Лігандообменная хроматографія
Лігандообменная хроматографія заснована на утворенні координаційних зв'язків між сорбентом і розділяються іонами або молекулами. Лігандообменная хроматографія застосовна тільки для поділу сполук, що містять донорні гетероатома або кратні зв'язки. Іони перехідних металів, що знаходяться в нерухомій фазі, є акцепторами електронів і легко вступають в координаційне взаємодію з електронодонорних атомами функціональних груп поділяється з'єднання. Для проведення лігандного поділу необхідна наявність схильних до координації органічних сполук і комплексоутворюючою катіона металу. Такий поділ характеризується оборотністю процесу і високою швидкістю обміну лігандів. Лігандних обмін застосовують в рідинної колоночной, тонкошарової та газової хроматографії, але найбільші успіхи були досягнуті в ВЕРХ.
Лігандообменную хроматографію застосовують для поділу у водному середовищі сполук, що представляють великий інтерес для органічної хімії і біохімії: амінів, амінокислот, білків, нуклеотидів, пептидів, вуглеводів. При цьому в вчестве комплексоутворюючих використовують іони міді, цинку, кадмію, нікелю, срібла і заліза. Іони ртуті і срібла в неполярной середовищі аліфатичних вуглеводнів утворюють лабільні комплекси з ненасиченими та ароматичними вуглеводнями. Великими достоїнствами лігандообменной хроматографії є її селективність і відсутність жорстких вимог до сорбенту, який може бути міцно пов'язаний іонами металу або тільки просочений солями металу.
Амінокислоти займають дві координаційні позиції, т.e. є бідентатнимі лігандами, що різко підвищує міцність їх зв'язування за рахунок утворення хелатного комплексу.
Лігандообменная хроматографія оптично активних сполук заснована на утворенні лабільних координаційних сполук, в яких з центральним іоном металу-комлексообразователя одночасно координована молекула розщеплює асиметричного реагенту і один з які підлягають поділу енантіомерів. Для здійснення лігандообменной хроматографії необхідна наявність в розщеплюють реагентах і в поділюваних лігандах донорних гетероатомів сірки, кисню, азоту, здатних координуватися з іоном металу. Спостерігається хороша координація α-амінокислот та іонів міді, цинку і нікелю. Донорні атоми утворюють щільно упаковану координаційну сферу навколо центрального іона металу, при цьому колективні ліганди вступають у тісний контакт з розщеплює реагентом. Цим і пояснюється висока ефективність розпізнавання реагенту, т.e. енантіоселектівность.
Такий принцип розщеплення рацематів-лігандообменная хроматографія - вперше був застосований з використанням полістирольного сорбенту, ковалентно зв'язаного з залишками оптично активної природного амінокислоти L-проліну. Сорбент міцно координував двовалентну мідь, залишаючи в її основний координаційної площині дві вакантні позиції для зв'язування рухомого ліганду молекули L-або D-амінокислоти. Виявилося, що залишок L-проліну проявляє настільки високу спорідненість до D-ізомерів амінокислот, що останні довелося навіть вимивати з колонки розчином аміаку, який, координуючись з іонами міді, витісняв рухливий ліганд з сорбційного комплексу, в той час як L-ізомери десорбувати водою .
Взаємодією аміногрупи оптично активної амінокислоти з хлорметіль-ної групою полістиролу в присутності иодида натрію синтезовано більше 50 сорбентів, що мають асиметричні атоми. Виявилося, що циклічні амінокислоти пролін і оксипролін мають максимальну енантіоселектівностью і кількісно розщеплюють рацемат практично всіх амінокислот, а також багато оксикислоти,
діаміни, аміноспирти. Перевагою полістирольних асиметричних сорбентів є висока хімічна стабільність, велика обмінна ємність і можливість препаративного розщеплення рацематів. Іноді за один цикл на 300 р. сорбенту вдається розщепити до 20 р. рацемату. З'явилися ліга-дообменнікі з прищепленими до сили-Кагеля амінопропільним або отриманим з нього дітіокарбаматним радикалом.
Рис. 1. Хроматограмма рацематів амінокислот, отримана на колонці розміром 100х1 мм (скло) з асиметричним полістирольні аніонітів (7,5 мкм), рухома фаза - 0,25 М ацетат натрію і 1,5 Х10-3 М ацетат міді, рН = 5,2, детектор -УФ (260 нм): 1 - лізин, 2 - аланін, 3 - серії, 4 - лейцин
Лігандообменную хроматографію з успіхом застосовують для виробництва оптично чистих мічених тритієм амінокислот.
Дуже важливе застосування лігандообменной хроматографії - швидке поділ асиметричних енантіомерів без попереднього відокремлення від супутніх домішок. У лігандообменной рідинної хроматографії на відміну від лігандообменной газової хроматографії не потрібне попереднє перетворення енантіомерів в легколетучие з'єднання. Звичайно як сорбенту застосовують полістирол, до якого щеплений радикал оптично активного бензілзамещенного пропілендіаміна.
Для скорочення часу аналізу, підвищення його чутливості і точності потрібно підвищення ефективності колонки, що досягається за рахунок зменшення часток полістирольного сорбенту. Перспективним є отримання сорбентів для лігандообменной хроматографії на основі пористих силікагелів, хімічно модифікованих активними лігандами. Поверхня силікагелю зв'язується через n-пропіленові містки з L-оксіпроліновимі лігандами.
В даний час створено і випробувано близько десятка асиметричних сілікагелевих сорбентів. Хоча в більшості сорбентів використані оптичні ізомери проліну і оксипролін, вони розрізняються спорідненістю до різних амінокислот і порядком їх елюювання; це пов'язано з тим, що рухливий ліганд фіксується в комплексі не тільки координацією карбоксильної і аміногрупи з іоном міді, але і взаємодією бічного радикала амінокислоти з найближчим оточенням координаційного центру, що визначає в кінцевому підсумку порядок утримування антиподів амінокислот сорбенті.
Оскільки сорбенти для лігандообменной хроматографії випускаються, запропоновані деякі модифікації методу, що дозволяють використовувати традиційні сорбенти. Так, N-алкілірованних оптично активні амінокислоти сорбуються на звернення-фазному силікагелі. У алкільних радикалів повинно бути більше 5-6 вуглецевих атомів. У цьому випадку модифікатор міцно утримується на сорбенті і не змивається водним елюентом, в який додають слідові кількості міді.
Визначення мікродомішок
ВЕРХ є надійним методом аналізу мікродомішок-речовин з концентрацією 0,01%.
У рідинної хроматографії застосовують селективні детектори (амперометрический, флуоріметріческій тощо), здатні детектувати дуже мала кількість речовини. Очищення зразка до введення в рідинної хроматограф мінімальна, нерідко його вводять без попередньої обробки, і без отримання похідних, що часто неможливо при застосуванні інших методів аналізу. Нарешті, в рідинної хроматографії можливе створення унікального діапазону селективних взаємодій за рахунок зміни рухомої фази, що значно покращує роздільну здатність всієї хроматографічної системи. Робота з мікродомішок накладає ряд вимог на весь процес поділу. Особливе значення має роздільна здатність колонки, вибір детектора, попередня обробка зразка і побудова калібрувального графіка. Правильний вибір умов хроматографування дозволяє підвищити чутливість, надійність і відтворюваність результатів, що дуже актуально при роботі з мікродомішок.
Попередня підготовка зразка і його введення в хроматограф
Перед аналізом мікродомішок для підвищення чутливості бажано провести концентрування з'єднання методами, описаними у відповідному розділі. Переважно застосовувати устаткування, що дозволяє проводити автоматичну попередню обробку зразка, в тому числі екстрагування, подрібнення, фільтрацію і автоматичне введення в хроматограф.
Для отримання високої чутливості потрібно вводити максимально можливий обсяг зразка. При роботі в ізократіческом режимі на високоефективних аналітичних колонках оптимальний обсяг зразка становить від 100 до 500 мкл. Введення великого об'єму розбавленого зразка дозволяє компенсувати відносно низьку чутливість деяких детекторів для рідинної хроматографії.
При невеликих кількостях зразка аналіз проводять на колонках з внутрішнім діаметром 1-2 мм, що зменшує його витрати. Використовуючи як розчинника проби слабкий розчинник, можна наносити на колонку великі обсяги зразка. При цьому він накопичується на вході в колонку, так як до 'для компонентів зразка велика і в колонці відбувається концентрування мікродомішок, що значно підвищує чутливість виявлення. Користуючись цим прийомом, можна виявити деякі малополярние органічні сполуки, наприклад ароматичні вуглеводні, присутні у вигляді мікродомішок у стічних водах, на колонці з оберненою фазою.
Для забезпечення найбільшого концентрування розчинник проби повинен бути по можливості слабким, наприклад, містити 90-95% води. Надалі для елюювання проби силу рухомої фази різко збільшують. Концентрування на колонці дозволяє в деяких випадках запроваджувати 1 л і більше зразка при кінцевому об'ємі зони цікавить нас речовини менше 50 мкл (градієнтне елюювання), тобто концентрувати речовина в 20 000 разів. Можна підвищити чутливість виявлення, проводячи концентрування зразка і поза колонки, наприклад, випарівая розчинник. Однак треба бути впевненим, що при цьому не відбувається втрата або видозміна домішок. Крім того, при такому процесі значно підвищиться вміст основних компонентів у зразку, що призведе до перевантаження по ним колонки і утруднить аналіз. Речовини, утримувані сильніше, ніж домішки, можуть бути після аналізу, видалені з колонки не тільки за рахунок підвищення сили розчинника, але і шляхом зворотної промивки колонки.
Роздільна здатність колонки
Іноді вдається провести поділ на зверненої фазі таким чином, що основні компоненти зразка елюіруются з часом, близьким до t 0, а микропримеси утримуються на колонці, що полегшує їх кількісне визначення. Оцінка вмісту микропримеси найбільш надійна, коли її пік реєструється до піку переважаючого в зразку компонента. Елюювання піку микропримеси на хвості переважаючого компонента сильно погіршує її кількісне визначення. Будь хроматографічне розділення на колонці призводить до розведення зразка. При аналізі мікродомішок виникає проблема поділу при мінімальному розведенні. Ступінь розведення введеного зразка може бути виражена рівнянням
З макс / С 0 = VsN 0,5 / [Vr (2 π) 0,5],
де С макс - Концентрація, відповідна максимуму піку; С0 - початкова концентрація в зразку; Vs - об'єм, що вводиться; N - число теоретичних тарілок для даної колонки; Vr - утримуваний обсяг микропримеси.
З рівняння видно, що зниження ступеня розведення. а значить, збільшення чутливості визначення микропримеси можна досягти за рахунок збільшення обсягу вводиться, ^ використання колонки з великим числом теоретичних тарілок або за рахунок зниження обсягу утримування микропримеси. До збільшення N веде застосування ефективних колонок, заповнених частинками з розміром менше 10 мкм. При аналізі мікродомішок бажано застосування коротких колонок (5-10 см) з розміром частинок 3-5 мкм.
Великий вплив при аналізі мікродомішок надає зміна селективності системи та підвищення коефіцієнта поділу а, що досягається зміною складу рухомої фази і вибором оптимального хроматографічного режиму. Крім того, як видно з рівняння
C макc / С 0 = (α -1) / α
зміна селективності може значно знизити ступінь розбавлення піку.
Детектори
При аналізі мікродомішок працюють з селективними детекторами, чутливими до цікавого речовини. Гранична чутливість детектора залежить від відношення сигналу до шуму самого детектора і від його здатності реагувати на микропримеси у зразку. Перед виконанням аналізу необхідно ці микропримеси ідентифікувати. Найбільш часто при аналізі мікродомішок застосовують високочутливі фотометричні детектори, що працюють в УФ-області, і спектрофотометри. УФ-фотометри, мають чутливість більше 0,002 е.о.п. на всю шкалу при шумі 1%, дозволяють виявляти нанограммовие кількості речовин, помірно поглинаючих в УФ-області, а флуориметр - навіть пікограммовие. Для досягнення максимальної чутливості бажано працювати при довжині хвилі, що відповідає максимуму поглинання в УФ-спектрі речовини. Отримання відповідних похідних після колонки підвищує селективність аналізу і дозволяє проводити його при максимальній попередньому очищенні зразка.
Домішки, здатні до окислення або відновлення в електроліті, найбільш доцільно визначати чутливими електрохімічними детекторами.
Калібрувальні графіки
При кількісному аналізі мікродомішок не так важлива висока точність вимірювань, як їх надійність, що досягається отриманням зон, вільних від сторонніх сполук. Так як точність близько 10% вважається цілком задовільною, піки можна оцінювати по їх висоті, менше залежить від чіткості відділення микропримеси від сусідніх зон, піки яких можуть накладатися на піки аналізованих мікродомішок. Хоча оцінка за площами піків більш точна, калібрування по висоті піків зручніше.
У ВЕРХ калібрувальні графіки мікродомішок зазвичай лінійні і проходять через початок координат. Щоб уникнути можливих часткових втрат зразка, проводять калібрування методом внутрішнього стандарту (по співвідношенню висот піків), причому внутрішній стандарт відомої концентрації додають до попередньої обробки зразка. У цьому випадку втрати враховують за рахунок еквівалентного зміни концентрації внутрішнього стандарту та зразка. Стандартний зразок, близький за властивостями микропримеси, додають, коли важко виділити аналізоване речовина в чистому вигляді, щоб побудувати калібрувальний графік. Детальніше калібрування за методом внутрішнього стандарту розглянута в гл. 10.
При аналізі складних сумішей, зокрема в тих випадках, коли спостерігаються ефекти впливу матриці або коли отримання в чистому вигляді вихідного зразка, для якого будується калібрувальний графік, важко, застосовують метод додавання стандарту. Наявність інших компонентів у зразку може впливати на ступінь утримування і (або) висоту піка цікавить речовини. Метод додавання стандарту полягає в наступному. Зразок поділяють в хроматографі і вимірюють висоту h x цікавить нас піку. Після цього додають відоме вагова кількість W x речовини Х і повторюють поділ, визначаючи висоту піка h 'x речовини X. Для речовини Х будують калібрувальний графік і, визначивши калібрувальний коефіцієнт Sx = (h 'x-h x) / W x, обчислюють кількість речовини Х у вихідному зразку як h x / S x. Для перевірки лінійності графіка беруть кілька значень W x. Метод додавання стандарту не забезпечує поправки на нестабільність базової лінії, на перешкоди з боку інших компонентів і т.д. Ці перешкоди повинні бути виявлені до додавання стандарту.
Методом, альтернативним методом додавання стандарту, є отримання зразка без аналізованої речовини і використання цього зразка як матриці для підготовки стандартів при звичайній калібрування.
При визначенні мікродомішок потрібно дотримуватися наступних рекомендацій.
Проводити попереднє концентрування зразка, а в ряді випадків і попередню його очищення.
Використовувати великі обсяги зразка і короткі ефективні колонки, заповнені частинками сорбенту менше 10 мкм, особливо микроколонки.
Застосовувати найбільш чутливі детектори з високим відношенням сигналу до шуму.
Застосовувати хроматографічні системи, що забезпечують високу роздільну здатність для мікродомішок (α> 1,2) при відносно низьких значеннях до '(0,5-1,5).
Якщо це можливо, то поділ слід проводити в обіг-фазному варіанті, коли основний компонент виходить у зоні t o. 5. Калібрування проводити по висоті піків.
Література
Kucera P. / J. Chromatogr, 1980, v. 198, p. 93-109.
Bowermaster J., McNair Я. / J. Chromatogr, 1983, v. 279, p. 431-438.
Scott RPF / Adv. Chromatogr., 1983, v. 22, p. 247-294.
Van der Berg JHM, Horsels HWM, Groenen RJ Af. / Chromatographia, 1984, v. 18, No. 10, p. 574-578.
Freebairn KW, Knox J. Я. / Chromafographia, 1984, v. 19, No. 1, p. 37-47.
Schoenmakers P. /, Billiet HAH, DeGalan L. / J. Chromatogr, 1981, v. 205, p. 13-30.
Jandera P., Churacek J. / J. Chromatogr, 1980, v. 192, No. 1, p. 19-36.
Lawrence JF, Frel RW Chemical Derivatisation in Liquid Chromatography. Amsterdam, Elsevier, 1976. 277 p.
Morris C. /., Morris P. Separation Methods in Biochemistry. N. Y, J. Wiley, 1976. 267 p.
Blau K., King GS Handbook of Derivatives for Chromatography London, Heyden, 1977. 784 p.
Kissinger PT ea / J. Chromatogr. Sci, 1979, v. 17, p. 137.
Lawrence JF Organic Trace Analysis by Liquid Chrcpiafography. NY, Acad. Press, 1981. 288 p.
Roos RW / J. Chromatogr. Sci, 1976, v. 14, p. 505.
Nachtmann P., Budna KW / J. Chromatogr, 1977, v. 136, p. 279.
Clark CR, Wells MM / J. Chromatogr. Sci, 1978, v. 16, p. 332.