кількість високо-
поліморфних мінісателітних послідовностей в геномі
перевищує 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,
1994). VNTR (variable number tandem repeats - варіюють по
числу тандемні повтори)-характеризуються наявністю 10 - 15 -
ти нуклеотидних "корови" послідовностей, схожих з
контролюючими елементами рекомбінації E.coli (Jeffreys et
al., 1985). За допомогою ДНК-зондів, сконструйованих на осно-
ве тандемної повторюваних "корови" послідовностей,
можна аналізувати індивідуальну мінливість в одиничних
або множинних високополіморфних локусах, несучих одно-
тіпную корову послідовність. Прикладом може служити
VNTR, виявлена в інтроні міоглобінового гена, що включає
чотири тандемних повтору з 33 п.о., фланкованому прямими
повторами з 9 п.о. Отримані з цього району ДНК-зонди з
успіхом використовуються для ідентифікації особистості методом
ДНК-Фінгерпринт, тому що ймовірність збігу алелів у
двох неспоріднених індивідуумів по всіх гіперваріабільним
локусами, гібрідізующіхіся з цим ДНК-зондом, значно
менше 10! -7 (Jeffreys et al., 1991). Високополіморфние VNTR
знайдені також в гені інсуліну, в області глобинового псевдо-
гена і в Х-хромосомі, що містить послідовності, Гомоле-
гічне ДНК вірусу гепатиту В (Nakamura et al., 1985). У
Останнім часом численні VNTR-послідовності про-
дуть виявлені в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien, 1992).
Пошук нових гіперваріабільних локусів заснований на систе-
зації скринінгу клонованих послідовностей ДНК з по-
міццю штучно синтезованих "корови" зондів. Особ-
але зручні для такого скринінгу геномні бібліотеки,
сконструйовані на основі попередньо фракціонованих
за величиною Mbo1 або Sau3A1 фрагментів ДНК, так як великі
фрагменти збагачені довгими і більше вариабильность мінісате-
тних послідовностями (Armour, et al., 1990). Хороші
результати були отримані також при скрінірованія космідних
бібліотек за допомогою G-багатих синтетичних ДНК-зондів і
використання хемолюмінесцентного методу в поєднанні з ПЛР
(Decorte, Cassiman, 1990). У деяких випадках з цією метою
застосовують також послідовності ДНК, виділені з фага
М13, що має в своєму складі подібні структури (Armour
etal., 1990).
Одним з варіантів мінісателітних послідовностей
є тримерной і тетрамерние короткі тандемні повтори
-STR (short tandem repeats), які стабільно успадковуються і
також володіють високим рівнем поліморфізму за кількістю корови
одиниць (Edwards et al., 1991). У X хромосомі такі повтори
виявлені через кожні 300 - 500 кб, тоді як в інших
частинах геному вони зустрічаються на відстані 10 кб один від
одного. За деякими оцінками їх частота може досягати 1 / 20
кб (Charlesworth et al., 1994). Можливо, справжнє число три-
і тетрамерних повторів в геномі людини ще більше, так як
вони виявлені в багатьох генах. Подібно до інших повторам STR
зазвичай зустрічаються в некодуючих частинах генів. Останнім
час, проте, виявлена група структурних генів, які несуть
тримерной повтори у регуляторних і навіть у трансльованих
частинах генів. Зміни числа цих внутрігенних повторів у
бік їх збільшення може призводити до порушення функції
цих генів аж до повного блоку експресії і бути при-
ної ряду важких спадкових захворювань - хвороби
експансії (см.главу X). В якості зондів для виявлення ко-
ротких тандемних повторів використовують синтетичні олігонук-
леотіди, побудовані з простих повторів трьох або чотирьох
нуклеотидів.
Останнім часом для виявлення різних класів
мікросателітних послідовностей та STR-повторів застосовують
ють ефективні методи, засновані на використанні ПЛР
(Edwards et al., 1991). Для цих локусів характерна велика
число алелей, які розрізняються за кількістю корови одиниць.
Продукти ампліфікації цих сайтів можуть відрізнятися один від
друга числом ді-три-чи тетрануклеотидна повторів. Для
зручності ідентифікації різних алелів полімеразну ланцюгову
реакцію проводять у присутності мічених нуклеотидів, а для
електрофоретичного розділення продуктів ампліфікації
використовують спеціальні секвеніруют гелі. Багато STR-локуси
настільки поліморфні, що знайшли застосування в судовій міді-
ціне для ідентифікації особи. Для підвищення достовірності
результатів з цією метою використовують мультиплексні варіанти
ПЛР, що дозволяють встановлювати генотип індивідуума одночасним-
сно з кількох STR-сайтів (Weber, May, 1994; Асєєв та
ін, 1995). Можливість точного генотипування особистості з
використанням полімеразної ланцюгової реакції, тобто на міні-
мальном кількості ДНК, є важливим методичним переваж-
ществом STR перед раніше розглянутими VNTR, для аналізу до-
торих частіше використовують блот-гібридизацію по Саузерн.
Висока частота коротких тандемних повторів, уні-
ність комбінацій числа тетра-, три-і димерів в різних сай-
тах в поєднанні з їх великою вариабильность та порівняльної
легкістю ідентифікації алелів дозволяє широко вико-
ти ці повтори для генетичного і фізичного картірова-
ня в якості найбільш зручних індексних маркерів геномних
ДНК-послідовностей (см.главу III). Такі маркерні сай-
ти отримали назву STS (sequence tagged sites). У настою-
ний час в геномі людини вже ідентифіковано близько 10
000 STS, переважна більшість яких є
тандемні повтори 2 - 4 нуклеотидів. Завдяки вираженій
індивідуальної специфічності і досить стабільному менде-
Левського типом успадкування STS-сайти знайшли широке застосування-
ня і в молекулярній діагностиці генних хвороб, перш
все в якості молекулярних маркерів для ідентифікації му-
тантних хромосом в родинах високого ризику (див. Главу VII).
Наявність великої кількості гіперваріабільних мікро-і мінісател-
тних послідовностей ДНК є характерною особ-
ністю геному людини. Аналогічні послідовності, про-
нням виявлених в геномі приматів, значно більш однорідні,
що доводить можливість істотного збільшення Варіано-
стабільності цих ділянок ДНК за порівняно короткий Евола-
ційний період (Юров, 1988; Gray et al., 1991).
Відомості про мутабільності високополіморфних послідовно-
ності в геномі людини дуже суперечливі. Показано,
проте, що в найбільш вариабильность мінісателітних локусах
частота мутацій може досягати 5% на гамету (Jeffreys et
al., 1988). Передбачається, що однією з головних функцій ги-
перваріабільних мікро-і мінісателітних послідовностей
ДНК може бути контроль гомологічною рекомбінації в мейозі.
На культурах клітин показано стимулюючий вплив Мініс-
теллітних послідовностей ДНК на гомологичную рекомбіна-
цію. Так, інсерцій синтезованою послідовності,
складеної на основі гіперваріабільних минисателлитах в
геномної ДНК призводить до більш, ніж 10-кратному збільшенню
числа реципрокних обмінів, причому ступінь цього впливу про-
ратно пропорційна відстані між STR і сайтом рекомбі-
нації (Wahls et al., 1990). Разом з тим, багато авторів про-
звертати увагу на досить високу стабільність Мініс-
теллітних алелів, що дозволяє їх широко використовувати як
для генетичного маркування, так і для популяційних
досліджень та ідентифікації особистості методом ДНК-фінгерп-
Рінта (Decorte, Cassiman 1993; Edwards et al., 1991; Іва-
нов, 1989).
Для багатьох мутацій, локалізованих в некодуючих
частинах геному, характерні високі рівні популяційного по-
ліморфізма. Необхідно, проте, підкреслити, що ця зрад-
тична не зачіпає загальної структури геному, визначальною
відмінності між видами. Більш того, сопосталеніе первинних
нуклеотидних послідовностей порівняно протяжних
секвенувати ділянок ДНК (області Т-рецепторних генів
довжиною близько 100 кб) виявило збереження високого ступеня
гомології не тільки в кодують, але і, що особливо здивуй-
тельно, в некодуючих частинах цих послідовностей. Якщо
врахувати, що еволюційно чоловік і миша розділені майже 80
мільйонами років еволюції, ці дані розглядаються як сві-
детельствует функціональної значимості некодуючих частин
цих генів Мабуть, далеко не всякі мутації в некодуючих-
чих районах ДНК є нейтральними і в певних слу-
чаях вони можуть негативно впливати на життєздатність. До
жаль, в даний час нічого або майже нічого неиз-
Вестн про функції некодуючих ДНК-послідовностей.
Висловлювалося навіть припущення, що їх єдиною функ-
єю є реплікація. Звідси виникло уявлення про
"Егоїстичної" або "паразитичної" ДНК. Звичайно, повністю
виключити наявність подібних паразитичних послідовник-
ностей ДНК в будь-якому геномі не можна. Тим не менш, представля-
ється малоймовірним, що значна частина генома людини,
також як і інших видів, відноситься до егоїстичної ДНК.
Мабуть, наші знання про роль некодирующей або, як ще
кажуть, "надлишкової" ДНК все ще явно недостатні. Ста-
вважають нестабільність структурної організації генома в межах виду
свідчить скоріше про важливу еволюційної ролі некодуючих-
щих ДНК-послідовностей і про їх участь у процесах он-
патогенезу. Можна припускати, що відповідь на це інтригуюче
питання в якійсь мірі буде отриманий при розшифровці і порів-
нении повної первинної нуклеотидної послідовності гено-
мов у тварин різних видів і, перш за все, у людини і
миші, де прогрес у секвенування генома ДНК особливо
значний (см.главу III). Доречно зауважити, що проведений
недавно комп'ютерний аналіз генома людини дозволяє перед-
вважати наявність в його некодирующей частини особливого, поки ще
незрозумілого генетичного коду, зміст і значення якого
залишаються загадковими (?).
Розділ 2.7 Мобільність геному, облігатні і факульта-
тивні елементи геному.
До цих пір ми розглядали основні структурні еле-
менти геному людини, положення яких відповідно до
уявленнями класичної генетики досить постійно.
Починаючи з 50-х років стали накопичуватися дані про істота-
вання великого числа мобільних генетичних елементів,
присутність яких у геномі не є обов'язковим, а їх
топографія і кількість може варіювати в різних кліть-
ках, тканинах і у різних індивідуумів (McClintock, 1984; Berg,
Howe, 1989). У прокаріотів такі елементи отримали назву
транспозонов. Їх структура і функції досить добре вивчений
печені. Відмінною особливістю мобільних елементів є-
ється здатність існувати як в інтегрованому з хро-
мосом вигляді, так і у вигляді окремих макромолекул - ЕПІС,
плазмід, вірусних частинок. Майже 50 різних сімейств мо-
більних елементів описано у дрозофіли. Разом ці пос-
сті складають близько 12% гаплоїдного набору
(Golubovsky, 1995). У геномі ссавців міститься до 50
000 диспергованих копій ретропозонів LINE розміром близько
6500 пар основанійю. Сімейство Alu-повторів, що містить від
300 до 500 тисяч копій, також належить до мобільних
елементів геному (Сharlesworth et al., 1994). Явище лізоге-
панії, тобто присутність вірусних послідовностей в
складі ДНК людини та наявність фрагментів генів людини в
вірусних геномах, служить одним із прикладів мобільності ДНК і
можливості "горизонтальної" передачі спадково закріплення
лених ознак між видами. Мобільні ДНК, як правило,
відносяться до факультативним елементам. Як вже зазначалося, не
існує чітких меж між облігатними і факультативними
елементами геному, так як може бути взаємний перехід від од-
ного стану до іншого. Структурні локуси або сегменти
хромосом можуть трансформуватися в факультативні елементи
за рахунок ампліфікації, інтеграції в мобільні елементи або
шляхом утворення цитоплазматичних ретротранскріптов. Про-
ратний перехід від факультативних елементів до облігатним здійсню-
ється за допомогою інсерцій, транспозон-індукованих
перебудов і зворотної транскрипції.
Факультативні елементи існують в геномі як популя-
ції інформативних макромолекул. Зміни, що виникають у них
під впливом зовнішніх чинників, носять зовсім інший ха-
рактер порівняно з класичними мутаціями в структурних
локусах. Для опису змін у факультативних елементах
запропонований термін "варіації" (Голубовський, 1985). Цей тер-
хв вперше використаний Жакобом і Воллманом для опису по-
ведення ЕПІС (Jacob, Wollman, 1961). Варіації можуть приво-
дить до змін на генотипической рівні, тобто до мута-
ціям, внаслідок простого переміщення факультативних елементів-
тов чи зсуву в співвідношенні між факультативними і обли-
Гатному елементами. У цих випадках мутації зустрічаються од-
новременно у багатьох індивідуумів. Подібні зміни упо-
дочени, можуть відбуватися відразу в багатьох локусах і відріз-
ються високою сайт-специфічністю. Локалізація структурних
перебудов, які виникають в результаті варіацій, зумовлений-
на початковій топографією факультативних елементів на
хромосомах. І нарешті, самі варіації можуть бути індуковані
звичайними "не-мутагенними" факторами, такими як температура
або міжлінійні кроси (Golubovsky, 1995). Факультативні
елементи можуть розглядатися як оперативна пам'ять гено-
ма, тому що в багатьох випадках спонтанне виникнення мута-
ції в облігатних елементах опосередковано їх активацією. Вва-
шається, зокрема, що но інсерційні мутагенез є
причиною спонтанного виникнення 70% видимих мутацій в
природних популяціях дрозофіли. Однак, у людини поки за-
зареєстовані лише поодинокі випадки виникнення мутацій
внаслідок переміщення мобільних елементів геному (Vidaud et
al., 1993).
Розділ 2.8 ізохорами, метилювання, гіперчутливість
сайти.
Перераховані вище компоненти генома не випадковим обра-
зом пов'язані з послідовностями нуклеотидів. І в цьому
сенсі можна говорити про існування в геномі людини
структур більш високого ієрархічного порядку. Прикладом
служать ізохорами - довгі, у середньому, понад 300 кб сегменти
ДНК, гомогенні по композиції підстав або за GC-рівням.
62% геному складається з GC-бідних ізохорами і в них локалізовано
близько 34% генів, 31% геному представлений GC-багатими ізохорами-
ми, що містять 38% генів, і в 3% ізохорами, збагачених
GC-послідовностями (так званих H3 ізохорами), знахо-
диться 28% генів (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,
1993). Таким чином, існують відносно невеликі
ділянки ДНК, в яких щільність генів в 10 -20 разів вище,
ніж в інших послідовностях.
Іншою загальною рисою геному людини є те, що in
vivo значна частка цитозинових залишків у молекулі ДНК
метиловано, тобто перебуває у формі 5-метілдезоксіціті-
дина. Експериментальне вивчення характеру метилування
грунтується на зіставленні рестрикційних фрагметов, утворю-
щихся після обробки ДНК ендонуклеаза, для яких сайти
впізнавання однакові і містять у своєму складі цитозин, але
діють ці ферменти по-різному, в залежності від того,
знаходиться це підстави в етиловому стані або
немає. Зокрема, рестріктази - Msp1 і Hpa11, дізнаються після-
довність CCGG, але на відміну від Msp1, Hpa11 не розщеплюючи-
ет ДНК в тих сайтах, де внутрішній CpG дінуклеотід мітили-
ваний. Деякі сегменти геному, особливо це стосується
повторюваним послідовностей, повністю метиловані в
місцях 5'-CCGG-3 'і частково метиловані в 5'-GCGC-3' -
сайтах рестрикції для Hha1. В інших сегментах спостерігається
характерний малюнок часткового метилювання в 5'-CCGG-3 '
послідовностях (Behn-Krappa et al., 1991). Різні
індивідууми, незалежно від їх етнічного походження,
практично не розрізняються за характером метилювання ДНК в
одних і тих же типах тканин, тоді як в процесі онтогенія-
тичної диференціювання відбуваються значні зміни
малюнків метилювання. У перещеплюваних культурах клітин опу-
холевой походження число метильованих сайтів різко
зменшено.
Висловлено припущення про наявність прямого зв'язку між
метилюванням ДНК і станом генетичної активності в
клітинах. Існує клас білків, які специфічним про-
разом зв'язуються з метилованими ділянками ДНК, роблячи їх
недоступними для дії низки ферментів, у тому числі, віз-
можна, і для полімераз. Отримано багато прямих експеримен-
тальних доказів ролі метилювання ДНК в інактивації
еукаріотичних промоторів, а, значить, і в регуляції актив-
ності генів. Навпаки, гіпометілірованіе промоторної області
генів, особливо CpG острівців, як правило, свідчить, що
чить про функціональної активності генів. Показано, що
незвичайні структури в молекулі ДНК, також як екзогенна
ДНК, інкорпорована в процесі генетичної трансформа-
ції, нерідко піддаються метилюванні. Відомо, що мети-
лювання грає важливу роль в інактивації X хромосоми у са-
мок, у регуляції експресії генів в процесі розвитку, а
також безпосередньо залучено до феномен хромосомного (ге-
автономних) імпринтингу, пов'язаного з відмінностями пенетрантності
деяких алелів в залежності від їх походження, тобто
проходження через материнський чи батьківський гаметогенез (Ба-
нів, 1991).
У GC-багатих ізохорами локалізовано велика кількість
CpG острівців - послідовностей від 500 до 2000 п.о., ха-
рактеризуються дуже високим вмістом гуаніну і цитозину
(G + C> 60%), представлених у вигляді кластерів Неметиловані-
них CpG дуплетів і, так званих, G / C боксів - локусів,
родинних сайту впізнавання для одного з транскрипційних
факторів Sp1 - (G) 4C (G) 4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;
Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова містять багато сайтів
впізнавання для чутливої до метилюванні ендонуклеази
HpaII, а також сайти для редкощепящіх рестриктаз, котрі дізнаються
Неметиловані CpG дуплети. Зокрема, більше 80%
Nor1-сайтів пов'язано з CpG-багатими острівцями. Як правило,
CpG острівці локалізовані в 5'-фланкують послідовник-
ності, 5'-зкзонах і 5-інтрони всіх вивчених хаузкі-
пінг-генів і 40% тканиноспецифічною генів. CpG острівці яв-
ляють характерною особливістю транскрипційного ділянок
геному. Їх ідентифікація в клонованих послідовностях
геномних бібліотек істотно полегшує пошук конкретних
структурних генів (див.розділ 2.4). Найбільша щільність CpG
острівців спостерігається в теломерна ділянках хромосом 1, 9,
15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis, 1994). Точні молекуляр-
тивні методи реєстрації СрG острівців показали, що їх число
в геномі людини наближається до 45000 (
Antequera, Bird, 1993).
Можна також відзначити існування в геномі людини
сайтів, гіперчутливість до діючої ДНК-ази 1 і структур-
але відрізняються від основної маси хроматину. Присутність та-
ких сайтів показано для багатьох генів ссавців і, по-ви-
дімому, це необхідна, але не достатня умова їх
експресії. Локалізація гіперчутливою сайтів може ме-
няться в процесі розвитку і під дією гормонів. У недо-
торих випадках ці ділянки маркують положення транскрипційно-
них регуляторних елементів геному, що діють як в поклади-
вальному, так і в негативному напрямках. В інших випад-
ях це області функціонально активних генів, що знаходяться в
деспіралізованном стані і мають однониткову структуру.
Саме такі однониткових ділянки ДНК особливо виска чутливих-
тельно до ДНК-азе 1. На цьому їх властивості заснований метод
нік-трансляції in situ, що дозволяє безпосередньо на хро-
мосомних препаратах візуалізувати функціонально активні
райони хромосом. З цією метою хромосомні препарати обро-
робляють ДНК-Азою 1, після чого безпосередньо на них з по-
міццю ДНК-полімерази проводять синтез ДНК в присутності мечі-
них нуклеотидів. При цьому мітка включається переважно
тільки в ті ділянки хромосом, де знаходяться функціонально ак-
тивні гени (Verma, Babu, 1989).
ГЛАВА YIII.
БІОЛОГІЧНІ МОДЕЛІ СПАДКОВИХ ХВОРОБ ЛЮДИНИ.
Розділ 8.1. Генетичні лінії тварин.
Велика роль у дослідженні проблем генетики челове-
ка та медичної генетики належить мутантним генетичним
лініях тварин і, особливо, генетичним лініях мишей
(Конюхов, 1969, 1980; Корочкін, 1978). Високий відсоток
подібності за нуклеотидними послідовностей між кодую-
щими, регуляторними та навіть интронами областями гомологічних
генів ссавців і людини, а також наявність великої
числа консервативних груп зчеплення з ідентичним расположе-
ням генів поряд з можливостями використання дуже потужних
експериментальних підходів для ідентифікації і клонування
генів лінійних тварин дозволяють проводити паралельні
дослідження, значно прискорюють ефективність пошуку і
молекулярного аналізу індивідуальних генів людини.
Для багатьох моногенних захворювань людини тварини,
несучі мутації в генах гомологічних, є кращими, а
часто і єдиними моделями для дослідження молеку-
лярних основ патогенезу та відпрацювання оптимальних схем ліку-
ня, в тому числі і з застосуванням методів генної терапії
(См.главу IX). Пошук таких біологічних моделей, перш
за все, ведеться, серед вже існуючих генетичних ліній
тварин з встановленим типом успадкування певних
аномальних ознак. Найбільш важким при цьому є до-
казательств ідентичності мутантних генів і, відповідно
первинних біохімічних дефектів, у людини і у лінійних
тварин.
У різних розплідниках світу, в тому числі і в Росії,
створені та підтримуються кллекціі, що налічують від десятків
до декілька сотень генетичних ліній різних експеримен-
тальних тварин - мишей, щурів, кролів, собак та ін (Коню-
хов, 1969; 1980; Staat, 1969; Hogan et al, 1989; Бландова і
ін, 1990). Серед них генетичні лінії мишей найбільш мно-
гочіслени в першу чергу через високу плодючості,
зручності змісту, відносній легкості експери-
ного маніпулювання і цілого ряду інших причин. Деякі
з цих ліній являють собою випадкові знахідки, інші,
а їх більшість, отримані в результаті дії різних
мутагенних факторів. Так, значне число біологічних
моделей було отримано шляхом біохімічної селекції потомства
мишей самців, оброблених сильними мутагенами - етілнітроз-
сечовиною, тріетіленмеламіном або опромінених Рентгеном. Так
були змодельовані на мишах альфа-таласемія, поліцитемія,
нирковий ацидоз (Erickson, 1988). Проте, такий спосіб напів-
чення тварин-моделей, хоча і більш ефективний, ніж пошук
спонтанно мутованих особин, також заснований на чистій слу-
вості і не дозволяє направлено міняти структуру потрібного
гена.
Процес створення подібних генетичних ліній зазвичай
включає відбір особин з фенотипическими відхиленнями; аналіз
успадкування цих фенотіпческіх ознак; тривалий поблизу-
кородственное розведення відселектований особин. При моно-
генному успадкування такі лінії можуть або цілком складатися
з мутантних гомозигот, або підтримуватися через гетерозі-
Готня особин у разі зниженої життєздатності та порушення
ня родючості у гомозигот.
На першому етапі пошуку адекватної моделі будь-якого
моногенних спадкових захворювань керуються
подібністю клінічних проявів перебігу хвороби і фенотипом
мутантних тварин. Проте, одного цього подібності недоста-
точно (Конюхов, 1969). Необхідно довести гомологічного
генотипической природи спостережуваних порушень, тобто доку-
мовити, що у людини і у тварин (мишей) фенотипічні з-
менения обумовлені мутаціями в гомологічних генах. Величезна
світова генетична колекція мишей насчітивет кілька
сотень ліній, у кожній з яких різні дефекти спадщини-
ються за моногенними типу. Спонтанні біологічні моделі
спадкових хвороб відомі й досить повно вивчені
для багатьох інших експериментальних і домашніх тварин.
Видається дивним, що, незважаючи на велику
схожість геномів ссавців і наявність близьких за привчає-
ної структурі і тотожних за функціями структурних генів,
для значної частини спадкових хвороб людини ге-
нетической аналоги серед тварин до цих пір не знайдені (Ко-
нюхов, 1969).
Це обмеження в даний час може бути преодалено
шляхом цілеспрямованого конструювання генетичних модель-
них ліній тварин. Експериментальні основи такого підходу
вже добре розроблені (Erickson, 1988; Аллен і ін, 1990;
Melton, 1993; Stewart et al., 1994). Для цього використовують
техніку культивування та трансфекції ембріональних стовбур-
вих клітин (див. нижче), відбір in vitro клонів з потрібними генет-
ного змінами і пересадку їх у зародки або в сомати-
ческие тканини тварин. Для аналізу експресії мутантних ге-
нов in vivo та оцінки їх біологічної дії особливо
зручними виявилися трансгенні тварини.
Розділ 8.2. Трансгенні тварини.
Трансгенних тварин одержують у результаті штучного-
ного введення - трансгенозу, чужорідного генетичного мате-
ріалу, що представляє з себе фрагмент гена чи іншу після-
послідовності ДНК, в запліднену яйцеклітину або в ранні
зародки ссавців. Подібні моделі є ідеальними
експериментальними системами для дослідження молекуляр-
но-генетичних основ онтогенезу, для вивчення функції чуже-
рідного гена, оцінки його біологічної дії на орга-
нізм, а також для виробництва різних маніпуляцій зі спе-
цифические клітинними клонами in vivo. Розроблено неяк-
до способів отримання трансгенних тварин. Історично бо-
леї раннім і широко застосовуваним до теперішнього часу є-
ється мікроіньекція чужорідної ДНК в пронуклеус - ядро опло-
дотворенной яйцеклітини. Існують детальні описи цього
методу (Аллен та ін, 1990; Hogan et al, 1989). Суть методу
полягає в тому, що під контролем мікроскопа за допомогою мік-
романіпулятора в чоловічій пронуклеус заплідненої яйцек-
льотки тонкою голкою (до 1 мікрона) вводять близько 2 піколітрів
розчину ДНК. Чужорідна ДНК, спочатку вільно лежить в
нуклеоплазмі, протягом кількох наступних поділів дроб-
лення випадковим чином інтегрує в один із сайтів ка-
кой-небудь хромосоми, тобто вбудовується в ДНК-реципієнта.
При цьому, як показали експерименти з міченої ДНК, у різних
них бластомерах одного і того ж дробиться зародка інтег-
рація може відбуватися в різні хромсомние сайти і число
інтегрованих копій ДНК в кожному з цих сайтів може зна-
ключно варіювати. Тим не менш, оскільки сам ембріон
розвивається, по-суті, з одного бластомери, у всіх клітинах
такої особи після народження чужорідна ДНК зазвичай знаходиться
тільки в одному якому-небудь хромосомному сайті, хоча в різних
особин вона інтегрується по-різному і в різні сайти. Після
введення чужорідної ДНК в пронуклеус яйцеклітину транспланто-
руют самці-реципієнту. Частка трансгенних тварин у потомстві
таких самок варіює від 10% до 30%. Це означає, що по-
добние механічний варіант трансфекції чужорідних генів на
ранній стадії ембріогенезу є надзвичайно ефективним.
Ідентифікацію трансгенних тварин виробляють шляхом аналізу
геномної ДНК на наявність екзогенних послідовностей, вико-
товуючи при цьому методи блот-гібридизації або ПЛР. Експрес-
цю введеного гена аналізують шляхом ідентифікації специфі-
чних мРНК і / або відповідних білкових продуктів в раз-
особистих тканинах трансгенної тварини.
Інший, більш прогресивніший спосіб отримання
трансгенних тварин заснований на тому, що трансфекції подвер-
нується НЕ зигота, а тотипотентності ембріональні стовбурові
клітини (див. нижче), які потім трансплантують в порожнину
бластоцисти (Gardner, 1978). Цей метод і його вирішальні перева-
важливіших конкурентних переваг в плані генетичного моделювання докладно
розглянуті в розділі 8.4.
Як правило, іньецірованная ДНК при вбудовуванні в хро-
мосому утворює блок з безлічі тандемної розташованих ко-
пий, при цьому число одиниць повтору в блоці у різних
особин може варіювати від одиниці до кількох сотень.
Після інтеграції введеної ДНК у хромосому різні генети-
етичні конструкції стійкі і стабільно передаються по-
томству відповідно до законів Менделя. Вбудовування вве-
денной ДНК у функціонально значимі області генома може
призводити до їх дестабілізації і супроводжуватися появою
мутацій, спектр яких дуже різноманітний. Таким чином,
тварини, одержані при введенні одного і того ж гена, бу-
дуть відрізнятися як по сайтах інтеграції, так і за кількістю-
ву копій вбудованої чужорідної ДНК, а в деяких випадках,
за рівнем мутабільності і за типами індукованих мутацій.
Таким чином, кожне трансгенна тварина в цьому сенсі
унікально.
Трансгенні тварини є надзвичайно зручним обь-
єктом для аналізу ролі окремих елементів гена в регуляції
його роботи. Так, зіставлення характеру експресії введений-
ного гена у тварин, що розрізняються по довжині фланнкірующіх
послідовностей іньецірованной ДНК, дає можливість про-
зовні елементи гена, контролюючі його роботу в різних
типах тканин. Для полегшення аналізу регуляторних послідовно-
ності гена часто вводять генетичні конструкції, соче-
тануть ці елементи з геном-репортером, експресія якого
виражається в появі відомої і легко обумовленою фер-
ментатівной активності. Використання для трансгенозу реком-
бінантних молекул ДНК, що представляють собою різні комбі-
нації регуляторних елементів і кодують послідовності-
тей, веде до глибшого розуміння молекулярних механіз-
мов активації генів у різних типах тканин.
Як вже вказувалося, випадковий характер інтеграції чуже-
рідний ДНК нерідко індукує мутації і порушує експресію
нормальних генів реципієнта. У ряді випадків спостерігаються отк-
лоненія у розвитку виявляються аналогічними або схожими з
вже відомими спадковими порушеннями у людини і по-
добние тварини також можуть використовуватися в якості гені-
тичних моделей захворювань. Цей підхід був застосований для
отримання моделей таких захворювань, у патогенезі яких
вирішальну роль відіграє ефект дози генів. Зокрема, шляхом
трансфекції зиготи мишей генами бета-глобіну, колагену, ре-
нина, антигенів гістосумісності вдалося отримати біологи-
етичні моделі таких захворювань, як бета-таласемія, нез-
фітосанітар остеогенез, гіпертонія і діабет, відповідно
(Erickson, 1988). У всіх перерахованих випадках введення до-
навчої дози експресованого гена призводило до порушення-
нію балланса білкових генопродуктов в клітинах і, як следс-
твіє цього, було причиною патологічних процесів.
Розділ 8.3. Експериментальне моделювання.
Інший варіант біологічного моделювання заснований на
отриманні тварин з певними дуже специфічними, але
неспадкових змінами. Ці тварини також можуть бути
використані для аналізу молекулярних основ патогенезу та
розробки методів адекватного лікування. Розглянемо кілька
прикладів подібного експериментального моделювання.
Описана технологія трансгенозу (введення генів у про-
Нуклеус) може бути використана, зокрема, для направ-
ленного отримання тварин з виборчими дефектами
(Каліцтвами) тих чи інших тканин і органів. Метод укладає-
ся в можливості селективної елімінації тих специфічних
типів клітин, які відсутні або дефектні у хворих з
модельованим типом захворювання. Такі тварини можуть бути
отримані при ін'єкції в зародок рекомбінантної ДНК, утримуючи-
щей який-небудь цитотоксичний ген, наприклад, ген дифтерії-
ного токсину, що знаходиться під контролем працюють у визна-
лених типах клітин регуляторних елементів ДНК. При активу-
ції цих контролюючих елементів на определеной стадії раз-
витія експресія токсичного гена призводить до виборчої
загибелі всієї специфічної популяції клітин, тобто така
система діє як дуже точний скальпель.
Подальша модифікація методу полягає в використан-
нии для трансгенозу умовно летального гена, яким є,
наприклад, ген тимідинкінази вірусу Герпесу. Клітини,
експресують цей ген, функціонують абсолютно нормаль-
але. Однак, на будь-якій стадії онтогенетичного розвитку можна
викликати їх селективну загибель при введенні тварині ганцік-
ловіра - протигерпесний препарату. Ця система дає біль-
ше можливостей для експериментального аналізу ролі специфі-
чних клонів клітин у процесі нормального розвитку, а так-
ж для вивчення патологічекіх процесів, пов'язаних з загибеллю
цих клітин. Подібна методологія використовується також при
розробці генотерапевтіческіх підходів для лікування некото-
яких неспадкових, зокрема онкологічних захворювань-
ний (см Главу IX).
Дуже багатообіцяючим методом моделювання представля-
ється спрямоване вимкнення роботи певних генів шляхом
введення в доімплантаційної зародки антисенсових мРНК.
Такий підхід був застосований, зокрема, при спробі моделі-
вання хвороби Гоше - лізосомного захворювання, обумовлений-
ного дефіцитом бета-глюкуронідази (Bevilacqua et al., 1988).
Природно, що в цьому випадку вимкнення експресії гена
носить транзиторний характер, тобто моделлю, по-суті, є по-
ється саме тварина - реципієнт антисмислової мРНК матриці.
Інший приклад експериментального моделювання заснований
на пересадці тканин або клітин атімусним імунодефіцитним
мишам nu / nu. У мишей цієї лінії у зв'язку з відсутністю тимуса
і вираженим вродженим імунодефіцитом не відбувається оттор-
ються трансплантованих чужорідних тканин. Більше того, у
таких тварин може відбуватися диференціювання трансплан-
тованої підшкірно ембріональних зачатків і регенерація пе-
ресаженних шматочків тканин з різних органів інших видів
тварин і людини. Так наприклад, шматочки трахеї щури з
нанесеними на них клітинами бронхогенного епітелію людини,
імплантовані підшкірно атімусним мишам, формують струк-
туру поверхневого епітелію, схожу з тією, яка є
в бронхах людини. Саме таким шляхом миші nu / nu були ак-
тивно використані для аналізу експресії мутантних варіанта
тов гена муковісцидозу людини, а також для випробування еф-
бництва корекції цього генетичного дефекту за допомогою
методів генотерапії. В останньому випадку мутантні епітелію-
альні клітини пацієнтів з муковісцидозом спочатку піддавали
трансфекції ретровірусними або аденовірусні векторами, не-
сущими, поряд з геном - репортером, повнорозмірну кДНК
нормального гена муковісцидозу. Відносна простота по-
добние моделей і можливість генетичного маніпулювання з
клітинами людини до їх трансплантації атімусним мишам справи-
ють цей підхід вельми привабливим для вирішення багатьох
експериментальних питань. Основні недоліки таких моді-
лей пов'язані з труднощами утримання та розведення атімусних
мишей та їх низькою життєздатністю. Генетичні лінії жи-
Вотня в цьому відношенні мають значні переваги.
Розділ 8.4. Конструювання модельних генетичних ли-
ний тварин.
Сучасний рівень експериментальної ембріології мле-
копітающіх і сучасні досягнення молекулярної генетики
дозволяють здійснювати спрямоване отримання генетичних
моделей спадкових хвороб шляхом введення сайт-специфічні-
чних модифікацій в геном ссавців. Такий значний
якісний прорив у генетичному моделюванні став можл-
дружин завдяки появі принципово нової технології мані-
пулірованія з ранніми зародками ссавців. Особливо
важливими в цьому відношенні виявилися два нових методичних
підходу: отримання зародків-химер, що складаються з клітинних
клонів різних зигот, шляхом введення тотипотентності клітин в
порожнину бластоцисти (Gardner, 1978) і розробка технології
культивування клітинних векторів, так званих ембріо-
нальних стовбурових клітин (Evans, Kaufman, 1981). З іншого
боку, з'явилися методи сайт-специфічного перенесення кло-
ваних послідовностей ДНК в геном еукаріот, осно-
ванні на відборі клітинних клонів, у яких після трансфек-
ції відбувається інсерцій екзогенної ДНК в гомологічних сайті
геномної ДНК без якого-небудь порушення послідовності
ДНК в місці вбудовування.
Конструювання генетичних моделей повинні предшеств-
вать ідентифікація та порівняльний аналіз двох гетерологіч-
них генів - гена людини, внаслідок порушення роботи кото-
рого розвивається моделируемое захворювання, і його гомолога у
обраного для моделювання тварини. При виборі об'єкта
моделювання, в першу чергу, керуються методичними-
кими можливостями експериментального маніпулювання з жи-
Вотня. Важливе значення має схожість кодують областей
гетерологічних генів по нуклеотидним послідовностей. У
більшості випадків миші представляються найбільш зручним
обьектом для моделювання. Сучасний алгоритм формуванні-
ня генетичної лінії тварин з мутаціями в гені заданому
передбачає: (1) наявність культур тотипотентності, тобто
здатних до необмеженого розвитку і диференціювання, емб-
ріональних стовбурових клітин; (2) створення на базі рекомбі-
рекомбінантних ДНК генно-інженерних конструкцій для спрямованого
переносу генів; (3) трансфекції цих конструкцій у культури
ембріональних стовбурових клітин наступним скринінгом і від-
бором клонів зі специфічними генетичними модифікаціями;
(4) введення відібраних модифікованих клітин у зародок на
стадії бластоцисти за методом Гарднера з метою отримання хі-
мірних трансгенних тварин; (5) відбір химерних особин, не-
сущих модифіковані гени в різних тканинах і органах;
(6) селекцію особин, гетерозиготних за даної мутації; (7)
інбредних розведення і селекцію гомозигот (рис.8.1).
Як згадувалося раніше, ідеальною системою для направ-
ленного перенесення мутацій в геном ссавців є емб-
ріональние стовбурові клітини - ЕСК (Evans, Kaufman, 1981;
Erickson, 1988; Labosky et al., 1994). Первинні культури
цих клітин отримують з клітин бластоцисти (внутрішньої кле-
точної маси) або з первинних статевих клітин ранніх пос-
тімплантаціонних зародків. При вирощуванні на поживному
шарі з ембріональних фібробластів ЕСК зберігаються в недіф-
ференцірованном стані від трьох місяців до року. При цьому
вони можуть бути кілька разів заморожені і відтанула без втрати
здібності до диференціювання. ЕСК, введені в бластоцель
(Порожнина бластоцисти), зберігають свою тотіпотентность і мо-
гут брати участь у формуванні, практично, всіх ембріо-
нальних зачатків і органів зародка. У ре-
док утворюється тварина - химера, що складається з клеточ-
них клонів двох різних типів: клітин вихідного батьківського
генотипу і ЕСК. Якщо ці клітини різняться, наприклад, по
генам забарвлення шерсті, тварина - химера буде мати попереч-
ву або плямисту забарвленість. При цьому всі тварини, неза-
лежно чином отримані в результаті введення в однаковий-
ші за генотипом зародки однієї і тієї ж лінії клітин, будуть
відрізнятися один від одного за характером плямистості, так як
всі химери різні по набору клітинних клонів, що розвилися
і диференціюватися з введених в зародок ЕСК. Химерні
тварини, у яких ЕСК диференціювалися в статеві клітини
і дали початок повноцінним зрілим гаметам стійко пе-
передавати своїм нащадкам генетичну інформацію, що містить-
ся в ЕСК. Таких тварин інгда називають зародковими транс-
Міттер. При схрещуванні їх з мишами дикого типу частина по-
Томко буде вже гетерозиготна за мутантним генам ЕСК, то
Тобто будуть нести мутацію в гаплоїдному стані в кожному ти-
пе клітин. Це в рівній мірі відноситься і до мутацій, вико-
штучного введеним попередньо в ЕСК. Схрещуючи таких
гетерозигот, можна отримати тварин, гомозиготних за заданий-
ної мутації. Природно, останнє можна досягти тільки в тому
випадку, якщо мутація не виявиться летальної в гомозиготному
стані у тварин цього виду.
Можливість вести селекцію потрібних мутантних або
трансгенних клонів ЕСК і лише потім їх використовувати в ка-
честве клітинних векторів знайшло широке застосування в генети-
зації моделюванні. Спочатку для цієї мети ЕСК обра-
бативает різними мутагенами (етілнітрозомочевіной) відби-
рали клони клітин, які несуть мутацію в гені потрібному, і потім
використовували їх для створення ін'єкційних химер по Гарднера.
Таким способом на мишах була отримана модель хвороби Леш-Ні-
хана - мутація гена гіпоксантин-фосфорібозіл-трансферази
(Hooper et al., 1987). C розробкою технології адресної
доставки чужорідної ДНК в гени-мішені цей спосіб генети-
тичного моделювання став особливо ефективним. Сайт-спеці-
чних модифікація генів ЕСК досягається за рахунок Гомоле-
гічної рекомбінації між екзогенної та хромосомної ДНК. При
трансфекції велика частина проникли в ядра молекул рекомбі-
рекомбінантних ДНК зберігається там протягом двох-трьох днів у вигляді
кільцевих ЕПІС і надалі втрачається або відбувається ін-
теграція трансфецірующей плазміди в геном клітини-господаря
шляхом негомологичностью рекомбінації, тобто у випадкові сайти
хромосомної ДНК. У таких клітинах експресія введених генів
стійко зберігається. Частота інтеграції екзогенної ДНК мо-
жет бути підвищена при використанні лінійних плазмід і спе-
ціальних, переважно, ретровірусних векторів екзогенної
ДНК (див. Главу IX). Випадки стабільної інтеграції екзогенної
ДНК можуть бути легко виявлені, якщо трансфецірующіе плазміди
або вектора містять селектіруемий маркерний ген. Найчастіше
в якості маркера використовують прокаріотичних ген neo, зі-
спілкується клітинам стійкість до неоміцину. Клітки, в яких
сталася інтеграції такої плазміди в хромосомну ДНК, будуть
утворювати стійкі клони при вирощуванні на середовищі G418,
містить неоміцин, в той час як всі інші клони клітин
будуть в цих умовах деградувати.
Розділ 8.5. Методи направленого перенесення генів.
Найбільш важливим кроком на шляху штучного отримання
мутантної лінії тварин є відбір клонів ЕСК з
сайт-специфічної модифікацією певного гена. Однак,
випадки інсерцій екзогенної ДНК в ген-мішень дуже рідкісні, їх
загальна частота, зазвичай, не перевищує 10-6. Робляться
спроби генетичної модифікації ЕСК з тим, щоб підвищити в
них частоту гомологічної рекомбінації. Ідентифіковано не-
які гени, які контролюють цей процес у мишей і у чоло-
століття. Проте, в будь-якому випадку схеми спрямованої модифікації
генів повинні включати селекцію потрібних клонів клітин. Вперше
спрямована сайт-специфічна модифікація була виконана
також на гені гіпоксантин-фосфорібозіл-трансферази (див. вище)
і була отримана ще одна генетична лінія мишей, моделював
ющая викликану дефектом у HPRT-гені хвороба Леш-Ніхана у че-
людини (Thomas, Capecci, 1987). Успіх цих досліджень, в
першу чергу, обумовлений існуванням простих схем відбирання-
ра клітин з функціонуючим і функціонуючі HPRT-геном
на селективних середовищах. Важливо також, що цей ген локалізований
в X-хромосомі і в ХУ-клітинах він представлений однією копією.
За цих умов випадки модифікації гена, викликані інсер-
єю екзогенної ДНК в правильному положенні, легко ідентифі-
ціруются - рис.8.1 (див. Главу X).
В даний час запропоновано декілька варіантів для
направленого перенесення неселектіруемих генів за рахунок додат-
чої інсерцій в трансфецірующую плазміду селектіруемого
маркерного гена в такому положенні, при якому його експрес-
ся відбувається переважно при правильному вбудовуванні
векторної послідовності в ген-мішень (рис.8.2). Так,
маркерний ген neo, поміщений в інсертіруемую область ДНК
плазміди без власного промотора, може експресуватися
тільки перебуваючи під контролем якого-небудь іншого промотора
хромосомної ДНК. Для цього інсерцій екзогенної ДНК повинна
відбутися в область гена-мішені без зсуву рамки зчитування.
При випадковому інтеграції експресії маркерного гена не буде
Таким чином, відбір неоміцин-стійких клітин призведе до
різкого збільшення частоти клонів, у яких відбулася гомо-
логічна рекомбінація між зкзогенной і геномної ДНК. На
цьому ж принципі грунтується використання генетичних конс-
інструкцію з геном neo, що не містить полі-А послідовності
в 3 'області. Подальший пошук гомологічних рекомбінантів
серед G418-стійких клітин проводять шляхом блот-гибрідизуючою-
ції, використовуючи як ДНК-зонда фрагмент векторної пос-
ледовательно, розташований поза направлено стерпного
ділянки екзогенної ДНК.
Особливо перспективним на сьогоднішній день представля-
ється метод позитивно-негативної селекції (Melton, 1994). Ме-
тод поєднує відбір клітин, у яких відбулася інтеграція
екзогенної ДНК, з селективної елімінацією тих з них, де
вбудовування відбулося за рахунок негомологичностью рекомбінації.
Для цього маркерний селектіруемий ген neo з регуляторними
послідовностями інсертіруют в стерпну область ДНК
плазміди, а поза цією областю вбудовують умовно летальний
вірусний ген тимідинкінази герпесу (HSV-tk). При інтеграції
такого вектора в геномної ДНК шляхом гомологічною рекомбіна-
ції HSV-tk ген не инкорпорируется в хромосому, тоді як при
негомологичностью рекомбінації цей ген буде присутній в
неоміцин-стійких клітинах. Обробка таких клітин протидії
герпісним агентом - ганцикловіром, буде супроводжуватися ги-
білизні всіх клонів, які експресують вірусну тимідинкіназу
(Ріс.8.3).
Відбір клітин з модифікованим геном також може про-
ватись за допомогою ПЛР. При цьому не використовують будь-які
маркерні гени та / або селектіруемие середовища. Олігопраймери для
ампліфікації вибирають таким чином, що один з них Гомоле-
гічен сусідній з сайтом інтеграції послідовності моди-
фіціруемого гена, а інший відповідає ділянці інсертіруе-
мій екзогенної ДНК (Ріс.8.4). Метод дозволяє виявляти
присутність п'яти правильно модифікованих клітин серед
50 000. Після трансфекції клітини розділяються на групи, в
кожній з яких проводять тестування за допомогою ПЛР. При
позитивній відповіді групу клітин розбивають на підгрупи і
процедуру повторюють до тих пір, поки не вдається ізолювати
потрібні клони.
Направлене вимикання генів-мішеней може бути досяг-
нуто декількома способами. Так звані, нульові мутації
можуть бути отримані шляхом вбудовування плазміди, що містить,
поряд з екзонами послідовностями модифікує гена
і селектіруемим маркерним геном, сильні транскрипційні і
трансляційні стоп-сигнали. При цьому в зруйнованому за рахунок
інсерцій екзоні транскрипція припиняється, в результаті чого
утворюється укорочений білок, незахищений від дії кле-
точних протеаз.
Більш досконалою є розроблена нещодавно техніч-
ка подвійний заміни гена. Для цього використовують ЕСК, дефіцитні
по ферменту HPRT - НМ1 (Melton, 1994). На першому етапі
ген-мішень інактивують шляхом заміни одного з екзонів і
прилеглих послідовностей на HPRT міні-ген. При цьому в
нокаутуючий векторі HPRT маркер фланкируются ДНК пос-
сті, гомологічними місцем вставки в ДНК гена-Міші-
ні. У цей же вектор включений і ген вірусної тимідинкінази
(Ріс.8.5). Після трансфекції відбираються клітини позитивні по
HPRT і негативні за вірусною тимідин-кінази. Саме в таких
клітинах з високим ступенем ймовірності сталася гомологічен-
ва рекомбінація з заміною одного з екзонів на інсертіро-
ний міні-ген HPRT. Факт такого вбудовування доводиться
за допомогою ПЛР. На наступному етапі інсертірованний HPRT мі-
ні-ген замінюють на відсутній фрагмент гена-мішені, в ко-
торий попередньо вносять цікавлять дослідника мута-
ції. При цьому альтернативний вектор несе ті ж фланкирующие
ДНК-последоваельності гена-мішені, що і перший (нокаутую-
щий) вектор. Клітини HPRT мінус на цьому, 2 - му етапі з великою
ймовірністю будуть нести гомологичную рекомбінацію вбудований-
струкції міні-HPRT гена і альтернативного фрагмента
вихідного гена. Факт такої рекомбінації контролюється з по-
міццю ПЛР. Таким чином, замість звичайного вимикання функції
гена, що досягається вже на 1-му етапі, дана технологія
дозволяє вносити в структуру гена дикого типу різні,
заздалегідь сплановані зміни, в тому числі і специфічні-
кі мутації, аналогічні таким при спадкових хворобах
у людини. Отже, даний підхід дозволяє проводити
більш тонке генетичне моделювання та досліджувати осо-
вості функції мутантного гена in vivo.
Для введення специфічних мутацій у визначені екзо-
ни гена використовують, так звані "hit & run" вектори (Has-
ty et al., 1991). Перспективним також видається викорис-
тання дріжджових YAC-векторів, несучих повнорозмірні
кДНК-ові послідовності гена. Так як рівень Гомоле-
гічної рекомбінації у дріжджів досить високий, у такі
конструкції легко вводити специфічні мутації і потім ис-
використовувати їх для трансфекції ЕСК і отримання трансгенних
тварин 4.
Відбір клонів ембріональних стовбурових клітин, в яких
сталася спрямована модифікація гена-мішені, в значній-
ною мірою, зумовлює успіх всього комплексу робіт з
створення модельної генетичної лінії. Однак, і подальші
етапи цієї програми, що включають отримання химерних транс-
генних тварин, ідентифікацію зародкових трансмітерів
(Химер, які продукують трансфецірованние статеві клітини) і
селекцію гетерозиготних, а потім гомозиготних мутантних осо-
бий, вимагають великої кваліфікації, праці і часу. Ускладнять-
ючим обставиною є те, що химерні тварини не-
рідко мають знижену життєздатність і плодючість. Те ж
може бути справедливо і щодо гетерозиготних мутант-
них особин. У гомозиготному стані інсертірованние мутації
можуть не тільки знижувати життєздатність і плодючість, але
і мати летальним або полулетальной ефектом вже в дебати-
тальному періоді. У такому випадку лінія підтримується шляхом
відбору та схрещування гетерозигот.
Незважаючи на величезні методичні складнощі і високу
вартість, спрямоване отримання моделей спадкових бо-
корисної виправдовує витрачені зусилля. Мутантні тварини
представляють унікальну можливість дослідити патофізіоло-
гические процеси, які розвиваються в організмі внаслідок на-
обвалень роботи певного гена, аналізувати вплив
специфічних мутацій на фенотип, тестувати нові лекарс-
ничих препарати і випробовувати різні терапевтичні
підходи. Велика також роль генетичних ліній у розробці
методів генної терапії (див. Главу IX).
ГЛАВА IY.
ТИПИ І НОМЕНКЛАТУРА Мутації. МЕТОДИ ДНК-ДІАГНОСТИКИ.
Розділ 4.1 Мутантні алелі, характеристика і типи му-
Тацій.
Кожен генетичний локус характеризується певним
рівнем мінливості, тобто присутністю різних алелів
або варіантів послідовностей ДНК у різних індивідуумів.
Стосовно до гену, алелі поділяються на дві групи -
нормальні, або алелі дикого типу, при яких функція гена
не порушена, і мутантні, що призводять до порушення роботи ге-
на. У будь-яких популяціях і для будь-яких генів алелі дикого типу
є переважаючими. Під мутацією розуміють всі зміни
в послідовності ДНК, незалежно від їх локалізації та
впливу на життєздатність особини. Таким чином, поняття
мутації є більш широким порівняно з поняттям му-
тантного алеля. Доречно, однак, зауважити, що в науковій
літературі порівняно часто зустрічаються в популяціях ва-
риант послідовностей генів, що не приводять до помітних
порушень функцій, зазвичай розглядаються як нейтральні
мутації або поліморфізми, тоді як поняття "мутація" і "му-
тантний аллель "часто вживаються як синоніми.
Як згадувалося раніше, різні зміни в нуклеотид-
ної послідовності транскрипційного областей ДНК можуть
по-різному проявлятися у фенотипі. Частина з них не надає
ніякого впливу на структуру і функцію відповідного
білка. Прикладом можуть служити заміни нуклеотидів, не приво-
дящіе до заміни амінокислот у силу вирожденність генетично-
го коду. Мутантні алелі, у свою чергу, можуть бути під-
розділені на три класи: (1) мутації, що ведуть до повної поті-
ре функції (loss-of-function), (2) мутації, що супроводжуються
кількісними змінами відповідних мРНК і первинних
білкових продуктів і (3) домінантно-негативні мутації,
міняють, білкових субодиниць таким чином, що вони
надають пошкоджуючий ефект на життєздатність або функ-
ня експресують типів клітин (gain-of-function
мутації). Найбільшим ушкоджує, мають мута-
ції, що призводять або до утворення безглуздого білка, чи-
бо до передчасного закінчення його синтезу, тобто делеції
або інсерцій, не кратні трьом нуклеотидам і тому викликаю-
щие зсув рамки зчитування, а також нонсенс мутації - заміни
нуклеотидів, при яких утворюються терминируются стоп-кодо-
ни. Прояв таких мутацій залежить від їх внутрігенной ло-
калізаціі. Чим ближче мутації до 5 'кінця гена, тобто до на-
чалу транскрипції, тим коротше їх білкові продукти. Такі
абортивні (truncated) білки нездатні до модифікацій і
швидко деградують.
Фенотипическое прояв замін нуклеотидів в кодо-
нах, так нназиваемих міссенс мутацій, залежить від природи
відповідних амінокислотних замін в білку і від функціо-
нальної значущості того домену, в якому це відбулося.
Так, заміни амінокислот у активних центрах білків можуть соп-
ровождается повною втратою його функціональної активності,
тоді як навіть значно більш серйозні порушення в дру-
гих частинах білка часто надають істотно менший вплив
на фенотип. Мутації на стику екзонів і інтронів (так назива-
емие сплайсінговие мутації) часто порушують процесинг пер-
ведення первинного РНК-транскрипту, в результаті чого відбувається або
неправильне вирізання відповідної інтронів області та
трансляція безглуздого подовженого білка, не захищеного
від протеолитического дії внутрішньоклітинних ферментів, чи-
бо вирізання екзонів та освіта делетірованного білка. У
обох випадках сплайсінговие мутації, як правило, який здатний надавати
люють важкий перебіг хвороби. Порушення в регуляторних про-
ластах генів супроводжуються кількісними змінами
відповідного продукту та не зачіпають структури і функ-
ціональної активності білка. Прояв таких мутацій визна-
значається, в кінцевому рахунку, пороговим рівнем концентрації
білка, при якому його функція ще зберігається. Як правило,
регуляторні мутації менш серйозні і мають більш ви-
женним плейотропних (множинні) ефектом в порівнянні з
мутаціями структурних генів.
Відносно недавно виявлений новий клас так званих
динамічних мутацій, або мутацій експансії, пов'язаних з
нестабільністю числа трінуклеотідних повторів у функціо-
нально значущих частинах генів. Багато трінуклеотідние повто-
ри, локалізовані в транскрипційного або регуляторних про-
ластах генів, характеризуються високим рівнем популяційної
мінливості, у межах якого не спостерігається фенотипи-
чних порушень (Willems, 1994). Хвороба розвивається лише
тоді, коли число повторів в цих сайтах перевершує визна-
ділений критичний рівень. Успадкування таких мутацій,
як правило, відрізняється від класичного менделевської ти-
па. Для них характерні: різна пенетрантность в поєднанні
з неповним домінуванням; геномний імпринтинг (відмінності фе-
нотіпіческіх проявів залежно від того, отримана му-
тація від матері або від батька) і феномен антиципації - на-
Растану тяжкості прояви захворювання в наступних поко-
домлення (Willems, 1994).
Класичним прикладом мутацій експансії є синд-
ром ламкої Х-хромосоми (FraXA), обумовлений присутністю
подовжених CCG повторів в 5'-нетрансльованій регуляторної
області FMR1-гена (Xq27.3). Аналогічні нестабільні повтори
виявлені ще в трьох ламких сайтах, причому два з них
(FraXE і FraXF) розташовані на дуже невеликій відстані
дистальнее FraXA. У всіх чотирьох випадках CCG-повтори лока-
лізованних поблизу від CpG острівців, при цьому збільшення числа
копій триплетів вище певного порогового рівня опору-
вождающихся гиперметилюванням всій регуляторної GC-багатої
області, внаслідок чого і відбувається різке зниження і
повне вимикання транскрипционной активності - мутації за
типу "втрати функції" (loss-of-functions). Таким чином,
область CCG-повторів у цих локусах можна розглядати, як
своєрідний cis-діючий елемент транскрипції (Willems,
1994, Mandel, 1994).
Інший тип динамічних мутацій описаний для 6-ти разів-
особистих важких аутосомно-домінантних нейродегенеративних
розладів (див. Главу X). Для всіх цих захворювань вияв-
жено присутність подовжених CAG-повторів у відкритій рамці
зчитування (ORF). Ці повтори транслюються в протяжні
поліглютаміновие треки, імовірно локалізовані в
ДНК-зв'язуючих доменах відповідних білкових продуктів.
У результаті білкові молекули набувають нових властивостей,
порушують нормальні метаболічні зв'язку. Таким чином,
нестабільні CAG-повтори можна розглядати, як
gain-of-function - мутації. Інтенсивно обговорюється також
можливість участі ампліфікації CAG-повторів у формуванні
схильності до таких частих розладів центральної
нервової системи, як шизофренія і маніакально-депресивний
психоз. Прикладом третьої групи хвороб експансії служить
міотонічна дистрофія. При цьому захворюванні величезні CTG
(Або CAG) повтори локалізовані в 3'-нетрансльованій області
гена. Вони також розглядаються, як фактори, що порушують
нуклеосомную організацію гена і пригнічують його транскрипцію
Більш докладно хвороби експансії розглянуті в Главі X.
Розділ 4.2. Генетична гетерогенність спадкових
захворювань.
Одним з важливих узагальнюючих підсумків молекулярно-генети-
них досліджень моногенних хвороб стало доказів-
тельство їх генетичної гетерогенності. Остання може
бути викликана різними причинами. Перш за все, виявилося, що
один і той же біохімічний ефект (фенотип) може бути
обумовлений мутаціями в різних генах. З іншого боку, мута-
ції одного і того ж гена, як встановлено, можуть приводити
до абсолютно різних клінічних проявах. Наприклад, мута-
ції гена адренорецептори, зчеплений з Х-хромосомою, можуть
бути причиною нейродегенеративного захворювання - хвороби
Кеннеді, якщо вони захоплюють область трінуклеотідних повто-
рів (Глава X), і в той же час призводити до синдрому Тестіко-
лярной фемінізації, тобто порушень статевої диференціювання
ровки, якщо вони зачіпають інші послідовності цього
ж гена. Крайнім вираженням такої гетерогенності може слу-
жити приклад з геном рецептора тирозинкінази-RET, різні
мутації якого можуть призводити до 4-м абсолютно різним
спадковим синдромам, таким як сімейна медуллярная
карцинома щитовидної залози, хвороба Гіршпрунга, безліч-
ва ендокринна неоплазія тип 2А (МЕН-2А) і тип 2B (МЕН-2B)
(Hayningen, 1994). Подібні фенотипічні різноманітності про-
явищ мутацій одного і того ж гена отримали назву ал-
паралельний серій. Термін використовується вже близько 20 років для
опису груп з декількох моногенних спадкових забо-
Левану, клінічні прояви яких дозволяють передпілля-
гать їх зв'язок з різними генами, в той час як біохімічні
і / або генетичні дослідження доводять їх алельних при-
роду, тобто в основі їх патогенезу лежать різні мутації
одного і того ж гена.
В даний час відомо більше 100 таких хвороб
(Romeo, McKusick, 1994). Для кожного захворювання з подібної
серії алелізм мутацій вже доведений на молекулярному рівні.
Причини подібного фенотипического різноманітності можуть бути
різними: (1) локалізація мутантних алелей у функціональних
але різних доменах білка; (2) принципово різний механізм
дії мутацій (loss-of-function, gain-of-function), (3)
присутність у тому ж гені модифікуючий мутантного алеля
або поліморфізму і (4) вплив генетичного оточення на
прояв мутантного алеля, тобто його взаємодія з
певними алелями гена-модифікатора або навіть нескольки-
ми такими генами. Поглиблений молекулярно-генетичний ана-
ліз практично кожного спадкового захворювання вказу-
ет на його значну генетичну гетерогенність, пов'язаний-
ву з різними мутаціями гена. Деякі приклади алельних
серій та генетичної гетерогенності захворювань будуть
розглянуті більш детально в Главі X.
Розділ 4.3 Номенклатура мутацій.
Для практичних цілей і, головним чином, для читання
наукової літератури, важливо знати, як записуються мутації.
До недавнього часу єдиної номенклатури запису мутацій не
існувало. У 1992 р. двома американськими вченими Артуром
Боде і Лап-Чі Тсуі була запропонована універсальна стандартна
система для позначення різних мутацій (Beudet, Lap-Сhee
Tsui, 1993). Вона розрахована як на запис амінокислотних за-
мен в білках, так і на нуклеотидні заміни і перестановки в
ДНК. У першому випадку, кожній амінокислоті відповідає од-
нобуквенний символ (табл.4.1), ліворуч записується нормальний
варіант амінокислоти, праворуч - мутантний, а розташований в
центрі номер відповідає місцю заміни в ланцюжку первинного
продукту трансляції. Наприклад, запис D44G означає заміну
аспарагіну на гліцин в 44-му положенні поліпептидного ланцюга, а
A655E - аланіну на глутамін в пложения 655 білкового продук-
ту. Так записуються різні варіанти амінокислотних замін
при міссенс мутаціях. Буквою Х позначається місце зупинки
синтезу поліпептидного ланцюга при нонсенс мутаціях. Наприклад,
Q39X означає заміну гліцину на стоп сигнал у 39-му кодоні, а
W1282X - триптофан-триплетів на стоп-кодон в положенні 1282.
Відсутньою однієї або декількох амінокислот позначають значком
^-Дельта. Так, найбільш часта мутація, що призводить до борошно-
вісцідозу-^ F508 - означає відсутність фенілаланіну в 508
положенні трансмембранного регуляторного білка муковісцідо-
за. Поліморфізми, пов'язані з рівноцінною за функціональною
значущості заміною амінокислот, записують через рисочку.
Наприклад, M/V470 - метіонін або валін в положенні 470.
Таблиця 4.1. Символи амінокмслот.
------------------------ T ----------------- T ------- -------¬
| Амінокислоти 1 | 0 трибуквений 1 | 0 Однолітерні 1 |
| 1 | 0 символ 1 | 0 символ 1 |
+-----------------------+-----------------+------- -------+
| Аланін 1 | 0 Ala 1 | 0 A 1 |
| Аргінін 1 | 0 Arg 1 | 0 R 1 |
| Аспарагін 1 | 0 Asn 1 | 0 N 1 |
| Аспарагінова кислота 1 | 0 Asp 1 | 0 D 1 |
| Asn та / або Asp 1 | 0 Asx 1 | 0 B 1 |
| Цистеїн 1 | 0 Cys 1 | 0 C 1 |
| Глутамін 1 | 0 Gln 1 | 0 Q 1 |
| Глутамінова кислота 1 | 0 Glu 1 | 0 E 1 |
| Gln та / або Glu 1 | 0 Glx 1 | 0 Z 1 |
| Гліцин 1 | 0 Gly 1 | 0 G 1 |
| Гістидин 1 | 0 His 1 | 0 H 1 |
| Ізолейцин 1 | 0 Ile 1 | 0 I 1 |
| Лейцин 1 | 0 Leu 1 | 0 L 1 |
| Лізин 1 | 0 Lys 1 | 0 K 1 |
| Метіонін 1 | 0 Met 1 | 0 M 1 |
| Фенілаланін 1 | 0 Phe 1 | 0 F 1 |
| Пролін 1 | 0 Pro 1 | 0 P 1 |
| Серін 1 | 0 Ser 1 | 0 S 1 |
| Треонін 1 | 0 Thr 1 | 0 T 1 |
| Триптофан 1 | 0 Trp 1 | 0 W 1 |
| Тирозин 1 | 0 Tyr 1 | 0 Y 1 |
| Валін 1 | 0 Val 1 | 0 V 1 |
L ----------------------- +-----------------+------- --------
Принципова схема запису і нумерації нуклеотидів
наведена на Рис.4.1. Відлік нуклеотидів в молекулі ДНК на-
чинается з першого смислового кодону, так що нуклеотид під
номером +1 відповідає першому нуклеотиду в молекулі кДНК.
Вгору за течією (або праворуч ліворуч від 3 'до 5'-кінця) від
перший кодону нуклеотиди записують зі знаком "-", вниз по
течією (від 5 'до 3') - зі знаком "+". Для багатьох генів
відсутність точних даних про положення ініціюючого сайту і
наявність декількох місць ініціації транскрипції істотно
ускладнюють нумерацію нуклеотидів. Нуклеотиди екзонів позна-
чають заголовними буквами, інтронів - прописними.
У табл.4.2. наведено приклади позначення різних мутацій
з використанням як амінокислотної, так і нуклеотидної ну-
мераціі. Нуклеотидна система запису особливо важлива для
позначення делецій, інсерцій, сплайсінгових мутацій та полі-
морфізма, не пов'язаних із замінами амінокислот або відбувалося
дящими в нетрансльовані частинах гена. У разі делеції або
інсерцій одного або двох нуклеотидів наводиться їх буквене
позначення. Наприклад, 441delA, 485insTA. При делеції або
інсерцій трьох і більше нуклеотидів вказується тільки їх
число. Так, 852del22 означає делеція 22 нуклеотидів, начи-
ва з 852-го нуклеотиду, а 3320ins7 позначає вставку 7 пар
підстав після нуклеотиду 3320. У разі великих вставок
або делецій їх розміри що показують в кілобазах, наприклад
2115ins13kb, чи позначаються відповідні інсертірован-
ні / делетірованние структурні елементи геному. Так,
2115insAlu означає інсерцій Alu-повтору після нуклеотиду
2115. При позначенні сплайсінгових мутацій записують номер
крайнього нуклеотиду в найближчому до мутації екзоні, число нук-
леотідов (зі знаком "+" у випадку 3 'кінця екзона і зі знаком
"-" У випадку 5 'кінця) і характер нуклеотидної заміни.
(Рис.4.1, Таб.4.2). Наприклад, 711 +5 G-T позначає заміну G
на Т в 5-м підставі інтрони, наступного за екзоном, закінчувати-
безпечує 711 нуклеотидів.
Розділ 4.4. Ідентифікація структурних мутацій, ізоляція му-
тантних ДНК.
Ідентифікація мутантних алелей, тобто виявлення
порушень у первинної нуклеотидної послідовності ДНК,
є самим прямим методом молекулярної діагностики
спадкових захворювань. Великі перебудови - делеції,
дуплікації, інверсії, транслокації - розміром більше 1 Мb,
зачіпають цілі гени чи навіть кілька генів, можуть
бути виявлені на цитологічних препаратах з использовани-
ем техніки високого дозволу хромосомного аналізу (аналіз
диференційно забарвлених прометафазних хромосом). Ще біль-
шая роздільна здатність (до 50 кb) може бути досягнута
при роботі на спеціальним чином приготованих (розтягнуті-
тих) інтерфазних хромосомах з використанням техніки Гібрит-
дізаціі in situ (FISH - Глава II).
Мутації, що змінюють довжину рестрикційних фрагментів,
можуть бути виявлені шляхом блот-гібридизації рестріцірованной
геномної ДНК з відповідними ДНК-зондами на стадіях гені-
тичного аналізу, що передують молекулярному клонування
гена. До числа таких мутацій ставляться досить протяжен-
ні, але не ідентифікуються цитогенетичних, внутрігенние
делеції, інсерцій і дуплікації, а також точкові мутації,
локалізовані в сайтах рестрикції. Неодмінною умовою ре-
алізації методу блот-гібридизації для пошуку подібних мута-
ций є наявність ДНК-зонда, що є або частиною ге-
на, або тісно зчепленої з цим геном клонованої
ДНК-послідовністю. При пошуку таких мутацій геномну
ДНК від здорового донора і хворого обробляють часто щепя-
щими рестріктазами, піддають електрофорез, блот-гібрид-
зації з міченим ДНК-зондом за стандартною схемою (Глава I) і
проводять порівняльний аналіз розташування бендів на ради-
оавтографе. Особливо інформативними зазвичай виявляються рест-
ріктази Msp1 і Taq1, які дізнаються сайти CGGG і TGGA, від-
відповідно. Завдяки наявності СpG послідовностей ці
сайти особливо часто піддаються спонтанного мутирование
(Див.розділ 4.5). Наявність протяжних делецій, або точкових
мутацій в сайтах рестрикції призводить до змін розмірів
рестрикційних фрагментів. Цілеспрямований пошук інших те-
точкові мутацій (що не зачіпають сайти рестрикції) і невеликі-
ших структурних аномалій можливий тільки для клонованих
генів з відомою нуклеотидної послідовністю смислових
ділянок ДНК. Методи ідентифікації подібних мутацій основа-
ни, головним чином, на використанні полімеразної ланцюгової
реакції в її різних модифікаціях (см.главу I, а також
розділи 4.5 та 4.6).
Для аналізу мутантних алелей, перш за все, необхідно
мати ізольовані послідовності мутантного гена, ко-
якi можуть бути отримані або шляхом клонування або амплі-
фікації мутантної кДНК, або за рахунок специфічної ампліфі-
кації окремих екзонів, їх частин та регуляторних областей
гена з використанням в якості матриці геномної ДНК паці-
ентов (Мал. 4.2). У першому випадку відбирають клоновані
к-ДНК-послідовності мутантного гена, проводячи скринінг
кДНК-ових бібліотек, сконструйованих із специфічних тка-
ній або культур клітин хворого. При цьому в якості зондів
використовують кДНК-ові послідовності нормального гена.
Іншим джерелом кодують послідовностей мутантного
гена може служити мРНК, ізольована з експресують
тканин або клітин хворого. Мутантний кДНК отримують шляхом
специфічної ампліфікації перекриваються послідовник-
ностей кодують областей гена, використовуючи як Матрі-
ци тотальну кДНК, отриману при зворотної транскрипції ізо-
ваною мРНК. Перевагою цього підходу є те,
що праймери для ампліфікації вибирають з екзонів областей,
нуклеотидні послідовності яких, як правило, стано-
вятся відомі незабаром після ідентифікації та клонування ге-
на. У ряді випадків ізоляція мутантної мРНК утруднена в свя-
зи з недоступністю зразків тканин або органів, у яких
відбувається експресія потрібного гена (мозок, печінка та ін.) Од-
нако, виявлення слідів, так званої, неза-
кінної або ектопічної мРНК в багатьох клітинах і тканинах, у
тому числі в клітинах крові, дозволяє преодалевать і ці
труднощі (Kaplan et al., 1992). Успіх подібної процедури
отримання мутантної кДНК пов'язаний, в першу чергу, з роз-
риментальних ефективних методів виділення і зворотної транскрипції
мРНК із збереженням всіх типів кДНК, включаючи ті, для яких
відповідні мРНК присутні в незначних концентраціях
(Наприклад, мРНК дистрофина при м'язової дистрофії Дюшенна
(См.главу X). Єдиним принциповим обмеженням мето-
дов детекції мутацій у кДНК-ових послідовностях є-
ються неможливість виявлення мутацій у регуляторних і інт-
ронних частинах гена. Подібні мутації можуть бути виявлені
тільки при аналізі геномної ДНК пацієнта.
Отримання геномної мутантної ДНК зазвичай не представляє
складнощів, так як вона може бути ізольована з будь-яких кле-
струм або тканин хворого незалежно від характеру експресії
досліджуваного гена. Однак, ампліфікація цілих екзонів віз-
можна тільки при знанні нуклеотидних послідовностей
фланкують інтрони областей, з яких і виробляють
підбір специфічних олігопраймеров. Секвенування інтронів
являє собою досить трудомістку задачу, вирішену
далеко не для всіх клонованих генів. Таким чином, до обме-
ня цього підходу слід віднести необхідність
достатньо повної інформації про структуру гена і про його пер-
вічно нуклеотидної послідовності. Крім того, об'єктом
тестування можуть бути лише порівняно невеликі області
гена, звідси для отримання більш повної інформації необхід-
ма ампліфікація багатьох екзонів.
Стратегія ідентифікації мутацій може бути різною і,
в кінцевому рахунку, визначається тим, чи маємо ми справу з раніше
невідомими мутаціями, якою метою аналізу є скрін-
вання вже відомих мутацій. У першому випадку обєктом
дослідження найчастіше служать клоновані або ампліфіці-
рова кДНК-ові послідовності, тоді як при молеку-
лярной діагностиці відомих мутацій, як правило, аналізі-
руют ампліфіковані фрагменти геномної ДНК.
Розділ 4.5. Первинна ідентифікація точкових мутацій.
Будь-які типи мутацій можуть бути виявлені шляхом прямого
секвенування мутантної кДНК або окремих екзонів і часто
первинний пошук порушень в кодують областях гена здійсню-
ють саме таким чином. Сам метод секвенування вже
був розглядати раніше (см.главу I, розділ 1.6). Для деяких
генів, що мають невеликі розміри, метод прямого секвенірова-
ня з успіхом застосовується як основний метод сканування
мутацій. Так, зокрема, особливо зручним виявилося його
застосування для детекції мутацій в порівняно невеликих за
розміром генах, таких, наприклад, як ген фактора IX згортаючи-
ня крові (гемофілія В). Використання ектопічної мРНК для
отримання ампліфікованих кДНК-ових фрагментів відкриває
особливо широкі можливості для застосування методу прямого
секвенування.
Розроблені в останні роки модифікації методів ПЛР
значно полегшили секвенування ампліфікованих фраг-
ментів і підвищили його ефективність. Так, зокрема, перед-
хибна варіант асиметричної ПЛР, коли при ампліфікації кон-
центрация одного з олігопраймеров в кілька десятків разів
перевершує концентрацію іншого праймера, в результаті чого
синтезується переважно тільки одна, потрібна для секвой-
вання ланцюжок ДНК. Для цієї ж мети (отримання одноцепо-
ного точкового ДНК) запропоновано використання магнітних часток з
фіксованим на їх поверхні стрептавідин. При цьому
один з праймерів для проведення ПЛР метится биотином. Потім
до продуктів ампліфікації додають магнітні частинки з при-
шитим стрептавідин. Завдяки міцному зв'язування біотин -
стрептовідін, мічена біотином послідовність ДНК фікс-
ється на магнітних частинках. За допомогою лужного лізису з
частинок видаляють другу немічених комплементарную послідовно-
ність ДНК, яку і використовують для секвенування. Ще
в одному варіанті ампліфікацію проводять у присутності праймі-
рів, що несуть сайт впізнавання для ферменту Т7 - РНК полімеру-
зи. Після ампліфікації в системі in vitro проводять
транскрипцію ампліфіката за допомогою Т7-РНК полімерази і обра-
тися одноланцюжкову РНК використовують для секвенування
- Метод GAWTS (genome amplification with transcript
sequences).
Однак, в загальному випадку секвенування повнорозмірною
кДНК або всіх екзонів для генотипування мутацій у окремих
них пацієнтів досить трудомістко, дорого і вимагає багато
часу. Тому на практиці частіше проводять попередній
відбір більш простими методами ампліфікованих, а іноді
клонованих фрагментів ДНК, імовірно містять
мутації, а потім секвеніруют тільки ці ділянки ДНК. Методи
пошуку фрагментів ДНК, імовірно містять мутації,
засновані на порівняльному аналізі мутантних і нормальних
послідовностей з цілого ряду фізичних і хімічних
характеристик, які в значній мірі варіюють в
Залежно від типу мутаційного ушкодження. Слід під-
черкнути, що незалежно від методу детекції мутації і прак-
тично незалежно від її природи (заміни нуклеотидів, деле-
ції, дуплікації і пр.) точні молекулярні характеристики
кожної мутації можуть бути отримані тільки шляхом прямого сек-
Веніровані. При наявності в ампліфікованої фрагменті з-
Вестн сайтів рестрикції положення мутації може бути перед-
ньо уточнено. Для цього продукти ампліфікації доз-
зают відповідної ендонуклеаз і досліджують більш корот-
Електричні фрагменти.
Найбільш просто виявляються мутації, які змінюють дли-
ну ампліфікованих фрагментів, так як подібні порушення
легко виявляються при електрофоретичному аналізі. Так, про-
тяжінь делеції, захоплюючі цілі Екзони, можуть бути ви-
явлені по зміні довжини рестрикційних фрагментів, Гібрит-
дізующіхся зі специфічними ДНК-зондами. Більш проста і
ефективна методика виявлення таких мутацій в генах, зчеп-
лених з підлогою, заснована на одночасній ампліфікації раз-
особистих екзонів, найбільш часто втягуються в подібні пе-
ребудови, так званий мультиплексний варіант ПЛР. Разні-
ца в розмірах і числі ампліфікованих фрагментів дозволяє
легко ідентифікувати такі мутації на електрофорезі
(Рис.4.2). Особливо широко цей метод використовується для іден-
тіфікаціі делецій у гені дистрофина, на частку яких прихо-
диться близько 60% всіх мутацій, що призводять до міодистрофії Дю-
Шеннай (см.главу X). При відсутності делецій всі ампліфікує-
ванні фрагменти після електрофоретичного розділення і ок-
рашіванія можна спостерігати у вигляді окремих смуг. Якщо в
досліджуваної ДНК якісь з екзонів делетіровани, будуть
відсутніми і відповідні їм смуги на електрофорег-
Рамі (Рис.4. 2). Вибираючи специфічні ділянки гена для ам-
пліфікаціі, можна оцінити розмір делеції з точністю до від-
слушних екзонів, а також визначити її внутрігенную локалі-
зацію.
Метод цей, однак, не виявляє подібні делеції,
перебувають у гетерозиготному стані або локалізовані в
аутосомним генах, так як нормальна гомологичная послідовно-
ність геномної ДНК може служити матрицею для ампліфікації-
ції будь-яких фрагментів. Даний підхід застосуємо до аналізу деле-
ції в аутосомним генах тільки в тих випадках, коли можливе
доповнити ПЛР кількісною оцінкою результатів ампліфікації-
ції - так звана кількісна ПЛР. Оригінальний метод
ідентифікації подібних делецій у гетерозигот заснований на
використанні в якості матричної ДНК для ПЛР кДНК, напів-
ченной шляхом зворотної транскрипції з ектопічної мРНК або
з мРНК, ізольованої з експресують даний ген тканин
або культур клітин пацієнта. На відміну від нормального гомо-
логу, в мутантної молекулі кДНК межують з делецій Екзони
зближені. Якщо в якості олігопраймеров для ПЛР будуть виб-
рани послідовності з цих областей гена, тільки му-
тантная кДНК буде служити матрицею для ампліфікації невеликі-
шого ділянки між праймерами з фланкують делеція екзо-
нов. У нормальній послідовності кДНК ця ділянка може
бути занадто великий, для того щоб пройшла ампліфікація.
Практично, для виявлення гетерозигот за протяжним
внутрігенним делециях проводять мультиплексну ПЛР з викорис-
ристанням системи олігопраймеров, забезпечують ампліфікацію
фрагментів, повністю перекривають всю молекулу кДНК. Нали-
чіе делеції реєструють по появи продуктів ампліфікації
незвичайного розміру.
Невеликі делеції та вставки нуклеотидів не призводять до
відсутності ампліфікованих фрагментів ДНК, але змінюють їх
розміри. Ці зміни можуть бути зареєстровані за
електрофорезі продуктів ампліфікації в поліакриламідному або
агарозном гелях (Рис.4.3). Саме цей метод використовується
для детекції найбільш часто зустрічається мутації в гені му-
ковісцідоза - делеції трьох нуклеотидів ^ F508. Після виявлено-
ня відмінностей між нормальною і мутантної ДНК по довжині рест-
рікціонних або ампліфіцірованих фрагментів гена необхідно
провести секвенування незвичайного фрагмента, з метою визна-
ділення змін в первинній структурі мутантної ДНК після-
послідовності в порівнянні з нормальною.
При мутаціях гена, що представляють собою заміну одного
або декількох нуклеотидів, довжини ампліфікованих фрагмент-
тов залишаються постійними, однак, деякі фізико-хіміч-
етичні властивості мутантних молекул ДНК змінюються. Так, напри-
заходів, при гібридизації однониткових ДНК, комплементарних нор-
мальної і мутантної ниткам ДНК, виникають структурні пору-
ня в місці негомологичностью спарювання. З урахуванням цих особ-
бенностей розроблені різні варіанти пошуку мутантних
фрагментів ДНК та ідентифікації в них точкових мутацій. Веду-
щими з цих методів є: метод аналізу конформаційно-
го поліморфізму однониткових ДНК - SSCP, денатуруючих гра-
діентний гель-електрофорез - DGGE, метод хімічного розщеплення-
лення некомплементарних сайтів (CMC), метод гетеродуплексно-
го аналізу (HA) і, нарешті, власне метод секвенування
Основні характеристики цих методів наведені в табл.4.3
Таблиця 4.3. Переваги та недоліки основних методів пер-
вічно ідентифікації мутацій.
------- T --------- T -------- T ------------ T ---------- ------¬
| Метод | розмір |%% | точність | сканування |
| | Фрагмента | детекції | картування +--------- T ------ +
| | (П.о.) | мутацій | мутації | екзонів | кДНК |
| | | | | | |
+------+---------+--------+------------+---------+ ------+
| SSCP | 250 | 80% | немає | + + + | + |
| DGGE | 600 | 95% | немає | + + | + + |
| СМС | 1700 |> 95% | так | + | + + + |
| PCR DS | 500 |> 99% | так | + + | + + |
| НА | 300 | 80% | немає | + + | + |
L ------ +---------+--------+------------+---------+ -------
"+" - Застосовність методу для сканування геномної ДНК і
кДНК
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод
аналізу конформаційного поліморфізму однониткових ДНК, перед-
пропозицій (Оrita et al.1989, Сlavac, Dean, 1993) заснований на
реєстрації відмінностей у електрофоретичної рухливості одно-
Стек гілок ДНК, однакових за величиною, але розрізняються
внаслідок нуклеотидних замін просторової організа-
ції молекул (Рис 4.4). Скручування або конформація невеликих
однониткових ДНК істотно залежить від їх нуклеотидної
послідовності, так що заміна навіть одного заснування в
молекулах однакового розміру призводить до зміни їх простий-
просторовий структури. Метод включає ампліфікацію специфі-
чних сегментів ДНК розміром від 50 до 300 пар основ,
зазвичай у присутності мічених трифосфато, денатурацію обра-
ристовувались продуктів ПЛР та нативний високодозвільного елек-
рофорез в поліакриламідному гелі. Іноді ампліфікацію прово-
дять без використання мітки, але тоді для кращого поділу
ДНК і однозначної ідентифікації бендів на електрофореграмме
використовують спеціальні гелі - Hydrolink або MDE (AT
Biochem, USA), а також більш чутливі в порівнянні з
етідіумом бромідом методи фарбування, такі як забарвлення се-
ребром. На процес конформації впливають різні
зовнішні фактори - температура, концентрація акриламіду і
гліцерину в гелі, іонна сила буферних розчинів
(Сlavac, Dean, 1993). Оптимальний підбір цих параметрів поз-
воляет ефективно розділяти ампліфіковані фрагменти ДНК,
різняться навіть всього на один нуклеотид. Конформаційний
метод виявлення точкових мутацій швидко набув широкого
розповсюдження завдяки своїй простоті і можливості попере-
ружівать будь-які типи замін. Ефективність детекції мутацій
при розмірах ампліфікується фрагмента менше 200 п.о.
становить 70-95%, але при довжині фрагмента, перевищує 400
п.о., ймовірність виявлення мутацій зменшується до 50%.
DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - ме-
тод денатуруючого градієнтного гель-електрофорезу, заснований
на залежності властивостей плавлення (або денатурації) невеликих
двухнитевой молекул ДНК від їх нуклеотидної послідовності
ності, а точніше від співвідношення AT і GC пар в досліджуваних
фрагментах (Майерс та ін, 1990; Fodde, Losekoot, 1994). Об'єк-
ясняется це тим, що GC зв'язок більш міцна порівняно
зі зв'язком між нуклеотидами A і T. Подібні відмінності в ді-
намики плавлення можуть бути виявлені шляхом порівняння подвиж-
ності нормальних і мутантних двухнитевой фрагментів ДНК при
їх електрофорезі в денатуруючих умовах (Рис.4.5). Гра-
діент денатурації досягається різницею температур, різної
концентрації сечовини або формальдегіду в гелях. При цих
умовах однакові за величиною двухнитевой молекули ДНК,
відрізняються за нуклеотидної послідовності, денатурує-
ють по-різному. Розроблено комп'ютерний алгоритм, дозволяю-
щий пророкувати характер плавлення в залежності від нукл-
отідной послідовності (Lerman, Silverstein, 1987). При
електрофорезі ампліфікованих двухнитевой фрагментів ДНК в
гелі з лінійно зростаючим градієнтом концентрацій денат-
рірующіх агентів плавлення ниток ДНК відбувається в строго
специфічною для даної послідовності області, еквівалентна
лентной температурі плавлення - tm, то є такий температу-
ре, при якій кожна пара основ з 50%-ой вірогідністю
може з'єднатися або розійтися. Після початку плавлення
просування двухнитевой фрагмента ДНК в гелі різко уповільнювався-
ється внаслідок складної просторової конфігурації молі-
кул, причому ця затримка буде тривати до тих пір, поки не
настане повна денатурація ДНК. У результаті відбувається
поділ фрагментів ДНК, що розрізняються по нуклеотидної
складом. Таким способом вдається ідентифікувати лише близько
50% однонуклеотидних замін у фрагментах ДНК довжиною від 50 до
декількох сотень нуклеотидів. Пов'язано це з тим, що при
проходженні ДНК через гель може початися часткова денат-
рація кінців молекул ще до досягнення оптимальної області
плавлення. Тому мутації, локалізовані поблизу кінців ам-
пліфіцірованних ділянок ДНК, надають менший вплив на
процес плавлення і тому можуть не виявлятися. Ефективна від-
ність виявлення мутацій за допомогою градієнтного денатурує-
ючої електрофорезу може бути істотно підвищена за рахунок
приєднання до кінців ампліфікованої геномної ДНК синте-
тичних фрагментів GC-нуклеотидів, довжиною в кілька
десятків пар основ. Такі монотонні тугоплавкі кінці
виконують роль своєрідних затискачів і різко збільшують
шанси виявлення для всіх точкових мутацій, незалежно від
їх локалізації усередині досліджуваного фрагмента ДНК. Ця моди-
сифікацію робить метод дуже чутливим (см.Таб.4.2). У
відміну від SSCP він придатний для більш великих ампліфікує-
ванних фрагментів ДНК. При дослідженні фрагментів до 600
п.о. ефективність виявлення мутацій цим методом досягає
95%. Найчастіше DGGE-метод застосовується для скринінгу мута-
ції в ампліфікованих екзон, при цьому в якості матриці
використовують геномної ДНК. Цей метод може бути з успіхом
застосований також для аналізу індукованих мутацій, так як
дозволяє вловлювати точкові мутації, які виникли навіть од-
ної з 100 оброблених мутагеном клітин. До недоліків ме-
тода слід віднести технічну складність отримання одно-
мірного градієнта денатуруючого агента в поліакриламідному
гелі, а також високу вартість штучно синтезованих
GC-решт.
HA (Неteroduplex analysis) - гетеродуплексний аналіз поз-
воляет ідентифікувати мутації, що знаходяться в компаунді або
в гетерозиготному стані. Слід зауважити, що у пригнічуючи-
ючої більшості пацієнтів з генними хворобами, успадковані-
ми за аутосомно-рецесивним типом, мутації в гомологічних
хромосомах знаходяться в компаунді, тобто в кожному з гомо-
логічних генів є функціонально значущі порушення, але
їх молекулярна природа і внутрігенная локалізація різні.
Виняток становлять лише мажорні мутації, частота яких
в популяції досягає десятків відсотків. Прикладами таких
мутацій є ^ F508 в гені муковісцидозу або R408W мута-
ція в гені фенілкетонурії. Принцип HA-методу полягає в
тому, що при ампліфікації відносно невеликих фрагментів
генів гетерозигот або гомозиготних компаундів мутація може
бути локалізована лише в одній з гомологічних ниток матріч-
ної ДНК. Тому в ампліфікаціонной суміші поряд з двома ти-
пами гомодуплексов утворюються гетеродуплекси між нормаль-
ної та мутантної ланцюжками ДНК. Такі гетеродуплексние молі-
кули ДНК мають іншу електрофоретічеcкую рухливість в порів-
рівняно з гомодуплексамі (не відрізняються між собою за під-
рухливість) за рахунок конформаційних особливостей у місцях
неспівпадання нуклеотидів (mismatch) (рис.4.6). Ці відмінності
можуть бути виявлені при електрофорезі в звичайному поліакріл-
ламідном гелі. Значно більш ефективне розділення гомо-
і гетеродуплексов може бути досягнуто при використанні
нових варіантів гелів - Hydrolink або MDE. Імовірність
ідентифікації точкових мутацій цим способом на фрагментах
ДНК менше 300 п.о. досягає 80-90%. Детекция мутацій здійсню-
ється як ізотопним, так і неізотопнимі методами
(Grompe, 1993).
CMC (Chemical Mismatch Cleavage) - метод хімічного
розщеплення некомплементарних сайтів, заснований на здатності
деяких хімічних агентів специфічно розривати нитка ДНК
в місці локалізації неспареного підстави (рис.4.7). Так,
цитозин чутливий до дії гідроксиламіну, а тимін - до
дії тетроксид осмію. Деякі модифікації методу
використовують чутливість тиміну і гуаніну до карбодіімідів.
Подальша обробка пиперидина призводить до повного розриву
молекули ДНК в модифікованому сайті. Виявлення мутацій
здійснюють за допомогою мічених ДНК-зондів, відповідних,
як правило, нормальним варіантів послідовності ДНК.
Такими зондами можуть бути синтезовані олігонуклеотиди,
клоновані послідовності ДНК або ампліфіковані
фрагменти (Cotton, 1990; Cotton, Malcolm, 1991).
При проведенні дослідження еталонну мічену ДНК кош-
жують з надлишком тестованої ДНК (або РНК). Тестованими
зразками ДНК можуть служити клоновані ДНК, оброблені
відповідними ендонуклеаза, або ампліфіковані
фрагменти. Суміш нагрівають до повної денатурації двухнитевой
молекул і потім охолоджують, щоб створити умови для образо-
вання дуплексів. При наявності мутацій у тестованих зразках
ДНК в гетеродуплексах, що виникли в результаті гібридизації
між однониткових молекулами еталонної і тестованої ДНК,
утворюються місця негомологичностью спарювання. Після обробки
відповідними хімічними агентами ідентифікація і лока-
лізація мутантних сайтів в досліджуваних ділянках ДНК прово-
диться шляхом електрофорезу і авторадіографії. Поява уко-
рочення фрагментів ДНК на електрофореграмме (а точніше нео-
бично бендів в нижній частині гелю) свідчить про наявність
мутантного сайту, а визначення розміру укорочених фрагмент-
тов однозначно визначає локалізацію цього сайту у вихідній
тестованої молекулі ДНК. Сучасні модифікації методу
CMC дозволяють ідентифікувати до 95-100% мутацій
(Grompe, 1993). Великими перевагами цього методу є:
(1) можливість досліджувати протяжні ділянки ДНК - до 2
кб, (2) здатність одночасно виявити і локалізувати
кілька мутацій в одному фрагменті ДНК і (3) можливість
одночасно використовувати кілька ДНК-зондів для пошуку
мутацій - мультиплексний варіант методики. До числа недоліків
ков можна віднести високу токсичність використовуваних хі-
реактивів. Остання може бути частково ослаблена
використанням карбодіімідів для ідентифікації GT гетеродуп-
плексів.
Дуже близьким за принципом до CMC-методу є метод
розщеплення гетеродуплексов РНКази А. З цією метою ство-
ються умови для утворення гетеродуплексов між тестуючи-
мій ДНК та комплементарної їй радіоактивно міченої РНК про-
бій. При обробці РНКази А відбувається розрізання молекул
РНК в місцях порушення спарювання підстав. Місця точкових
мутацій визначаються як і у випадку СМС, за розмірами образо-
вавшись фрагментів після електрофорезу і авторадіграфіі.
Необхідність використання радіоактивно міченої РНК-проби
і можливість детекції тільки близько 50% точкових мутацій чи-
мітіруют широке застосування методу (Grompe, 1993).
Первинна ідентифікація мутацій може бути здійснена
шляхом аналізу порушень не в нуклеотидної послідовності
гена, а в амінокислотної послідовності відповідного
поліпептидного продукту. Для цього виділяють тотальну мРНК
з лейкоцитів крові, проводять зворотну транскрипцію, амплі-
фіціровуют специфічні Екзони кДНК (метод RT-PCR), встраи-
вають ампліфікованих область ДНК в експресійна систему
і аналізують утворений продукт. Цей метод особливо
ефективний при детекції мутацій в протяжних генах, що містить
бовців велике число екзонів, таких як ген міопатії Дюшенна
або ген нейрофіброматозу 1.
Розділ 4.6. Молекулярне сканування відомих мутацій.
Розглянуті вище методи виявлення мутацій передпілля-
гают обов'язкове секвенування містять їх сегментів ДНК
з метою точної ідентифікації нуклеотидних порушень, оцінки
їх фенотипова прояви і визначення причетності до
розвитку хвороби. Тому вони рідко використовуються в практи-
чеський діагностиці і при популяційному скринінгу гетерозі-
гот. Після опису мутації з'являється можливість її аналі-
за більш простими способами, що не вимагають секвенування.
Як згадувалося вище, мутації, які змінюють довжину ампліфікує-
ванних фрагментів, можуть бути виявлені за допомогою нативного
електрофорезу в поліакриламідному або агарозном гелях.
З міссенс мутацій найбільш просто діагностуються ті
заміни нуклеотидів, які призводять до зникнення або про-
разования сайту впізнавання для якої-небудь з рестриктаз.
Вони виявляються по зміні довжини ампліфікованої фраг-
мента ДНК після його обробки відповідної ендонуклеаз.
Тому відразу після ідентифікації мутації проводиться компь-
ютерний пошук можливих сайтів рестрикції в місці локалізують-
ції заміни підстави. Імовірність такої події досить
велика, тому що для кожної з декількох сотень відомих у
Нині рестрикційних ендонуклеаз сайтом впізнавання
служить своя специфічна послідовність ДНК, середні
розміри якої становлять 5 - 6 нуклеотидів.
Якщо природних рестрикційних сайтів в місці мутації
знайти не вдається, то такі сайти можуть бути створені
штучно. Зокрема, розроблена методика створення з
допомогою ПЛР нових сайтів рестрикції в мутантних алелі, але
не в алелі дикого типу - метод ПЛР-опосередкованого
сайт-спрямованого мутагенезу (Ng et al., 1991; Eiken et
al., 1991). Для цього ампліфікується ділянку ДНК вибирають
таким чином, щоб 3'-кінець одного з праймерів безпосереднім-
ного примикав до мутантному сайту (рис.4.8). Саме цей
праймер неповністю комплементарний матричної ДНК. У ньому з-
змінюють один з нуклеотидів з 3'-кінця так, щоб у поєднанні
з нуклеотидом мутантного, але не нормального сайту в цьому
місці утворювався сайт рестрикції для якої-небудь з ен-
донуклеаз. Тоді після рестрикції та електрофорезу продуктів
ампліфікації геномної ДНК у індивідуумів, що не містять дан-
ву мутацію, на електрофореграмме буде присутній один
нерестріцірованний фрагмент, у гетерозигот з'явиться два до-
додаткових фрагмента, відповідних по довжині рестріціро-
ванним сегментами ДНК, і у гомозигот по мутації будуть
бути присутнім тільки ці два фрагменти.
Концептуально близьким до цього варіанту є метод
що отримав назву "ампліфікація рефрактерної мутаційної
системи "- amplification refractory mutation system - ARMS. У
основі методу лежить нездатність Taq1 термофільною полімеризації, що
рази до ампліфікації фрагмента при наявності невідповідності
(Mismatch) між матричної ДНК і 3'-кінцем одного з олігоп-
Раймером (Newton et al., 1989; Bottema et al., 1990). Суть
методу полягає в оновременно проведенні двох ПЛР, для
кожній з яких одним з праймерів служить аллель-специфі-
чна мутантна або нормальна олігонуклеотидно послідовно-
ність, відповідно. При цьому в якості другого прайм-
міра для проведення двох реакцій вибирають одну і ту ж олі-
гонуклеотідную послідовність, так що в обох випадках
можуть ампліфікувати ділянки ДНК однаковою протяжен-
ності.Мутантний сайт у аллель-специфічних праймерів розпо-
хибна не в центрі, а ближче до 3'-кінця, і частіше за все займає
передостанню позицію. За певних умов, найважливішим
з яких є концентрація іонів магнію в розчині,
наявність сайту негомологичностью спаровування в 3'-області прайм-
міра перешкоджає початку синтезу ДНК. Таким чином, при на-
явності мутації у досліджуваній матричної ДНК ампліфіковані
фрагменти утворюються тільки в тому випадку, якщо в якості
аллель-специфічного праймера вибирається мутантна пос-
вательность, тоді як при використанні нормального оліго-
нуклеотидного праймера ПЛР блокується (Рис.4.9.). Метод на-
йшов широке застосування для детекції мутацій при фенілкетону-
рії, бета-таласемії, муковісцидозі, при типування генів
HLA системи. Однак, складності в підборі праймерів і в вибо-
ре оптимального режиму ПЛР обмежують широке застосування
цього методу. Разом з тим, його безперечною перевагою
є можливість застосування повністю автоматичного
сканування.
Таким же перевагою володіють і методи детекції
стану гена, засновані на лигирование синтетичних олі-
гонуклеотідних зондів-OLA (oligonucleotide ligation assay).
При проведенні цих реакцій специфічні ДНК або РНК після-
послідовності досліджують шляхом використання їх в якості
матриці для ковалентного зв'язування двох пар олігонуклеотиди-
них зондів (Landegren, 1993). ДНК-зонди для лігування під-
відбирають таким чином, щоб вони були повністю комплементарності-
ни нормальному фрагменту ДНК в області локалізації мутації,
причому сама нуклеотидна заміна повинна знаходитися на стику
двох праймерів. Зазвичай в один з зондів вводять радіоактивну
або флюоресцентную мітку, а інший - мітять биотином. Після
гібридизації при строго стандартних умовах синтезовані
олігонуклеотидно послідовності зшивають ДНК-лігази з
термофільних мікроорганізмів. Такі ферменти працюють при
високих температурах і зберігають свою активність в умовах,
необхідних для проведення денатурації молекул ДНК. При на-
явності мутації в тестованої молекулі ДНК на кінці одного з
зондів утворюється сайт некомплементарного спаровування, не-
посередньо примикає до місця лігування. Наявність тер-
номінального неспареного заснування в суміжно розташованих
послідовностях ДНК-зондів різко знижує швидкість ліги-
вання та за певних умов проведення реакції зшивши-
ки між зондами в цьому випадку не відбувається. Метод включає
кілька послідовних циклів гібридизації, лігування
і денатурації. Починаючи з другого циклу, матричної ДНК для
гібридизації зондів поряд з тестованої пробою служать також
лігувати послідовності. У подальшому проводять
електрофоретичний аналіз мічених однониткових фрагментів
ДНК. Система успішно апробована на мутаціях глобинового ге-
нов при серповидно-клітинної анемії і на мутації delF508 при
муковісцидозі.
Універсальним методом детекції замін підстав є
метод аллель-специфічних олігонуклеотидів - ASO, який
включає ампліфікацію фрагментів ДНК і подальшу дот-або
слот-гібридизацію з міченими аллель-специфічними олігонук-
леотідамі (Reiss, 1991). Для цього синтезують два типи олі-
гонуклеотідних послідовностей зазвичай розміром 19 пар
підстав, в яких мутантний сайт займає центральне по-
положення. Кожен з цих олігонуклеотидних зондів комплемен-
тарен нормальному або мутантному варіантами ДНК, від-
відповідно. Умови гібридизації підбирають таким чином,
щоб дуплекси утворювалися тільки при повній комплемен-
тарності гібридних пар. У цих умовах ампліфіковані
фрагменти ДНК без мутації будуть гібрідізоваться тільки з
нормальним зондом, ДНК гомозигот по мутації - тільки з му-
тантним і ДНК гетерозигот - з обома олігонуклеотидами
(Рис.4.10). Для зменшення перехресного аллель-специфічної
гібридизації в реакційну суміш додають 30-кратний хати-
струм конкурентного немічених олігонуклеотидно ДНК-зонда.
Розроблено зручні модифікації методу ASO з використанням
аллель-специфічних ДНК-зондів, мічених біотином або пе-
роксідазой хрону (Лебедєва та ін, 1994).
Найбільш швидким, економічним і зручним методом скані-
нування точкових мутацій є модифікований варіант
ASO, так звана гібридізаційного система зворотного
дот-блоту (reverse dot-blot hybridisation system) (Saiki
et.al., 1989). Метод дозволяє одночасно скрініровать сра-
зу багато точкових мутацій і доступний автоматизації
(Chebab, 1993). У цьому випадку проводять гібридизацію мічених
продуктів ПЛР, зазвичай представляють собою окремі Екзони,
з фіксованими на нейлонових фільтрах аллель-специфічно-
ми олігонуклеотидно зондами (ASO). Попередню іммобі-
кликаних забезпечити практичну реалізацію мутантних і нормальних ASO-зондів на мембранах здійсню-
ють за рахунок приєднання ГОМОПОЛІМЕРНА T-хвостів з
дезоксирибонуклеотидів-трансферази на кінці. При цьому оліго-
нуклеотидні послідовності залишаються вільними і можуть
брати участь у гібридизації з міченими ампліфікованих
фрагментами ДНК. Після відмивання незв'язаних молекул ДНК ра-
діоавтографіческіе або кольорові плями на фільтрах стають
помітними тільки в місцях локалізації олігонуклеотидів, пів-
ністю комплементарних тестованої геномної ДНК. Реакцію,
зазвичай проводять у присутності іонів тетра-алкіламмонія,
зменшують залежність температури плавлення від композиції
підстав. Це дозволяє використовувати однакові умови
гібридизації для різних олігонуклеотидів, тобто вести
пошук відразу декількох типів мутацій, локалізованих в одному
і тому ж екзонів гена. Даний метод покладено в основу роз-
лення спеціальних систем, призначених для одночасної
детекції найбільш поширених мутацій в досліджуваному ге-
не. Система являє собою стрічковий фільтр (стрип) з
нанесеними плямами олігопраймеров, кожен з яких від-
ветствует певної мутації. Стріп поміщають в розчин з
сумішшю тих мічених ампліфікованих екзонів, які можуть
містити тестовані мутантні алелі і створюють умови для
аллель-спеціфіфческой гібридизації. Таким способом сканують
одновренно 42 мутації, відповідальні за серповидноклеточной
анемії, 34 мутації при муковісцидозі (Сhebab, 1993)
Дуже простий метод виявлення та ідентифікації
описаних раніше мутацій в ампліфікованих фрагментах ДНК
заснований на аналізі характеру електрофоретичного розділення
продуктів ПЛР в MDE-гідросвязивающіх гелях у присутності
високих концентрацій сечовини. Ці гелі сприяють формуван-
вання гетеродуплексов в процесі електрофорезу, причому
розташування дуплексів дуже специфічно для різних му-
тантних алелів, локалізованих в одному і тому ж ампліфіці-
рмі фрагменті. Це дозволяє не тільки виявляти, але з
високим ступенем ймовірності ідентифікувати відомі му-
тації. У мультиплексному варіанті методики можливий одночасним-
менний пошук мутацій в декількох ампліфікованих фрагмент-
тах. Простота і висока швидкість аналізу сприяють роз-
лення на основі поділу в MDE-гелях схем максимальної ав-
пи процесу пошуку та ідентифікації відомих мута-
ций у пацієнтів і гетерозиготних носіїв мутацій
Отже, методи виявлення мутацій досить різноманітні і
постійно удосконалюються. У першу чергу, молекулярному
аналізу піддають ті гени, пошкодження яких супроводжувалося
ються розвитком найбільш частих захворювань. Дослідження
проводять або в родинах високого ризику, де вже є біль-
зані з тим чи іншим моногенних захворювань з метою виявлення
гетерозиготних носіїв, або безпосередньо в популяціях,
де є велика вибірка хворих і можна припускати
високу частоту гетерозиготних носіїв мутацій. При цьому
вибір конкретних схем ідентифікації мутантних алелей, за-
часту, визначається діагностичними можливостями лабора-
торій і вартістю аналізів. Особливу увагу приділяють пошуку
тих алелів, які зустрічаються в популяціях з високою
частотою. Саме для таких мутацій розробляють більш
прості та ефективні методи молекулярної діагностики, поз-
воля тестувати хворих і проводити скринінг гетерозі-
гот серед їх родичів або серед певних груп
населення.
Найважливішою характеристикою мутантного алеля є
його кореляція з тяжкістю перебігу захворювання, тобто фе-
нотіпіческое вираз мутації в гомозиготному і в гетерозі-
Готня стані, а також у компаунді з іншими мутантними
алелями того ж гена. Для багатьох моногенних хвороб попере-
ружено велике число алелей, які за своїм клінічно-
му прояву можуть бути поділені на різні групи,
від дуже м'яких, що надають незначний пошкоджуючий
ефект, до летальних чи полулетальной, що обумовлюють
смерть пацієнтів у ранньому віці. Таким чином, молеку-
лярная діагностика мутацій може мати визначальне значення-
ня для прогнозування розвитку захворювання і вибору адек-
ватної тактики лікування. Подібні скрінірующіе програми в
Нині розроблено і успішно здійснюються в
багатьох країнах для таких поширених захворювань як
серповидноклітинна анемія, муковісцидоз (Rene et
al., 1994). Реалізація цих програм поряд з великою міді-
цинськой користю приносить і масу соціальних проблем, неко-
торие з яких будуть розглянуті нижче.
ВСТУП У молекулярної діагностики та Генотерапія
СПАДКОВИХ ХВОРОБ.
В. Н. Горбунова, В. С. Баранов
ЗМІСТ
ВСТУП.
ГЛАВА I. СТРУКТУРА І МЕТОДИ АНАЛІЗУ ДНК.
Розділ 1.1 Загальні уявлення, центральна догма, гені-
тичний код.
Розділ 1.2 Виділення ДНК, її синтез і рестрикція.
Розділ 1.3 блот-гібридизація по Саузерн, гібридизація
in situ.
Розділ 1.4 ДНК-зонди, клонування, векторні системи.
Розділ 1.5 Геномні та к-ДНК-ові бібліотеки генів, їх
скринінг.
Розділ 1.6 Секвенування послідовностей ДНК.
Розділ 1.7 Полімеразна ланцюгова реакція.
РОЗДІЛ II. ГЕНОМ ЛЮДИНИ, СТРУКТУРА ГЕНІВ.
Розділ 2.1 Визначення геному і його основних елементів.
Розділ 2.2 Повторювані послідовності ДНК.
Розділ 2.3 Мультігенние сімейства, псевдогени, онко-
ни.
Розділ 2.4 Сучасне визначення поняття "ген",
транскрипція, регуляторні елементи генів.
Розділ 2.5 Мінливість геному, поліморфні сайти рест-
рікціі, ПДРФ-аналіз.
Розділ 2.6 вариабильность мікро-і мінісателітних ДНК.
Розділ 2.7 Мобільність геному, облігатні і факультатив-
ні елементи геному.
Розділ 2.8 ізохорами, метилювання, гіперчутливість
сайти.
ГЛАВА III. ГЕНЕТИЧНІ КАРТКИ, позиційних КЛОНУВАННЯ.
Розділ 3.1 Класифікація генетичних карт, оцінка
зчеплення.
Розділ 3.2 Соматична гібридизація, цитогенетичний
аналіз, картування анонімних послідовно-
ності ДНК.
Розділ 3.3 Генетичні індексні маркери.
Розділ 3.4 Хромосом-среціфіческіе бібліотеки генів,
пульсуючий гель-електрофорез.
Розділ 3.5 Позиційне клонування, прогулянка і стрибки
по хромосомі, ідентифікація та ізоляція ге-
нов.
Розділ 3.6 Каталог генів і генних хвороб Маккьюсик.
Міжнародна програма "Геном людини".
ГЛАВА IY. ТИПИ І НОМЕНКЛАТУРА Мутації. МЕТОДИ ДНК-
ДІАГНОСТИКИ.
Розділ 4.1 Мутантні алелі, характеристика і типи му-
Тацій.
Розділ 4.2 Генетична гетерогенність спадкових
захворювань.
Розділ 4.3 Номенклатура мутацій.
Розділ 4.4 Ідентифікація структурних мутацій, ізоляція
мутантних ДНК.
Розділ 4.5 Первинна ідентифікація точкових мутацій.
Розділ 4.6 Молекулярне сканування відомих мутацій.
ГЛАВА Y. Популяційна Аналіз мутацій. ЕНДОГЕННІ
МЕХАНІЗМИ спонтанного мутагенезу.
Розділ 5.1 Популяційний аналіз мутацій, поліморфізм,
нерівноважності по зчепленню.
Розділ 5.2 Частоти спонтанного мутагенезу.
Розділ 5.3 Ендогенні механізми виникнення мутацій.
Розділ 5.4 Механізми підтримки і розповсюдження му-
Тацій в популяціях.
ГЛАВА YI. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИЙ АНАЛІЗ експресії генів.
Розділ 6.1 Диференціальна активність генів, вибір
адекватних біологічних моделей.
Розділ 6.2 Аналіз регуляторних елементів гена, ізоляція
і дослідження мРНК, штучні
транскрипційні системи.
Розділ 6.3 Аналіз трансляції, ДНК-експресійна систе-
ми.
РОЗДІЛ VII. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ аспекти пренатального
ДІАГНОСТИКИ СПАДКОВИХ ХВОРОБ.
Розділ 7.1 Прямі та непрямі методи молекулярної діаг-
стики.
Розділ 7.2 ДНК-діагностика при різних типах спадщини-
вання.
Розділ 7.3 Групи ризику, пошук гетерозиготних носите-
лей мутацій.
Розділ 7.4 Особливості застосування молекулярних методів
в пренатальній діагностиці моногенних болез-
ній.
Розділ 7.5 доімплантаційної діагностика, загальна схема
пренатальної діагностики, точність прогнозувати
вання.
ГЛАВА YIII. БІОЛОГІЧНІ МОДЕЛІ СПАДКОВИХ ХВОРОБ
ЛЮДИНИ.
Розділ 8.1 Генетичні лінії тварин.
Розділ 8.2 Трансгенні тварини.
Розділ 8.3 Експериментальне моделювання.
Розділ 8.4 Конструювання модельних генетичних ли-
ний тварин.
Розділ 8.5 Методи направленого перенесення генів.
ГЛАВА IX. Генна терапія.
Розділ 9.1 Визначення, історична довідка, програми
генної терапії.
Розділ 9.2 Типи генотерапевтіческіх втручань, вибір
клітин-мішеней.
Розділ 9.3 Методи генетичної трансфекції в генній ті-
рапии.
Розділ 9.4 Конструювання векторних систем та вдосконалення-
налення методів трансформації клітин че-
ловека.
9.4.1 Основні векторні системи.
9.4.2 Методи фізичного перенесення чужорідної ДНК в
клітини еукаріот.
9.4.3 ліпосомних метод трансфекції.
9.4.4 Рекомбінантні віруси.
9.4.5 Перспективи створення "ідеальних" векторних
систем.
Розділ 9.5 Генотерапія моногенних спадкових захв-
ваний.
Розділ 9.6 Генотерапія неспадкових захворювань:
пухлини, інфекції.
Розділ 9.7 Деякі етичні та соціальні проблеми ген-
ної терапії.
Глава X. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕЯКИХ
Моногенних захворювань.
Розділ 10.1 Хромосомна локалізація і принципи класифіка-
фікації генів спадкових хвороб.
Розділ 10.2 Метаболічні дефекти лізосомних ферментів
тов. Хвороби накопичення.
Розділ 10.3 Хвороби експансії, викликані "динамічно-
мі "мутаціями.
Розділ 10.4 Моногенні спадкові хвороби, діагнос-
ностіруемие молекулярними методами в Росії.
10.4.1 Муковісцидоз.
10.4.2 міодистрофія Дюшенна.
10.4.3 Гемофілія А.
10.4.4 Гемофілія B.
10.4.5 Хвороба Віллебранда.
10.4.6 Фенілкетонурія.
10.4.7 Синдром Леш-Ніхана.
10.4.8 Хвороба Вільсона-Коновалова.
10.4.9 Адрено-генітальний синдром.
10.4.10 Спинальная м'язова атрофія.
10.4.11 Атаксія Фридрейха.
ВИСНОВОК.
ГЛАВА Y.
Популяційна Аналіз мутацій. Механізму спонтанного
Мутагенезу.
Розділ 5.1 Поліморфізм, нерівноважності по зчепленню.
Молекулярна ідентифікація мутантних алелів і розрив-
ботка ефективних методів їх діагностики у хворих та у Гете-
розіготних носіїв є тією експериментальної базою,
яка дозволяє досліджувати поширеність мутацій в
різних етнічних групах та популяціях. Одночасно віз-
можения аналіз зчеплення мутантних алелей з іншими генети-
тичними маркерами і оцінка на цій основі передбачуваних ме-
ханізмів виникнення і підтримки в популяції спостерігається-
мого рівня мінливості. Але перш ніж перейти до опису
основних цілей і методів популяційного аналізу мутацій оп-
рідшали більш точно два основних поняття, часто використовуваних
при проведенні подібних дослідженнях - це поняття полімор-
фізма і нерівноважності по зчепленню.
Генетична мінливість локусу в певній попу-
ляції вимірюється рівнем поліморфізму, і кількісним ви-
раженням цього заходу служать частоти алелів. У однолокусной
двухаллельной системі частоти двох варіантів алелів - А1 і
А2, позначаються літерами p і q, соответвственно, і (p + q = 1).
Коли ми говоримо, що в популяції існує поліморфізм за
мутації, це означає, що її частота вище певного виб-
ранного відповідно до якимись причинами умовного рів-
ня, найчастіше вище 5%. Високополіморфнимі вважаються локуси
з близькими значеннями частот алелей. У великих популяціях
з випадковим характером схрещування, тобто в панмікті-
чних популяціях, діє закон Харді-Вайнберга, згідно
якому частоти гомозиготних особин в популяції рівні p! 2 і
q! 2, соответстенно, а частка гетерозигот дорівнює 2pq. Таким об-
разом, в двухаллельной моделі частота гетерозигот в популяції
ції по поліморфним локусами становить від 10% і більше, а по
високополіморфним локусами може досягати 50%. Якщо число
алелів в локусі більше двох, загальна частота гетерозигот в
популяції дорівнює 1 - (p1! 2 + p2! 2 + ... + pn! 2), де pk -
частота алелі Ak, k = 1, 2, ... n і p1 + p2 + ... + Pn = 1.
При цьому частка гетерозигот в популяції зростає з збільшен-
ням числа алелей і досягає максимальної межі в каж-
дой групі з n алелів при рівності їх частот. Таким обра-
зом, при збільшенні числа алелей, що зустрічаються з рівними
ймовірностями, частота гетерозигот в популяції буде стре-
митися до одиниці, тобто подовляющее число особин у популяції
ції будуть гетерозиготними з даного локусу. Така ситуація
характерна для високополіморфних мікросателітних повторів, в
Зокрема STR, що і робить їх поряд з іншими преімущест-
вами найбільш зручними генетичними маркерами.
Як ми вже згадували, частими моногенними спадково-
вими захворюваннями вважаються такі, при яких один хворий
дитина зустрічається серед 2000 - 10000 новонароджених, то
є q! 2 коливається в межах 1 / 2000 - 1 / 10000. Від-
повідно, частота мутацій - q, в цих генах становить від
0.5% до 2.5% і частка гетерозиготних носіїв - 2pq, досягається-
ет 1% - 5%. Для більш рідкісних захворювань частоти гетерозигот
не перевищують десятих часток відсотка. Тим не менш, якщо
врахувати, що загальна кількість різних моногенних захворювань-
ний становить близько 5000 нозологій, виявляється, що, в
середньому, кожна людина є носієм мутантних алелей
близько десяти генів. У загальному випадку, набір цих генів разли-
че у різних людей, і лише в тих сім'ях, де обоє батьків
є носіями мутацій одного і того ж гена з'являється
25%-ий ризик народження хворої дитини.
До цих пір ми розглядали мінливість в одному локусі
- A. Поняття нерівноважності по зчепленню визначає ставлення-
ня між мінливістю в двох локусах - A і B. Ситуація
тут може бути двоякою. Якщо мінливість у цих локусах
незалежна, то алелі двох локусів зустрічаються в популяції в
випадкових комбінаціях. Однак, якщо алелі різних локусів
в одних комбінаціях зустрічаються частіше, ніж в інших, то гово-
рять, що існує неравновесность по зчепленню. Кіль-
венно цей зв'язок оцінюється за допомогою детермінанта нерівно-
весності по зчепленню - d. Розглянемо, чому дорівнює детерм-
Нант нерівноважності по зчепленню в двухлокусной двухаллель-
ної системі. Нехай Pnm, де n = 1,2 і m = 1,2, частоти чотирьох
можливих у цьому разі типів гамет - A1B1, A2B2, A1B2,
A2B1, а Pn і Rm - частоти алелів локусів A і B, від-
відповідно. Якщо поєднання алелей в гаметах випадкові, то
теоретично очікувані частоти гамет чотирьох типів рівні
твору частот входять у ці гамети алелів, тобто
Pnm = Pn * Rm. У цьому випадку твір частот двох типів га-
мет (A1B1 і A2B2), що знаходяться в стані "тяжіння",
дорівнює добутку частот гамет в стані "відштовхування"
(A1B2 і A2B1), тобто P11 * P22 = P1 * P2 * R1 * R2 = P12 * P21. Од-
нако, якщо поєднання алелей в гаметах невипадкові, то ці
твори різні. Їх різниця служить мірою нерівно-
весності по зчепленню - d. Отже d = | P11 * P22 - P12 * P21 | При
відсутності нерівноважності по зчепленню d = 0. Верхня гра-
Іваниця d = 0.25. Максимальна неравновесность по зчепленню
досягається при повній відсутності двох типів гамет, знаходячи-
щихся або в стані "тяжіння", або в стані "від-
талківанія ", при одночасному рівності частот залишилися
двох типів гамет.
Мутації в різних локусах виникають, як правило, не-
залежно один від одного і наявність нерівноважності по зчеплення-
нію, мабуть, відображає той факт, що мутація в одному з
локусів виникла в хромосомі, що несе певний аллель
іншого локусу, і далі ця хромосома отримала поширення
ня в популяції. Нерівноважності по зчепленню є дуже
важливою популяційної характеристикою, що дозволяє судити про
порядку і приблизний час виникнення різних мутацій,
а також оцінювати можливі механізми їх підтримки в попу-
ляції. Виявлення сильної нерівноважності по зчепленню між-
ду специфічними мутаціями гена і певними алелями
маркерних локусів має важливе практичне значення. Часто
спостерігається неравновесность по зчепленню між мутантними
алелями гена і одночасно кількома маркерними локусу-
ми. У цьому випадку аналіз маркерних гаплотипів, тобто так званих вели-
рів алелів різних локусів, локалізованих в одній хро-
мосом, дає можливість з високим ступенем ймовірності оце-
нивать характер мутаційного ушкодження і простежувати його
спадкування у сім'ях хворого.
Розділ 5.3 Частоти спонтанного мутагенезу.
Вважається, що середня частота спонтанного виникнення-
ня мутацій у структурних локусах людини коливається в пре-
справах від 10 (-5) до 10 (-6) на одну гамету за кожне покоління-
ня. Однак, ця величина може значно варіювати для
різних генів, змінюючись в межах від 10 (-4) для високомута-
більних локусів до 10 (-11) в найбільш стійких частинах ге-
нома. Ці відмінності залежать від багатьох факторів і, в першу
чергу, від характеру мутаційного ушкодження, від механізму
виникнення мутації і локалізації порушення. Велике зна-
чення також має сам ген, протяжність його кодують про-
ластей і ті функції, які виконують контрольовані ним мо-
молекули в забезпеченні життєдіяльності клітин і всього орга-
нізіа, в цілому. Так наприклад, порушення роботи генів, про-
продукція яких необхідна на ранніх стадіях ембріогенезу,
може призводити до загибелі плоду. Такі мутації важкі для ді-
агностики і в практичній медицині ми найчастіше маємо справу
тільки з тими мутаціями, які не виявляють летального еф-
фекта на ранніх стадіях ембріонального розвитку. Тим ні ме-
неї, не виключено, що ранні ембріональні літали складаючи-
ет чималий відсоток серед мутантних алелей різних генів і
вносять певний внесок у зниження репродуктивної функції.
Особливої уваги заслуговує проблема мутірованія в
STR-сайтах і в VNTR-локусах, часто використовуваних в даний
час для геномної дактилоскопії та молекулярної діагностики.
Ці ділянки геному, мінливість у яких обумовлена раз-
лічіямі в числі тандемних повторів, формально можна віднести
до розряду високомутабільних. Зауважимо відразу, однак, що пря-
моє зіставлення темпів мутірованія в кодують областях
геному і в міні-і мікро послідовностях ДНК,
мабуть, некоректно, тому що фізична основа мінливості-
вості, що спостерігається в цих функціонально і структурно разли-
чающих локусах зовсім різна. Мутабільность в
STR-сайтах обумовлена нестабільністю числа повторів, при-
ніж виникають мутації зачіпають, як правило, лише весь-
ма обмежене число кластерірованних копій, найчастіше 1
або 2. Подібні тандемні повтори рідко спостерігаються в
смислових послідовностях ДНК. Виняток становлять
лише мутації експансії, але і для них характерно (1) існу-
вованіе великого числа алелей дикого типу, що відрізняються
один від одного невеликим числом копій, і (2) значні
відмінності по довжині повторюваного ділянки між нормальними і
мутантними варіантами гена. Крім того, мінливість в
STR-сайтах в основі своїй носить нейтральний характер і пото-
му темп мутації в цих локусах не схильний до жорсткого
контролю з боку природного відбору.
Прямі дослідження показали, що в більшості випадків
частота виникнення спонтанних мутацій в мікро
STR-сайтах варіює в межах від 0.1% до 0.45% на гамету,
що повинно враховуватися при використанні цих маркерів у
практичній медицині. Частота мутації в вариабильность
(CA) n-повторах, використовуваних як індексних маркерів
в Genethon - картах зчеплення становить 0.05% на гамету.
Показано, що для ряду VNTR-локусів (MSB2) частота мутірова-
ня досягає 0.7% на гамету. Для інших локусів (М17) попере-
ружено достовірне перевищення швидкості мутагенезу в зарод-
шевих клітинах порівняно з соматичними. Для багатьох
достатньо стабільних STR-локусів виявлені суттєві
міжпопуляційних відмінності за частотою алелів, що дозволяє
використовувати цю мінливість для генетичної характеристи-
ки окремих популяцій. У той же час інші STR-сайти зна-
засідання частіше піддаються спонтанного мутирование, що при-
водить до врівноваження патерну алелів і робить ці марки-
ри малопридатними для популяційних досліджень. Є
дані, що в найбільш вариабильность STR-локусах частота
спонтанних мутацій може досягати 5% на гамету за покоління
(Jeffreys et al., 1988).
Розділ 5.3. Ендогенні механізми виникнення мутацій.
Основну частину мутацій, що ведуть до спадкових болез-
ням, складають точкові мутації, делеції і в меншою мірою-
ні інсерцій і дуплікації. При цьому, як показує детальний
порівняльний аналіз, частота, тип і локалізація цих мута-
ций аж ніяк невипадкові і залежать від багатьох, поки ще неви-
яснення ендогенних механізмів мутагенезу. На користь такого
виведення свідчить унікальний характер спектру мутацій
для кожного з багатьох десятків генів, первинна структура
ДНК і типи мутацій яких вже добре вивчені. Так, для мно-
гих структурних генів домінуючими по спектру і частоті яв-
ляють точкові мутації (ген трансмембранного регуляторного
білка муковісцидозу, ген фенілаланінгідроксилази, ген факто-
ра IX cвертиванія крові, бета-глобинового ген і мн ін), тог-
та як для інших - досить протяжні структурні пе-
ребудови типу делецій, дуплікацій і інсерцій (гени дистро-
фіна, фактора VIII згортання крові, 21-гідроксилази)
(См.главу X). До структурних факторів, що визначають ендогенними-
ні механізми мутагенезу, можна віднести (1) наявність прямих і
зворотних повторів і симетричних елементів поблизу місця пе-
ребудови, (2) високу концентрація СpG динуклеотид, (3)
наявність внегенних послідовностей ДНК, гомологічних
фрагментами структурного гена; (4) мобільні елементи геному.
Природно, що реалізація цих структурних чинників у ті
чи інші типи мутацій можлива лише в процесі реплікації
(1,2) і рекомбінації (3) ДНК хромосом.
Як докладно розглянуто в серії робіт DN Cooper і
M. Кrawczak (1990, 1991), наявність в первинній структурі ДНК
прямих повторів, ідентичних повторюваних послідовник-
ностей, інвертованих повторів, шпилькових структур, квазі-
паліндромний послідовностей і симетричних елементів
генома (наприклад CTGAAGTC) нерідко веде до утворення пе-
тель при реплікації ДНК внаслідок ковзаючого порушення
спарювання (slipping mispairing) батьківської та дочірньої це-
пий ДНК. Ці нові структурні елементи ДНК або знищений-
ються ферментами системи репарації, що веде до делеція, чи-
бо зберігаються і дублюються, що призводить до дуплікації і
інсерцій, при цьому дані зміни закріплюються за
подальших раундах реплікації. Автори приходять до наступних
висновків: (1) виникнення подібних мутацій відбувається
невипадково, але залежить від особливостей первинної структури
ДНК в місці перебудови; (2) в основі структурних перебудов
ДНК лежать помилки реплікації, (3) принципово подібні моді-
Чи ендогенного мутагенезу характерні як для делецій, так і
для інсерцій. Вважається, що саме механізм ковзаючого на-
рушення спарювання відповідальний за мутації експансії, приво-
дящіе до швидкого збільшення числа трінуклеотідних повторів і
до порушення роботи відповідних генів, а також за високу
мінливість, що спостерігається в багатьох місцях локалізації міні-
і мікросателлтних тандемних повторів.
Нещодавно показано, що підвищеною ендогенної мутаген-
ністю мають взагалі всі послідовності ДНК, які знахо-
дяться в певному конформаційних станів, а саме в
стані вигину (bent DNA) (Milot et al., 1992). Відомо,
що така конформационная структура ДНК властива промо-
битим частинам генів, місць початку реплікації (origins of
replication), місцям контакту хромосом з ядерним матриксом.
Саме ці ділянки ДНК є місцями посадки ферментів
топоізомераз, залучених в процеси реплікації, транскріп-
ції, рекобінаціі, в тому числі, як виявилося, і в процес
негомологичностью (незаконної-illegitimate) рекомбнаціі. Уста-
новлено, що саме негомологичностью рекомбінація може приво-
дить не тільки до внутрігенним делеція, дуплікації і іншим
мутацій на молекулярному рівні, але і є однією з
основних причин великих структурних хромосомних перебудов
типу транслокацій, інверсій та інших.
Заміни або втрати окремих підстав у геномної ДНК
можуть виникати в результаті порушення процесів реплікації
і репарації. Помилки в ДНК матриці, викликані дією пов-
реждающіх зовнішніх агентів, або спонтанної деградацією осно-
ваний закріплюються в наступних циклах реплікації. Основні
типи спонтанної деградації включають втрату підстав і про-
цес дезамінування. Особливо чутливі до дезамінірова-
нію цитозинових залишки. Встановлено, що у хребетних поч-
ти половина всіх цитозинових залишків в ДНК метиловано в
П'ятому положенні. Процес метилювання особливо часто захва-
ють області повторів 5'CpG 3 ', розташовані як усередині
генів, так і в їх промоторних частинах. При дезамінування
5-метилцитозин перетворюється на тимін. У циклі подальшої
реплікації, що виник в результаті дезамінування місметч
(TG) може або корегуватимуться в нормальний варіант (С-G),
або приводити до мутацій типу трансцізій (Т-G) або (С-А).
Природно, що гени, які мають у своїй структурі великий
відсоток CpG підстав, особливо часто піддаються спонтан-
ному мутирование типу трансцізій. Зокрема, переважання
подібних точкових мутацій відомо для генів чинників IX і
VIII згортання крові, для гена фенілкетонурії та інших.
Так, з 76 мутацій гена фактора IX у 21 випадку знайдені
трансцізіі CpG - TpG або СРА (Green et al., 1990). Переважали
ня таких мутацій відзначено і в 22 CpG дуплету гена феніла-
ланінгідроксілази у хворих на фенілкетонурію (Abadie et
al., 1989).
Іншим важливим чинником ендогенного мутагенезу є
наявність тісно зчеплених з генами гомологічних послідовно-
ності ДНК (псевдогенами). У мейозі така ситуація неред-
до призводить до нерівної гомологічною рекомбінації і, як
наслідок цього, до генної конверсії, що супроводжується струк-
турних перебудовами типу делецій, дуплікацій і т.п. Подоб-
ний механізм мутацій, як виявилося, є домінуючим
ри були розроблені для всіх 22 аутосом і для Х-хромосоми.
Реєстрація алелів всіх STR проводилася автоматичним
сканером з використанням комп'ютерної програми Genotyper.
Тільки з допомогою одного автоматичного сканера вдається
проаналізувати за цією схемою більше 2.5 тисяч генотипів в
день! (Reed et al., 1994). Така система вже сьогодні відкривають-
ет найширші можливості не тільки для генетичного
картування і створення докладних карт зчеплення практично
будь-яких моногенних захворювань, але, що особливо істотно,
вона робить реальною розробку стратегії картування генів,
мутації яких привертають до мультифакторіальних забо-
Левану, таким як діабет, гіпертонія, інфаркт міокарда,
психози та багато іншого.
Розділ 3.4 Хромосом-специфічні бібліотеки генів,
пульсуючий гель-електрофорез.
Використовуючи настільки велику систему молекулярних маркерів
і проводячи аналіз зчеплення на колекціях клітинних культур
або на матеріалі інформативних родоводів можна досить
швидко прив'язати будь-яка ознака, особливо моногенних, не
тільки до певної хромосомі, але навіть до одного бенду, оп-
ределить найближчі фланкирующие маркери і перейти не-
посередньо до позиційного клонування з метою виділення
та ідентифікації самого гена. У зв'язку з цим важливе значення в
картуванні генів належить молекулярно-цитогенетичним
підходам, що є принципово важливою ланкою для успеш-
ного поєднання карт зчеплення і фізичних карт цілих хро-
мосом та їх фрагментів.
Точність цитогенетичного картування визначається
ступенем спіралізаціі хромосом, характером використаної
мітки і роздільною здатністю мікроскопічного устатку-
вання. При картуванні на стандартних метафазних хромосомах
і використанні радіоактивно мічених зондів точність карти-
вання обмежується одним великим бендом або навіть сег-
тому хромосоми і становить близько 5-10 мільйонів п.о. При
використанні біотіновой мітки на прометафазних хромосомах
точність картування зростає в середньому в 5-10 разів (до 1
мільйона п.о.), а при роботі зі спеціально приготованими і
розтягнутими інтерфазних хромосомами може доходити до 50
тисяч п.о. (Boehringer Mannheim Mannual, 1992). Тим не менш,
навіть при такій роздільній здатності цитогенетичне кар-
ння дає лише дуже орієнтовні результати і Оби-
чно розглядається як 1-й етап фізичного картування.
Значно більш точні результати досягаються на 2-му
етапі - етапі фізичного (рестрикційного) картування.
Середня відстань між стандартними сайтами впізнавання на
рестрикційних картах коливається в межах від 10 до 20 кб.
З-за розбіжностей майже на два порядки масштабів цітогенеті-
чного та молекулярного картування пряме зіставлення
цих типів фізичних карт практично неможливо.
Одним із способів подолання цих труднощів є
конструювання хромосом-специфічних бібліотек генів. Як
вже згадувалося (см.главу I, 1.5) для приготування таких
бібліотек використовують набори клітинних ліній соматичних ги-
бріди з окремими хромосомами людини або хромосоми, ме-
ханических відібрані шляхом проточної цитометрії. Для деяких-
яких видів молекулярного клонування зручніше виявилися біб-
ліотека генів, побудовані з субхромосомальних фрагментів.
Отримання таких фрагментів досягається шляхом цілеспрямованої діяльності,
ного конструювання соматичних гібридів, що містять лише
частина якої-небудь хромосоми людини. Субхромосомние клони
можуть бути отримані і за допомогою мікроманіпуляцій, при кото-
яких механічно, під контролем мікроманіпулятори може бути
вирізаний практично будь-який видимий фрагмент кожної хромосоми.
Розроблено також молекулярні методи виділення з генома і
ідентифікації великих фрагментів ДНК, що наближаються за раз-
заходам до одиничних хромосомним бендом. Це стало можливим
після виявлення редкощепящіх рестриктаз, розрізають ДНК
на фрагменти довжиною від сотень тисяч до мільйона пар нуклеоті-
дів (Estivill, Williamson, 1987).
Іншим важливим кроком на шляху клонування та аналізу
великих субхромосомальних фрагментів ДНК є розробка
методів їх розділення гель-електрофорезу в пульсуючого-
щем полі (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smith
et al., 1987). У відповідності зі стандартними методами
електрофорезу під дією односпрямованого постійного
поля в агарозному або в поліакриламідному гелях вдається поділу-
лять фрагменти ДНК розміром не більше 3 - 5 десятків кілобаз.
Просування великих фрагментів ДНК в гелі при пульсуючому
зміні напрямку електричного поля відбувається, по
Мабуть, за рахунок конформаційних змін, обумовлених
скручуванням і розкручуванням молекул ДНК у момент переклю-
чення напрямку поля. При цьому більш короткі молекули
легше адаптуються до зміни умов і тому рухаються в
гелі швидше. Існують різні варіанти пульсуючого
гель-електрофорезу, головним чином, пов'язані з геометри-
ного розташуванням напрямків полів - ортогональний,
гексогональний, інверсійний. При використанні будь-якого з
цих варіантів можуть бути розділені молекули ДНК розміром від
50 кб до більш, як 9 мільйонів п.о. Ефективність розділі-
ня фрагментів ДНК залежить не тільки від їх розмірів, а й від
умов проведення електрофорезу (напруга, температура
буфера, концентрація агарози, час одного імпульсу). У ка-
честве маркерів для визначення величини великих молекул ДНК
використовують цілі хромосоми дріжджів відомої молекулярної
маси. Надалі відбір великих фрагментів ДНК, що несуть
специфічні послідовності, також може бути здійсненим-
влені шляхом блот-гібридизації з ДНК-зондами. Розділені і
ідентифіковані фрагменти ДНК можуть бути елюіровани з
гелю і використані для рестрикційного картування, пост-
роїння бібліотек генів і для молекулярного клонування з
метою ідентифікації та ізоляції генних послідовностей. У
Останнім часом для ізоляції великих субхромосомальних сег-
ментів ДНК широко використовується метод клонування в
штучних дріжджових мініхромосомах - YAC, та побудови
бібліотек генів на основі YAC-векторів.
Розділ 3.5 Позиційне клонування, прогулянка і стрибки
по хромосомі, ідентифікація та ізоляція генів.
Ми вже згадували, що середні розміри гена складають
близько 10-30 кб, варіюючи в широких межах (см.главу II.2.
4). Одиниці рекомбінації, розміри цитогенетичних бендів
і субхромосомних фрагментів ДНК вимірюються мільйонами пар
нуклеотидів, також як і розміри фрагментів ДНК, що виділяються
за допомогою обробки геномної ДНК редкощепящімі ендонуклеаза-
ми, пульсуючого електрофорезу і клонування в дріжджових
мініхромосомах. Перехід від цих великих фрагментів до після-
довність ДНК, порівнянними з розмірами гена, здійснювала-
нюється за допомогою молекулярного клонування, тобто отри-
ня набору фагових або космідних клонів, що містять відноси-
тельно невеликі послідовності, насичується або пів-
ністю перекривають великий сегмент ДНК, імовірно
містить ідентифікований ген (Рис.3.5). Потім проводять
упорядкування клонів відповідно до взаємним расположени-
ем інсертірованних в них фрагментів ДНК, здійснюючи однова-
ременно молекулярний аналіз цих фрагментів з метою ідентифікації
фікації регуляторних або кодують областей генів. Пізніше
ми докладніше зупинимося на тих критеріях, за допомогою яких
можна розрізнити транскрибуються і нетранскрібіруемие учас-
ки геному. Для молекулярного клонування використовують різноманіт-
ні підходи (Iannuzzi, Collins, 1990). Перш за все, це
насичують клонування, тобто ізоляція з хромосом-спеці-
чних бібліотек декількох сотень клонів з метою картуються-
вання різними методами інсертірованних в них фрагментів
ДНК та ідентифікації клонів з послідовностями, локалізованих
ванними в заданому районі. Значно частіше використовується
тактика скрінірованія фагових, космідних і YAC бібліотек,
сконструйованих з субхромосомальних сегментів ДНК, перед-
ньо відібраних на підставі зчеплення з різними
ДНК-маркерами. При цьому методи виділення субхромосомальних
сегментів ДНК можуть бути самими різними. Подальший пошук
в бібліотеках генів клонів, що містять транскрибуються
послідовності ДНК, здійснюють досить трудомісткими
методами, що одержали назву "прогулянки" і "стрибків" за
хромосомі.
"Прогулянка" по хромосомі або ковзне зондування
(Рис.3.6). полягає в послідовному відборі клонів, зі-
тримають частково перекриваються фрагменти ДНК із визна-
ленного району генома (Rommens et al., 1989). На першому етапі
проводять скринінг бібліотеки за допомогою маркерною ДНК, зчеп-
ленній з геном. Після знаходження позитивних клонів
останні самі служать зондами для ізоляції інших клонів,
містять перекриваються послідовності ДНК. Таким об-
разом, щоразу відібраний фрагмент використовується в якості-
ве скрінірующего ДНК-зонда для подальшого пошуку. У ре-
док получют набір клонованих фрагментів ДНК, пів-
ністю перекривають область пошуку гена. Група подібних
клонів носить назву "контігов". За допомогою фізичного кар-
тування інсертірованной ДНК у різних клонах вдається точно
встановити ступінь перекривання між сусідніми фрагментами
і відповідно порядок становище клонів в "контігах".
При скрінірованія космідних бібліотек з виявленням кожного
нового клону до ділянки ДНК, повністю перекритому відібрані-
ми зондами, в середньому додається близько 20 кб. Таким спосо-
бом, однак, рідко вдається пройти більше 200 - 300 кб в одному
напрямі через наявність в геномі повторюваних і важко
клонованої послідовностей ДНК.
Для подолання цих обмежень і прискорення процесу
пошуку генних послідовностей американським дослідним-
лем Френком Коллінзом, нині президентом Програми Геном Че-
ної людини, був розроблений метод "стрибків" по хромосомі. Цей
метод дозволяє ізолювати фрагменти ДНК, віддалені в гено-
ме один від одного на сотні тисяч нуклеотидів (довжина стрибка),
не ізолюючи при цьому всі проміжні послідовності
ДНК (Collins, Weissman, 1984). Як видно на представленій
схемою (Рис.3.7), стрибки починаються зі стартового зонда, то
тобто з послідовності, гибрідизуючою зі зчепленим з
геном ДНК-маркером. Попередньо геномна ДНК переварюючи-
ється редкощепящей рестриктазою, в результаті чого утворюються
великі фрагменти ДНК, які відповідають за довжиною одному Прижов-
ку. Потім, ці фрагменти переводяться в кільцеву форму за
рахунок штучного приєднання до їх кінців невеликого
маркерного гена. При цьому кінці рестрикційних фрагментів
зближуються. Кільцеві молекули ДНК розрізають среднещепящімі
рестріктазами і з пулу відносно невеликих фрагментів
ДНК відбирають ті, які містять маркерний ген, а, таким чи-
тельно, і навколишні його кінцеві ділянки вихідних великих
фрагментів. Відібрані послідовності клонують в фаго-
вих або космідних векторах, отримуючи бібліотеку генів кінці-
вих ділянок. Потім в цій бібліотеці проводять скринінг кло-
нов, які містять стартовий зонд. Тільки в цих клонах компле-
ментарное зонду послідовності з'єднані маркерним геном
з послідовностями ДНК, віддаленими від стартової ділянки
пошуку на довжину стрибка. При необхідності проміжні сег-
менти ДНК також можуть бути клоновані з використанням ме-
тода ковзаючого зондування.
Зупинимося тепер на тих критеріях, за якими можна
відрізнити сегменти ДНК, які є частинами генів, від будь-яких
інших послідовностей (Рис.3.7.) (Lindsay, Bird, 1987;
Rommens et al., 1989; Wicking, Williamson, 1991; Collins,
1992). Умовно ці критерії можуть бути розділені на три
групи. У першій групі досліджують структурні особливості
генних послідовностей. Друга група критеріїв заснована
на пошуку функціональних ділянок генів. У третьому випадку
аналізують характер нуклеотидних послідовностей тести-
ються фрагментів ДНК. Діагностику структурних ділянок ге-
нов здійснюють шляхом гібридизації з ДНК-зондами або прямим
скрінірованія кДНК-ових бібліотек. Функціональна діаг-
ностика генів включає уловлювання екзонів (exon trapping),
промоторних ділянок, полі-A сигнальних послідовностей,
а також перенесення генів в інші конструкції та ідентифікацію в
них відповідних транскриптів. І, нарешті, пошук генів
може бути здійснено шляхом прямого секвенування великих
фрагментів ДНК з подальшим комп'ютерним аналізом нуклео-
тідной послідовності і зіставленням її з присутній-
щими в базах даних ідентифікованими генами інших видів
живих істот.
Як вже відзначалося раніше, що кодують області генів,
представлені в геномі унікальними послідовностями,
досить консервативні в процесі еволюції. Існує
високий відсоток гомології в структурі ДНК між однаковими
генами у різних видів ссавців. На цьому факті грунтується,
так званий зоо-блот - скринінг клонованих послідовно-
ності, що не містять повторів, але дають перехресну
гібридизацію з геномної ДНК, виділеної з різних видів жи-
Вотня - приматів, сільськогосподарських тварин, гризунів,
птахів, рептилій. Клони, що містять консервативні послідовно-
ності, піддають подальшому аналізу на присутність у
інсертірованних фрагментах ДНК CpG острівців, часто маркування
чих 5'-фланкирующие області генів хребетних, особливо ге-
нов домашнього господарства (см.главу II, 2.4), і досліджують на-
відмінність відкритих рамок зчитування-ORF (open reading frames).
Подальший пошук генів у більш вузькому інтервалі може бути
здійснено за допомогою комп'ютерного аналізу відповідної
нуклеотидної послідовності ДНК. Крім того, всі клони-
рова ДНК з цього інтервалу можуть бути відразу використанням
ни для аналізу РНК-транскриптів (Iannuzzi, Collins, 1990).
Важливим доказом приналежності клонованої ДНК
гену є ідентифікація гомологічних РНК транскриптів в
тканинах, де можна припускати експресію цього гена. З цією
метою проводять гібридизацію вже відібраних за першими двома
критеріям клонів ДНК з тотальною мРНК, виділеної з цих
тканин, а також скрініруют відповідні кДНК-ові бібліо-
патьоки. Для генів спадкових захворювань з невідомим
первинним біохімічним дефектом бібліотеки конструюють з
уражених органів і тканин. При виявленні послідовник-
ностей кДНК, гибрідизуючою з геномними зондами, їх, в свою
чергу, використовують для зондування бібліотеки та виявлення
всіх клонів з перекриваються послідовностями кДНК. До
жаль, для генів з низьким рівнем експресії гибрідизуючою-
ція може не дати позитивних результатів.
Виділені клони, задовольняють переліченим крите-
ріям, з великою ймовірністю містять послідовності ДНК,
є частинами гена. Проте, завжди існує небезпека
вибору якогось іншого гена (або псевдогени), локалізована-
ного в тій же області ДНК. Тому потрібні додаткові
доказу ідентичності обраній послідовності ДНК
специфічного гену. Такі докази можуть бути отри-
ни, наприклад, при визначенні нуклеотидної послідовності
ності кДНК і зіставленні її з амінокислотної послідовності
тельностью кодується цим геном білка. Вагомим доказів-
давством на користь правильності проведеної ідентифікації
гена може бути виявлення мутантних варіантів алелів в
ізольованих послідовностях ДНК у хворих, що страждають
відповідним спадковим захворюванням. Так, наприклад,
при ідентифікації гена муковісцидозу, у 70% хворих у клони-
руемой кДНК послідовності була виявлена однотипна
мутація - делеція трьох нуклеотидів - delF508. Нарешті, реша-
ючим аргументом правильності ідентифікації потрібного гена яв-
ляется успішно здійснена з його допомогою генокоррекція
первинного біохімічного дефекту, виконана на відповід-
відних культурах мутантних клітин, або отримання стій-
кого терапевтичного ефекту у трансгенних тварин - біо-
логічних моделей даного спадкового захворювання.
Визначення розміру молекул мРНК, гибрідизуючою з ге-
автономних клонами, дає оцінку сумарної величини гена. Ця
оцінка має важливе значення для реконструювання полнораз-
мірної кДНК. Її клонування, по-суті, означає ідентіфікаію
гена, так як дозволяє визначити його межі геномної
ДНК, охарактеризувати його екзонів-інтронів структуру і ре-
ного елементи. Знаючи первинну нуклеотидну послідовність
ність кДНК, можна з упевненістю прогнозувати аміно-
для гена 21-гідроксилази (Morel, Miller, 1991), а також для
гена фактора VIII згортання крові (Lakich et al., 1993).
Важлива роль помилок рекобінаціі в етіології структурних поло-
мок гена особливо очевидна при аналізі гена дистрофина, му-
тації якого ведуть до міопатії Дюшенна. Відомо, що в 60%
випадків мутації цього гена є делеції, зах-
охоплювала б один або кілька сусідніх екзонів. Відомо
також, що переважна більшість делецій зосереджено в
двох "гарячих" районах цього гігантського за розмірами гена
(2,2 Мб), і при цьому частота внутрігенних рекомбінацій майже
в 4 рази більше, ніж можна припускати, виходячи з його раз-
меров (Oudet et al., 1992). Цікаво відзначити, що в одній
з цих гарячих точок (Інтрон 7) нещодавно було виявлено кластер
транспозоноподобних повторюваних послідовностей.
Питома вага мобільних (транспозонподібного) елементів типу
Alu і Line повторів (див. Главу 2) у виникненні генних му-
Тацій до кінця не з'ясований. Є поодинокі спостереження про
реальному перемещніі цих елементів за типом конверсії та їх
інтеграції в структурні гени аденозіндезамінази, аполіпоп-
ротеіна С, факторів VIII і IX згортання крові, кальмодулі-
на (Vidaud et al., 1993).
Розділ 5.4 Механізми підтримки і розповсюдження му-
Тацій в популяціях.
Частоти і характер розподілу мутацій в популяціях
залежать від багатьох факторів, головними з яких є
частоти мутагенезу і тиск природного відбору. Значи-
валий вплив на цей процес надають також структурні
особливості популяцій, такі як розміри, ступінь географи-
чеський і етнічної ізольованості, величина інбридингу,
характер міграції населення.
Для всіх мутацій, що виникають за рахунок підвищеного рів-
ня спонтанного мутагенезу, характерні наступні особливості
- Невипадковий характер внутрігенной локалізації мутацій,
схожість типів порушень при відсутності повної молекулярної
ідентичності між ними. На відміну від спонтанних мутацій,
викликаються ендогенними причинами, для мутацій, індукований-
них дією несприятливих факторів зовнішнього середовища, про-
промисловими і сільськогосподарськими шкідливостями, іонізуючим
опроміненням, хімічними агентами і іншим, специфіки в типах
мутацій і у характері їх локалізації не спостерігається. У попові-
ляціях, що знаходяться в сфері дії таких несприятливих
факторів, буде підвищена частота мутацій в різних генах,
однак спектр індукованих мутацій буде досить різно-
образним.
Розглянемо тепер вплив відбору на процес підтримання
ня та розповсюдження мутацій в популяціях. Багато генів мо-
генного спадкових захворювань рецесивні, тобто му-
тації у них в гетерозиготному стані не роблять шкідливого
впливу на життєздатність. Тому після виникнення му-
тація може поширюватися в популяції до певної
концентрації, практично не піддаючись елімінувальних
дії природного відбору. Надалі частота цієї му-
тації досягне рівноважного стану і не буде підвищуватися
за рахунок відщепленні гомозиготних особин, життєздатність і
репродуктивні якості яких різко знижені. При цьому ско-
кість елімінації мутації з популяції різко сповільнюється при
зниження її частоти і, практично, після виникнення му-
тація може зберігатися в популяції протягом багатьох
десятків і навіть сотень поколінь. Різні мутації можуть
випадковим чином отримати більше поширення в ізольованих-
ваних популяціях або серед груп населення, що відрізняються
підвищеним рівнем інбридингу. У цілому, за відсутності дав-
лення відбору по відношенню до гетерозиготним особинам загальна кон-
центрация мутантних алелей в популяції визначається часто-
тій їх спонтанного виникнення, при цьому пул мутацій буде
складатися з великої кількості різноманітних алелів, кож-
кожний з яких буде представлений рідкісними або навіть одиничними
випадками в різних популяціях.
Однак, специфічні мутації можуть отримати значи-
тельно більш широке розповсюдження в тих випадках, коли
гетерозиготні особини мають які-небудь селективні переваж-
вин. Таким ефектом може володіти сама мутація, але більш
ймовірна можливість нерівноважності по зчепленню між цією
мутацією і селективними алелями іншого локусу. Гетерозіго-
ти можуть отримати перевагу при зміні умов навколиш-
ющей середовища, в якихось екстремальних ситуаціях або серед
певних груп населення. Так наприклад, мутації, підвищують-
ющие стійкість організму до дії інфекційних агентів,
можуть одержати широке поширення в період масових
епідемій. Одночасно підвищиться частота всіх алелів інших
локусів, що знаходяться в нерівноважності по зчепленню з даною
мутацією. Мутантні алелі, що забезпечують селективну перева-
важливіших конкурентних переваг гетерозигот, стають переважаючими в багатьох
популяціях, не повністю ізольованих один від одного. При
цьому найбільша частота таких алелів буде наблюдатеся в ра-
йонах, де вплив підтримує відбору було максимальним
(Наприклад, в епіцентрі епідемії). У міру віддалення від цього
району концентрація таких мутантних алелей буде змен-
шаться, причому їх розподіл в різних популяціях буде
корелювати з характером міграції населення. Подібний ха-
рактер розподілу певного мутантного алеля в
частково ізольованих популяціях прийнято пов'язувати з так
званим ефектом засновника або родоначальника.
Дослідження спектрів розподілу мутацій у різних
них популяціях дозволяє робити припущення щодо
можливого походження таких пошкоджень і тих механізмів,
які лежать в основі їх розповсюдження серед населення.
Розглянемо найбільш ймовірні інтерпретації різних
варіантів розподілу алелів у популяціях. Мутації,
представлені у поодиноких хворих або в групі споріднених
індивідуумів і не мають специфічної внутрігенной локалі-
зації, мабуть, є наслідком природного мута-
ційного процесу. Якщо в якихось популяціях концентрація
мутацій у різних генах підвищена, ймовірно, вони перебувають
в зоні дії зовнішніх несприятливих чинників, індукують-
ють виникнення порушень у структурі ДНК. У тих випадках,
коли локалізація і типи мутацій носять специфічний харак-
тер можна припускати наявність особливих молекулярних механіз-
мов контролю підвищеного рівня мутагенезу в определеннного
районах геному. Поширення специфічних мутацій у з-
ваною популяціях відбувається за рахунок їх обмеженого
розміру і підвищеного рівня інбридингу (ефект родоначаль-
ника). І, нарешті, виявлення градієнтного розподілу
мутацій, що превалюють у різних, частково ізольованих
популяціях дозволяє припускати селективну перевагу
гетерозиготних носіїв мутацій на певних етапах ево-
люціонной розвитку.
Таким чином, зіставляючи спектри розподілу одно-
тіпних мутацій у жителів різних континентів, різних країн, у
людей, що належать до різних рас і національностей
можна визначити ступінь генетичної близькості між усіма
цими групами і реконструювати їх філогенетичні відно-
лення (Cavalli-Sforza, Piazza, 1993). Одним з практичних
наслідків цих досліджень є можливість прогнозувати-
вать найбільш ймовірні мутації в різних генах у пацієнтів
тов різного етнічного походження, що призводить до звуження
нію спектру пошуку специфічних мутацій. Особливий інтерес у
цьому сенсі представляють найбільш поширені мутації
(Наприклад delF508 при муковісцидозі; R408W - при фенілкето-
Нурії і багато інших). Для профілактики спадкових за-
ахворювань необхідна розробка ефективних і простих мето-
дов молекулярної діагностики таких мутацій як у хворих,
так і в гетерозиготних носіїв з метою проведення скрін-
ючий програм серед населення та виявлення максимально мож-
мужнього числа сімей з підвищеним ризиком народження хворої
дитини.
РОЗДІЛ VII.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ аспекти пренатального Діаг-
Ностика СПАДКОВИХ ЗАХВОРЮВАНЬ.
Розділ 7.1 Прямі та непрямі методи молекулярної діаг-
стики.
Локалізація і клонування кДНК-ових послідовності-
тей генів відкривають принципово нові можливості діагнос-
тики спадкових захворювань, засновані на дослідженні
мутантних алелей у пацієнтів, членів їх сімей або у припускає-
додаються гетерозиготних носіїв патологічних мутацій.
Це в рівній мірі відноситься і до пренатальної діагностики,
яка може бути проведена з використанням молекулярних
методів аналізу на самих ранніх стадіях розвитку плоду
(См.7.5). Ці ж підходи цілком прийнятні для діагностики до
появи будь-яких клінічних або біохімічних симптомів
хвороби (досімптоматіческая діагностика), що дозволяє ви-
працювати і почати раціональну тактику лікування (упереджувальний
терапія), а також ефективно виявляти гетерозиготних носите-
лей в родинах високого ризику, що є важливим чинником
профілактики спадкових хвороб. Вирішальними преімущест-
вами молекулярної діагностики є її універсальність,
можливість використовувати для аналізу будь-ДН-містять
клітини або тканини, причому аналіз може бути проведений на лю-
Бих стадіях онтогенезу, починаючи зі стадії зиготи.
Принципово розрізняють пряму і непряму ДНК-діагнос-
тику мононогенних спадкових хвороб. У загальному випадку,
використання прямих методів діагностики можливо лише для
клонованих генів з відомою нуклеотидної послідовності
ністю повнорозмірною кДНК, при цьому необхідно попередньо
валий генотипування мутантних алелей у батьків. У
разі прямої діагностики обьектом молекулярного аналізу яв-
ляется сам ген, точніше мутації цього гена, ідентифікація ко-
торих і становить основну задачу дослідження. Такий під-
хід особливо ефективний при наявності точної інформації про при-
роді, частоту та локалізацію найбільш поширених (доми-
нірующіх за частотою) мутацій відповідних генів, а також
про наявність у них особливо легко мутуючий "гарячих" точок. До
таких належать мутація delF508 і ряд інших мутацій при
муковісцидозі, делеційного мутації при міодистрофії Дюшенна,
мутація R408W при фенілкетонурії, інверсійна мутація при
гемофілії А, протяжна делеція при адрено-генітальний
синдромі, експансії триплетних повторів у випадку "динамічний
ких "мутацій при синдромі ламкої X-хромосоми і при ряді дру-
гих нейродегенеративних захворювань (див. Глави IV та X). Ме-
тоди, використовувані для спрямованого пошуку цих мутацій,
детально розглянуті в Главі IV. У ряді випадків (муковісці-
доз, фенілкетонурія, серповидно-клітинна анемія) ці методи
вдалося автоматизувати, що дозволяє одноверменно тести-
ровать відразу кілька (до 30 і більше) різних мутацій.
При цьому з'являється реальна можливість виявляти понад
95-98% мутантних хромосом, що робить доцільним і еко-
номічного виправданим скрінірованія всієї популяції окремих
країн на виявлення мутантних особин для подальшої органі-
зації ефективних профілактичних заходів, спрямованих
на попередження народження хворих дітей. Подібні програми
по муковисцидозу вже успішно проводяться в ряді країн Захід-
ної Європи (Великобританія, Данія, Франція) та Північної Аме-
Рікі.
Головна перевага прямого методу - це висока, до-
яка проходить до 100%, точність діагностики і відсутність необхід-
мости аналізу всієї сім'ї на предмет її інформативності
(Див. нижче). Остання обставина особливо важливо для про-
ведення пренатальної діагностики тяжких, часто летальних
спадкових хвороб (муковісцидоз, міодистрофія Дюшен-
на, гемофілія А та ін). Такі сім'ї нерідко звертаються за ме-
дико-генетичної допомогою вже після того, як хвора дитина
помер. Так, за нашими спостереженнями до 80% сімей з високим рис-
ком муковісцидозу звертаються з приводу необхідності водень-
вої діагностики вже після смерті хворої дитини (Baranov
et al., 1992).
Однак, існує величезна кількість спадкових
хвороб, для яких мутації не описані або не знайдено ма-
жорна мутацій в досліджуваних популяціях. І навіть у всіх тих
випадках, коли є мажорні мутації, поряд з ними, опи-
сани численні рідко зустрічаються (аж до одиничних
випадків), так звані мінорні мутації. Крім того, всег-
та зберігається можливість присутності у пробанда невідомим-
них мутацій, а клонування гена хворої людини для цілей
прямого секвенування, навіть обмеженого лише смислової
його частиною - кДНК, далеко не завжди можливо в силу очевид-
родних фінансових і тимчасових обмежень такого підходу. Ці
труднощі успішно долаються завдяки наявності непрямих
(Непрямих) методів молекулярної діагностики.
Цей історично більш ранній підхід заснований на викорис-
танні зчеплених з геном поліморфних маркерів, за допомогою
яких проводиться ідентифікації мутантних хромосом (точніше
хромосом, що несуть мутантний ген) в родинах високого ризику, то
Тобто в батьків хворого і його найближчих родичів. У
Нині непрямі методи молекулярної діагностики
принципово можливі практично для всіх моногенних забо-
левание з відомою локалізацією контролюючого гена, для
кожного з яких вже розроблена зручна система поза-і
внутрігенних поліморфних індексних маркерів (см.главу III).
Більш того, непрямі методи молекулярної діагностики
придатні навіть для тих хвороб, гени яких ще не ідентифікації
ваних і мутації не відомі. Єдиним і неодмінним
умовою цього є наявність поліморфних сайтів рестрік-
ції або коротких тандемних повторів типу STR, що знаходяться в
безпосередній близькості від мутантного гена чи, що ще
краще, всередині нього (найчастіше в інтрони). За допомогою цих
полморфних сайтів вдається маркувати мутантні алелі гена
і простежити їх передачу потомству (див. Главу 111). Ранні
дослідження непрямим методом проводилися майже виключно
з використанням поліморфних сайтів рестрикції - двухаллель-
ної системи, інформативна ємність якої не перевищує 50%,
а реальне число гетерозигот за цією ознакою в популя-
ції, найчастіше, виявляється істотно нижче 0.5. Слідові-
тельно, в кращому разі лише половина гетерозиготних носи-
телей спадкового захворювання, викликаного рецесивною
мутацією який-небудь ген, може бути доступна непрямий
молекулярної діагностики з використанням одного поліморфно-
го сайту рестрикції. Підвищення інформативності в разі
ПДРФ-аналізу могло бути досягнуто тільки шляхом збільшення
числа поліморфних сайтів. Як првило, для діагностики необ-
ходимо не один, а 3-4 поліморфних сайту, що далеко не у
всіх випадках можливо. Багато хто з поліморфних сайтів локалі-
користані поза генів на відстанях, при яких кросинговер
може в помітному відсотку випадків спотворити результати діаг-
стики. Крім того, практичне використання рестрикційних-
них сайтів часто утруднено через відсутність або великий
вартістю відповідних ендонуклеазною рестриктаз.
Всі ці недоліки можуть бути усунені при використанні
нии в якості молекулярних маркерів високополіморфних тан-
Демня повторюваних коротких три-і тетрамерних повторів
(STR) (див. Главу III). Для багатьох генів знайдені унікальні
патерни поліморфних алелей, що відрізняються за кількістю "коро-
вих "едінінц повторюваних послідовностей нуклеотидів.
Такі "кількісні" поліморфізми, як вже згадувалося
(См.главу III), дуже широко поширені по всьому геному
і присутні в інтрони і фланкують областях багатьох
генів. Поява в кінці 1994р 0.7-сантіморганной карти ге-
нома людини, побудованої на базі високополіморфних дінук-
леотідних (CA) n повторів, зробило реальним маркування,
практично, будь-якого картіровано гена. Особливу діагнос-
тичну цінність представляють внутрігенние маркери, для ко-
торих різко знижена ймовірність кросинговеру з мутантними
алелями гена, а отже, особливо висока точність ді-
агностики. Крім того, як виявилося, багато внутрігенние
поліморфні короткі тандемні повтори виявляють сильне
нерівновага по зчепленню з певними мутантними алелі-
ми гена, що значно полегшує їх ідентифікацію у отяго-
чених сім'ях. Індекс гетерозиготності таких поліаллельних
міні-та мікросателітних систем нерідко перевищує 0.8. Їх
застосування дозволяє маркувати, тобто зробити інформації
тивними (див. 7.4) для ДНК-діагностики практично всі сім'ї
високого ризику за умови наявності хворої дитини або дос-
тупності для молекулярного аналізу його патанатомічного ма-
матеріалу.
Вивчення поліморфних маркерів у хворого пробанда і його
батьків і з'ясування алельному природи молекулярного марці-
ра, так зване "визначення фази зчеплення" (див.розділ
7.4), становить основу для подальшої діагностики побічно-
ми методами (Євграфов, Макаров, 1987). Застосування непрямих
методів молекулярної діагностики передбачає також у ка-
честве обов'язкового попереднього етапу дослідження
частоти алелів відповідних поліморфних сайтів в анали-
зований популяціях, серед хворих та гетерозиготних носите-
лей мутацій, а також визначення ймовірності рекомбінації та
нерівноважності по зчепленню між маркерними сайтами і му-
тантнимі алелями гена. Такі дослідження проводяться з по-
міццю методів блот-гібридизації за Саузерн, або ПЛР
(Див.розділ 1.3.; 1.7; 2,5). У першому випадку в розпорядженні
дослідника повинні бути відповідні ДНК-зонди, у дру-
ром - повинні бути відомі нуклеотидні послідовності
районів ДНК, що включають відповідні поліморфні сайти,
для вибору олігопраймеров (див. Глави II, 1V).
Розділ 7.2. ДНК-діагностика при різних типах Насл-
нання.
Нагадаємо, що значне число моногенних захворювань
успадковується за рецесивним типом. Це означає, що при ауто-
сомной локалізації відповідного гена хворіють тільки гомо-
зиготности носії мутацій. Гетерозиготи клінічно здорові,
але з рівною імовірністю передають своїм дітям мутантний або
нормальний варіанти гена. Таким чином, протягом тривалих-
лого часу мутація в прихованому вигляді може передаватися
з покоління в покоління. При аутосомно-рецесивним типі
наслідування в родоводах важких хворих, які або не
доживають до репродуктивного віку, або мають різко сни-
ковими потенції до розмноження, рідко вдається виявити хворих
родичів, особливо, по висхідній лінії. Виняток
становлять сім'ї з підвищеним рівнем інбридингу, який
виникає або за рахунок високої частоти близькоспоріднених
шлюбів, або за рахунок вступу в шлюб, з однакових
ізольованих популяцій обмеженою чисельності. Хворі
діти з імовірністю 25% народжуються в тих сім'ях, де обидва ро-
дителя є гетерозиготними носіями мутацій одного і
того ж гена. Можливо також народження хворої дитини в та-
кою сім'ї, де тільки один з подружжя несе мутацію, а дру-
раю мутація виникла в гамете його партнера в момент, перед-
простують запліднення. Частка таких сімей у загальній групі
ризику відносно невелика, а ризик повторного народження в
них хворої дитини не перевищує загальної частоти спонтанного
виникнення мутацій в даному гені. Для хвороб, зчеплений-
них з підлогою, тобто контрольованих генами, локалізованість в
Х-хромосомі, характерно те, що хворіють переважно маль-
чики, тоді як носіями є дівчата.
Y-хромосома містить дуже мало генів, більшість з
яких (близько 10) картіровано в так званої псевдоауто-
сомной області короткого плеча, гомологічною такої на ко-
Ротко плечі X-хромосоми. Найважливішим істинним геном Y-хромо-
соми, тобто геном, представленим тільки цього хромосом-
ме, є ген SRY (Yp21.1), що детермінують розвиток статі
за чоловічим типом. Мутації цього регуляторного гена призводять
до порушень статевого диференціювання (XY-жінки), а його пе-
переносять внаслідок помилок рекомбінації псевдоаутосомних райо-
нів на коротке плече X-хромосоми обумовлює синдром ре-
версії полу-Sex reverse (XX-чоловіки) (McElreavey et al.,
1993). Практично важливо, що присутність навіть невеликого
околоцентромерного фрагмента довгого плеча Y-хромосоми при
каріотипі XX є безумовним свідченням для видалення
зачатків гонад у таких індивідуумів у зв'язку з високою ймовірність ви-
ятностью експресії гена Gba, що веде до їх злоякісного
переродження - гонадобластоме (Giquel et al., 1992). У отли-
ки від Y-хромосоми, велика за розміром X-хромосома людини
несе до 5% всіх структурних генів, багато з яких вже
ідентифіковані (див. Главу III).
Всі рецесивні алелі Х-хромосоми у хлопчиків проявляють-
ся, тому що перебувають у гемізиготність стані. Дівчата мо-
гут хворіти в тому випадку, якщо вони гомозиготні по мутації.
Така можливість може здійснитися в сім'ї, де хворий їх
батько, а мати є носієм мутації і передала Досі-
ри свій мутантний алель. Якщо батько хворої дівчинки здоровий,
можна припускати, що мутація виникла в тій його гамете,
яка брала участь у заплідненні. Х-зчеплені заболева-
ня у дівчаток (міодистрофія Дюшенна, гемофілія А) можуть бути
наслідком поєднаного прояви мутації цих генів у одно-
го з батьків і делеції відповідних фрагментів хромо-
сом в іншого. У цих рідкісних випадках у дівчаток, як і у
хлопчиків, мутації Х-зчеплених генів будуть знаходитися в ге-
мізіготном стані
При домінантному спадкуванні для розвитку хвороби дос-
таточно одного мутантного алеля. Такі хворі з імовірність
ністю 50% народжуються в сім'ях, де один з батьків хворий.
Дуже рідко хворі діти з домінантним типом успадкування
можуть народитися і у здорових батьків в результаті мутірова-
ня однієї з гамет. Однак, ймовірність повторного народження
хворої дитини в такій родині така ж, як і для популяції
в цілому. Пренатальна діагностика домінантних хвороб про-
водиться досить рідко з ряду причин. По-перше, такі
хвороби складають відносно невеликий відсоток серед всіх
моногенних захворювань. По-друге, важкі хвороби, опору-
вождающихся летальним результатом в ранньому віці або наводячи-
щие до безпліддя, не передаються у спадок, а з'являються
щоразу заново внаслідок мутації при дозріванні гамет.
Необхідність же запобігання народження хворих, які не
тільки доживають до репродуктивного віку, а й здатні
залишити потомство, є питанням дискусійним. Прове-
деніе пренатальної діагностики таких захворювань приймається
з урахуванням багатьох конкретних обставин. Актуальність цієї
проблеми стала особливо очевидною в останні роки, коли
була відкрита численна група домінантних нейродегене-
ративних захворювань (див. Главу IV), які проявляються
порівняно пізно, нерідко вже в репродуктивному віці,
важко протікають і, по-суті, не мають скільки-небудь реаль-
ної терапії. Для таких захворювань першорядне значення
набувають методи досімптоматіческое діагностики з викорис-
ристанням методів ДНК-аналізу (см.главу X).
Значно більше поширені моногенні хвороби з
частковим домінуванням і неповної пенетрантностью. Для по-
добние захворювань ризик народження хворої дитини в отяго-
щенной сім'ї залежить від конкретних значень цих параметрів,
які, у свою чергу, визначаються молекулярними механіз-
мами, що лежать в основі формування такого роду відхилень
від менделевської типу успадкування.
Розробка молекулярних методів діагностики хвороб,
викликаних мутаціями в мітохондріальних генах, як показують
дослідження останніх років (McKusick, 1994), набуває
особливе значення. Як правило, в основі різних мітохондрій-
альних хвороб лежать порушення в системі окислювального
фосфорилювання. Оскільки деякі тканини мають підвищен-
шенной чутливістю до подібних порушень, подібна клі-
ническая картина захворювань може спостерігатися внаслідок
мутацій різних мітохондріальних генів. Успадкування таких
хвороб значно відрізняється від менделевської типу, в
Перш за все, через материнського характеру наслідувань
мітохондрій, наявності в зиготі і відповідно у всіх кліть-
ках організму великої кількості копій мітохондріальних хромо-
сом, через особливості сегрегації цих хромосом при поділі
клітин і, нарешті, через тих кількісних і якісних
змін до мітохондріальної ДНК, які соровождают про-
цес онтогенетичної диференціювання клітин і старіння ор-
ганизма.
Для всіх "мітохондріальних хвороб" характерний мате-
ринський тип спадкування і присутність мутантних алелей
тільки в частині хромосом (так звана гетероплазмії), частка
яких може варіювати у різних тканинах. Як правило, су-
нує певний порогове значення частки мутантних хро-
мосом, перевищення якого веде до появи та прогресування
ванию захворювання. Скорочення числа мітохондрій, походячи-
ний в нормі при старінні, може сприяти збільшенню
частки мутантних хромосом у определнной тканинах і тим самим
бути причиною хвороби. Невипадково тому, що для багатьох
"Мітохондріальних хвороб", характерно пізній початок. У
силу функціональних особливостей мітохондріальних генів годину-
то спостерігається кумулятивний ефект двох і більше мутацій, ло-
калізованних в різних генах. Важливим представляється також те
обставина, що у мітохондріальних генах OXPHOS-комплек-
са частота виникнення мутацій вище, ніж в ядерних генах,
кодують субьедініци окисного фосфорилювання
(McKusick, 1994).
Розділ 7.3. Групи ризику, пошук гетерозиготних носите-
лей мутацій.
Як випливає з вищевикладеного, точна діагностика в
поєднанні з детальним аналізом типу успадкування того чи
іншого захворювання має визначальне значення для формування
ня груп ризику, тобто відбору сімей, в яких імовірність
народження хворих дітей підвищена. Перш за все, це ті сім'ї,
де вже є або була дитина, що страждає яким-небудь моног-
вим спадковим захворюванням. Для аутосомно-рецесивних
хвороб з великою часткою ймовірності можна вважати, що обидва
батька цієї дитини є гетерозиготними носіями
мутантних алелей відповідного гена і ризик повторного
народження хворої дитини в такій сім'ї становить 25%, не-
залежно від результату попередніх пологів. Тому в таких випадках
рекомендується обов'язкова пренатальна діагностика плоду
при кожній наступній вагітності.
Для зчеплених зі статтю захворювань важливої практичної
завданням є виявлення випадків спонтанного виникнення
мутацій у батьківському поколінні. Для таких поширених
захворювань, як міодистрофія Дюшенна і гемофілія А, майже
1 / 3 всіх випадків має спонтанне походження. При цьому
мутації гена дистрофина, як правило, виникають у оогенезі,
тобто у матері, а мутації гена фактора Y111, зазвичай, появ-
ляють під час сперматогенезу у діда хворої дитини (див.
Главу X). На відміну від тих сімей, в яких мати гетерозі-
Готня, ймовірність повторного народження хворої дитини в
сім'ях зі спонтанною мутацією не перевищує середньопопуляційні-
ної частоти, і тому немає необхідності проводити пренаталь-
ву діагностику плоду при наступних вагітностях. Специ-
ального розгляду у цьому зв'язку заслуговує, однак, питання
гонадного мозаїцизму, тобто наявності в гонадах матері гені-
тично нормальних і мутантних ооцитів. Особливо великий ризик
такого стану у разі міодистрофії Дюшенна. Гонадний мо-
зацізм в силу своєї специфіки органної досить важко до-
казать або спростувати. Між тим, вважається що 6,7% спро-
радіческіх випадків іодістрофіі Дюшенна обумовлена гонадний
мозаїцизм у матері (Essen et al., 1992).
Детальний медико-генетичне консультування сімей, в
яких зареєстровані спонтанні випадки народження дітей з
Х-зчепленими захворюваннями в поєднанні з відповідними
лабораторними, в тому числі і молекулярними дослідженнями,
як правило, дозволяють відповісти на питання про походження
мутації. Так, гетерозиготне носійство у матері може бути
запідозрено, зокрема, за змістом відповідних біл-
кових продуктів (наприклад, фактора Y111 згортання крові
при гемофілії А; дистрофина в м'язах і креатинкінази в сиво-
Ротко крові при міодистрофії Дюшенна) або за допомогою спеці-
альних ДНК-методів, що дозволяють ідентифікувати мутантний
аллель у матері. Якщо диференціювання цих випадків немож-
на або доведено, що мутація у хворої дитини не є
спонтанної, слід припускати, що мати є гетеро-
зиготности носієм і з 50%-ої ймовірністю буде переду-
вать хворобу своїм синам. У цьому випадку пренатальна ді-
агностика є обов'язковою і повинна супроводжуватися визначенням
статі плоду. Слід, однак, підкреслити, що встановлення
чоловічої статі плоду на сьогоднішній день аж ніяк не є
показанням для переривання вагітності, оскільки у 50% слу-
чаїв вони отримують від матері X-хромосому з нормальним алелем
гена і є цілком здоровими. Визначити, яку саме X
-Хромосому (з нормальним або мутантним алелем) отримав бу-
дущій хлопчик, і є завданням молекулярної діагностики.
За допомогою прямих і непрямих методів ДНК-діагностики ця за-
дача вже практично вирішується для дуже багатьох зчеплених з
підлогою захворювань (см.главу X).
Найбільш ефективним заходом профілактики спадкових
захворювань є виявлення гетерозиготних носіїв му-
Тацій, так як при цьому вдається запобігти народженню пер-
вого хворої дитини в родинах високого ризику. Родичі
хворого з великою ймовірністю можуть бути гетерозиготними
носіями мутантних алелей, тому в тих випадках, коли
це можливо, вони підлягають обстеженню в першу чергу.
Для хвороб, зчеплених зі статтю, це родичі по женс-
кою лінії - сестри, дочки і тітки пробанда. Їх діагностика
особливо важлива, тому що ймовірність народження хворих синів
в потомстві носійок мутацій дуже висока і не залежить від
генотипу чоловіка. При аутосомно-рецесивних захворюваннях по-
Ловін сибсов батьків і 2 / 3 здорових сибсов хворого будуть
гетерозиготними носіями мутації. Тому в тих сім'ях,
де принципово можлива молекулярна ідентифікація му-
тантних алелів, необхідно обстежити максимальну кількість
родичів хворого пробанда для виявлення гетерозиготних
носіїв. Іноді у великих сім'ях з розгалуженими Родос-
умовних вдається простежити успадкування неідентифіковані
мутацій за допомогою непрямих методів молекулярної діагностики-
ки.
Для захворювань, поширених у певних попу-
ляціях або в якихось етнічних групах та обумовлених
присутністю одного або декількох переважних і легко
ідентифікованих мутантних алелей, можливе проведення те-
тального скринінгу на гетерозиготне носійство цих мута-
ций серед певних груп населення, наприклад, серед бе-
ремінних жінок або серед новонароджених. Вважається, що по-
добние скринінг економічно виправданий у тому випадку, якщо при
проведення процедури виявляються алелі, які становлять не ме-
неї 90 - 95% всіх мутацій даного гена в досліджуваній попу-
ляції. Виявлені при подібних опитуваннях носії мута-
ций також складають групу ризику, і в подальшому повинні
бути аналогічним чином протестовані їх дружини. Однак,
навіть у тому випадку, якщо мутація знайдена тільки в одного з
батьків, ймовірність народження хворої дитини кілька
вище популяційної частоти, але, звичайно, значно менше
25%. Конкретне значення цього ризику залежить від загальної часто-
ти мутацій відповідного гена в популяції. У таких сім'ях
за бажанням батьків також може бути проведена пренатальна
діагностика і простежено успадкування мутантного алеля. При
відсутності цієї мутації у плода прогноз вважається сприятливих
ятним, незалежно від того, які алелі дитина отримає від
другого чоловіка.
Розділ 7.4 Особливості застосування молекулярних методів
в пренатальній діагностиці моногенних болез-
ній.
Наступним кроком після відбору потребує пренатальної
діагностиці сім'ї є комплексне молекулярне обстеженню-
вання її членів - батьків і, якщо є така можливість,
хворої дитини. Ці дослідження можуть бути досить
тривалими і тому бажано їх проводити до настання
вагітності. Результати молекулярного обстеження сім'ї
служать основою для призначення та вибору способів проведення
пренатальної діагностики. Після цього сім'я планує бере-
менность, та у визначені терміни жінка потрапляє в клініку
для проводенія процедури, що забезпечує забір необхідних
для діагностики тканин плодового походження. При цьому повинні-
дме враховувати, що визначення конкретних строків цієї про-
цедури залежить від багатьох медичних показань (передовсім
чергу, акушерських), що забезпечують максимальну безпеки
ність подібного інвазивного втручання як для матері,
так і для майбутньої дитини (Баранов та ін, 1994; Бара-
нов, 1994).
Найбільш об'єктивна інформація про наявність моногенно
спадкового захворювання у плода може бути отримана при
аналізі його ДНК і виявленні мутаційних змін до коди-
ючий або регуляторних послідовностях відповідних
генів. Практична діагностика мутантних алелей в сім'ях
високого ризику проводиться для захворювань з відомим спект-
ром найбільш часто зустрічаються мутацій. При цьому для кожного з
дой хвороби розробляються відносно прості і найбільш
ефективні методи ідентифікації мутантних алелей. У насто-
ящее час налічується вже кілька сотень таких захворювань-
ний і кількість їх швидко збільшується (Baranov, 1993; Ба-
нів, 1994; см.главу X).
Для генотипування мутацій, тобто для з'ясування при-
пологи мутантних алелей у хворого і його батьків використовують-
ються різні стандартні методи, детально викладені в
главі IV. Вибір конкретного методу залежить від типу передпілля-
гаемая мутацій і від методичних можливостей діагностичного-
ких центрів. При відсутності у пробанда найбільш частих і ра-
неї описаних мутацій його ДНК може бути спрямована у спеці-
алізірованние молекулярно-генетичні лабораторії для бо-
леї ретельного аналізу з використанням усього комплексу ме-
тодов ідентифікації мутацій аж до одержання й секвеніруют-
вання мутантних кДНК-вих послідовностей гена. Однак,
подібні дослідження дуже дорогі, вимагають багато праці і
часу і тому у звичайній клінічній практиці використовуються
досить рідко. У цих випадках частіше вдаються до непрямих
методам молекулярної діагностики (див. розділ 7.1). Для мно-
гих захворювань, ці методи все ще залишаються єдино
можливими (см.главу X). Однак, як уже вказувалося, вони
вимагають обов'язкового обстеження повної сім'ї, включаючи
хворої дитини. При його відсутності молекулярне маркірова-
ня мутантних генів у гетерозиготних батьків стає
неможливим, а, отже, неможлива і пренатальна ді-
агностика.
Ідентифікацію мутантних генів здійснюють шляхом порів-
нання маркерних генотипів батьків і хворої дитини. Якщо
не стався кросинговер між маркерним локусом і геном,
всі хворі діти в сім'ї повинні мати однаковий маркерний
генотип. Тому при проведенні пренатальної діагностики
схожість генотипів плоду і пробанда є необхідним,
проте в ряді випадків, зовсім не достатньою умовою для
підтвердження наявності захворювання. Так, наприклад, у гомоз-
Готня по маркеру батьків всі діти будуть мати однаковий
генотип з цього локусу незалежно від присутності мутантних
алелів гена. Необхідною умовою диференціювання нормаль-
них і мутантних генів у носіїв мутацій є їх зчеп-
ня з різними алелями маркерного локусу. Тому, дискриміна-
мінація мутантних генів у батьків можлива тільки з по-
міццю гетерозиготних маркерів. За цих умов мутантні
гени батьків можуть бути визначені за тим маркерним алле-
лям, які присутні у хворої дитини. Однак, іден-
тіфікація за маркерними аллелям обох мутантних генів можли-
на лише в тих випадках, коли батьки гетерозиготності, а про-
банд (хворий) гомозіготен за маркерними локусу.
Можливість ідентифікації мутантних генів батьків на
основі аналізу маркерних генотипів визначає інформативних
ність сім'ї по відношенню до даного маркера. На Рис.7.1
представлені можливі маркерні генотипи з повністю і годину-
тично інформативних, а також у неінформативних сім'ях при
визначенні їх шляхом блот-гібридизації з ДНК-зондом. Анало-
гічне схеми можуть бути складені і в тих випадках, коли
маркерні генотипи визначаються шляхом аналізу містять по-
ліморфние локуси ампліфікованих фрагментів ДНК. У інфор-
ментації сім'ях маркерний генотип хворої дитини відрізняє-
ся від маркерних генотипів обох батьків і здорового сібси,
тому можна простежити успадкування мутантних генів при
кожної вагітності. У цьому разі подібність маркерних гено-
типів пробанда та плоду достатньо для несприятливого прог-
ноза, а носії мутації будуть мати батьківський генотип. У
частково інформативних сім'ях ідентифікується тільки один
з мутантних генів, так як маркерний генотип хворого ре-
бенка збігається з генотипом одного або навіть обох батьків.
У цьому випадку при подібності маркерних генотипів плоду і про-
банда ймовірність хвороби майбутньої дитини становить 50%.
Всі діти з іншим маркерним генотипом будуть здорові, але по-
Ловін з них буде нести один з мутантних алелей. Неін-
Формативний маркер не придатний для ідентифікації мутантних
генів, а отже, і для проведення молекулярної діаг-
стики в даній сім'ї. За відсутності повної інформатівнос-
ти необхідно досліджувати інші зчеплені з геном полі-
морфние локуси і вибрати в якості маркерів ті з них, ко-
торие у батьків пробанда перебувають у гетерозиготному відбутися у-
янии. У частково інформативних сім'ях можна проводять дебати-
ментальною діагностику з такою ж мірою достовірності, як і
в повністю інформативних сім'ях, при одночасному вико-
танням двох поліморфних локусів, кожен з яких марки-
рілої різні мутантні гени обох батьків. Інформативними
виявляються також ті сім'ї, в яких один з мутантних ал-
плекай може бути ідентифікований прямим аналізом соответс-
твующего ділянки гена, а наявність іншого мутантного алеля
доводиться з допомогою маркерного локусу. Для багатьох моно-
генних спадкових захворювань кількість іден-
ванних високополіморфних локусів, тісно зчеплених з контро-
лірующім геном, достатньо для того, щоб більше 90% сімей
високого ризику опинилися повністю інформативними, а значить,
придатними для проведення в них пренатальної діагностики з
іспользовааніем молекулярних методів тестування стану
плоду.
Таким чином, за відсутності можливості прямої іден-
тіфікаціі відповідних мутантних алелей, аналіз інформації
тивності сім'ї слід починати з найбільш поліморфних мар-
керних локусів. так як при цьому більша ймовірність того,
що батьки хворої дитини виявляться гетерозиготами за
обраному маркеру. При подальшому виборі маркерів важливо
також враховувати наявність між ними нерівноважності по зчеп-
тацій, тому що найчастіше інформативність сім'ї стосовно
маркерів, що знаходяться в сильному нерівновазі по зчепленню,
буде однакова. Дійсно, невипадковий характер цис-і
транс-розташування алелів у нерівноважних по зчепленню ло-
кусах обумовлює підвищену ймовірність таких подій,
при яких гомозиготи за одним із маркерів виявляються го-
мозіготнимі і по іншому. Те ж саме справедливо й у відно-
шении гетерозигот. Тому при аналізі інформативності
сім'ї, в першу чергу, слід вибирати маркерні локуси,
що знаходяться між собою в рівновазі по зчепленню.
Слід також враховувати, що певні алелі полі-
морфних сайтів, розташованих близько до мутації, що виникла
одноразово багато років тому і распросранівшейся в популяції,
будуть залишатися в дуже тісному нерівновазі по зчепленню.
Прикладом може служити неравновесность між delF508 (оріен-
тіровочний вік виникнення 30-50 000 років) і 6-ти член-
вим тетрамерним повтором TAGG в інтроні 6 гена муковісцидозу
(Chebab et al., 1993; Агбангли та ін, 1994). Тому в сім-
ях високого ризику з великою часткою ймовірності, конкретне
значення якої визначається детерминантом нерівноважності
по зчепленню, гомозиготи з цього маркерного аллелю, нададуть-
ся також гомозиготами і по мутації, тобто будуть хворі.
Звичайно, пренатальний діагноз не може бути заснований тільки
на цій інформації, однак, її слід враховувати при ви-
лення комплексного висновку щодо здоров'я майбутнього
дитини.
У всіх випадках при використанні непрямих методів мо-
лекулярной діагностики необхідно також пам'ятати, що маркер-
ний генотип плоду визначає наявність мутантних генів з точ-
ністю до ймовірності кросинговеру між мутантним алелем
і маркерним локусом. Тому, чим ближче розташований маркер по
відношенню до мутантному аллелю, тим менша ймовірність помилки
при проведенні пренатальної діагностики. Для того щоб пів-
ністю уникнути або, принаймні, різко знизити імовірність
ність такої помилки, бажано використовувати внутрігенние
маркери або проводити одночасне тестування ДНК плоду з
допомогою двох маркерних локусів, що фланкують мутантний ал-
лель. Останній підхід особливо виправданий при роботі з дуже
протяжними генами (наприклад геном дистрофина довжиною близько
2200 тисяч пар основ), де ймовірність внутрігенного
кросинговеру за деякими даними може досягати 2-2,5%.
Розділ 7.5 доімплантаційної діагностика, точність прог-
нозірованія.
Слід підкреслити, що загальний підхід до молекулярного
тестування, практично, не залежить від форми нозології,
так як для аналізу генів і мутантних алелей використовується
один і ті ж методи (див. Розділ IV). При наявності у хворого
або у його батьків ідентифікованих мутацій або при зна-
дении інформативних для даної сім'ї ДНК-маркерів проведення
пренатальної діагностики стає можливим на будь-який ста-
дии розвитку і при будь-якому терміні вагітності.
ДНК-діагностика на початкових етапах розвитку людини,
безумовно, має свої методичні особливості і тісно соп-
ряжена з прийомами екстракорпорального запліднення і
трансплантації зародків. Ці обставини дозволяють виокрем-
лити її на самостійний науково-практичний напрямок -
доімплантаційної діагностику генних та хромосомних хвороб
(Verlinsky, Kuliev, 1993). Незважаючи на очевидні успіхи в
цій галузі, досягнуті у ряді зарубіжних лабораторій (до-
імплантаційна діагностика муковісцидозу, деяких X-зчеп-
лених захворювань - міодистрофії Дюшенна, синдрому ламкої X
-Хромосоми, гемофілії), даний напрямок досліджень все
ще знаходиться на рівні наукових розробок і не має широ-
кого застосування. Об'єктом ДНК-діагностики на цих стадіях
розвитку можуть служити полярні тільця овуліровавшіх яйцек-
льоток і окремі бластомери зародка, отримані методом
мікрургіі (рис.7.2). Недоліком цього підходу є
порівняно невисокий відсоток (до 30%) приживлюваності опери-
ваних зародків після їх штучної трансплантації в
матку. Докладно з методами доімплатаціонной діагностики, її
сучасним станом і перспективами можна ознайомитися в
вже цитованій монографії (Verlinsky, Kuliev, 1993). Є
певні підстави вважати, що у зв'язку з швидким зростанням
числа центрів екстракорпорального запліднення в Рос-
оці, помітним збільшенням ефективності їх роботи, оцінюють-
мій за кількістю вагітностей і пологів, методи доїмо-
плантационной діагностики спадкових хвороб будуть
прівлкать до себе все велике число дослідників. Однак,
практична значущість такого підходу на увазі його високої
вартості та недостатньої надійності ще порівняно довго
буде залишатися проблематичною, принаймні, в нашій
країні.
Узагальнений досвід різних молекулярних діагностичних
центрів світу свідчить про те, що оптимальним для пре-
натальній діагностики є перший триместр вагітності
(10-12 - тижня), оскільки при несприятливому прогнозі бе-
ремінь може бути перервана звичайним медичним абортом.
Найчастіше молекулярну діагностику проводять і в другому три-
местре вагітності (зазвичай на 17-21 тижнях). Необхідні
для аналізу зразки ДНК плоду виділяють з біоптатів хоріона
(Плаценти), клітин амніотичної рідини (амніоцітов) або
з лімфоцитів пуповинної крові за допомогою відповідних
інвазивних процедур - хоріонбіопсія, плацентобіопсія, амніо-
центез або кордоцентез, які проводяться під контролем уль
тразвука (Мал. 7.3). Детальніше про ці методи, їх переваж-
суспільствах і недоліки можна дізнатися у відповідних моног-
рафіях і оглядах (РАРР, 1992; Баранов, 1994; Баранов та ін,
1994). Діагностика в 2-му триместрі вагітності нерідко по-
казана для неінформативних сімей у випадку тих нозологій,
пренатальна діагностика яких принципова можлива пу-
тим біохімічного тестування первинних порушень (напри-
заходів муковісцидоз) або оцінки будь-яких інших проявів бо-
лезни у плода.
Основним джерелом ДНК для діагностики в постнатальному
періоді є лімфоцити крові. Рідше для цих цілей ви-
товують інші тканини і біологічні рідини, що містять
клітинні елементи (слина, кістки, сеча). Якщо сім'я частково
інформативна (ідентифікується або доступний молекулярної
маркуванні лише один мутантний алель), також рекомендується
діагностика в 1-му триместрі вагітності, так як вона позво-
ляєт відкинути діагноз у 50% всіх плодів при аутосомно-ре-
цессівних захворюваннях, що доводиться відсутністю ідентифікації
фіціруемого мутантного алеля. В іншому випадку подальша
тактика визначається виходячи з побажань жінки та можли-
ностей для уточнення діагнозу на більш пізніх термінах розви-
ку (II-й триместр вагітності). Так, у разі пренатальної
діагностики муковісцидозу результати молекулярних досліджень-
ний можуть бути доповнені біохімічним тестуванням фермен-
тов амніотичної рідини на 18 - 20-й тижнях вагітності
(Горбунова та ін, 1991; Baranov et al., 1992); у разі ге-
мофіліі А - прямим серологічним дослідженням активності
фактора Y11 згортання крові (Aseev et al., 1994); у разі
міодистрофії Дюшенна - іммуноцітохіміческім аналізом дистро-
фіна в біоптатах м'язів плоду (Hoffman et al., 1992) і т.д.
Слід однак підкреслити, що сучасний рівень молеку-
лярних знань про природу гена, його мутації та поліморфізм
дозволяє в ідеалі проводити молекулярну діагностику най-
леї частих моногенних захворювань, практично, у всіх слу-
чаях. Можливості молекулярної діагностики в Росії поки
дуже обмежені (Baranov, 1993; див. Глава X). Крім того,
ситуація ускладнюється порівняно пізнім (часто, вже у
час вагітності) зверненням родин високого ризику на пре-
натальну діагностику, що не дозволяє провести молекуляр-
ні дослідження її інформативності в повному обсязі. Пов'язано
це, в першу чергу, з поганою поінформованістю населення
про роботу відповідних медико-генетичних служб.
З усіх існуючих способів пренатальної діагностики
методи, засновані на аналізі ДНК, є найбільш точні-
ми, так як вони виявляють первинні порушення в структурі ге-
нов. Це перш за все відноситься до тих захворювань, діагнос-
тика яких здійснюється шляхом прямої ідентифікації му-
тантних алелів. Тим не менш, навіть у цьому випадку остаточно-
валий висновок про здоров'я майбутньої дитини хоча і приб-
ліжается до абсолютного, але все-таки має імовірнісний харак-
тер. Основним джерелом помилок при проведенні пренатальної
діагностики служить можлива контамінація матеріалу плоду,
використовуваного для постановки діагнозу, іншими тканинами, в
першу чергу, материнського походження. Тому відразу
після взяття діагностичного матеріалу шляхом біопсії хоріо-
на, амніоцентезу або кордоцентеза проводять ретельну його
оцінку з використанням різноманітних лабораторних методів.
Відмінність молекулярних методів тестування від біохімічних
або будь-яких інших полягає в їх підвищеної чувствітельнос-
ти і величезною роздільної здатності. Забруднення матеріалу
особливо небезпечно в тих випадках, коли прогноз дається на підставі
ве аналізу ампліфікованих фрагментів ДНК. Потрапили в тес-
ничих зразки клітини чужорідного походження можуть пос-
лужіть джерелом донорської ДНК для ПЛР і тоді може бути
отримано невідповідне дійсності висновок про
тому, що дитина буде здоровий. Ризик подібних помилок може
бути значно зменшений при роботі в стерильних умовах і
при постановці аналізів у кількох паралельних пробах.
Звичайно, в будь-якому діагностичному центрі можливі лаборатор-
ні помилки чисто технічного порядку, які не залежать від вико-
пользуемих методів тестування. Однак, достовірність прог-
нозірованія, заснованого на прямому аналізі мутантних алелей
плоду, зазвичай, перевищує 99%. При використанні непрямих
методів молекулярної діагностики з'являється додатковий
ризик помилки, пов'язаний з можливістю рекомбінації між му-
тантним алелем і маркерним локусом (особливо при великих
розмірах гена, як, наприклад, у випадку гена дистрофина).
Конкретне значення цього ризику залежить від взаємного розта-
дання використовуються для діагностики маркерів і відповідних-
чих мутантних алелей. Зазвичай, для молекулярної діагностики
використовують маркери, частота рекомбінації яких з мутантних-
ми алелями гена не перевищує десятих, а іноді і сотих до-
лей відсотка.
У випадку несприятливого прогнозу у випадку охорони здоров'я
майбутньої дитини рішення про переривання або продовження бере-
менності приймають батьки на підставі наданого в
їх розпорядження загального висновку. Після народження дитини
або переривання вагітності бажано проводити верифікацію
діагнозу усіма доступними для цього методами, включаючи й ті,
які були використані для постановки пренатального діаг-
ноза.
ВИСНОВОК
При всій різноманітності тем, порушених у монографії,
весь викладений у ній матеріал, по-суті, стосується трьох
основних проблем: 4 (1) 0генетіческое картування і геном че-
ної людини, 4 (2) 0молекулярная діагностика генних хвороб, 4 (3)
генокоррекція спадкових дефектів і генотерапія. У рі-
нии кожної з названих проблем досягнуті серйозні успіхи.
Нагадаємо Деякі із них.
Відомо, що перший ген людини (ген кольоровий сліпо-
ти-дальтонізму) картірован на Х-хромосомі людини в
1911р. Перший аутосомний ген - тільки в 1968р. До 1973 на
всіх хромосомах людини було картіровано всього 64 гена, а до
1994р. на генетичних картах вже локалізовано понад 60 000
маркерних ДНК послідовностей (головним чином, фрагмент-
тов кДНК експресують генів-EST см.главу III.), а також
4более 05 000 повнорозмірних структурних генів. Завдяки мно-
гочісленним поліморфним сайтів і, головним чином, Мікрос-
теллітним молекулярним маркерами, створені докладні (1,5-2
сантіморганние) генетичні карти для кожної хромосоми че-
ловека. Це дозволило перейти від функціонального до позиційних-
ному картування, т 4о 0Е 4сть 0картірованію нових генів не-
посередньо на фізичній карті ДНК цілого генома.
На думку авторитетних фахівців з генетичного
картування таких як Пітер Гудфеллоу, Поль Вайссенбах і
ін 4угіх, 0дальнейшее нарощування щільності молекулярних марці-
рів на хромосомах людини вже позбавлено сенсу, тим більше, що
в процесі идетификации все нових і нових генів методом EST,
нові поліморфні сайти все одно будуть знайдені. Не менш
оптимістично йдуть справи і з секвенуванням, т 4о 0Е 4сть 0ви-
яснень первинної нуклеотидної послідовності всій
двометрової молекули ДНК людини. Достатньо зауважити, що
первісна вартість секвенування однієї пари нуклеоті-
дов оцінювалася в 1 $, зараз вона складає вже близько 40
центів і продовжує знижується. Причина цього - широка авто-
тизації монотонного процесу секвенування. Так, 10 робо-
тов фірми Applied Biosystems за один тиждень секвеніруют бо-
леї 30000000 п 4ар 0о 4снованій. 0Дальнейшее вдосконалення
технології секвенування 4, 0создані 4е 0прінціпіально нових під-
ходів (метод "чіпів"-Мірзабеков А.Д., Ed.Southern),
4повишающіх в десятки разів 0степен 4ь 0автоматізаціі цього про-
процесу у високоспеціалізованих центрах дозволяє наді-
яться, що секвенування всього геному людини буде завер-
Шено в 2006 році, а цілком ймовірно і до 2000 року!
Однак, саме по собі завершення гігантського за задумом і
грандіозного з реалізації наукового проекту "Геном людини"
аж ніяк не означає, що процес пізнання геному завершений.
Вже зараз стає очевидним, що не існує якогось
усередненого геному людини, кожен геном як і кожен че-
ловек суто індивідуальний. Ця індивідуальність геному про-
є не тільки на рівні окремої особистості, але і на
рівні етнічних груп, націй, окремих популяцій і рас
(Cavalli-Sforsa, 1994). Геном людини як система динамич-
ва, дуже різноманітний. Аналіз цього розмаїття
(Diversity) - одне з найважливіших продовжень програми Геном
людини. Ще більш актуальним є з'ясування "функціо-
нальної карти геному ". Секвенування дозволить розшифрувати
порядок всіх 3 4.5 0х 10 квітня! 09 нуклеотидів. Але ж це тільки на-
чало. Визначити межі генів, з'ясувати становище багато-
чисельних регуляторних елементів, їх Інтрон-екзонів
структуру і, нарешті, функціональне призначення кожного з
60 000 генів, призначення яких поки що невідомо - ось сле-
дме воістину глобальне завдання молекулярної генетики.
Цілком ймовірно, що саме на цьому шляху вдасться вирішити за-
гидко "надлишкової ДНК", зрозуміти еволюцію (філогенез) геному
людини і, можливо, розшифрувати партитуру симфонії життя
- Т 4о 0Е 4сть 0последовательность включення і виключення генів у
ході онтогенезу.
На генетичні карти людини вже в 1994р. нанесено
933 гена, мутації яких приводять до різних спадково-
вим захворювань, причому понад 400 з них проклоніровани,
т 4о 0Е 4сть 0виделени в чистому вигляді і розмножені поза оргаизм че-
ловека у складі ДНК фагів, вірусів, дріжджів і бактерій. Для
багатьох з цих генів, особливо, пов'язаних з найбільш
частими, соціально значущими захворюваннями, докладно вивчені
спектри мутацій, охарактеризовано алельних поліморфізми і
розроблені схеми молекулярної діагностики. Причому, якщо в
1993р. таких захворювань було близько 130 (Bob Williamson), то
у 1994 - понад 600. По-суті, вже сьогодні кожен спадково-
ний недуга, ген якого картірован, доступний молекуярной ді-
діагностиці прямими або непрямими методами.
Крім моногенних хвороб, проблеми молекулярної діаг-
стики яких значною мірою вже вирішені, все біль-
ше уваги сьогодні приділяють мультифакторіальних заболевани-
ям. На порядку денному молекулярна діагностика схильний-
ності до таких широкораспространенной недуг як атероскле-
троянд, ішемія серця, онкологічні 4, психіатричні 0заболе-
вання, діабет та багато інших 4огое 0друг 4о 0Е. З'ясування генетичної приро-
ди цих хвороб, так само як досімптоматіческая діагностика
багатьох моногенних хвороб з пізньої маніфестацією, ставить
перед дослідниками 4, 0т 4о 0Е 4сть 0молекулярнимі біологами і
лікарями 4, 0проблему доцільності такої досімптоматіческое
діагностики, права особи на винятковість знань про
власному геномі, точніше про тих мутаціях і генетичних
схильність які закодовані в ньому ще до рож-
дення. Для деяких захворювань 4 (0муковісцідоз, фенілкетону-
рія) така рання діагностика, безумовно, доцільна,
тому що дозволяє почати лікування до початку захворювання. Для
тих же нозологій, де реальної терапії поки немає (хорея Ген-
тінгтона, інші хвороби "експансії", міодистрофія Дюшенна і
ін) доцільність такої діагностики і, головне, конфі-
денціальность отриманої інформації широко обговорюються.
Так, вже зараз цілком реально говорити про "генетичному
паспорті новонароджених ", т 4о 0Е 4сть 0о тому, що вже незабаром після
народження за допомогою автоматизованої системи вдасться проаналізовано
налізіровать весь спектр найбільш частих мутацій широко
поширених захворювань як моногенної так і мультіфак-
торіальної природи 4, в 0том числі і генів, мутації яких з
високою ймовірністю можуть привести до раку молочної залози,
товстого кошечніка, до атеросклерозу, діабету і мн 4огім 0другім
ттяжелим недуг. Жити 4, 0н 4 і 0в чому себе не обмежуючи, засу-
нув як страус голову в пісок, або, знаючи, що у вас мутація
в гені глутатіонтранферази, а отже, висока імовірність
ність хвороб легенів (особливо раку) утриматися від куре-
ня? Що краще, добровільні обмеження і періодичні
огляди або стан щасливого невідання, що загрожує Немі-
нуемой катастрофою? А скільки мультіфіакторіальних захв-
ваний можна уникнути, знаючи про слабких і сильних сторонах своє-
го геному! В даний час в США провдено масові опитування
населення, мета яких з'ясувати доцільність досімпто-
тичного діагностики в родинах високого ризику, доступність
(Конфіденційність) цієї інформації для членів сім'ї, нані-
мець, страхових компаній тощо Іншими словами, практично
опанувавши плодом Древа Пізнання - власним геномом-челове-
кість поставлено перед дилемою як зробити так, щоб
користь від нього виявилася багато вагоміше, ніж потенційний
шкоду. Невипадково, сьогодні вже на новому, молекулярному рівні
спливають ідеї "поліпшення людської породи" Френсіса
Гальтона, правда, неимеющие нічого спільного з примітивною єв-
Геників минулого. Знайшли реальність і здавалися неможливі-
ми в недалекому минулому ідеї патентування окремих генів і
їх фрагментів, потенційно особливо перспективних для молі-
кулярной діагностики та біотехнологій. Незважаючи на протести
керівників програми "Геном людини" Френсіса Коллінса,
Томаса Каски і широкої наукової громадськості патент-
носпособность геному людини, принаймні, його окремих
них фрагментів, генів (наприклад, гена BRCA-1-мутації кото-
рого різко збільшують вірогідність раку молочної залози) по-
лучила схвалення 4е 0 законодавчих комітетів США
Ще більше етичних і моральних питань породжує ге-
нотерапія. Однак, і в цій області намітилася певна
еволюція поглядів як фахівців, так і широкої громадськості
ності. Від повної неприйнятність такого підходу в 70-80-х го-
та 4х 0уходящего століття до визнання безпеки (при дотриманні
необхідних правил) генноінженерних маніпуляцій на сомато-
чних клітинах. Тим часом, логіка підказує, що в міру
того як все більше соматичних мутацій вдасться виправити за
допомогою генної терапії, тим значніше буде їх внесок на
рівні статевих клітин. Тим більше буде шанс того, що 4прі
4вступленіі 0в шлюб гомозигот за аутосомно-рецесивним захв-
могам 4 (а ймовірність такої події буде зростати в
4мере вдосконалення методів лікування генетичних
4болезней) 0, всі діти 4будут здорові, хоча і отримають від своїх
4родітелей мутантні гени. Це стане особливо реальним у
4связі з успішною розробкою методології доімплантаційної
4діагностікі спадкових хвороб. Тому 0в наукової літе-
ратурі все наполегливіше звучить тема генокоррекціі на рівні
статевих клітин або ранніх зародків людини. Сучасний
методоческій рівень поки що не дозволяє з абсолютною уве-
тю здійснювати спрямований перенос гена в статеві
клітини і клітини роздрібнюється зародків. Поки цього вдалося
досягти тільки в експериментах з ембріональними стволовими
клітинами, причому на 1-му етапі виник організм, в дійсності
ності, є мозаїка по введеному гену (див. Главу
V 4I 0II). Природно, це не означає, що проблема Гомоле-
гічної рекомбінації нормального і мутантного гена на рівні
статевих клітин і ранніх зародків принципово нерозв'язна.
Проте, потрібно ще багато часу, можливо не одне
десятиліття XXI-го століття, перш, ніж це завдання буде успеш-
але вирішена. Нині думка фахівців та широкої
громадськості - максимально запобігти можливості попа-
дання чужорідного генетичного матеріалу в статеві клітини,
з тим, щоб уникнути непередбачуваних, а, швидше за все,
вельми сумних, наслідків для людства такого
трансгенозу.
Ні, однак, сумнівів у тому, що, якщо кінець ХХ-го століття
ознаменований розшифровкою молекулярної структури геному чоло-
століття, то століття XXI прославиться з'ясуванням його функцій на рів-
не окремих генів, генних спільнот, хромосом, також всього
геному в цілому в контролюванні процесів онто-і філогенії-
за.
Молодим людям, що вступають у ХХІ століття, необхідно знати,
4на якому етапі 0находітся наука 4о структуру та функції 0геном 4а
людини. Це важливо не тільки з суто утилітарних, міді-
цінських позицій (хоча і цей аспект дуже важливий), але і з
позицій загальнолюдських. Бо всяка епохальне відкриття на-
уки (а саме таким і є розшифровка генома челове-
ка) до недавнього часу використовувалася не тільки на благо,
але і на шкоду людству (4п 0ечальний приклад тому - відкриття
розщеплення ядра урану, що породило атомну бомбу). Нерозумний-
ні експерименти з геномом людини можуть призвести до ще бо-
леї страшних наслідків. Уберегти генофонд людства,
всіляко оберігаючи його від ризикованих втручань, і при
цьому отримати максимальну вигоду з вже отриманої безцінною
інформації в плані діагностики, профілактики та лікування мно-
гих тисяч спадково обумовлених хвороб - ось завдання,
яку необхідно вирішувати вже сьогодні 4 і 0С якої ми прийдемо
в нове XXI століття!
ГЛАВА IX.
Генна терапія.
Розділ 9.1 Визначення, історична довідка, програм-
ми генної терапії.
У широкому сенсі слова генна терапія означає лікування
шляхом введення в тканини або в клітини пацієнта смислових пос-
ледовательно ДНК. Спочатку генна терапія розглядають
ривать як можливість виправлення дефекту в гені. Вважаємо
лось, що основним об'єктом для такого лікування будуть служити
моногенні спадкові захворювання людини, причому тео-
ретіческі представлялася вірогідною корекція генного дефекту
як на соматичному рівні, так і на рівні зародкових (по-
лових) клітин. Численні експерименти по створенню
трансгенних тварин, розпочаті після 1980 р., а також на
культурах клітин внесли істотні корективи в ці теоре-
тичні уявлення. По-перше, виявилося значно
простіше виправляти не сам дефект у гені, тобто замінювати весь
мутантний ген або його мутований фрагмент на нормальний, а
вести корекцію шляхом введення в організм пацієнта повноцінного
але що працює гена (зазвичай його кДНК). По-друге, незважаючи
на вирішальні успіхи генної інженерії останніх років, дослід-
вання по Генн терапії у людини здійснюються виключи-
тельно на соматичних тканинах, в яких у нормі відбувається
експресія дефектного гена. Генна терапія на рівні статевих
і зародкових клітин людини з огляду на можливі серйозні пос-
долання наслідків для генофонду людства видаються вельми
проблематичною і на даному етапі наших знань - малореальний-
ною. І нарешті, по-третє, вже розроблена і застосовується
на практиці методологія генної терапії виявилася придатною
для лікування не тільки моногенних спадкових захворювань,
але і таких широко поширених хвороб, якими є
злоякісні пухлини, багато видів тяжких вірусних інфек-
цій, включаючи СНІД, серцево-судинні та інші захворювання.
Враховуючи ці обставини, генну терапію на сучасному
етапі можна визначити як лікування спадкових, онкологи-
чеських, деяких інфекційних (вірусних) та інших захворювань-
ний шляхом введення генів у клітини пацієнтів з метою направ-
ленного зміни генних дефектів, або додання клітинам но-
вих функцій (Culver, 1994). Перші клінічні випробування ме-
тодов генної терапії були зроблені 22 травня 1989р. з метою
генетичного маркування пухлина-інфільтрують лімфоцитів
у разі прогресуючої меланоми. Маркіровані прокаріоти-
ного геном neo, Т-лімфоцити були стійкі до неоміцину і
могли бути легко відселектований в культурі, що дозволило
детально простежити їхню долю в крові та виборче
накопичення в пухлинах (детальніше див 9.5).
Першим моногенних спадкових захворювань, у відно-
шении якого були застосовані методи генної терапії, надав-
ся спадковий іммуннодефіціт, обумовлений мутацією в
гені аденозин-дезамінази. 14 вересня 1990р.в Бетезда (США)
4-х річній дівчинці, яка страждає цим досить рідкісним забо-
левание (1: 100 000), були пересаджені її власні лім-
фоцитів, попередньо трансформовані ex vivo геном ADA
(Ген ADA + ген neo + ретровірусний вектор). Лікувальний ефект
спостерігався протягом декількох місяців, після чого процедура
ра була повторена з інтервалом 3-5 місяців (Anderson, 1992;
Culver, 1994). Протягом 3-х років терапії в загальній складності
проведено 23 внутрішньовенних трансфузії ADA-трансформованих
Т-лифоцитов без видимих несприятливих ефектів. У резуль-
таті лікування стан пацієнтки (Ашанті В. ДеСільва) нас-
тільки покращився, що вона змогла вести нормальний спосіб
життя і не боятися випадкових інфекцій. Настільки ж успішним
виявилося і лікування другої пацієнтки з цим захворюванням
(Детальніше див 9.5). В даний час клінічні
випробування генної терапії цього захворювання проводяться в Іта-
ща, Франції, Великобританії та Японії.
Інші моногенні спадкові захворювання, у ставлення-
нии яких вже є офіційно дозволені протоколи та
розпочаті клінічні випробування, стосуються сімейної гіперхолес-
терінеміі (1992); муковісцидозу (1993); гемофілії В (1992);
хвороби Гоше (1993). У відношенні багатьох інших захворювань
медичні протоколи клінічних випробувань знаходяться в ста-
дии затвердження (див. розділ 9.5.). До 1993р. тільки в США до
клінічних випробувань генно-інженерних конструкцій на чоло-
столітті було допущено 53 проекту (Culver, 1994). До 1995р. в мі-
ре число таких проектів зросла до 100 і більше 400 пацієнтів
тов було безпосередньо залучено в ці дослідження (Hodg-
son, 1995). Переважна більшість таких проектів (86) ка-
салось лікування онкологічних захворювань, а також СНІДу.
Таким чином, від дослідів на тваринах і теоретичних
побудов 80-х років уже в 1990 році вдалося приступити до
реального лікування моногенних захворювань, кількість яких
стрімко наростає. Природно, що подібні революци-
ційні зміни могли виникнути тільки в результаті вирішальних
успіхів молекулярної біології в картуванні генів, мутації
яких приводять до спадкових захворювань (см.главу
III), з'ясуванні молекулярної природи цих мутацій (см.главу
IV), успіхів у секвенування і клонування генів (см.главу
I та II), створення генно-інженерних конструкцій (см.главу
II), відпрацювання та вдосконалення методів їх доставки
(Див. нижче). Слід також підкреслити, що якісний ска-
чок в області генної терапії, коли сам ген став розглядає-
ватися як лікарський препарат, став можливий завдяки
того, що попередні експериментальні та клінічні
дослідження довели безпеку генної терапії.
Разом з тим, і в сьогоднішніх дослідженнях з генної
терапії необхідно враховувати, що наслідки маніпулірова-
ня генами або рекомбінантними ДНК in vivo вивчені недостатньо
точно. Слід пам'ятати, що введення в організм людини
послідовностей ДНК, що не знаходяться під контролем свойс-
ничих нею регуляторних елементів, може призводити до важко
передбачуваності змін метаболічних процесів і супроводжується
датися функціональним дисбалансом. Сучасні уявлення
про структуру геному і його взаємодіях з екзогенними ДНК і
вірусними послідовностями, часто використовуються в ка-
честве векторів для переносу генів (див. 9.2), можуть надати-
ся недостатніми для прогнозування можливих небажаних
них чи неконтрольованих наслідків такого втручання.
Тому при розробці програм генної терапії принципо-
ве значення мають питання безпеки запропонованих схем
лікування як для самого пацієнта, так і для популяції в цілому
(Anderson, 1992; Miller, 1992). Важливо, щоб при проведенні
випробувань очікуваний лікувальний ефект чи можливість отри-
ня додаткової корисної інформації перевершували потен-
ний ризик запропонованої процедури. Невипадково, в країнах з
найбільш просунутим рівнем досліджень у цій області,
особливо в США, медичні протоколи з використанням смис-
лових послідовностей ДНК піддаються обов'язковій екс-
експертизі у відповідних комітетах і комісіях. Клінічні
випробування запропонованої генотерапевтіческой процедури можли-
ни тільки після її схвалення відповідним законодавчо
затвердженим органом. У США такими є: консультат-
ний Комітет з рекомбінантних ДНК (Recombinant DNA Advisory
Committee - RAC), Комітет з ліків і харчових продуктів
(Food and Drug Administration-FDA), з наступним орга-
в'язковим затвердженням проекту директором Національного Інсти-
тута Здоров'я (National Institute of Health) (Miller, 1992;
Anderson, 1992; Culver, 1994). У Європі такі протоколи сос-
шають і затверджуються відповідно до рекомендацій Єв-
ропейской Робочої Групи з переносу генів та генної терапії
(European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy)
(Cohen-Haguenauer, 1995). Програми генної терапії для клі-
технічних випробувань повинні включати наступні розділи: обгрун-
нованіе вибору нозології для проведення курсу генної тера-
ПІІ; визначення типу клітин, які підлягають генетичної моди-
фікації; схему конструювання екзогенної ДНК; обгрунтування
біологічної безпеки вводиться генної конструкції,
включає досліди на культурах клітин та на модельних (транс-
генних) тварин; розробку процедури її перенесення в клітини
пацієнта; методи аналізу експресії введених генів; оцінку
клінічного (терапевтичного) ефекту; можливі побічні
наслідки і способи їх попередження (Culver, 1993; Co-
hen-Haguenauer, 1995).
Найважливішим елементом у програмі генної терапії є
аналіз наслідків проведених процедур. Цей контроль прово-
дять на всіх етапах терапії, причому дослідження виконують на
різних рівнях. Перш за все, після переносу гена здійсню-
ють пошук модифікованих клітин в організмі пацієнта
і стежать за динамікою цих клітин в певних тканинах.
Цей пошук може бути полегшений за наявності маркерного гена в
конструкції. Присутність послідовностей екзогенної ДНК
в модифікованих клітинах найчастіше ідентифікують з по-
міццю ПЛР. На наступному етапі проводять аналіз експресії
введених генів шляхом ідентифікації та кількісної оцінки
відповідного РНК-транскрипту, або білкового продукту
гена. У тих випадках, коли це можливо, проводять аналіз
корекції первинного біохімічного дефекту. Потім, все по-
жані дані зіставляють з результатами комплексного ме-
медичні обстеження і вносять необхідні виправлення і
додати до проведену схему лікування.
Розділ 9.2. Типи генотерапевтіческіх втручань, ви-
бор клітин-мішеней.
Розглянемо найбільш загальні принципи, що лежать в основі
побудови програм генної терапії. Отже, генна терапія
припускає введення послідовностей ДНК в клітини-Міші-
ні. Вона проводиться або з метою корекції спадкової па-
тології, що виникла внаслідок генетичного дефекту, або
для надання цим клітинам нових функцій, що сприяють уст-
пораненню патологічних процесів. У першому випадку, в орга-
нізм хворого вводять нормально працюючий гомолог дефектного
гена. Другий підхід застосовують при лікуванні, таких захворювань-
ний, як пухлини або інфекції. У цих випадках вводять гени,
володіють умовним цитотоксическим ефектом або сприяю-
ющие формування вираженого імунної відповіді. Мішенями для
таких генів служать уражені тканини, імунні клітини, спеці-
чних чином проникають у ці тканини, або поперед-
але трансформовані in vitro інші клітини. Таким чином,
в залежності від характеру захворювання і передбачуваного ге-
нотерапевтіческого підходу об'єктом генетичної трансфекції
можуть служити найрізноманітніші соматичні клітини, як несучі
дефектний ген, так і нормальні клітини, які отримують тера-
певтіческіе властивості після трансфекції. У залежності від
способу введення екзогенних ДНК в геном пацієнта генна ті-
рапія може проводитися або в культурі клітин (ex vivo),
або безпосередньо в організмі (in vivo). Клітинна генна
терапія чи терапія ex vivo припускає виділення і кукси-
вірованіе специфічних типів клітин пацієнта, введення в
них чужорідних генів, відбір трансфецірованних клітин і Реін-
фузію їх тому ж пацієнтові (Мал. 9.1). В даний час
більшість допущених до клінічних випробувань програм
генної терапії використовує саме цей підхід (Cul-
ver, 1994). Здійснення таких програм можливе лише в
великих спеціалізованих центрах, вимагає великих матері-
альних витрат і високих біотехнологій.
Генна терапія in vivo заснована на прямому введенні кло-
ваних і певним чином упакованих послідовник-
ностей ДНК у специфічні тканини хворого. При цьому вводяться
ДНК, як правило, інтегрують з молекулами, що забезпечують
їх адресну доставку в клітини-мішені (див. 9.3). Цей дуже
перспективний підхід, розрахований на масове лікування широко
поширених захворювань, поки що реально апробовано толь-
до для лікування муковісцидозу (Crystal et al., 1994). Особ-
але перспективною для лікування генних хвороб in vivo предс-
Таля введення генів за допомогою аерозольних або іньеціруе-
мих вакцин. Аерозольна генотерапія розробляється, як
правило, для лікування пульмонологічних захворювань, таких
як муковісцидоз, енфізема, рак легенів, при яких об'єкта-
ми генетичної модифікації є специфічні типи ле-
гочних клітин (Hoffman, 1991). Іньеціруемие вакцини можуть
використовуватися для модифікації різних типів клітин і з
часом, мабуть, стануть найбільш поширеним і
універсальним способом доставки чужорідного генетичного
матеріалу в будь-які тканини.
Ефективність курсу генної терапії в значній сте-
пені залежить від правильного вибору типів соматичних клітин-
струм, в яких повинна бать проведена генетична модифікацій-
ція. Так наприклад, при лікуванні будь-якого спадкового
захворювання, обумовленого дефектом секреторного білка, ге-
нетической корекції, в принципі, можуть бути піддані лю-
різновиди клітини, тоді як для нерозчинних або мембран-пов'язаний-
них білків вибір обмежений тими клітинами, де експресують-
ся відповідний ген (див.розділ 8.5). Розробці програми
генної терапії передують ретельний аналіз тканеспеціфі-
чеський експресії відповідного гена, ідентифікація пер-
ведення первинного біохімічного дефекту, дослідження структури,
функції і внутрішньоклітинного розподілу його білкового про-
продукту, а також біохімічний аналіз патологічного процес-
са. Всі ці дані враховуються при складанні відповідних
ного медичного протоколу. Крім того, план генотерапевті-
чних втручань визначається також доступністю кле-
ток-мішеней, періодом їх життя і характером міграції в орга-
нізме, ефективністю і специфічністю трансфекції кле-
струм, тривалістю експресії введеного гена.
Найбільш перспективною представляється можливість гені-
тичної модифікації не самих уже диференційованих клітин
з спадковим дефектом, а їх попередників, тобто
довго живуть стовбурових клітин. Зокрема, багатообіцяючої
є трансформація тотипотентності ембріональних стовбурових
клітин, які при створенні певних мікроусловій можуть
диференціюватися, практично, в будь-які соматичні клітини
організму (Hodgson, 1995). Слід згадати в цьому зв'язку
запропонований недавно ефективний метод отримання стволових
клітин гемопоетичний ряду, перспективних для генотерапії
спадкових захворювань крові (Berardi et al., 1995).
Як правило, визначення типу клітин, які підлягають гені-
тичної модифікації, завершується оцінкою результатів пере-
носа гена в системі in vitro та проведення експериментів на
тварин моделях в тих випадках, коли це можливо. Апробовано нове
цію процедури генокоррекціі спадкового захворювання про-
водять на первинних культурах експресують клітин хворого
або на перещеплюваних культурах, отриманих після попередньо
тельной трансформації первинних культур. На цих клітинних
моделях оцінюють ефективність обраної системи переносу
екзогенної ДНК, визначають експресію вводиться генетичної
конструкції, аналізують її взаємодія з геномом кліть-
ки, відпрацьовують способи ідентифікації первинного дефекту і
його корекції на біохімічному рівні.
Проте, багато проблем генної терапії не можуть бути
вирішені на рівні клітин. Важливе значення має аналіз впливав-
ня введених ДНК-послідовностей на міжклітинні взаємо-
ємств, що визначають роботу відповідних тканин і ор-
ганів. Такі дослідження можуть бути проведені тільки in vi-
vo. Так, наприклад, в культурі клітин можна визначити колі-
кість синтезованого білка, необхідне для нормалізації
біохімічного дефекту, але цих даних недостатньо для від-
вета на запитання, яку кількість клітин в організмі має
бути модифіковане для відновлення порушеної функції.
Використовуючи культури клітин, можна розробити біохімічну
систему адресної доставки рекомбінантних ДНК, проте, про-
Вєрка надійності роботи цієї системи може бути здійснена
тільки на рівні цілого організму. Показники тривалості і
характеру експресії введеного гена в культурі клітин можуть
використовуватися лише як орієнтовних параметрів
для оцінки необхідної періодичності повторення терапевти-
чних процедур. Крім того, багато побічних ефектів і, в
першу чергу, можливі помилки в регуляції еспресо чуже-
рідного гена і небезпека вірусної контамінації в результаті
використання компетентного по реплікації вектора (див. нижче),
можуть бути виявлені тільки in vivo. Тому така увага в
програмах з генної терапії приділяється експериментів in vivo
на природних або штучно отриманих моделях від-
відних спадкових хвороб у тварин (см.главу
VIII). Успішна корекція генетичних дефектів у таких жи-
тваринного і відсутність небажаних побічних ефектів генної
терапії є найважливішою передумовою для дозволу клі-
технічних випробувань.
Розділ 9.3 Методи генетичної трансфекції в генній ті-
рапии.
Вирішальною умовою успішної генотерапії є забезпе-
чення ефективної доставки, тобто трансфекції (у широкому
сенсі) або трансдукції (при використанні вірусних вектора-
рів) чужорідного гена в клітини-мішені, забезпечення тривалого-
ної персистенції його в цих клітинах і створення умов для
повноцінної роботи, тобто експресії. Трансфекція може
проводитися з використанням (1) чистої ("голої"-naked) ДНК,
лігувати у відповідну плазміду, або (2) комплекси-
зованою ДНК - плазмідна ДНК комплексірованная з солями,
білками (трансферину), органічними полімерами (DEAE -
декстраном, полілізіном, ліпосомами або частками золота),
або (3) ДНК у складі вірусних частинок, попередньо ли-
значили спсобності до реплікації. Запорукою тривалої персіс-
тенціі чужорідної ДНК в клітинах-реципієнтах є її
вбудовування в геном, тобто в ДНК клітини-господаря. Перебуван-
ня екзогенної ДНК в ядрі у вільному стані (у вигляді, так
званих, ЕПІС) з неминучістю веде до її елімінації
навіть у неподільних клітинах і, відповідно, до транзиторної
Екпрес (зазвичай, протягом декількох місяців). Необхід-
мій передумовою експресії чужорідної ДНК є наявність
відповідних промоторів, причому у разі наявності тканес-
пеціфіческіх промоторів можна домогтися експресії введеного
гена тільки в певних тканинах і клітинах (див. нижче). Ос-
новні методи доставки чужорідних генів у клітини підрозділяють-
ються на хімічні, фізичні та біологічні. Ефективна від-
ність трансфекції і інтеграційна здатність трансдуціро-
ванної чужорідної ДНК при різних способах трансфекції в
ДНК-клітини мішені наведені в Табл.9.1.
Таблиця 9.1. Основні характеристики генетичної трансфек-
ції in vitro (Culver, 1994).
-------------------- T ------------ T ------------- T - ----------¬
| Методи | Трансдукція | Іінтеграція | Експресія |
+-------------------+------------+-------------+-- ----------+
| Хімічні: | | | |
| Са-фосфат | | | |
| Преципитация | низька | низька | трнзіторная |
+-------------------+------------+-------------+-- ----------+
| Фізичні: | | | |
| Електропорація | низька | низька | транзиторна |
| Мікроін'єкції | висока | низька | транзиторна |
| "Бомбардування" | | | |
| Частинками золота | висока | низька | транзиторна |
+-------------------+------------+-------------+-- ----------+
| Злиття: | | | |
| Ліпосоми | низька | низька | транзиторна |
| Рецептор-опосередковує-| | | |
| Ний ендоцитоз: | | | |
| ДНК-білковий | | | |
| Комплекс | висока | низька | транзиторна |
| ДНК-комплекс-| | | |
| Вірусна капсида | висока | низька | транзиторна |
+-------------------+------------+-------------+-- ----------+
| Рекомбінантні | | | |
| Віруси: | | | |
| Аденовірус | висока | низька | транзиторна |
| Адено-асоційова-| | | |
| Ний вірус (AAV) | висока | низька | тривала? |
| Вірус герпесу (HSV) | низька | низька | слабка |
| Вірус імуно-| | | |
| Дефіциту (HIV) | висока | висока | тривала? |
| Вірус мишачою лійці | | | |
| Мії Молоні (MoMLV) | висока | висока | тривала? |
| Вірус вітряної | | | |
| Віспи (Vaccinia) | висока | низька | слабка |
L ------------------- +------------+-------------+-- -----------
Як випливає з представлених даних, введення чужерод-
них генів in vitro може бути вельми ефективно як при по-
мощі деяких фізичних способів доставки (електропоаціі,
бомбардування частинками золота), так і, практично, при
всіх варіантах біологічної доставки, особливо, за допомогою
рекомбінантних вірусів. Однак, реально інтеграція в геном
клітини-реципієнта може бути досягнута тільки у разі рет-
ровірусних або адено-асоційованих векторів, що володіють
необхідними для вбудовування в еукаріотичних ДНК властивості-
ми. При цьому відсутність вбудовування в геномної ДНК, як пра-
вило, корелює з транзиторною (тимчасової) експресією ге-
на. Отже, тільки вірусні вектори або генетичні
конструкції, що включають вірусні послідовності здатні
до активної трансфекції, а в ряді випадків і до тривалої екс-
депресії чужорідних генів. Слід нагадати в цьому зв'язку,
що зі 100 вже схвалених проектів генотерапії 95 передпілля-
гают використовувати вірусну трансдукції і 86 з них засновані
на застосуванні ретровірусних векторів.
Незважаючи на зусилля багатьох генно-інженерних лабораторій,
Центрів, а останнім часом і фармацевтичних фірм, від-
присутність ідеальних векторів, що володіють ефективної (100%)
трансфекції як ex vivo так і in vivo, в поєднанні з висо-
кою пакующей здатністю (включення генетичної конструк-
ції від 1 до 1 000 000 п.о.), що інтегрують в геном або не-
інтегруючих, але забезпечують тривалу і, що особливо
важливо, регульовану експресію, при відсутності небезпеки он-
Коген модифікацій чи інших небажаних побічних ефек-
тов, продовжує залишатися одним з серйозних перешкод на
шляху внедеренія генотерапії (Hodgson, 1995).
Розділ 9.4. Конструювання векторних систем та вдосконалення-
налення методів трансформації клітин
людини.
9.4.1. Основні векторні системи.
У Табл.9.1 наведені основні типи векторних систем.
Зупинимося докладніше на способах їх конструювання, перева-
важливіших конкурентних переваг і недоліки, деякі з яких вже згадуючи-
лись у попередньому розділі. Як правило, що вводиться генетічес-
кая конструкція являє собою повнорозмірну кДНК-овую
послідовність певного гена, інсертірованную в
експресійна вектор, тобто що знаходиться під дією
сильного промотора. Вибір відповідного промотора залежить від
багатьох параметрів, головним з яких є необхідний
рівень експресії гена в клітинах-мішенях. Вектор часто зі-
тримає один із маркерних генів, таких як гени neo, бе-
та-Gal, ген люциферази та ін, присутність яких в трансду-
товки клітинах може бути легко виявлено за наявністю
або відповідного білкового продукту (гістохімічно для
генів бета-Gal і люциферази), або маркерних послідовник-
ностей ДНК. Якщо в якості маркера обраний селектіруемий ген
(Neo), відбір клітин, трансфецірованних in vitro, може про-
ватись автоматично на соответвтвующих селективних се-
ках. Існує два типи конструкцій; один - на основі плазми-
мідной ДНК, інший - на базі вірусів. Плазмідні конструкції
зручні для клонування, генно-інженерних маніпуляцій і по-
жання великої кількості рекомбінантної ДНК. Проте, бак-
ріальних плазміди, на відміну від вірусних конструкцій, не
здатні самостійно проникати в еукаріотичні клітини.
Для введення інсертірованной в плазміду екзогенної ДНК в
клітини людини необхідно перенести її у відповідний вірус-
ний вектор або застосувати спосіб, що полегшує її проходження
через клітинні мембрани.
9.4.2 Методи фізичного перенесення чужорідної ДНК в
клітини еукаріот.
Доречно зауважити, що чужорідна ДНК може спонтанно
проникати в клітини еукаріотів, завдяки наявності на зовнішніх
клітинних мембранах білків, специфічно зв'язують ДНК.
Ендоцитозу (впячивания всередину клітинної мембрани) чу-
жеродная ДНК потрапляє в цитоплазму у складі ендосом, де
зазвичай швидко руйнується лізосомальних ферментів. Тільки
невелика частина екзогенної ДНК виходить з ендосом, потрапляє
в ядро і, якщо не руйнується ендогенними нуклеазами, то мо-
жет бути інтегрована в ДНК клітини. Таке, однак, є наслiдком-
ся досить рідко. Відомий виняток становлять м'язи,
в яких завдяки низькій активності ендогенних нуклеаз і
низькою проліферативної активності введена ДНК довго (до 1
року) може зберігатися і навіть експресуватися в міофіб-
Рилла (Hansen et al., 1991).
Ефективна доставка чужорідної ДНК безпосередньо в
ядро клітини-мішені може бути досягнута шляхом мікроін'єкції
(Метод застосовується сьогодні майже виключно для створення
трансгенних тварин шляхом введення екзогенної ДНК в пронук-
Леус заплідненої яйцеклітини - cм.Главу VIII); за допомогою
електропорації (короткочасного впливу сильним елект-
рическим полем); шляхом перфорації клітинних мембран золотими
або вольфрамовими мікрочастинками коньюгірованимі з чужерод-
вими ДНК і розігнаними до високої швидкості (метод бомбарди-
ровки). Ці методи доставки застосовні, головним чином, для
клітин, культивованих in vitro. Виняток становить лише
метод бомбардування, який за наявності спеціального генно-
го "рушниці" з успіхом застосовується і in vivo (Yang et
al., 1990).
Для підвищення ефективності перенесення зазвичай використовують
системи доставки - з'єднання або групи сполук, взаємо-
діючі з ДНК з утворенням компактних структур, обліг-
чающих проникнення ДНК в клітини і захищають її від дій для ефективної боротьби
твія нуклеаз (Власова та ін, 1994). Найпростішою системою
доставки є система кальцій-фосфатної копреціпітаціі,
широко застосовується для трансфекції клітин in vitro. Більше
складний і багатообіцяючий варіант трансфекції представляє
собою рецептор-опосередкований транспорт, який передбачає
створення достатньо складною, зазвичай трикомпонентної конс-
ції: ДНК-полікатіона + ліганд + вірус (Мал. 9.2). У ка-
честве лігандів використовуються специфічні білки, такі як
трансферин, еритропоетин, асіалоглюкопротеін, коньюгированного-
ний з альбуміном інсулін і деякі інші, взаємодію-
щие з клітинними рецепторами і забезпечують фіксацію ген-
струкції на специфічних клітинах, тобто адресну
доставку чужорідної ДНК в клітини певного типу (напри-
заходів асіалоглюкопротеін - у клітини печінки, трансферин і
еритропоетин - у клітини крові і т.д). Ліганди ковалентно
приєднуються до зв'язує і компактізующім чужорідну ДНК
катіонних носіям (полілізіну, DEAE-Dextran та ін.)
Важливим компонентом системи є аденовірус або його
N-кінцевий фрагмент, що виступають у якості ефективних фу-
зогенних агентів, які забезпечують вихід екзогенної ДНК з ен-
ДОСом після попадання її в цитоплазму клітин-мішеней. Адреса-
ва доставка та ефективний захист від лізосомальних ферментів
забезпечують високу трансфекціонную здатність таких конс-
ції, їх безперечну перспективність для генної терапії
in vivo (Hodgson, 1995).
Ми вже згадували про можливість поєднання векторного і
фізико-хімічного підходу при конструюванні систем для
переносу генів до клітин людини. Одна з таких систем осно-
вана на використанні філаментне фага fd для трансфекції
епітеліальних клітин. Гени fd, що кодують білки оболонки фа-
га, експресуються на його поверхні. В один з них інсер-
ваними послідовність, що кодує полі-L-лізин. Полили-
Созінов залишки в складі злитого білка зв'язуються з плазми-
мідной ДНК і утримують її на поверхні фага. В іншій ген
оболонки фага інсертіруют послідовник ДНК, що кодує
будь-якої агент, специфічно зв'язується з апікальної
поверхнею епітеліальних клітин і інтерналізується (забезпе-
чують проникнення) фага всередину клітини. З цією метою
були апробовані гени білків патогенних бактерій, вражаю-
щих кишковий епітелій - інтерналін і інвазін, а також після-
послідовності ДНК, які кодують пептидні фрагменти варіабель-
ного району моноклональних антитіл Ab11. Було показано, що
у всіх трьох випадках досягається адресна доставка та інтер-
водовідведення фага в клітини-мішені, тобто система успішно
функціонує.
Спрямований перенесення генів у багато типів клітин, з-
тримають трансферріновие рецептори, може бути здійснено
при комплексування ДНК з трансферину. Використання в
цьому комплексі аденовірусного вектора существено полегшує
проходження ДНК через ендосоми і потрапляння її в ядро. Іде-
альних білковими лігандами для специфічних клітинних ре-
цепторов можуть служити моноклональні антитіла або їх фрагменти-
менти, спрямовані проти тих елементів рецепторів, які
знаходяться на зовнішній поверхні клітинної мембрани. Подоб-
ва система розроблена для рецептор-опосередкованого генного
переносу в епітеліальні клітини. Вона заснована на використання
нии протидії секреторних SCFab-фрагментів антитіл для полі-
мірного імуноглобулінового рецептора pIgR. Цей рецептор
транспортує IgA і IgM в респіраторні епітеліальні кліть-
ки, пов'язуючи імуноглобуліни та інтерналізіруя їх шляхом ендо-
цитоза. Показано, що в системі in vitro частота трансфекції
епітеліальних клітин при використанні SCFab-полі-L-ли-
зин-ДНК комплексу така ж, як і при введенні екзогенної
ДНК за допомогою трансферрінового рецептора. Аналогічні під-
ходи можуть бути застосовані для введення генів і в інші типи
клітин.
9.4.3 ліпосомних метод трансфекції.
Ефективний внутрішньоклітинний транспорт і захист від ДЕГ-
радаціі лізосомальних ферментів досягаються при вико-
вання в якості векторів ліпосом-ліпідних бульбашок, обла-
дають вираженими фузогеннимі властивостями - здатністю
зливатися з клітинними мембранами. Особливо перспективні в
цьому відношенні ліпосоми, отримані на основі катіонних ли-
пидов, що забезпечують 100% пов'язання ДНК в конденсовані
нуклеоліпідние частинки. Позитивний заряд на поверхні
таких бульбашок забезпечує їх активну злиття з негативним
тельно зарядженими клітинної мембранами і пряме попадання
чужорідної ДНК в цитоплазму, минаючи ендосоми і, відповідно-
але, не піддаючись дії лізосомних гідролаз. Дуже еф-
ної перенесення високоочищених ДНК або РНК-послідовник-
ностей в соматичні, особливо, в м'язові тканини може бути
здійснено за допомогою препаратів ліпофектіна або ліпофекта-
міну (Caplen et al., 1994). Набагато більш висока частота
трансфекції в порівнянні з ліпосом-опосередкованим перенесенням
отримана в експериментах на культурах клітин при використанні
нии ДНК-ліпідного комплексу з циклічним амфіпатіческім
пептидом граміцидину S.
Особливо перспективними останнім часом представляють-
ся комплекси, в яких ліпосоми коньюгіруют з мембранними
антитілами до певних білків-мішеней (іммуноліпосоми)
або з білками-лігандами (див. вище). Ці конструкції забезпе-
чивают ефективну адресну доставку чужорідної ДНК в клітинах-
ки-мішені. Подібна схема була успішно апробована для пе-
переносять гена сироваткового альбуміну людини в гепатоцити
лінійних щурів Nagase із спадковою дісальбумінеміей. До-
казано присутність і експресія введеного таким чином ге-
на людину в клітинах печінки щурів. Аналогічні результати
одержані в дослідах на кроликах лінійних Watanabe, дефектних
по рецепторів ліпопротеїнів низької щільності - LDL. Ці жи-
Вотня моделюють одне з найбільш частих моногенних захв-
ваний людини - сімейну гіперхолесерінемію. При внутрівен-
ної ін'єкції кроликам ліпідного асіалоглікопротеінового
комплексу з плазмідної ДНК, що несе нормальний LDL-ген, уро-
вень холестерину в крові тварин стійко знижувався.
Важливою перевагою рецептор-опосередкованих систем на
основі ліпосом є їх низька иммунореактивность. Вони
позбавлені й багатьох інших недоліків, властивих вірусним
векторним системам. Разом з тим, до цих пір не вирішена проб-
лема низької частоти трансформації клітин при ліпосомних пе-
переносять. Ця обставина істотно обмежує застосу-
ня ліпосом в генній терапії (Crystal, 1995). Тим не менш,
в даний час рецептор-опосередкований варіант передачі
генетичної інформації в клітини еукаріотів з використанням у
як лігандів специфічних антитіл, рецепторних білків,
а також вірусних послідовностей і ліпосом дозволяє в
одній системі поєднати переваги фізико-хімічних ме-
тодов перенесення ДНК і вірусних векторів і тому представляє
один з найбільш перспективних і швидко розвиваються нап-
ління в трансфекції еукаріотичних клітин.
9.4.4 Рекомбінантні віруси.
Конструювання векторів на базі вірусів являє
собою найбільш цікавий і перспективний розділ генотера-
пії. Еволюційно склалася система забезпечення ефективно-
го проникнення в клітини-мішені, а в разі ретровірусів і
система інтеграції в клітинний геном, дозволяє розгля-
вать віруси як природні вектори чужорідної ДНК для кле-
струм ссавців. Дійсно, тільки за допомогою вірусних
векторів поки вдається досягти такого рівня трансфекції кле-
струм людини in vitro і in vivo, який необхідний для про-
явища лікувального ефекту. Це доводять численні
експерименти на тваринах і перші клінічні випробування ут-
вердженими програм генотерапії (див. 9.2). Разом з тим,
не можна недооцінювати і цілком реальну небезпеку патології-
чних процесів, пов'язаних з використанням вірусних годину-
тиц. В якості векторів застосовують такі рекомбінантні
віруси: ретровіруси, аденовіруси, аденоассоціірованние виру-
си, вірус герпесу, вірус СНІДу (HIV), вірус вітряної віспи і
деякі інші (Anderson, 1992; Culver, 1994; Lowenstein,
1994; Hodgson, 1995; Kay, Woo, 1992). Враховуючи велику прак-
тичну значущість цих векторів, розглянемо їх більш під-
робно.
_Ретровірусние Вектори. . Генні конструкції на основі
ретровірусів (РНК-вмісних вірусів) особливо часто викорис-
зуются для трансдукції ДНК ex vivo. Найбільш популярний рет-
ровірусний вектор - вірус мишачого лейкозу Molony (MoMLV).
У порівнянні з іншими типами векторів ретровіруси мають
унікальною здатністю ефективно переносити чужорідні ге-
ни і стабільно інтегрувати їх у геном діляться соматічес-
ких клітин. Для безпеки ретровірусних послідовності-
ти модифікують таким чином, що в інфікованих ними
клітинах вірусні білки не виробляються. Це досягається за
рахунок видалення або інактивації всіх кодують послідовник-
ностей вірусу. Реплікація вірусних векторів може відбува-
дить тільки в спеціальних "пакуючих" клітинах, в геном кото-
яких вбудовані всі гени, які виробляють вірусні білки. При вве-
дении ретровірусних векторів у ці клітини утворюються віріо-
ни, що несуть векторну РНК і здатні лише проникати в кліть-
ки-мішені, але не розмножуватися в них. Недоліком цієї систе-
ми, також як і інших векторних систем на основі вірусів,
є можливість контамінації виробляє клітинної чи-
нии нормальним ретровірусом і отримання на цій основі ком-
компетентного по реплікації вектора. Для запобігання цьому
необхідно регулярне тестування "пакующей" лінії клітин.
Можлива також контамінація ретровирусного вектора клітинно-
ми РНК, деякі з них можуть назад транскрибувати і
вбудовуватися в геном трансдуцірованних клітин. Наслідки
такої події можуть бути виявлені в експериментах на живіт-
них моделях. Іншими серйозними вадами ретровірусних
векторів є: (1) їх здатність переносити генетічес-
кий матеріал тільки в проліфірірующіе клітини, (2) спосіб-
ність індукувати мутації при випадковій інтеграції в геном;
(3) можливість спонтанної активації онкогена; (4) невеликі
розміри стерпної ДНК-вставки - до 8 тисяч п.о.; (5) порів-
ково низький титр -10! 6-10! 7/мл рекомбінантних вірусних
частинок, одержуваних для трансдукції; (6) необхідність конс-
труірованія відповідних "пакуючих" клонів клітин.
_Аденовірусние Вектори. . На відміну від ретровірусів адено-
віруси активно інфеціруют неделящиеся клітини, мають біль-
ший потенційної пакующей здатністю (ДНК-вставка> 8 кб),
мають високий титр - 10! 11 / мл, проте, не забезпечують
вбудовування чужорідної ДНК в геном трансформованої клітини
(Hodgson, 1955). Використання їх перспективно для генокор-
рекции клітин верхніх дихальних шляхів, легенів та інших ор-
ганів - мозку, печінки, м'язів, шкіри та ін Вони ефективні при
доставці аерозольним способом, що було використано в пер-
вих клінічних випробуваннях по генотерапії муковісцидозу
(Crystal et al., 1994). У аденовірусні вектори також інсер-
ваними маркерні гени - neo, CAT або бета-галактозидазної
ген (бета-Gal) для того, щоб ідентифікувати трансдуціро-
ванні клітини. Для конструювання векторів використовують де-
фектние по реплікації аденовіруси, які отримують шляхом
вирізання з вірусною ДНК генів, кодіруюшіх білки (E1a,
E1b) - так звані аденовірусні вектори 2-го покоління. У
Нині створюються аденовірусні вектори третього покоління-
ня, в яких крім генів Е1а і Е1b видаляють і регуляторний
ген Е4. Така конструкція може підтримуватися тільки в при-
присутності клітин-хелперів (наприклад, в культурі клітин нирок
людини). Видалення більшого числа аденовірусних генів з
векторів часто супроводжується їх дестабілізацією. Це один
з головних недоліків аденовірусних векторів, так як в ря-
де випадків залишаються гени, трансдуцірованние в клітини-Міші-
ні, сприяють формуванню імунної відповіді. Саме ви-
ваний імунну відповідь при повторних введеннях аденовірусного
вектора з інсерцій гена CFTR, виявився найбільш серйозним
перешкодою для успішної генотерапії муковісцидозу (Crystal
et al., 1994). Деякі аденовірусні білки здатні оказ-
вать цитотоксичний ефект на високоспеціалізовані
клітини людини. Схема підтримки аденовірусних векторів
подібна до тієї, яка використовується для виробництва ретрові-
Русні векторів. Велика небезпека їх контамінації хелперних
реплицируются вірусом. Крім того, аденовіруси рідко ін-
тегріруются в геномної ДНК і тому експресія переносимих
ними генів, як правило, носить тимчасовий характер
(Табл. 9.1). Здатність інфікованих, практично, будь-які
клітини як in vivo, так і in vitro робить особливо актуаль-
ної адресну доставку таких конструкцій і введення в їх сос-
тав тканиноспецифічною промотра. Наприклад, промотор гена
альфа-фетопротеїну при необхідності експресії гена в кліть-
ках печінки, або промотори генів сурфактантная білків В і С
для експресії чужорідних генів у клітинах легенів.
_Аденоассоціірованние Віруси. мають значно мен-
ший пакующей здатністю (близько 5 кб). Однак, на відміну від
раніше розглянутих вірусів не мають онкогенної актив-
ністю, не патогенні, здатні інтегруватися в геном, де
перебувають у латентному стані. Унікальною особливістю AAV
є їх здатність до стабільної невипадковою інтеграції
в один з районів хромосоми 19. Специфічність інтеграції ви-
руса визначається наявністю в його геномі гена rep. Близько
родинні AAV, так звані, парвовірус (H1, MVM, Lu-
III), мають ще меншою пакующей здатністю - близько 2
кб і не мають специфічного вбудовування, однак, вони також
розглядаються як потенційно перспективні вектори.
_Вірус Простого герпесу (HSV). . Великий (152 кб) ДНК-со-
тримає вірус, при трансформації не інтегіруется в геном,
формуючи в ядрах епісомние структури. Унікальна особливість
HSV є його виражена тропність до клітин нервової сис-
теми. Звідси його перспективність як векторної системи для
лікування пухлин мозку, хвороби Паркінсона та багатьох інших.
Його відоме перевагу - досить велика пакующая
здатність (> 30Кб). Важливим етапом у створенні вектора на ос-
нове HSV є видалення з його геному області ICP22, від-
дальну за синтез літичних білків, і індукція мутації
1814, викликає блок транскрипції вірусної ДНК. Останнім
час на основі HSV стали отримувати штучні похідні
вірусу, так називемие амплікон-продукти, позбавлені, практи-
но, всіх генів HSV, але здатні до реплікації.
Конструкції векторів, використовуваних для перенесення екзо-
генних ДНК в клітини людини, постійно вдосконалюються в
залежно від типу клітин-мішеней. Так, новий тип векторів,
сконструйованих на основі псевдо-аденовірусів, поєднує в
собі всі переваги аденовірусних векторів, але при цьому
власні вірусні гени, практично, не надають никако-
го пошкоджуючого ефекту на трансфецірованние клітини-Міші-
ні, тому що містять дуже мало регуляторних елементів і
послідовностей, відповідальних за упаковку і реплікацію
аденовірусу. Крім того, псевдо-аденовірусні вектори з ус-
пехом переносять чужорідні послідовності ДНК як у де-
лящіеся, так і в покояться клітини. Вивчаються також перспек-
тиви використання для генної терапії інших вірусних сис-
тем, таких як SV40, вірус імунодефіциту (HIV), вірус вет-
ряной віспи та багато інших. Зокрема, заслуговують ува-
ня епісомние (неінтегрірующіеся в геном реципієнта) вектора-
ри, отримані на основі дуже великого вірусу Епштейн-Бар-
ра, здатного нести вставку розміром від 60 до 330 кб (Sun
et al., 1994).
9.4.5 Перспективи створення "ідеальних" векторних систем.
Огляд існуючих даних дозволяє прийти до укладенні-
нію, що, незважаючи на зусилля багатьох лабораторій світу, всі
вже відомі та випробувані in vivo і in vitro векторні сис-
теми далекі від досконалості (Hodgson, 1995). Якщо проблема
доставки чуужеродной ДНК in vitro практично вирішена, а її
доставка в клітини-мішені різних тканин in vivo успішно реша-
ється (головним чином, шляхом створення комбінованих рецеп-
тор-опосередкованих конструкцій), то інші характеристики
існуючих векторної системи - стабільність інтеграції,
регульована експресія, безпека - все ще потребують
серйозних доопрацювань. Перш за все, це стосується стабільнос-
ти експресії. Остання може бути досягнута або при ін-
теграціі чужорідної ДНК безпосередньо в геном реципієнта,
або шляхом забезпечення тривалої персистенції екзогенної
ДНК в ядрі. До теперішнього часу інтеграція в геном досягнень-
Галась тільки при використанні ретровірусних або адено-ас-
соціірованних векторів (Табл. 9.1). Випадкова інтеграція
трансфектной ДНК в геном відбувається досить рідко, причому
у разі ретровірусних векторів це відбувається тільки в де-
лящіхся клітинах. Підвищити ефективність стабільної інтеграція
ції можна шляхом вдосконалення генних конструкцій типу
рецептор-опосередкованих систем (Мал. 9.2). Однак, ці століття-
торні конструкції повинні включати тільки частина вірусних ге-
нов, наприклад, гени зворотної транскриптази, ретровірусної
інтегрази, деякі транспазоновие гени, парвовирусной
rep-гени (див. 9.4.4). Враховуючи можливий мутагенний ефект
випадкової інтеграції, дуже перспективним видається
створення достатньо стабільних епісомних векторів. У част-
ності, останнім часом особлива увага приділяється створенню
векторів на базі штучних хромосом ссавців (Mam-
malian Artificial Chromosomes), які могли б достататоч-
але автономно перебувати в ядрі, зберігаючи здатність до реп-
лікації та експресії. Зручними моделями для цього представ-
ляють автономно реплицируются циркулярні мікрохромосоми
ракових клітин (Hodgson, 1995).
Особливо привабливою в плані генної корекції
представляється можливість заміни всього мутантного гена чи
його мутованої частини (наприклад, одного екзона) на нормаль-
ний аналог, що може бути досягнуто шляхом гомологічною ре-
комбінації. При цьому в ідеалі можна очікувати не тільки тривалий
тільну персистенції введеного гена, але і збереження нор-
мальної експресії. З цією метою в конструкції, використовувані
для переносу ДНК, включають агенти, що підвищують частоту гомо-
логічного спаровування, наприклад, бактеріальну рекомбіна-
зу. Показано, що в цих умовах частота гомологічною ре-
комбінації може перевищувати 2.5 * 10-4. Це достатньо для то-
го, щоб за допомогою ПЛР відібрати потрібні клони клітин. Для
спрямованого введення фрагментів гена в строго певні
локуси геному нещодавно розроблена система подвійної заміни,
заснована на використанні HPRT-залежних ембріональних
стовбурових клітин і векторної конструкції містить ген HPRT
(Гіпоксантин-фосфорібзілтрансферази) і ген тимідин-кінази
вірусу герпесу (HSV). Подвійна селекція трансформантів позво-
ляєт відібрати клітини, у яких відбулася гомологичная ре-
комбінація. Такий підхід знайшов широке застосування при ство-
нии штучних моделей спадкових хвороб у людини
(Див. детальніше Главу VIII). Проте, в клінічній практиці
він ще не використовується.
Розділ 9.5 Генотерапія моногенних спадкових забо-
Леваном.
Питання генотерапії спадкових захворювань детально
розглянуті в численних оглядах (Ledley, 1987; Ander-
son, 1992; Pyeritz, 1993; Breakefield, 1993; Lowenstein,
1994; Kay, Woo, 1994; Brown et al., 1994; Дріз, 1994; Crys-
tal, 1995) і досить повно підсумовані в нещодавно опублі-
кованої монографії (Culver, 1994).
Вже через рік після першого введення маркерного гена в
організм людини була проведена успішна клітинна сомати-
чна генотерапія спадкового захворювання, обумовлений-
ного дефіцитом аденозіндезамінази (ADA) (див. 9.1). При цьому
захворюванні в крові пацієнтів накопичується у високій кон-
центрації 2'-дезоксіаденозін, який токсично Дейсі-
твіє на T-і B-лімфоцити, в результаті чого у хворих раз-
вивается серйозний комбінований імунодефіцит. Для під-
тримання життя пацієнтів проводять періодичні гетерологіч-
ні трансплантації клітин кісткового мозку, однак, лише для
третини хворих можуть бути підібрані сумісні донори. Ен-
зим-замещающая терапія також призводить до помітного поліпшення
стану пацієнтів, але, як правило, успіх цей носить вре-
менний характер. План генної терапії, розроблений співро-
ніками Національного Інституту Здоров'я США (NIH) і схвалений-
ний RAC, полягав у призначенні хворим аутологічних лімфо-
цитов, трансдуцірованних нормальним ADA-геном. Здійснення
цього плану зажадало виконання наступних процедур: день за-
ляції клітин з крові пацієнта; активації і иммуностимуляции
росту T-лімфоцитів в культурі; трансдукції їх ретровірусних
вектором, що несе нормальний ADA-ген і маркерний ген neo;
відбору трансдуцірованних клітин на селективної середовищі; внут-
Рівень реінфузії модифікованих T-лімфоцитів пацієнта.
Першою пацієнткою, що зазнала цієї терапії, була 4-х років-
няя дівчинка (див.розділ 9.1). Протягом 10.5 місяців їй
було зроблено 8 аутологічних вливань трансдуцірованних
T-лімфоцитів і після піврічної перерви програму реінфу-
зій повторювали кожні 3-5 місяців. Вже після першого циклу
число T-лімфоцитів нормалізувався, концентрація ADA в цир-
кулірующіх клітинах крові збільшилася з 1% до 20 - 25% нір-
мального рівня і різко покращилися основні імунні харак-
ристики. Всупереч багатьом прогнозам, протягом більш,
ніж 6 місяців після припинення масованих уливань у
кроветока пацієнтки стійко зберігалося високе число кор-
ректірованних T-клітин, що дозволило надалі знизити
кількість вводяться клітин і значно збільшити проміжки
ки між цими процедурами. Через три місяці після перших
клінічних випробувань була розпочата програма генної терапії
ADA-дефіциту у другої 9-річної пацієнтки. Після 11 інфузій
трансдуцірованних аутологічних T-клітин стан цієї де-
вочкі також помітно покращився і відзначалася повна нормалі-
зація відповідних біохімічних і імунологічних поки-
казників. Таким чином, необхідно ще раз наголосити, що при
лікуванні обох пацієнток був досягнутий очевидний клінічний
ефект (Anderson, 1992; Culver, 1994).
Однак, в обох випадках не всі імунні функції віднов-
лися повністю. Мабуть, це було пов'язано з тим,
що корекція генетичного дефекту проводилась у зрілих
T-лімфоцитах. У зв'язку з цим запропоновані програми генної ті-
рапии за допомогою реінфузії змішаної популяції трансдуціро-
ванних T-лімфоцитів і перефирического стовбурових клітин крові.
Можливість ізоляції і трансдукції таких тотіпатентних ство-
лових клітин показана в експериментах на приматах.
Успіх перших клінічних випробувань з'явився потужним стиму-
лом для прискорення розвитку нових генотерапевтіческіх методів
стосовно до інших спадкових захворювань. У
Табл. 92 представлений список хвороб, для яких принципи-
ально можливий генотерапевтіческій підхід і генокоррекція
спадкового дефекту з великою ймовірністю буде здійсню-
ществлена вже в найближчому майбутньому, а також ті захворювання,
для яких вже є офіціальниі затверджені протоколи та
які знаходяться на різних стадіях клінічних випробувань.
Таблиця 9.2. Спадкові захворювання, генокоррекція кото-
яких знаходиться на стадії клінічних випробувань (КВ), експери-
ментальних розробок (ЕР) і принципово можлива (ПВ).
(Сulver, 1994; Lowenstein, 1994)
--- T ---------------- T ----------------------- T ----- ----------- T ---- ¬
| | Хвороба | Дефектний ген | Клітини-мішені | Ста-|
| | | | | Дія |
+--+----------------+-----------------------+----- -----------+----+
| 1 | Імунодефіцит | аденозиндезаминазу | лімфоцити | КД |
| 2 | Імунодефіцит | пуріннуклеозід-| лімфоцити | ПВ |
| | | Фосфорілаза | | |
| 3 | Сімейна гіпер-| рецептор ліпопротеїнів | гепатоцити | КД |
| | Холістерінемія | низької щільності | | |
| 4 | Гемофілія В | чинник 1Х | фібробласти | КД |
| 5 | Гемофілія А | чинник Y111 | міобласти, | ЕР |
| | | | Фібробласти | |
| 6 | Хвороба Гоше | в-глюкоцереброзідази | макрофаги, | КД |
| | (Сфінголіпідози) | | стовбурові клітини | |
| 7 | Хвороба Хантера | ідуронат-сульфатаз | макрофаги, | ПВ |
| | | | Стовбурові клітини | |
| 8 | Синдром Гурлера | L-ідуронідаза | макрофаги, | ПВ |
| | | | Стовбурові клітини | |
| 9 | Емфізема легень | альфа-1-антитрипсин | лімфоцити | ЕР |
| 10 | Муковісцидоз | CF-трансмембранний | епітелій бронхів | КД |
| | | Регулятор | | |
| 11 | Фенілкетонурія | фенілаланінгідроксилази | гепатоцити | ЕР |
| 12 | Гіпераммонемія | орнітінтранскарбамілаза | гепатоцити | ПВ |
| 13 | Цітрулінемія | аргіносукцінатсінтетаза | гепатоцити | ПВ |
| 14 | М'язова дист-| дистрофін | міобласти, | ЕР |
| | Рофія Дюшенна | | міофібрили | |
| 15 | Талассемия | бета-глобін | еритробластів | ЕР |
| 16 | Серповіднокле-| бета-глобін | еритробластів | ЕР |
| | Точна анемія | | | |
| 17 | Респіраторний | сурфактант | епітелій бронхів | ЕР |
| | Дистрес-синдром | білок У | | |
| 18 | Хронічний | NADPH-оксидаза | гранулоцити | ЕР |
| | Грануломатоз | | | |
| 19 | Хвороба | білок-попередник | нервові клітини | ЕР |
| | Альцгеймера | в-амілоїду (ААР) | | |
| 20 | Хвороба | тирозин-гідроксилази | міобласти, | ЕР |
| | Паркінсона | | фібробласти | |
| | | | Нервові клітини | |
| 21 | Метахроматі-| арилсульфатази А | стовбурові клітини | ПВ |
| | Чна лейко-| | крові, | |
| | Дистрофія | | нервові клітини | |
| 22 | Синдром Леш-| гіпоксантин-фосфо-| нервові клітини | ПВ |
| | Ніхана | рибоза трансфераза | | |
L - +----------------+-----------------------+----- -----------+-----
Як випливає даних Таблиці 9.2, на стадії клінічних
випробувань в 1994р. вже знаходилися 5 моногенних захворювань.
Для 10 генних хвороб проводилися експериментальні дослі-
вання та відпрацьовувалися вимоги, необхідні для одержання
ня офіційного дозволу клінічних випробувань (см.9.1).
Дослідження з іншим захворюванням знаходяться на початковій стадії
них етапах. Список таких захворювань дуже швидко збільшуючи-
ється. Звертає на себе увагу, що перші програми з
генної терапії пов'язані з модифікацією гемопоетичних клітин
(W