Конструювання клонування і відбір рекомбінантних молекул ДНК

Конструювання, клонування і відбір рекомбінантних молекул ДНК

Розглянемо процес отримання клонованих ДНК. На першому етапі готують фрагменти ДНК, придатні для подальшого лігування з векторною молекулою. Наступний етап полягає в самому лигирование. Ці процеси здійснюються in vitro. Далі рекомбінантні молекули вводять в клітини, де вони амплифицируют шляхом реплікації. Потім проводять клонування, відбір та подальшу ампліфікацію.

Вставки

а. Загальні положення
При конструюванні рекомбінантних молекул зазвичай використовують складні суміші потенційних вставок, і в результаті утворюється цілий набір клонів, з якого шляхом скринінгу та відбору отримують потрібні рекомбінантні молекули. Скринінг і відбір можна значно спростити, якщо збагатити вихідну суміш потрібним сегментом; в цьому випадку для виявлення шуканого рекомбінантів доводиться перевіряти значно менше рекомбінантних клонів. З одного боку, для конструювання рекомбінантних ДНК можна використовувати очищені фрагменти ДНК, а з іншого - саме молекулярне клонування є найбільш простим і ефективним способом очищення фрагментів. Клонування є також найбільш ефективний спосіб отримання більшості фрагментів геномної ДНК у значних кількостях.
Існує три джерела вставок для клонування:
1) геномна ДНК, фрагментована або за допомогою рестріктірующіх ендонуклеаз, або фізичними методами, наприклад за допомогою ультразвуку;
2) синтетичні фрагменти ДНК, отримані хімічним або ферментативним методом або шляхом об'єднання цих двох методів;
3) сегменти ДНК, отримані з допомогою ферментативного копіювання РНК-матриці in vitro. При розщепленні ДНК ендонуклеаза часто утворюються фрагменти, здатні до безпосереднього лигированию з підходящими липкими або тупими кінцями вектора. В інших випадках відповідні кінці приєднують до фрагментів перед лігування.
б. Вставки геномної ДНК
Ендонуклеазною розщеплення. Найбільш прямий спосіб отримання вставок полягає в розщепленні сумарною геномної ДНК будь-якого організму чи вірусу за допомогою рестріктірующей ендонуклеази. Метод відрізняється високою відтворюваністю: специфічний фермент розрізає дану ДНК з утворенням унікального набору фрагментів. Якщо при ендонуклеазною розщепленні утворюються липкі кінці, відповідні кінців векторної молекули, то клонування здійснюють відразу або після збагачення популяції фрагментами для отримання потрібної вставки.
Збагачення суміші потрібними фрагментами. Для ефективного розділення складних сумішей фрагментів використовують два методи: електрофорез в напіврідкої середовищі і рідинну хроматографію високого дозволу з зверненої фазою. Проте жоден з цих методів не дозволяє отримати фрагменти в чистому вигляді. Зазвичай препарати містять домішки інших фрагментів, що мають близьку довжину або володіють такою ж здатністю до елюції. Проте можна отримати значне збагачення суміші щодо потрібного фрагмента, що полегшує його виявлення у великій колекції клонів.
При електрофорезі та хроматографії поділ фрагментів ДНК грунтується на їх відмінності за розміром і нуклеотидного складу. Якщо розмір генома невеликий, то утворюється відносно невелике число добре разделяющихся фрагментів; їх легко виділити, зібравши потрібні фракції елюата з хроматографічної колонки або вирізавши шматочки агарозного гелю. Однак якщо розщеплюється великий геном, то добре відділяються лише деякі фрагменти. Частіше виходить безперервний набір фрагментів всіляких розмірів. Щоб зрозуміти, в чому тут справа, проведемо простий розрахунок. Типовий гаплоїдний геном ссавців містить приблизно 3 * 10 ⁹ п. н. Грубу оцінку кількості фрагментів, що утворюються при вичерпному розщепленні ендонуклеаз, можна отримати, розділивши розмір генома на передбачуване середня відстань між двома сусідніми сайтами для даної рестріктірующей ендонуклеази. Для ферменту, котрий дізнався ділянку з шести пар основ, середня відстань між сайтами буде дорівнює 4 ⁶ п. н. Якщо розмір сайту впізнавання дорівнює чотирьом парам нуклеотидів, то він буде зустрічатися приблизно один раз на кожні 4 ⁴ п. н. При розщепленні ДНК ссавців ферментами, які розрізають молекулу по сайтах впізнавання завдовжки шість пар нуклеотидів, утворюється приблизно 7 * 10 ⁵ унікальних фрагментів, а ферментом, сайт впізнавання якого становить чотири пари нуклеотидів, - 12 * 10 ⁶ фрагментів. У результаті виходить безперервний розподіл фрагментів за довжинами. При цьому деякі фрагменти взагалі неможливо виявити, оскільки вони представлені в дуже малій кількості.
Ідентифікація специфічних фрагментів. Проблеми, що виникають при ідентифікації фрагментів. При розщепленні приблизно 50 мкг геномної ДНК і наступному електрофорезі препарату маса сегмента ДНК довжиною 1000 п. н., Що зустрічається в геномі лише один раз, складає всього 17 * 10 ^-6 мкг, або 17 пг. Як ідентифікувати цей специфічний фрагмент? Якщо є гомологичная ДНК або препарат комплементарної РНК, які можна використовувати в якості зонда при гібридизації, то нас цікавить фрагмент можна виявити при відпалі зонда з фрагментами після їх денатурації. Так, як зонд можна використовувати очищену мРНК, відповідну гену, який ми хочемо клонувати. Іноді в ролі зонда виступає гомологічний ген, клонований в іншому організмі і має досить близьку структуру. Щоб виявити гібрид, потрібно використовувати мічений зонд. Найчастіше його мітять радіоактивним ізотопом.
Визначивши приблизний розмір даного нас фрагмента, можна елюіровать матеріал відповідної галузі іншого гелю, що не пройшов гібридизацію, і використовувати цей матеріал для клонування. Аналогічним чином можна тестувати фракції після хроматографічного розділення фрагментів на колонці.
Блот. Майже у всіх випадках, подібних до описаних вище, ДНК перед гібридизацією переносять з гелю на більш відповідну підкладку. Цей метод широко використовується, наприклад, для ідентифікації специфічних РНК і білків після їх електрофоретичного поділу. Блот ДНК названий на ім'я його винахідника блотів по Саузерн; відповідні методики для РНК і білків отримали назву Нозерн-блотів і вестерн-блотів.
Гібридизація міченого зонда з фрагментами ДНК, що знаходяться в гелі, відбувається дуже неефективно. Тому перед відпалом фрагменти переносять з гелю на більш відповідну тверду підкладку, зазвичай на нітроцелюлозні фільтр або нейлон. Спочатку гель обробляють лугом, щоб відбулася денатурація ДНК. Потім на нього накладають тверду підкладку і пропускають через гель буферний розчин. У результаті фрагменти ДНК переходять на підкладку зі збереженням їх взаємного розташування. Далі інкубують підкладку в розчині, що містить ³² Р-зонд, при такій іонній силі і температурі, які забезпечують утворення водневих зв'язків між зондом і комплементарним фрагментом ДНК. Чутливість методу залежить від питомої радіоактивності зонда і дозволяє зареєструвати фрагменти, коли їх кількість вимірюється пікограмів. Наприклад, ³² Р-мічені зонди, отримані за допомогою нік-трансляції, мають питому радіоактивність більше 100 імп. / Хв на 1 пг, що достатньо для візуалізації радіоавтографов.
Випадкова фрагментація геномної ДНК. Довгі молекули ДНК легко ламаються навіть при незначних гідродинамічних напругах, і їх можна піддати випадкової фрагментації за допомогою ультразвуку, шляхом швидкого перемішування розчину або пропускання його через невеликий отвір. Для отримання випадкового набору перекриваються фрагментів можна використовувати і рестріктірующіе ендонуклеази, якщо проводити досвід в таких умовах, коли розщеплення відбувається лише в невеликому числі наявних сайтів. Середній розмір утворюються фрагментів залежить від величини зусилля, що прикладається і від концентрації ендонуклеази. Зазвичай ДНК виділяють з великої популяції клітин, тому вихідні її препарати завжди представлені великим числом ідентичних геномів. Кожен сегмент ДНК присутня в кінцевому наборі у фрагментах різних розмірів, що не дозволяє очистити його перед клонуванням. Тим не менш, випадкові набори фрагментів мають перевагу перед наборами, які отримуються в результаті повного гідролізу рестріктірующей ендонуклеаз, оскільки ймовірність знаходження хоча б однієї копії потрібного сегмента цілком в одному фрагменті у них значно вище.
Вирізання певних сегментів хромосом. Якщо положення даного гена в хромосомі відомо і хромосома досить велика, щоб проводити з нею різні маніпуляції, можна вищепіть її частина, яка містить потрібний ген. Цим вимогам задовольняють політенні хромосоми слинних залоз Drosophila. Кожна така хромосома містить більше 1000 копій ДНК, розташованих паралельно один одному, так що невеликий сегмент може включати 1000 копій певного гена. Генетичні і цитогенетичні дослідження дозволили більш-менш точно встановити положення багатьох генів Drosophila. Використовуючи фазово-контрастну мікроскопію, можна локалізувати область хромосоми, що містить певний ген, і вирізати її тонкою голкою. Таким методом отримують сегменти геному довжиною близько 200 т.п. н., які далі розрізають рестріктірующімі ендонуклеаза і включають в векторні молекули. Досягається при цьому збагачення вельми значно, оскільки на частку 200 т.п. н. припадає лише близько 0,1% від 1,8 * 10 ⁸ п. н., складових весь геном.
в. Синтетичні вставки
Успіхи, досягнуті в створенні методів хімічного синтезу, дозволили синтезувати з простих нуклеозидів молекули ДНК довжиною до 50 залишків. Такі молекули, які важко отримати іншим шляхом, можна потім клонувати і виділити у великих кількостях. Наприклад, скринінг певного гена може виявитися неможливим за відсутності відповідного зонда. Однак такий ген можна синтезувати in vitro, якщо виходячи з амінокислотної послідовності відповідного поліпептиду встановити нуклеотидну послідовність. Саме таким способом були вперше клоновані в клітинах Е. coli сегменти, що кодують гормони соматостатин та інсулін. Ці сегменти отримували, синтезуючи окремі олігонуклеотидно блоки і об'єднуючи їх потім за допомогою ДНК-лігази. Було синтезовано вісім коротких одноланцюгових фрагментів ДНК. Їх відпалювали і отримували дволанцюжкові молекули, стабілізовані водневими зв'язками, які утворюються між комплементарними кінцевими послідовностями. Оскільки всі синтетичні продукти мали на 5'-кінцях гідроксильні групи, перед лігування кінці фосфорилювати за допомогою полінуклеотідкінази і АТР. Відповідні фосфатні групи пофарбовані. Згодом з 66 коротких синтетичних фрагментів був відтворений ген інсуліну довжиною 514 п. н. Слід зазначити, що у зв'язку з виродженим генетичного коду встановлення істинної нуклеотидної послідовності гена виходячи з відомої послідовності амінокислотних залишків у відповідному поліпептиди виявляється неможливим. Тим не менш, вдалося визначити і синтезувати функціональну кодує послідовність.
Синтезувати нуклеотидну послідовність цілого ген, дуже важко. Однак більшу цінність представляє синтез навіть коротких ділянок кодує послідовності, оскільки за відсутності інших зондів ділянки довжиною 15-20 нуклеотидів можна використовувати в якості специфічних зондів при гібридизації. Синтетичні зонди використовуються при Саузерн - і Нозерн-гібридизації, а також для скринінгу рекомбінантних клонів. Крім того, короткі синтетичні послідовності застосовуються в якості праймерів при визначенні нуклеотидних послідовностей довгих сегментів ДНК, а також при ферментативному синтезі ДНК на молекулах РНК за допомогою зворотної транскриптази. Іншою важливою областю застосування описаної технології синтезу є отримання коротких сегментів ДНК, що містять сайти впізнавання для відомих рестріктірующіх ендонуклеаз. Такі сегменти-лінкера лигируют з тупими кінцями фрагментів ДНК, що вбудовуються в векторні молекули.
Хімічний синтез полідезоксінуклеотідов. Для хімічного синтезу полідезоксінуклеотідов широко застосовують два методи. В обох випадках вихідними будівельними блоками є дезоксірібонуклеозіди, і обидва методи включають етап зв'язування мононуклеотидів і олігонуклеотидів. Методи повністю автоматизовані, при цьому використовується установка "Синтезатор ДНК".
Незалежно від методу першою умовою є захист тих реакційноздатних груп дезоксінуклеозідов, які не беруть участь у зв'язуванні. Так, аміногрупи дезоксіаденозіна і дезоксіцітозіна зазвичай бензоіліруют, а до аміногрупи гуанозіна приєднують залишок ізомасляной кислоти. Тимидин, у якого аміногрупа відсутня, використовується немодіфіцірованним.5 '-гідроксильні групи зазвичай захищають шляхом утворення ефірного зв'язку з 4,4'-діметоксітріфе-нілметільним з'єднанням, яке називають діметоксітрітілом, або скорочено ₂ Тг. По завершенні синтезу всі приєднані групи повинні бути видалені. Вільні аміногрупи відновлюються при м'якому лужному гідролізі аміноацільних одиниць, а діметоксітрітільние групи видаляються за допомогою м'якого кислотного гідролізу.
Фосфаттріефірний метод. Нуклеозид з приєднаною діметоксітрітільной групою можна без будь-яких додаткових модифікацій використовувати для синтезу фосфодіефіра шляхом приєднання до З "-ОН-групі, наприклад, і-хлорфенилфосфордихлоридата. Цей диефіри може служити прямим попередником 5'-кінця нового ланцюга. Далі такий диефіри перетворюється на тріефір за допомогою, наприклад, р-ціаноетанола. Потім 5'-діметоксітрітіль-ва група видаляється шляхом м'якого кислотного гідролізу, в результаті чого утворюється реакційноздатні 5'-гідроксильна група. Диефірів і тріефір змішують у присутності реагентів, стимулюючих їх зв'язування, зазвичай арілсульфонілових сполук, наприклад триизопропилбензолсульфонилхлорида. Точний механізм скріплення невідомий. Продуктом реакції є повністю захищений дінуклеотід. При видаленні всіх захищають груп утворюється простий дінуклеозідмонофосфат. Істотно, що повністю захищений дінуклеотід є гарним вихідним продуктом для створення більш великих молекул. При обробці кислотою або ZnBr ₂ діметоксітрітіловая група віддаляється і дінуклеотід може грати роль З "-кінця зростання ланцюга. При обробці ж триетиламі переважно гідролізується ціаноетіловий ефір, в результаті чого дінуклеотід набуває реакційноздатні 3'-кінець, який може служити 5'-кінцем подовжуючої ланцюга. Зв'язування двох динуклеотид дає тетрануклео-ТІД. Аналогічно відповідним чином захищені мононуклеотид і олігонуклеотиди можуть з'єднуватися в довгі блоки. У залежності від вибору вихідного матеріалу синтез ланцюгів ДНК йде в напрямку 3'-> 5 'або 5'-> 3'.
Фосфаттріефірний метод можна спростити і процес синтезу прискорити, якщо фіксувати один з кінцевих нуклеотидів за допомогою гідроксильної групи на твердому носії. У принципі фіксована може бути будь-яка гідроксильна група, але зазвичай реакція йде краще, якщо закріплений 3'-гідроксил. Зазвичай фіксація здійснюється шляхом утворення ефірного зв'язку між 3-ОН-групою і карбоксильною групою на носії, наприклад на пористому скляному кульці. У цьому випадку перший нуклеотид виявляється фіксованим, а 3'-ОН-група - захищеною. Далі послідовно додаються нуклеотиди або олігонуклеотиди з 5'-ОН-групами, захищеними діметоксітрітілом. Перед кожним наступним етапом приєднання діметоксітрітіл видаляється, у результаті чого утворюється вільна 5'-ОН-група, за якою може відбуватися подальше нарощування ланцюга. Після закінчення синтезу полідезоксінуклеотід від'єднують від носія за допомогою лужного гідролізу. При такій процедурі синтезу не потрібно проводити додаткове очищення після кожного акту нарощування ланцюга, як при інших способах. Метод з використанням фіксації на носієві був автоматизований, при цьому синтез полімеру довжиною 10-20 нуклеотид займав кілька діб.
Фосфіттріефірний метод. Основним вихідним продуктом в цьому випадку теж є дезоксінуклеозіди з захищеними аміногрупами і 5-діметоксітрітіло-вої группой.3 '-гідроксильна група кінцевого нуклеозиду захищена шляхом фіксації її на твердому носії за допомогою ефірного зв'язку. Попередником наступного залишку є захищений дезоксінуклеозід-З "-фосфорамідіт, який активується за допомогою тетразолу. Швидкість процесу та його ефективність залежать від фосфорамідітов, стабільних і ефективно зв'язуються, легко синтезованих агентів. Проміжним продуктом реакції зв'язування є фосфен. Він окислюється до фосфату за допомогою йоду. Як і в попередньому випадку, тріефір захищає нову міжнуклеотидних зв'язок від гідролізу під час наступних етапів синтезу. По завершенні синтезу ланцюга видаляють різні захищають групи і звільняють полідезоксінуклеотід від твердого носія за допомогою лужного гідролізу. Фосфітний метод з твердими носіями, отриманими на основі силікагелів, застосовують при автоматизованому послідовному синтезі олігодезоксірі-бонуклеотідов. Приєднання кожного нуклеотидного залишку займає менше 15 хв, при цьому можуть синтезуватися ланцюга довжиною до 50 залишків з хорошим виходом.

Отримати великі колекції клонованих колоній або бляшок на нітроцелюлозних фільтрах не складає труднощів. Бактерії і дріжджі добре ростуть на самому нітроцелюлози фільтрі, вміщеному на відповідний поживний агар. Фільтр, що містить колонії, обробляють так, щоб відбулися лізис клітин і денатурація ДНК, відпалюють денатуровану ДНК із зондом, ідентифікують бляшки, ДНК яких гібрідізовалась, і відбирають клітини з відповідної ділянки агару. Фагових бляшки переносять на нітроцелюлозні фільтр, наклавши його на поживний агар. За один раз на фільтр може бути перенесено до 10000 бляшок з однієї чашки діаметром 10 см. Якщо обережно зняти фільтр, то ДНК з кожної бляшки залишиться фіксованою на ньому. Після відпалу та ідентифікації потрібних бляшок можна відібрати фаговой частки з бляшок, що залишилися на чашці з агаром.
Аналогічним чином можна виявити упаковані рекомбінантні молекули вірусу SV40. Поживний агар, що покриває інфікований моношар клітин мавпи, видаляють, весь моношар переносять на нітроцелюлозні фільтр і ідентифікують потрібні бляшки шляхом відпалу з відповідним радіоактивно міченим зондом. Віріони, що містять рекомбінантні ДНК, відбирають з агарового шару.
В якості зондів можна використовувати високо очищені мРНК і денатуровані гомологічні ДНК або кДНК. Особливо зручні одноланцюгові зонди, оскільки їх не потрібно денатурувати і тестовані клоновані ДНК не конкурують з іншими гибрідизуючою ланцюгами ДНК під час відпалу. мРНК-зонди вже є одноланцюжковий, а одноланцюгові кДНК-зонди легко отримати, скопіювавши тільки один ланцюг. Одноланцюгові РНК-зонди можна також приготувати з рекомбінантної плазміди, що містить послідовність зонда, вбудовану в спеціальний вектор, наприклад pGEM. Цей вектор містить два різних високоспецифічних бактеріальних промотора, фланкують вставку рекомбінантних молекулах. Використовуючи очищену відповідним чином лінеаризовану плазміду в якості матриці in vitro і ту чи іншу з РНК-полімераз прокаріот, синтезують РНК, яка представляє собою копію однієї з двох ланцюгів вставки.
Якщо відома амінокислотна послідовність поліпептиду, кодованого даним геном, то можна відновити нуклеотидну послідовність цього гена і потім синтезувати його хімічними методами. Навіть у тих випадках, коли як зонд використовується ділянка ДНК довжиною всього 15 нуклеотидів, можна отримати відносно достовірний результат. Через вирожденність генетичного коду неможливо точно відновити унікальну послідовність кодує ділянки. Щоб вирішити цю проблему, синтезують суміш олігонуклеотидів, що розрізняються одним або кількома нуклеотидами. Це не так важко, як здається. Замість того щоб використовувати один захищений мононуклеотид на певному етапі хімічного синтезу, використовують суміш захищених мононуклеотидів.
Тестування на синтез специфічного поліпептиду in vitro. Іноді не вдається провести прямий скринінг клонів тому, що просто немає у достатній мірі очищений відповідний зонд. У такому випадку можна використовувати непрямі методи, хоча зазвичай вони незручні при масовому скринінгу клонованих популяцій. Більшість зазвичай застосовуються непрямих методів засновані на двох принципах. По-перше, можна транслювати відповідну мРНК in vitro та отримати ідентифікований поліпептид. По-друге, можна використовувати той факт, що трансляція пригнічується, якщо одноланцюжкова мРНК ренатурірует з комплементарною клонованої ДНК. РНК, що входить до дуплекс РНК-ДНК, не здатна функціонувати як мРНК.
Якщо проинкубировать суміш мРНК in vitro в присутності необхідних компонентів, то на них синтезуються відповідні поліпептиди. Суміш цих поліпептидів можна розділити за розмірами з допомогою електрофорезу. Ефективна трансляція in vitro здійснюється тільки з одноланцюгових мРНК. Якщо ж до початку трансляції якась мРНК ренатуріровала з комплементарною ДНК і утворився гібридний дуплекс ДНК-РНК, то інформація з цієї мРНК не буде зчитуватися. За допомогою процедури, що отримала назву HART, клоновані рекомбінантні ДНК очищають, денатурують і отжигают з препаратами мРНК до початку трансляції in vitro. Молекули ДНК, гомологічні певного гену, гибрідизуючою з мРНК, і серед продуктів трансляції не є відповідний поліпептид.
Другий метод ідентифікації рекомбінантних молекул за допомогою трансляції in vitro отримав назву гібридізаційного селекції. З популяції рекомбінантів виділяють і очищають рекомбінантні ДНК. Отримані препарати ДНК піддають денатурації і кожен з них фіксують на твердій основі, наприклад на нітроцелюлози фільтрі. Кожен з препаратів інкубують з сумішшю мРНК. Гібридизація і зв'язування РНК на фільтрі відбуваються тільки в тих випадках, коли РНК виявляється комплементарної иммобилизованной клонованої ДНК. Всі інші РНК видаляються з фільтру при промиванні. Пов'язану РНК відокремлюють від ДНК і тестують на синтез специфічного поліпептиду в системі трансляції in vitro. Це дозволяє ідентифікувати відповідний рекомбінантів.
Для полегшення ідентифікації поліпептидів, що утворюються при трансляції суміші мРНК in vitro, використовують різні методи. Якщо препарат мРНК збагатити специфічної мРНК, то поліпептид, що кодується такій мРНК, іноді вдається ідентифікувати серед продуктів трансляції за його розміром і кількістю. Коли використовується складна суміш мРНК і поліпептидів, що цікавить нас поліпептид можна ідентифікувати за його здатності взаємодіяти зі специфічними антитілами. У таких випадках застосовують метод білкового блотів, аналогічний блотів ДНК. При іншому підході потрібний поліпептид осаджують у присутності специфічних антитіл із суміші продуктів трансляції in vitro, осад розчиняють і піддають електрофорез. У принципі в гелі повинні бути присутніми тільки два білки - цікавий для нас поліпептид і імуноглобулін.
в. Визначення експресії гена в клітинах
Експресуються ген, що входить до складу рекомбінантної ДНК, при певних умовах надає клітині-хазяїну специфічні фенотипічні властивості. Метод відбору, заснований на виявленні цього фенотипу, дозволяє ідентифікувати та виділяти відповідний клон точно так само, як стандартні селективні маркери у векторних молекулах дозволяють відбирати трансформовані клітини. До стандартних селективним маркерним системам, відносяться клітини Є. coli, що втратили в-лактамазу, які використовуються для відбору трансформантів, що містять вектори з геном amp, а також клітини ссавців, що мають фенотип ТК ^-, які дозволяють відібрати трансформанта, що містять вектори з геном тимідинкінази. За допомогою фенотипического відбору можна відбирати специфічні клони безпосередньо з популяцій бактерій, дріжджових або тварин клітин, трансформованих сумішшю рекомбінантних векторів, що містять різні гени бактерій, дріжджів або тварин відповідно. Можливість проведення такого відбору залежить від наявності хазяйських клітин з певним фенотипом, найчастіше клітин, дефектних щодо продукту гена, який повинен бути клонований. Якщо відсутні потрібні хазяйські клітини, то замість фенотипического відбору можна використовувати імунологічний скринінг. У таких випадках клони відбирають за допомогою антитіл, специфічних у відношенні продукту даного гена.
Фенотипический відбір. Фенотипический відбір з популяції трансформованих клітин - це найпряміший шлях виділення потрібного клону. На практиці цей метод, взагалі кажучи, обмежується клонуванням прокаріотичних генів і деяких генів дріжджів та інших грибів у клітинах прокаріот та еукаріотичних генів в клітинах еукаріотів. Щоб клонувати ген А, суміш фрагментів ДНК вбудовували в векторні молекули і трансфіціровалі ними клітини, мутантні по гену А. Клітини вирощували в умовах, що вимагають присутності продукту гена А, так що колонії могли утворювати лише ті клітини, в яких синтезується продукт гена А, присутнього у векторі. Найбільш відповідними для проведення такого відбору є клітини-господарі, в яких делетірован або весь ген А, або його частину. В іншому випадку доводиться виявляти і розмежовувати ревертанти і трансформантів. Крім того, делеційного мутанти виключають ймовірність прояви фенотипу А + в результаті супресії фенотипу А ^- якимись іншими генами.
Експресія еукаріотичних генів в бактеріальних системах господар-вектор. Ні фенотипический відбір, ні імунологічний скринінг зазвичай незастосовні при виділенні клітин Є. coli, що містять певний рекомбінантний еукаріотичний ген. Виняток становлять деякі гени дріжджів та інших грибів, здатні експресуватися в клітинах Е. coli. Однак більшість генів еукаріот не можуть належним чином експрес-рова в клітинах Е. coli, оскільки вони втратили функціональні промотори і містять некодуючі ділянки у складі кодують послідовностей. Інша справа, якщо рекомбінантів містять кДНК-копії еукаріотичних мРНК, оскільки некодуючі ділянки вищепляются під час дозрівання мРНК в еукаріотичних клітинах. Клітини Є. coli не здатні здійснювати такий сплайсинг. У результаті кДНК транслюються в правильні поліпептиди в Є. coli. Для того щоб клітини Є. coli змогли забезпечити транскрипцію і трансляцію клонованої еукаріотичної кДНК, у відповідні сайти вектора зазвичай включають Є. сой'-промотор і сигнали трансляції. Подібним же чином, для того щоб кДНК еукаріот могла експресуватися в еукаріотичних клітинах, вектор необхідно забезпечити відповідними сигналами регуляції транскрипції. Оскільки в нормі геномні регуляторні сигнали зазвичай знаходяться поза транскрипційного частини гена, в 5 '- або З "-фланкуюче ділянці, вони відсутні в мРНК або кДНК.
Інші методи фенотипического скринінгу в еукаріотичних клітинах. Фенотипический скринінг рідко застосовується при роботі з диплоїдними еукаріотичних клітинах, оскільки для цього необхідна лінія клітин, у яких пошкоджені обидва алелі даного нас гена. Ідентифікувати трансформовані клітини можна за допомогою котрансформаціі, застосовуючи селективний маркер і відповідні мутантні клітини або домінантний маркер і клітини, інгібіруемие антибіотиком. Однак при цьому неможливо розрізнити потрібний котрансформант і супутні контрансформірованние колонії, що містять різні рекомбінантні молекули ДНК. Тому зазвичай скринінг грунтується на використанні специфічних властивостей, які проявляються за потрібне клоном. Як приклад можна навести морфологічні зміни, які спостерігаються при перетворенні нормальних клітин у пухлинні, що описаний в розділах, присвячених векторах на основі папіломавірусів великої рогатої худоби і ретровірусів. Клітини, трансформовані до онкогенного фенотипом, утворюють характерну колонію, або фокус, на відміну від звичайних клітин, що утворюють моношар. Цей метод використовували, наприклад, при відборі рекомбінантів, що містять клітинні онкогени з геномної ДНК тварин.
Інший метод скринінгу застосовують при клонуванні клітин тварин, в яких експресується рекомбінантний ген, що кодує секретується поліпептид. При цьому використовують клітини господаря, в нормі не утворюють поліпептид, і тестують середу, в якій знаходяться трансформовані клітини, на присутність в ній даного поліпептиду. Якщо продуктом є гормон, то його присутність у середовищі можна виявити за допомогою будь-якого зручного високочутливого біологічного методу. Таким же способом були клоновані гени, що кодують фактори росту, які стимулюють проліферацію специфічних клітин-мішеней. Якщо активність поліпептиду як такого важко виміряти, то використовують специфічні до нього антитіла. Цей метод непридатний для одночасного скринінгу на велику популяцію клонованих клітин, що містять різні рекомбінантні молекули, оскільки для цього довелося б проводити занадто багато окремих тестів. Замість цього суміш трансформованих клітин поділяють на зручне число окремих груп і тестують ці групи. Групу, що дає позитивну відповідь, знову поділяють на підгрупи, знову виділяють позитивну підгрупу, поділяють її, тестують і так далі до тих пір, поки не буде ідентифікований один позитивний клон.
Імунологічний скринінг. Для скринінгу рекомбінантної популяції у відношенні експресії даного гена використовують більш загальний метод, в основі якого лежить імунологічний підхід. Білок, що синтезується в цьому випадку не повинен бути функціонально активним; необхідні лише специфічні антитіла до нього і клітини господаря, не синтезують цей антиген. Антитіла взаємодіють з білковими молекулами одного клону. Їх виявляють по акумуляції радіоактивності, джерелом якої служать або мічені антитіла, які специфічні мічені реагенти, узнающие імуноглобуліни.
Було розроблено кілька модифікацій техніки скринінгу за участю антитіл стосовно Є. сой-системам господар-вектор. Всі вони подібні між собою, хоча застосовуються прийоми залежать, наприклад, від того, якого роду клони - бактеріальні або фагових-будуть тестуватися. В одній з модифікацій цього методу антитіла рівномірно розподіляють по поверхні твердого носія, наприклад пластикового або паперового диска, і потім притискають його до агаровому шару, який містить спеціалізовані колонії або фагових бляшки. Якщо специфічний антиген синтезується яких-небудь клоном, він буде зв'язуватися з антитілом на диску. Антиген можна локалізувати, обробивши знятий з агару диск іншими радіоактивно міченими антитілами, промивши диск і отримавши радіоавтограф. Ця процедура залежить від здатності двох антитіл зв'язуватися з різними антигенними детермінантами на одному і тому ж поліпептиди. Як і при скринінгу шляхом відпалу з ДНК - або РНК-зондами, позитивний клон дає чітке темна пляма на рентгенівській плівці.
Якщо нас цікавить ген кодує поліпептид, розташований на поверхні тваринної клітини, то за допомогою високоспецифічних методів можна провести імунологічний скринінг та відбір трансформованих клітин. Поверхневі білки можуть взаємодіяти зі специфічними антитілами, а якщо ці антитіла зв'язуються з будь-якою флуоресцентною міткою, то клітини, що синтезують цей білок, будуть відрізнятися від інших трансформантів за своїми флуоресцентним властивостями. Життєздатні флуоресціюючі клітини виявляють серед величезного числа нефлуоресцірующіх клітин за допомогою спеціального приладу. Далі життєздатні клітини розмножують і отримують популяцію клонованих клітин. Деякі поверхневі білки є рецепторами, з якими зв'язуються специфічні ліганди. Якщо досліджуваний ген кодує такий рецептор, то, використовуючи флуоресціюючий ліганд, можна відокремити трансформовані клітини за допомогою приладу FACS.

Бібліотеки

Можливість проведення шотган-експериментів розглядалася ще тоді, коли технологія рекомбінантних ДНК робила свої перші кроки. Ідея ампліфікації дуже складних сумішей фрагментів ДНК і подальшого виявлення одного з них здавалася фантастичною, а зараз вона видається майже банальною. Основний принцип цього підходу полягає у створенні колекції рекомбінантних молекул, що складають повний геном даного організму. По суті, повний нефракціонований набір фрагментів ДНК перетворюють на відповідний набір стабільних рекомбінантів, який можна зберігати і багаторазово використовувати для клонування різних вставок. При цьому застосовуються Є. сой-системи господар-вектор, де в якості вектора використовуються плазміди або бактеріофаги, оскільки вони більш придатні для отримання великої кількості рекомбінантних молекул і зручні для зберігання.
Найбільш важливі два типи бібліотек. Одна з них, створювана з сумарною геномної ДНК, в принципі повинна містити всі гени даного організму. Однак така мета зазвичай виявляється недосяжною, оскільки деякі послідовності ДНК не вдається клонувати. Один з варіантів геномної бібліотеки являє собою всю ДНК якоїсь однієї хромосоми. Для створення такої бібліотеки необхідно виділити ДНК з окремих хромосом. Хромосоми людини фракционируют за допомогою методів, аналогічних використовуваним при сортуванні флуоресціюючих і нефлуоресцірующіх клітин. Метод заснований на різній ефективності зв'язування флуоресціюючих барвників з хромосомами, яка залежить від розміру хромосом і GC-вмісту ДНК. Розчин забарвлених хромосом пропускають з високою швидкістю через вузький отвір, на яке сфокусований пучок світла, що випускається лазером. Хромосоми по черзі перетинають цей пучок, який індукує їх специфічну флуоресценцію. Детектор визначає інтенсивність флуоресценції і змінює напрямок руху тих хромосом, інтенсивність флуоресценції яких перевищує задану величину, таким чином, що вони потрапляють у спеціальний колектор. Змінюючи цей наперед встановлений рівень інтенсивності флуоресценції, можна відбирати різні хромосоми.
Окремі хромосоми дріжджів і деяких найпростіших неможливо ідентифікувати цитогенетичними методами, проте ДНК з них все ж вдається виділити. Для виділення застосовують м'які методи, щоб уникнути розриву молекул. Потім ДНК піддають електрофорез в агарозному гелі в умовах, що дозволяють розділити молекули довжиною до 2000 т.п. н. Традиційні методи електрофорезу не дозволяють розділяти дуплексні молекули, розмір яких значно перевищує 20 тощо н. Швидкість міграції настільки великих молекул вже не залежить від їх розміру. Однак якщо замість постійного односпрямованого електричного поля, прикладеного до звичайного гелю, використовувати поле, орієнтація якого багаторазово змінюється, то навіть дуже великі молекули можна буде розділити за розмірами. Мабуть, цей феномен пояснюється механізмом проходження молекул ДНК через пори агарозного гелю. Передбачається, що молекули витягуються в напрямку поля, а потім при зміні цього напряму переорієнтуються. Час переорієнтації залежить від довжини ланцюга і кута між напрямками поля; вони і визначають кінцеве відстань, на яке переміщається молекула. У найпростішому варіанті імпульсного електрофорезу електричний струм подається імпульсами, при цьому напрямку поля приблизно перпендикулярні один одному, а саме поле неоднорідне. При більш складних розподілах використовують однорідні поля і оптимізують кут між двома напрямками, з тим щоб підвищити дозвіл. Імпульс зазвичай триває приблизно хвилину.
Бібліотеки другого типу включають послідовності, складові всю мРНК, що виявляється в певних клітинах. У цьому випадку популяцію мРНК перетворюють на популяцію молекул кДНК, які потім клонують. Геномні бібліотеки являють собою зібрання генів і послідовностей ДНК; в бібліотеках кДНК представлені продукти експресії цих генів у формі мРНК.
а. Геномні бібліотеки
Геномні бібліотеки зазвичай створюють за допомогою векторів, сконструйованих на основі бактеріофага X або косміди. Ці вектори містять великі вставки, завдяки чому мінімізується кількість рекомбінантів, наобходімих для складання бібліотеки. Наприклад, якщо створюється Х-бібліотека геному ссавця, що містить 3 * 10 ⁹ п. н. при середній довжині вставки 17 тощо н., то весь геном буде представлений 3 * 10 ⁹ / 1,7 * 10 ⁴ = 1,8 * 10 ⁵ рекомбінантів. Насправді для створення бібліотеки, вірогідність виявлення у якій певного сегмента геному перевищує 99%, потрібно отримати ~ 10 ⁶ окремих рекомбінантних молекул, оскільки лігування окремих фрагментів відбувається випадково. Так, деякі фрагменти можуть бути включені більш ніж в одну векторну молекулу, а інші можуть взагалі не брати участь у лигирование та упаковці. Повна космідная бібліотека містить менше рекомбінантних молекул, оскільки розмір вставок може досягати 45 тощо н.
Фрагменти сумарною геномної ДНК для конструювання бібліотек можна отримувати декількома способами. Найбільш зручний з них полягає в частковому розщепленні ДНК рестріктірующей ендонуклеаз, сайт впізнавання якої містить шість підстав, а які утворюються липкі кінці відповідають липким кінців обраного вектора. У цьому випадку розрізання здійснюють лише в обмеженому числі можливих сайтів. Оскільки вибір таких сайтів проводиться випадково і у використовуваному препараті геномної ДНК міститься багато копій будь-якого геномного сегмента, практично кожен сегмент ДНК повинен бути представлений у фрагментах ДНК, придатних за своїм розміром для клонування. При такому підході, однак, може вийти неповна бібліотека. Ті частини геному, в яких сайти впізнавання рестріктірующіх ендонуклеаз знаходяться дуже далеко один від одного, не зможуть включитися в життєву рекомбінантний фаг. З іншого боку, ті області геному, в яких сайти впізнавання тісно згруповані, будуть розділені на дуже короткі фрагменти, і не всі з них будуть представлені в бібліотеці.
Взагалі кажучи, більш репрезентативну бібліотеку можна отримати при частковій фрагментації геномної ДНК, здійснюваної більш випадково, ніж за допомогою ферменту з сайтом впізнавання з шести пар основ. Для цього можна використовувати гідродинамічні методи деградації ДНК або дуже обмежену обробку ендонуклеаза з сайтами впізнавання з чотирьох пар основ, наприклад Alu I і НАЕ III.
б. Бібліотеки кДНК
Для створення бібліотек кДНК зазвичай використовують плазмідні або фагових вектори, сконструйовані на основі бактеріофага X. Принципи конструювання не відрізняються від описаних, за винятком того, що в цих випадках частіше використовують суміш різних мРНК, а не очищену мРНК. Отримані за допомогою спеціально сконструйованих векторів чи певним чином відібрані бібліотеки кДНК можуть використовуватися для клонування послідовностей мРНК навіть у тих випадках, коли амінокислотна послідовність білка і кодує нуклеотидна послідовність невідомі і навіть відсутня гомологічний зонд. Відповідні приклади ми розглянемо нижче.
Бібліотека експресують кДНК. Очищену кДНК або суміш різних кДНК можна лігувати з векторами, спеціально сконструйованими для здійснення транскрипції і трансляції кодує області кДНК. Потрібний клон ідентифікують за допомогою імунологічного скринінгу з застосуванням антитіл, специфічних до поліпептиди, гіпнотізіруемому даної кДНК. Ця вельми зручна методика дозволяє здійснити клонування навіть тоді, коли нічого не відомо про структуру потрібного нам гена або білка.
Одним з векторів, широко застосовуються для вивчення експресії, є похідне фага X, що отримало назву Xgtll. Коли кДНК, що містять EсоRI-Лінкер, включаються у вектор Xgtll в його єдиному сайті для ендонуклеази EcoRI, вставки опиняються в області, що кодує бактеріальний ген в-галактозидази. Приблизно одна з шести кДНК-вставок включається у відповідній для транскрипції орієнтації і в фазі з рамкою зчитування в-галактозидази. При індукції в-галактозидазної гена за допомогою по-галактозид в lac-промоторі починається транскрипція, яка поширюється на еукаріотичний сегмент. У результаті трансляції відповідної РНК утворюється гібридний білок, у якого на N-кінці знаходиться в-галактозидазної поліпептид, а на С-кінці-еукаріотичний. Бібліотека кДНК, створена за допомогою A. gt11, утворює популяцію бляшок, окремі члени якої містять ці гібридні білки. Бляшку, містить цікавий для нас білок, ідентифікують за її здатністю пов'язувати відповідне антитіло. На одній чашці можна виявити одну позитивну бляшку серед 10 ⁴ та без труднощів провести скринінг ¹⁰ червень бляшок.
Бібліотеки селективних кДНК. Розвиток і диференціювання складних багатоклітинних організмів з однієї заплідненої яйцеклітини здійснюються за допомогою високоорганізованої системи диференційованої експресії генів. Одні гени експресуються тільки в одному або суворо обмеженому числі типів клітин, інші - в якийсь певний період часу. У результаті популяції цитоплазматичних мРНК в різних тканинах і клітинах виявляються представленими різними молекулами. Така диференційована експресія генів може використовуватися для клонування кДНК, відповідних регульованим генам, навіть у тих випадках, коли про продукти цих генів нічого не відомо.
Наприклад, при вивченні процесів раннього розвитку Xenopus важливо знати, які гени експресуються при перших клітинних поділках. Для цього потрібно ідентифікувати ті мРНК, які присутні в гаструли, але не в яйцеклітинах. Це можна зробити, створивши геномну бібліотеку і провівши роздільний скринінг з використанням препаратів РНК з яйцеклітин і гаструли. Потім можна ідентифікувати і клонувати фагових бляшки, які дають позитивну відповідь при відпалі тільки з РНК гаструли. Однак даний метод має той недолік, що багато з 10 ⁵ або більше мРНК у двох зазначених вище препаратах є однаковими і доводиться проводити скринінг величезного числа бляшок, щоб виявити ті деякі, які виявляють специфічність. Більш ефективним є створення бібліотеки кДНК на основі гаструлярной РНК.
Клонування кДНК, що кодує малу субодиницю рибулезо-1 ,5-бісфосфаткарбоксілази з листя гороха.ruBPCase, - мабуть, один з найпоширеніших на землі білків, - складається з восьми ідентичних великих і восьми ідентичних малих субодиниць. Ген великої субодиниці знаходиться в хлоропластної ДНК, а ген малого поліпептиду - у ядерній хромосомної ДНК. Експресія генів залежить від освітленості, про що свідчать дані, представлені в лівій верхній частині малюнка. Рослини гороху витримували 9 діб. в темряві і потім деякі з них виставляли на світ на 48 год Полісомную poly-РНК, виділену з рослин обох типів, транслювали in vitro.20 кДа - попередник малої субодиниці RuBPCase синтезувався тільки в тих рослинах, які перебували на світлі. РНК з листя рослин, які зазнали висвітлення, використовували для синтезу дволанцюжкової кДНК, до якої були приєднані Hind III-Лінкер. ДНК лігувати з розрізаною в Hind Ill-сайті плазмидой pBR322 і отриманими рекомбінантними плазмідами трансформували штам НВ101 Є. coli. Трансформовані бактеріальні колонії, стійкі до ампіциліну, вирощували на нітроцелюлозних фільтрах, поміщених на поверхню поживного агару в чашках. Після фіксації ДНК на фільтрах клони, що містять кДНК RuBPCase, ідентифікували за їх здатності гібрідізоваться з радіоактивно міченої poly-РНК з піддавалися освітленню листя і по відсутності гібридизації з РНК з листя рослин, вирощених у темряві. Помилкові позитивні клони елімінувати, проводячи гібридизацію початково позитивних клонів з радіоактивно міченої РНК, збагаченої по мРНК RuBPCase. Збагачення проводили фракціонуванням РНК за розмірами з допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі. Шукана мРНК представляла собою молекулу довжиною 900 п. н., Присутню в зазнали висвітлення листі, при трансляції якої in vitro утворювалася мала субодиниця RuBPCase. Нарешті, гібридні клони були ідентифіковані також при гібридізаційного селекції. раю була попередньо збагачена послідовностями мРНК, специфічними для стадії гаструли. Таке збагачення можна отримати наступним чином. За допомогою зворотної транскриптази на мРНК з гаструли синтезують одноланцюжкову кДНК. Потім всі кДНК, гомологічні мРНК, присутнім як в яйцеклітинах, так і в гаструли, видаляють шляхом утворення гібридів кДНК'мРНК між кДНК гаструли і мРНК яйцеклітин; ці гібриди адсорбуються на гідроксиапатит, а в розчині залишаються тільки одноланцюгові кДНК, специфічні для гаструли. З цих кДНК отримують звичайним способом дуплексні молекули кДНК і створюють бібліотеку кДНК. Така бібліотека зазвичай буває сильно збагачена молекулами кДНК, відповідними гаструлоспеціфічной мРНК. Аналогічний підхід можна використовувати у разі мРНК, виділеної з будь-яких двох споріднених тканин або клітин. Варіації на цю тему включають використання в якості зондів молекул кДНК, збагачених описаним вище методом. У цьому випадку водили котрансфекцію за участю ДНК з цих клітин, відбір у середовищі HAT, сортування і клонування. ДНК з отриманих вторинних трансформантів, що містить менше 50 тощо н. ДНК людини на мишачий геном, використовували для створення геномної бібліотеки. Було відібрано шість фагових клонів, які гібрідізовалісь із зондом, що містить повторювані послідовності ДНК людини, розкидані по всьому геному. Всі шість клонів містили перекриваються сегменти ДНК. Дві вставки з шести вбудовували в фагових вектори для відтворення унікального сегмента ДНК розміром 31 тощо н., відповідального за синтез поверхневого рецептора трансферину людини, після трансфекції у мишачі клітини.
Бібліотеку кДНК піддають скринінгу, виявляючи ті клони, які гибрідизуючою з збагаченим мРНК - зондом.

Деякі стратегії клонування генів і кДНК

Ми розглянули безліч різних методів, використовуваних при конструюванні, клонування і відборі специфічних рекомбінантних генів. На основі цих методів можна розробити безліч стратегій для отримання певних клонованих генів або кДНК. При виборі ефективної і дієвої стратегії важливо враховувати природу гена і його продукту, а також походження виду. Щоб уявити собі все різноманіття методів роботи з рекомбінантними молекулами ДНК, краще за все розглянути конкретні приклади клонування різних генів і кДНК.