Зміст
Тези
Вступ
1. З історії досліджень з клонування тварин
2. Клонування тварин
3. Методи клонування тварин
3.1. Методи трансплантації ядер
3.2. метод
SLIC (sequence and ligation-independent cloning) метод клонування3.3. Метод генетичного перепрограмування клітин шкіри
4. Етичні проблеми клонування тварин
5. Застосування клонів тварин
6. Ефективність клонування тварин
Висновки
Список використаної літератури
Тези
Клонування, в біології - це метод одержання декількох ідентичних організмів шляхом безстатевого (у тому числі вегетативного) розмноження.
Термін "клонування" прийшов в російську мову з англійської. Лише трохи змінивши своє звучання і написання, він є аналогом англійського clone, cloning. У самому ж англійській мові це слово почало вживатися (як біологічний термін) менше 100 років тому. Проте за цей невеликий для життя слова термін воно вже встигло кілька разів поміняти своє значення.
Створювати тварин і рослини з заданими якостями завжди було чимось надзвичайно привабливим так як це означало створити організми унікальні і найпотрібніші, стійкі до хвороб, кліматичним умовам, що дають достатній приплід, необхідну кількість м'яса, молока, плодів, овочів і інших продуктів. Використання таких технологій клонування передбачає унікальну можливість отримувати фенотипічно і генетично ідентичні організми, які можуть бути використані для вирішення різних теоретичних і прикладних завдань, що стоять перед біомедицини та сільським господарством. Зокрема, використання клонування могло б сприяти вивченню проблеми тотипотентності диференційованого клітин, розвитку та старіння організмів, злоякісного переродження клітин. Завдяки технологіям клонування передбачається поява прискореної генетичної селекції та тиражування тварин з винятковими виробничими показниками. У поєднанні з трансгенозу клонування тварин відкриває додаткові можливості для виробництва цінних біологічно активних білків для лікування різних захворювань тварин і людини. Клонування тварин можливо дозволить проводити випробування медичних препаратів на ідентичних організмах.
Усі клітини організму тварин несуть однакову генетичну інформацію. Однак у процесі морфогенезу соматичні клітини диференціюються, в результаті чого частина генома репресуються. Чим вище рівень спеціалізації клітин, тим менше їх тотипотентність. Ця закономірність була встановлена в експериментах з пересадки ядер.
Вступ
"Клонування" - отримання нащадків, що є точною генетичною копією організму. Сукупність таких нащадків-копій, що походять від одного організму, називають клоном. Організми в межах кожного клону характеризуються однаковою фенотипической однорідністю та ідентичним генотипом.
Термін "клон" був вперше використаний в 1903 році Веббером (Webber, Німеччина) стосовно до рослин, розмножується вегетативно, і означав, що дочірні рослини клону генетично ідентичні материнському. В даний час розробки в області генної інженерії дозволяють клонувати не тільки мікроорганізми і рослини, а й тварин. Вперше трансплантацію ядер соматичних клітин зародків у енуклеірованние клітини жаби здійснили американські дослідники Р. Бріггс і Т. Кінг у 1952 році. Вчені, користуючись мікропіпеткою, видаляли ядра з яйцеклітин шпорцевой жаби, а замість них пересаджували ядра клітин ембріонів, що знаходяться на різних стадіях розвитку. Проведені дослідження показали, що ядра ранніх ембріонів у стадії пізньої бластули і навіть ранньої гаструли володіють тотіпотентность і забезпечують нормальний розвиток ембріонів. Якщо брати ядра з клітин зародка на ранній стадії його розвитку - бластули, то приблизно в 80% випадків зародок благополучно розвивається далі і перетворюється на нормального пуголовка. Якщо ж розвиток зародка, донора ядра, просунулося на наступну стадію - гаструли, то лише менш ніж у 20% випадків оперовані яйцеклітини розвивалися нормально. При пересадці ядер з більш диференційованих клітин (мезодерми і середньої кишки) пізньої гаструли у ембріонів спостерігалося недорозвинення і навіть відсутність нервової системи. Після пересадки ядра з клітин більш пізнього розвитку яйцеклітини взагалі не розвивалися.
З історії досліджень з клонування тварин
Можливість клонування тварин довів Дж. Гердон, англійський біолог, який першим зумів отримати клоновані ембріони шпорцевих жаб. Він випалював ультрафіолетом ядра ікринок і потім підсаджував в них ядра, виділені з клітин епітелію пуголовків цього виду. Більша частина отриманих таким чином ікринок гинула, і лише зовсім маленька їх частка (2,5%) розвивалася в пуголовків. Дорослих жаб отримати таким чином не вдавалося. Тим не менше це був успіх, і результати дослідів Гердона розповсюджені по підручники і посібники з біології. У 1976 р. Гердон і його співавтор Р. Ласки публікують роботу, в якій описують досліди з ядрами, виділеними з клітин нирок, шкіри і легкого вже дорослих шпорцевих жаб. Дослідники спочатку підрощувати ці клітини поза організмом (in vitro), а потім вводять їх ядра в без'ядерні ікринки. Чверть таких ікринок починає ділитися, але незабаром завмирає на одою з стадій розвитку. Тоді вчені виділяють ядра отриманих ембріонів і знову підсаджують їх в позбавлені власних ядер ікринки ... У результаті цілої серії подібних пересадок на світ нарешті з'являється кілька пуголовків. Хоча експерименти Гердона і його послідовників показали принципову можливість отримання серійних клонів амфібій, що з'являються на світ пуголовки вперто не бажали перетворюватися на дорослих жаб. Питання, таким чином, як і раніше полягав у тому, чи можна виростити з однієї спеціалізованої клітини його тіла доросле хребетна тварина. Досліди на амфібія давали негативний результат, але вчені не припиняли досліджень у цій області.
Більш широкі дослідження, що охоплюють не тільки амфібій, але і риб, а також дрозофіл, в 1962 р. були розпочаті англійським біологом Дж. Гордоном. Він першим у дослідах з південноафриканськими жабами Xenopus laevis) в якості донора ядер використав не зародкові клітини, а вже цілком спеціалізувалися клітини епітелію кишечнику плаваючого пуголовка.
Потім Гердон разом з Ласки (1970) стали культивувати in vitro (поза організмом у живильному середовищі) клітини нирки, легені і шкіри дорослих тварин і використовувати вже ці клітини в якості донорів ядер. Приблизно 25% первинно реконструйованих яйцеклітин розвивалися до стадії бластули. При серійних пересадках вони розвивалися до стадії плаваючого пуголовка. Таким чином було показано, що клітини трьох різних тканин дорослого хребетного (X. laevis) містять ядра, які можуть забезпечити розвиток принаймні до стадії пуголовка.
У свою чергу Ді Берардіно і Хофнер (1983) використовували для трансплантації ядра неподільних і повністю диференційованих клітин крові - еритроцитів жаби Rana pipiens. Після серійної пересадки таких ядер 10% реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючого пуголовка. Ці експерименти показали, що деякі ядра соматичних клітин здатні зберігати тотіпотентность.
Причини, по яких ядра клітин дорослих тварин і навіть пізніх ембріонів залишаються тотипотентності, поки точно не встановлені. Вирішальну роль відіграє взаємодія ядра і цитоплазми. Вміщені в цитоплазмі тварин речовини беруть участь у регулюванні експресії клітинного генів ядра [5].
Роботи М. ді Бернардіно і Н. Хоффера показали, що цитоплазма ооцитів амфібій містить фактори, що відновлюють тотіпотентность ядер диференційованих соматичних клітин. Ці фактори реактивує репресовані ділянки геному.
У 1985 р. була описана технологія клонування кісткових риб, розроблена радянськими вченими Л.А. Слєпцова, Н.В. Дабагян і К. Г. Газарян. Зародки на стадії бластули відокремлювали від жовтка. Ядра клітин зародків впорскували в цитоплазму незапліднених ікринок, які починали дробитися і розвивалися в личинки. Ці експерименти показали, що втрата ядром тотипотентності в процесі онтогенезу пов'язана не з втратою генів, а їх репресією. При культивуванні соматичних клітин in vitro частота тотипотентності ядер збільшується. Генетичний механізм стабільної репресії геному диференційованих клітин не з'ясований, способи відновлення тотипотентності не розроблені, тому в основному ведеться клонування шляхом трансплантації ядер ембріональних клітин.
Пересадки ядер у ссавців почалися пізніше, в 80-х роках. Це було пов'язано з технічними труднощами, так як зигота ссавців має невеликі розміри. Наприклад, діаметр зиготи миші приблизно 60 мкм, а діаметр заплідненої яйцеклітини жаби близько 1200 мкм, тобто в 20 разів більше [26].
Незважаючи на перераховані труднощі, перші повідомлення про отримання клонів мишей, ідентичних донору, з'явилися вже в 1981 році. В якості донора були використані ембріональні клітини однієї з ліній мишей, взяті на стадії бластоцисти. Достовірність отриманих даних спочатку була поставлені під сумнів, оскільки відтворити результати проведених експериментів в інших лабораторіях не вдавалося, проте через кілька років Дж. Мак Грат і Д. Солтер також досягли успіху. У цих експериментах клони мишей вдавалося отримати лише в тому випадку, якщо трансплантували ядра ембріонів на стадії не пізніше 2 бластомерів. Було показано, що ядра 8-клітинних зародків і клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисти не забезпечують розвиток in vitro реконструйованих яйцеклітин навіть до стадії морули, яка передує стадії бластоцисти. Невелика частина (5%) ядер 4-клітинних зародків дає можливість розвиватися тільки до стадії морули. Ці та багато інших дані показують, що в ембріогенезі у мишей клітинні ядра рано втрачають тотипотентність, що пов'язано очевидно, з дуже ранньої активацією геному зародка - вже на стадії 2-х клітин. У інших ссавців, зокрема, у кроликів, овець і великої рогатої худоби, активація першої групи генів в ембріогенезі відбувається пізніше, на 8-16-клітинної стадії. Можливо тому перші значні успіхи в клонування ембріонів були досягнуті на інших видах ссавців, а не на мишах. Тим не менш, роботи з мишами, незважаючи на їх непросту долю, значно розширили наші уявлення про методологію клонування ссавців.
На початку шляху
1883 - Відкриття яйцеклітини німецьким цитологом Оскаром Гертвіга.
1943 - Журнал Science повідомив про успішне заплідненні яйцеклітини "в пробірці".
1977 - Професор зоології Оксфордського університету Дж. Гордон клонує більше півсотні жаб.
1978 - Народження в Англії Луїзи Браун, першої дитини "з пробірки".
1985 - 4 січня в одній з клінік північного Лондона народилася дівчинка у місіс Коттон - першої в світі сурогатної матері (зачата не з яйцеклітини місіс Коттон).
1987 - Фахівці Університету імені Дж. Вашингтона, що використали спеціальний фермент, зуміли розділити клітини людського зародка і клонувати їх до стадії тридцяти двох клітин (бластів, бластомерів).
Дж. Гордон
Перші успішні досліди з клонування тварин були проведені в середині 1970-х років англійським ембріологом Дж. Гордоном (J. Gordon) в експериментах на амфібія, коли заміна ядра яйцеклітини на ядро з соматичної клітини дорослої жаби призвела до появи пуголовка. Це показало, що техніка трансплантації ядер із соматичних клітин дорослих організмів у енуклеірованние ооцити дозволяє отримувати генетичні копії організму, що став донором ядер диференційованого клітин. Результат експерименту став підставою для висновку про оборотності ембріональної диференціювання геному принаймні у земноводних [18].
2. Клонування тварин
У своєму експерименті Кемпбелл і його колеги витягли з ембріона вівці на ранній стадії розвитку (на стадії ембріонального диска) клітину і виростили культуру клітин, тобто домоглися того, що клітина розмножилася в штучному живильному середовищі. Отримані генетично ідентичні клітини (клітинна лінія) зберегли тотіпонентность. Потім вчені взяли яйцеклітину вівці-реципієнта, ретельно видалили з неї весь хромосомний матеріал і домоглися її злиття з тотипотентності кліткою з культури. Отримані синтетичні ембріони вирощували до стадії морули-бластули, а потім імплантували в матку вівці. У результаті вдалося виростити декількох нормальних ягнят, які були генетично ідентичні.
Рис. 1. Методика, за допомогою якої Кемпбелл і його колеги клонували овець. З клітин ембріонального диска отримали стійкі культури клітин. З ооцитів-реципієнтів видаляли частину цитоплазми разом з метафазної пластинкою і индуцировали злиття таких без'ядерних | |
ооцитів з кліткою з тотипотентності клітинної лінії. Отримані таким чином ембріони тимчасово містилися в вівцю-реципієнта. через тиждень перевіряли рівень їх розвитку. Нарешті, морули та бластоцисти имплантировались іншим вівцям, де і проходив весь онтогенез. | |
У принципі, після того, як отримана стійка лінія тотіпонентних клітин, ніщо не заважає вносити до них генетичні зміни. Наприклад, перебудовуючи або видаляючи окремі гени, можна створювати трансгенні лінії овець та інших сільськогосподарських тварин. Однак перш ніж ця технологія знайде практичне застосування, належить вирішити ще безліч проблем.
Поки кількість клонованих тварин дуже мало в порівнянні з числом вихідних ембріонів, з клітин яких вдавалося виростити. Багато клітин гинули, не встигнувши досягти стадії бластоцисти. Не ясно, викликаний чи високий відсоток невдач різноманітними шкідливими чинниками, які впливають на клітину при маніпуляціях з нею, або гетерогенністю самої клітинної лінії. Остання менш імовірно, оскільки відсоток успішних випадків не змінюється при пересіву культури. Для прояснення цього питання необхідно досліджувати інші тотипотентності клітинні лінії.
Результативність пересадки ядра в яйцеклітину і її подальше благополучний розвиток залежить від адекватного перепрограмування ядра донора. Макромолекули (білки і транспортна РНК) ооцита відповідають за його розвиток тільки протягом порівняно короткого часу (між двома клітинними поділами), і чим цей період коротший, тим менше залишається часу для перепрограмування. Клітини більш зрілих ембріонів вимагають більшого часу для перепрограмування, тому ймовірність успіху при їх використанні знижується. Певну роль відіграє також сумісність ядра донора і реципієнта цитоплазми, все ще слабо вивчена.
Успіх пересадки клітинних ядер пов'язаний принаймні з двома факторами. По-перше, овуліровавшіе ооцити є кращими реципієнтами, ніж зиготи, або тому, що у незапліднених яйцеклітин залишається більше часу для перепрограмування, або тому, що їх цитоплазма є більш підходящою. Можливо, в цитоплазмі ооцитів є елементи, необхідні для перебудови хромосом і активації геному і зникають після запліднення або тому, що вони якимось чином пов'язані з реплікується ДНК, або в результаті запрограмованого розпаду. По-друге, клітини з ядрами донора, взятими на стадіях G 1 або G 0 клітинного циклу, розвиваються набагато краще, ніж клітини з ядрами з стадій S або G 2. Інтуїтивно це здається зрозумілим, адже перепрограмувати відкритий реплицируются геном простіше.
Клонування тварин можливе за допомогою експериментальних маніпуляцій з яйцеклітинами (ооцитами) і ядрами соматичних клітин тварин in vitro та in vivo подібно до того, як в природі з'являються однояйцеві близнюки. Клонування тварин досягається в результаті перенесення ядра з диференційованої клітини в незапліднену яйцеклітину, у якої видалене власне ядро (енуклеірованних яйцеклітина) з подальшою пересадкою реконструйованої яйцеклітини в яйцепровід названої матері. Однак довгий час всі спроби застосувати описаний вище метод для клонування ссавців були безуспішними. Значний внесок у вирішення цієї проблеми був зроблений шотландської групою дослідників з Рослінського інституту та компанії "PPL Therapeuticus" (Шотландія) під керівництвом Яна Вільмута (Wilmut). У 1996 році з'явилися їх публікації по успішному народженню ягнят у результаті трансплантації ядер, отриманих з фібробластів плоду вівці, в енуклеірованние ооцити. [2] В остаточному вигляді проблема клонування тварин була вирішена групою Вільмута в 1997, коли народилася вівця на прізвисько Доллі - перше ссавець, отримане з ядра соматичної клітини дорослої: власне ядро ооцита було замінено на ядро клітини з культури епітеліальних клітин молочної залози дорослої лактуючої вівці . [3] Надалі були проведені успішні експерименти з клонування різних ссавців з використанням ядер, взятих з дорослих соматичних клітин тварин (миша, коза, свиня, корова), а також взятих у мертвих, заморожених [4] на кілька років, тварин. Поява технології клонування тварин викликало не тільки великий науковий інтерес, але і привернуло увагу великого бізнесу в багатьох країнах. Подібні роботи ведуться і в Росії, але цілеспрямованої програми досліджень не існує. У цілому технологія клонування тварин ще знаходиться в стадія розвитку. У великої кількості отриманих таким чином організмів спостерігаються різні патології, що призводять до внутрішньоутробної загибелі або загибелі відразу після народження.
У квітні 2008 року Південнокорейські митники приступили до дресирування семи щенят, клонованих із соматичних клеткок кращого корейського розшукового пса породи канадський лабрадор-ретрівер. На думку південнокорейських вчених, 90% клонованих цуценят будуть задовольняти вимогам для роботи на митниці, тоді як лише менше 30% звичайних цуценят проходять тести на профпридатність.
Клонування з метою відтворення вимерлих видів
Клонування може бути використано для відтворення природних популяцій тварин, вимерлих з вини людини. Незважаючи на наявність певних проблем і труднощів, перші результати в цьому напрямку вже є.
Клонування Бантенг
У 2004 році на світ з'явилася пара Бантенг (диких биків, що мешкали у Південно-Східній Азії), клонованих з клітин тварин, які померли більше 20 років тому. Два Бантенг були клоновані з унікального "замороженого зоопарку" Сан-Дієго, створеного ще до того, як люди зрозуміли, що клонування взагалі можливо. Який здійснив клонування американська компанія Advanced Cell Technology повідомила, що в ньому використовувалися клітини тварин, які померли в 1980 році, не залишивши потомства.
Бантенг клонували, перенісши їх генетичний матеріал у порожні яйцеклітини звичайних домашніх корів; з 16 зародків до народження дожили тільки два. [7] [8]
Імператорський дятел
В останній раз імператорського дятла бачили в Мексиці в 1958 році. З тих пір орнітологи намагаються знайти сліди цієї популяції, але безуспішно. Близько десяти років тому з'явилися навіть чутки, що птах ще живе на планеті, але і вони не підтвердилися.
Зате в музеях залишилися опудала птиці. Науковий співробітник Дарвіновського музею Ігор Фадєєв вважає, що якщо операцію по виділенню ДНК провести зі всіма опудалами, які знаходяться в різних країнах світу, то дятла можна буде воскресити. У різних музеях світу на сьогоднішній день залишилося лише десять опудал імператорського дятла.
Якщо проект матиме успіх, то в недалекому майбутньому на нашій планеті, можливо, знову з'явиться імператорський дятел. У Державному Дарвінівському музеї впевнені, що останні методи молекулярної біології дозволяють виділити і відтворити ДНК цих птахів. [9]
Дронт
У червні 2006 року голландські вчені виявили на острові Маврикій добре збережені останки дронта - вимерлої історично недавно (у XVII столітті) літає птиці. Раніше наука не мала останками птиці, у зникненні якої, як завжди, винна людина. Але тепер з'явилася певна надія на "воскресіння" дивного представника пернатих. [10]
Клонування гігантських птахів
Плани з клонування зниклих гігантських птахів були поставлені під сумнів у результаті досліджень науковців Оксфордського університету. Виділивши ділянки ДНК з останків вимерлих птахів, вчені виявили, що їх генетичний матеріал настільки зруйнований, що сучасна технологія не дозволяє провести повноцінне клонування. Мета наукових робіт полягала у відродженні вимерлих кілька століть тому новозеландського страуса Моа, а також Мадагаскарського епіорніса (птахи-слона).
Зразки ДНК були взяті з фрагментів тканин, що збереглися в музеях. Проте вчені не змогли отримати достатню по своїй довжині ланцюжок ДНК, щоб провести клонування. Тим не менш, деякі вчені вважають, що в найближчі роки буде розроблена технологія відновлення втрачених частин ДНК, шляхом вшивання туди "латок" з ДНК близькоспоріднених видів.
1970 - успішне клонування жаби [12]
1985 - клонування кісткових риб [13]
1996 - овечка Доллі.
1997 - перша миша. [14].
1998 - перша корова [15].
1999 - перший козел [16].
2001 - перша кішка [17].
2002 - перший кролик [18].
2003 - перше бик [19], мул [20], олень [21].
2004 - перший досвід клонування з комерційними цілями (кішки). [22]
2005 - перша собака (афганський хорт на прізвисько Снуппі). [23]
2006 - перший тхір
2007 - другий собака [24]
2008 - третій собака (лабрадор по кличці Чейс). Клонована за державним замовленням [25]. Початок комерційного клонування собак [26]
Методи клонування тварин
Останні десятиліття XX століття ознаменувалися бурхливим розвитком однієї з головних гілок біологічної науки - молекулярної генетики. Вже на початку 70-х років учені в лабораторних умовах почали отримувати та клонувати рекомбінантні молекули ДНК, культивувати в пробірках клітини і тканини рослин і тварин. Виник новий напрям генетики генетична інженерія. На основі її методології почали розроблятися різного роду біотехнології, створюватися генетично змінені організми (ГМО). З'явилася можливість генної терапії деяких захворювань людини, а останнє десятиліття XX століття ознаменувалося ще однією важливою подією - досягнутий величезний прогрес в клонуванні тварин із соматичних клітин.
Особливо великий резонанс у світової громадськості отримали дослідження шотландських вчених з Рослінського Університету, яким вдалося з клітини молочної залози вагітної вівці отримати генетично точну її копію. Клонована вівця на прізвисько Доллі нормально розвивалася і привела на світ спочатку одного, а потім ще трьох нормальних ягнят. Слідом за цим з'явилася низка нових повідомлень про відтворення генетичних близнюків корів, мишей, кіз, свиней із соматичних клітин цих тварин. У приматів, зокрема, у мавп поки не вдалося отримати клони з використанням клітин дорослого організму, плоду або навіть ембріональних стовбурових клітин.
Проте роботи в цьому напрямку активно ведуться. У минулому році з'явилося повідомлення про клональне розмноженні потомства приматів шляхом ділення зародка. Американським дослідникам вдалося отримати генетично ідентичні ембріони мавпи резус шляхом поділу бластомерів зародка на стадії поділу. З ембріона народилася цілком нормальна мавпочка Тетра.
Такий тип клонування забезпечує генетично ідентичне потомство, і в результаті можна отримати двійню, трійню і більше генетичних близнюків. Це дозволяє проводити теоретичні дослідження щодо ефективності нових методів терапії тих чи інших захворювань, з'являється можливість повторювати наукові експерименти на абсолютно генетично ідентичному матеріалі. Імплантіруя зародки послідовно однієї і тієї ж сурогатної самці, можна досліджувати вплив її організму на розвиток плода [31].
Розроблені методи клонування тварин поки ще далеко не досконалі. У процесі експериментів спостерігається висока смертність плодів і новонароджених. Ще не ясні багато теоретичні питання клонування тварин з окремої соматичної клітини.
Проте успіх, досягнутий в клонуванні вівці і мавп, показав теоретичну можливість створення генетичних копій також людини з окремої клітини, взятої з якого-небудь його органу. Багато вчених з ентузіазмом сприйняли ідею клонування людини.
3.1 Методи трансплантації ядер
У нашій країні Б.В. Конюховим і Є.С. Платоновим в 1985 р. був розроблений метод менш травматичного перенесення ядер методом мікроманіпуляції. Він протікає в два етапи: спочатку тонкою мікропіпеткою проколюють зони пеллюціда і плазматичної мембрани і витягають пронуклеус, а потім інший піпеткою, більшого діаметру (12 мкм) у той же отвір вводять диплоидное ядро донора. У цьому випадку менше травмується цитоплазма зиготи і транспортується ядро донора.
Трансплантація ядер може здійснюватися й іншим способом, з використанням цітохалазінов (речовин, синтезованих грибами).
Цітохалазін У руйнує структуру мікрофіламентів і сприяє унікальному розташуванню ядра. Ядро залишається з'єднаним з клітиною тоненьким стеблинкою цитоплазми. При центрифугуванні цей місток розривається, утворюються без'ядерні клітини (цітопласти) і каріопласти, що представляють собою ядра, оточені тонким шаром цитоплазми і цитоплазматичною мембраною. Цітопласти відокремлюють від інтактних клітин в градієнті щільності. Вони зберігають здатність прикріплятися до поверхні культурального судини і можуть бути використані для злиття з каріопластамі інших клітин з метою отримання життєздатної клітини [14] [12].
Методи виділення каріопластов трохи складніше і включають в себе ряд операції з центрифугированию, розділення в градієнті щільності і т.д. У деяких випадках до суміші клітин і каріопластов додають частки танталу діаметром 1 - 3 мкм. Вони проникають у клітини і ніколи в каріопласт, тому більш важкі клітини осідають швидше каріопластов.
Цітопласти містять всі види органел, властиві нормальній клітині, зберігають здатність прикріплюватися до субстрату, утворювати складчасту мембрану, пересуватися, здійснювати пиноцитоз.
Каріопласти оточені тонким шаром цитоплазми (близько 10% від усієї клітинної цитоплазми), містять компактний ендоплазматичний ретикулум, кілька мітохондрій і рибосом. У деяких клітинних ліній 1 / 10 каріопластов здатна відновити весь втрачений об'єм цитоплазми і відновитися в життєздатні клітини.
Для реконструкції клітин суспензію каріопластов в сольовому буфері додають до моношар культури цітопластов з пропорції 100 каріопластов на 1 цітопласт. Цітопласти повинні бути вже покриті інактивованими вірусними частинками. Інкубують при температурі 4оС 45 хвилин, а потім ще 45 хвилин при температурі 37оС. Відмивають розчином Ерла для видалення не злилися каріопластов [8].
( sequence and ligation - independent cloning ) метод клонирования
3.2 SLIC (sequence and ligation - independent cloning) метод клонуванняСтів Елледж і невтомна Мамі Лі в черговий раз порадували наукове співтовариство оригінальним методом клонування. Новий метод отримав Новинка является модификацией известного метода LIC (ligation-independent cloning) - клонирования без использования лигазы.
назва SLIC (sequence and ligation-independent cloning). Новинка є модифікацією відомого методу LIC (ligation-independent cloning) - клонування без використання лігази. Для того щоб вставити фрагмент ДНК у вектор за допомогою класичного методу LIC, достатньо змішати вектор і вставку, на кінцях яких розташовані протяжні одноланцюгові ділянки, комплементарні один одному. При цьому вставка "прилипає" до вектора, утворюючи рекомбіновану плазміду з ніками в обох ланцюгах. Отриманою плазмидой трансформують Е.coli, система репарації якої відновлює нормальну структуру плазміди.Метод SLIC - це те ж саме, що і LIC з єдиною різницею: "злипання" вектора і вставки проводять в присутності білка RecA. Ця незначна модифікація методу дозволяє домогтися досить високого виходу (1 нг. Вектора здатний дати 3900 трансформантів) а також спростити саму процедуру клонування. Так якщо для класичного методу LIC необхідно точно підігнати розмір одноланцюгових ділянок у вектора і вставки (щоб у підсумку на стику вектора і вставки вийшли ніки), то метод SLIC допускає наявність протяжних гепів [19].
Фактор RecA-один із ключових факторів репарації та рекомбінації E.coli. Зв'язуючись з одноланцюговим ділянкою ДНК, RecA стимулює процес "strand exchange" (в ході цього процесу одноланцюговий ділянка однієї молекули ДНК вбудовується в гомологічний двухчепочений ділянку іншої молекули ДНК, утворюючи D-петлю). Очевидно, додавання RecA in vitro на кроці клонування дозволяє E.coli ефективніше репарирувати плазміду in vivo.
Для успішного клонування необхідна наявність 30-ти нуклеотидних ділянок гомології по краях вектора і вставки. Отримувати одноланцюгові ділянки пропонується за допомогою T4 ДНК-полімерази без додавання нуклеотидів. За допомогою SLIC в один вектор можна запхнути відразу 5 вставок в одну стадію без зниження виходу. Нарешті, високий вихід дозволяє використовувати метод SLIC при клонуванні бібліотек [7].
3.3 Метод генетичного перепрограмірованія клітин шкіри
Розроблено новий метод клонування - менш трудомісткий, ніж спосіб, завдяки якому була створена овечка Доллі. У зв'язку з цим виникли побоювання, що одного разу він буде використаний для обробки ембріонів людини, щоб формувати дітей "на замовлення".
Вчені, завдяки цьому методу отримали мишенят з клітин шкіри дорослих особин, виявили: така технологія набагато ефективніша, ніж спосіб створення Доллі, а побічних ефектів у неї менше - отже, вона краще підходить для використання стосовно людини.
Для клонування мишей вчені вводили клітини шкіри, взяті у дорослої особини, у тканини ембріона на ранній стадії розвитку, отриманого шляхом екстракорпорального запліднення (ЕКЗ). Деякі з дитинчат виявилися частковими клонами особин-донорів, а деякі, як і Доллі, стовідсотковими.
Однак, на відміну від "методу ім'я Доллі", цей спосіб настільки простий і ефективний, що виникли побоювання: в клініках, де практикується ЕКО людини, їм можуть скористатися для допомоги безплідним подружнім парам, які мріють про повністю "своєму" в біологічному відношенні дитину [11].
Метод передбачає генетичне перепрограмування клітин шкіри, в результаті якого вони повертаються в квазіембріональное стан. У минулому році, коли ця революційна методика вперше була застосована до клітин шкіри людини, Католицька церква і президент Джордж Буш високо оцінили її як морально-прийнятний спосіб отримання ембріональних стволових клітин, не пов'язаний з необхідністю створювати або знищувати людські ембріони [13].
Однак той же метод вже використовується в інших цілях - для відтворення потомства лабораторних мишей, яке є або стовідсотковими клонами, або генетичними "химерами" дорослих мишей, клітини шкіри яких зазнали перепрограмуванню.
Експерименти на мишах показали, що в принципі тепер можливо взяти клітину шкіри людини, перепрограмувати її для повернення в ембріональний стан, а потім ввести її в ембріон людини на ранній стадії. У результаті вийде дитина, що володіє деякими загальними генами не тільки з батьками ембріона, але і з людиною, у якого були взяті клітини шкіри.
Така дитина є химерою - генетичною "поміссю" двох або більшої кількості особин - так як деякі з його клітин походять від ембріона, а інші - від клітини шкіри. Фактично у такої дитини буде три біологічних батьків. Відомі химери людини, що виникають в природних умовах - коли в матці з'єднуються двох ембріонів. Часто подібні люди є абсолютно нормальними і здоровими. За словами доктора Ланца, немає причин припускати, що люди-химери, створені за допомогою нового методу, будуть нездорові.
Більш того, експерименти на мишах показали, що можливо створювати повні клони - дитинчат, які на 100% ідентичні дорослої особини в генетичному плані. Цього вдалося досягти, використовуючи різновид дефективних ембріонів мишей з чотирма наборами хромосом замість нормального числа - двох.
Цей "тетраплоїдних" ембріон, розвиваючись, перетворювався виключно в плаценту плоду, коли ж у нього ввели перепрограмувати клітини шкіри, інша частина плоду розвинулася з цієї єдиної клітини і зробилася стовідсотковим клоном дорослої особини, шкіра якої використовувалася [15].
Ніхто з учених, які розробляють методи перепрограмування клітин для виробництва індукованих плюрипотентних стовбурових клітин (induced pluripotent stem, скорочено iPS) - так називають ембріональні клітини - не планує застосовувати їх в репродуктивній медицині людини. Головна мета вчених - налагодити виробництво стовбурових клітин для терапевтичного лікування таких захворювань, як хвороба Паркінсона, хвороба Альцгеймера та інсульт [3].
Етичні проблеми клонування тварин
Члени Європарламенту на пленарному засіданні асамблеї в Страсбурзі проголосували "широкою більшістю голосів" проти клонування тварин у продовольчих цілях, повідомив РІА Новини представник прес-служби Європарламенту.
На сьогоднішній день ніде в світі продукти з м'яса тварин-клонів не продаються, проте, на думку експертів, вони можуть з'явитися на продовольчих ринках до 2010 року, зокрема, в США. У березні комітет з безпеки продуктів харчування при уряді Японії зробив висновок про те, що м'ясо клонованих корів і свиней безпечно.
Європейське агентство з продовольчої безпеки (EFSA) у січні минулого року оприлюднило попередній висновок, згідно з яким, м'ясо і молоко клонованих тварин придатне до споживання. Експерти EFSA, що проводили дослідження за дорученням Єврокомісії, вважають "дуже малоймовірним, що існує будь-яка відмінність у плані продовольчої безпеки" між м'ясом і молоком тварин-клонів і їх родичів, вирощених традиційним шляхом.
Незалежна Європейська експертна група з етики в галузі науки і нових технологій (EGE), зі свого боку, висловила сумніви у виправданості можливості споживання людиною м'яса і молока тварин-клонів. Експерти EGE виходять з того, що підсадка ембріонів клонів самкам домашніх тварин є болючим процесом і часто загрожує їх загибеллю, а самі клоновані тварини передчасно старіють і дуже вразливі в плані здоров'я.
Рішення про дозвіл до продажу м'яса і молока тварин-клонів належить приймати Єврокомісії спільно з країнами-членами ЄС [24].
5. Застосування клонів тварин
Клони не завжди виглядають однаково. Хоча у клонів один і той же генетичний матеріал, навколишнє середовище так само відіграє величезну роль у тому, як пристосується до неї організм клонованого істоти. Наприклад, перша кішка, яка була клонована, її звали Сісі, була каленкорской породи і була зовсім не схожа на свою матір (донора) [21].
Репродуктивне клонування може дозволяти дослідникам клонувати тварин з потенційною вигодою для галузей медицини і сільського господарства. Наприклад, ті ж самі Шотландські дослідники, які клонували Доллі, клонували іншу вівцю, яка була генетично модифікована, щоб давати молоко, яке містить людську основу білка для крові. Ми сподіваємося, що надалі цей білок може відбиратися з молока і подаватися людині в чистому вигляді, це дуже допоможе людям, у яких низька згортання крові. Так само можна використовувати тварин для того щоб тестувати на них нові види ліків і звичайну продукцію, призначену для людини. Велика перевага використання клонованих тварин для перевірки на таблетки полягає в тому, що всі вони є генетично ідентичними, що означає, що їхня реакція на таблетки повинна бути більш менш схожою, ніж у тварин з різним генетичним набором.
Іншою причиною для клонування може служити те, що існують популяції тварин, які стоять на межі вимирання. У 2001 році саме з цієї причини учені зробили перший клону, підданого небезпеки вимирання - азіатського вола.
Дитинча, який розвивався в матці у своєї мами-заступника загинув всього лише через три дні після свого народження. Цей досвід був перейнятий і вже через два роки, у 2003 році, учені створюють клон особини вола, так само стоїть на межі зникнення. Незабаром 3 африканських диких кішки були клоновані з заморожених ембріонів, які були використані в якості ДНК. Незважаючи на те, що деякі експерти вважають, що клонування рятує особини, які стоять на межі вимирання; деякі вчені вважають, що клонування несе негативний характер, оскільки всі особини маю генетично ідентичний набір хромосом, що в цілому відіграє негативну роль, так як для виживання різновиди необхідні різні варіанти ДНК.
Деякі люди так само проявили інтерес в тому, щоб їх померлих домашніх улюбленців клонували, сподіваючись, що ці клони будуть абсолютно такими ж як і їх померлий донор. Але як показало клонування Кішки Сісі, клон не завжди виглядає так само, як і його "оригінал", у якого було взято ДНК [4].
Репродуктивне клонування - дуже неефективна техніка і більшість клонованих тварин ембріонів, не можуть розвиватися в здорових особинах. Наприклад, Доллі була єдиним клоном, який був народжений живим із загальної кількості 277 клонованих ембріонів. Ця дуже низька ефективність, об'єднана занепокоєннями з приводу безпеки, становить серйозну перешкоду для застосування репродуктивного клонування. Дослідники виявили деякі проблеми зі здоров'ям у вівці та інших ссавців, які були клоновані. Це збільшення розміру плоду при народження і різноманітні дефекти в життєвих органах, типу печінки, мозку і серця. Іншими наслідками є передчасне старіння і проблеми з імунною системою.
Інша потенційна проблема полягає у віці хромосоми клонованої клітини. Всі клітини проходять їх нормальні стадії поділу. Кінчик хромосоми, який називається теломеров з кожним поділом коротшає. Через якийсь час теломер стає настільки маленьким, що клітка не може більше ділиться, і в кінцевому підсумку гине. Це звичайний процес старіння, який притаманний усім типам клітин. Отже, клони, створені від клітини, прийнятої від дорослої особини, можуть мати хромосоми, які вже коротше, ніж нормальна, і це може вплинути на швидке старіння клонованої особини. І дійсно, Доллі, яка була клонована від клітини шестирічної вівці, мала хромосоми, теломери якого були коротші, ніж у овець її віку. Доллі померла у віці 6 років, приблизно половина тривалості життя вівці, що становить 12 років [27].
6. Ефективність клонування тварин
Клонування ссавців методом перенесення ядер супроводжується патологією в ембріональний, плодовий і неонатальний періоди розвитку клонів. Можливими причинами аномалій у клонованих тварин можуть бути помилки репрограмування геному, пошкодження спадкового матеріалу при культивуванні ембріонів in vitro і сама процедура перенесення ядер [9].
Значна частина тих, що вижили клонів має низку порушень, що виникають через невідповідне епігенетичного репрограмування геному. Суть проблеми полягає в тому, що розвиток клонованої тварини відбувається за рахунок реалізації генетичної інформації, що містяться в хромосомах донорського ядра з диференційованої соматичної клітини, при цьому стан активності різних генів у соматичних і ембріональних клітинах значно відрізняється. У соматичних клітинах в активному стані знаходяться гени, характерні для диференційованої тканини і відповідальні за синтез специфічних білків. У той же час для розвитку ембріона на ранніх стадіях потрібно, щоб синтезувалися зовсім інші білки, інформація про яких закодована в генах раннього розвитку.
У процесі природного статевого розмноження зигота утворюється в результаті злиття чоловічої та жіночої статевих клітин. У процесі гаметогенезу в статевих клітинах відбувається ремоделювання спадкового матеріалу, тобто його підготовка до подальших процесів запліднення і раннього розвитку. У момент запліднення їх гени "мовчать", з них не відбувається зчитування інформації. Ядро соматичної клітини при його перенесенні в енуклеірованних ооцит не "мовчить", у ньому активно відбуваються процеси транскрипції (зчитування) [21].
Перші успішні досліди з клонування довели, що соматичне ядро в цитоплазмі ооцитів піддається репрограмування - процесу переорієнтування донорського геному на синтез білків, що відповідають раннього зародку. Стають активними ті ділянки хромосом, які посилено працюють у раннього зародка. У багатьох випадках процес репрограмування геному ядерного трансплантата є неповним, що і призводить до ранньої зупинки розвитку ембріонів.
Існує й інша проблема, пов'язана з так званим геномним імпринтингом. Явище геномного імпринтингу полягає в тому, що для нормального розвитку організму необхідні гени як батьківського, так і материнського походження. Відомо, що певні гени так імпрінтірована в процесі гаметогенезу, що після процесу запліднення експресується тільки батьківський або тільки материнський аллель. При перенесенні соматичного ядра в енуклеірованних ооцит цей механізм може порушуватися, оскільки після їх злиття відбувається складна функціональна перебудова всього клітинного геному, протягом якої велика ймовірність помилок.
У даних роботах наводиться інформація про відмінності в організації материнського і батьківського хроматину, підкреслюється роль метилювання в придушенні активності генів. Висловлюється припущення, що причиною низької виживаності тварин, отриманих у результаті переносу ядер, є генетичні порушення (мутації), що акумулюються в процесі старіння клітин організму-донора ядер або під час їх культивування в умовах in vitro.
Висока частота виникнення аномалій та їх міжвидові схожість, а також отримання здорового потомства від тварин-клонів говорить на користь епігенетичної природи виникнення таких порушень, тобто найбільш достовірним поясненням вад розвитку є нездатність реконструйованих ембріонів відповідним чином репрограмміровать статус ядра соматичної клітини [22].
У роботах R. Jaenisсh обговорюється проблема укорочування кінцевих ділянок хромосом (теломер) в клітинах клонованих тварин. З початком диференціювання в більшості клітин відбувається необоротне укорочення кінцевих ділянок хромосом, що ставить питання про те, успадковують чи клоновані тварини укорочені теломери їх генетичних батьків і чи схильні вони внаслідок цього передчасного старіння. Короткі теломер зареєстровано у першої клонованої вівці Доллі, але не зазначено у клонованих в 2000 р. телят. Було встановлено, що активність ферменту теломерази, удлиняющего кінцеві ділянки хромосом, в ядерних трансплантата знаходиться на рівні, подібному з контролем. Теломераза повністю відновлює довжину теломер донорського геному на стадії раннього ембріона, і, як вважає автор статті, цей фактор не може впливати на виживання клонів.
Клонування методом перенесення ядер неоднаково ефективно при використанні як донорів диференційованих соматичних і тотипотентності ембріональних стовбурових клітин. Реконструйовані ембріони з геномом ембріональної стовбурової клітини, які досягли стадії бластоцисти, розвиваються до народження в 10-20 разів частіше, ніж ембріони, отримані після перенесення ядер соматичних клітин. Ці спостереження дають підстави припускати, що ядра недиференційованої ембріональної клітини на відміну від диференційованої потрібно лише незначне репрограмування. Це пояснюється схожістю епігенетичного статусу геномів ембріональних стовбурових клітин і клітин раннього ембріона. Під епігенетичних статусом у генетиці розвитку розуміється сума всіх взаємодій генів із середовищем їхнього функціонування.
Раніше було показано, що народилися тварини-клони часто виявляють ознаки порушення дихання і кровообігу, при народженні мають підвищений вага тіла і плаценти, внаслідок чого цієї патології був привласнений термін "синдрому великого молодняку". Авторами даних статей, однак, не було встановлено будь-якої взаємозв'язку між зміною активності ряду імпринтованих генів у клонів і підвищеною вагою; аномалії в експресії генів носили випадковий характер.
Отримані результати свідчили про значні варіаціях в активності і рівні метилування імпринтованих генів в плацентах і тканинах мишенят, отриманих в результаті трансплантації ядер з ембріональних стовбурових клітин. Щоб з'ясувати, чи є ці порушення результатом зміни імпринтингу в донорській популяції ЕС клітин або наслідком неправильного репрограмування донорського геному після пересадки ядер, у декількох ліній ЕС клітин викликалася спрямована диференціювання додаванням ретиноєвої кислоти. У результаті з'ясувалося, що є значні варіації в рівні експресії генів імпринтованих не тільки між різними лініями ЕС клітин, але і між різними субклона одній лінії ЕС клітин (тобто між ЕС клітинами, що беруть свій початок від однієї-єдиної батьківської клітки). Ці аномалії виникають в процесі культивування ЕС клітин в умовах in vitro [27].
Незалежно від типу клітин, які використовуються в якості донорів ядер, тільки невеликий відсоток реконструйованих ембріонів (1-3%) розвиваються до народження, з них менше половини досягають стадії статевозрілості. Це піднімає питання про те, чи має взагалі місце нормальна регуляція взаємодії генів у клонованих тварин. Народження здорових клонів може пояснюватися толерантністю розвитку ссавців до більшої частини епігенетичних порушень, а летальний ефект викликається кумулятивну дію втрат нормальної регуляції генів у багатьох локусах.
На закінчення авторами статей робиться висновок, що, цілком ймовірно, клони всіх видів ссавців, включаючи людей, будуть мати епігенетичними аномаліями і пов'язаним з ними фенотипом. Оскільки ембріональні стовбурові клітини є потенційним джерелом багатьох типів клітин для використання в цілях трансплантаційної терапії, дуже важливо встановити, характерно чи стан епігенетичної нестабільності для ЕС клітин людини, та оцінити значення цього явища на перспективи застосування ЕС клітин у медицині [13] [24].
Висновки
Клонування - процес створення генетично подібного організму несексуальним (нестатевим) шляхом. Клонування використовували багато років для вирощування рослин. Тварина клонування було предметом вивчення для вчених багато років, але отримувало мало уваги до 1997, поки не було клоновано першу ссавець - овечка Доллі. Учений Доллі і кілька інших вчених клонували різних тварин, включаючи корів і мишей. Недавній успіх клонування призвела до жорстких дебатів серед науковців, політиків та широкої публіки про використання та етики клонування тварин і можливо людини.
За останні 50 років, вчені провели експерименти з клонування в великому колі тварин, використавши багато різних методів. У 1979, дослідники зробили перші генетично ідентичних мишей, розколів ембріон миші в експериментальній трубі, а потім запровадивши вийшов ембріон у матку дорослої самки миші. Незабаром після того, як дослідники справило першу генетично ідентичних корів, вівцю і курчат, переміщаючи ядро клітини, взятої у раннього ембріона в яйце, у якого було звільнено ядро.
Головна причина клонування тварин у тому, щоб зробити організми з певними якостями, які необхідні людині, наприклад вівця була виведена щоб надати людський інсулін. Якщо б вчені покладалися тільки на статеве (сексуальне) розмноження щоб вивести цих тварин, вони б ризикували тим, що необхідні їм якості зникли, так як статеве розмноження (сексуальне) переставляє генетичний код в блоках. Іншими причинами для клонування можуть бути втрачені або померлі домашні тварини або тварини, які знаходяться на межі вимирання. Якими б не були причини, нові технології клонування розпалили багато етичних спорах серед учених. Деякі держави розглянули або наказали законодавство, щоб уповільнити, обмежити або заборонити експерименти клонування. Ясно, що клонування буде частиною нашого життя в майбутньому, але майбутнє цієї технології має все ж таки бути визначено.
Список використаної літератури
1. С. І. Заїр - Бек, І. В. Муштавінскій, Розвиток критичного мислення на уроці, - М.; Просвітництво, 2004.
2. Газета "Біологія" Видавничого дому "Перше вересня", № 12/2003. (Л. В. ЯКОВЕНКО Медицина та клонування)
3. Газета "Біологія" Видавничого дому "Перше вересня", № 30/2003. (Голем третього тисячоліття. Релігійні та історичні наслідки клонування)
4.Газета "Перше вересня" Видавничого дому "Перше вересня", № 12/2003 (Василь Чеширський. Найтонша ланцюжок. Що таке клонування з біологічної точки зору?)
5.Газета "Перше вересня" Видавничого дому "Перше вересня", № 15/2003. (О. ВОЛКОВ. Клонування: мертвий сезон)
6. Газета "Перше вересня" Видавничого дому "Перше вересня", № 15/2003. (А. Грудинкин, Народжені помилково. Клоновані організми найчастіше нежиттєздатні. Чому?) 7. Афонькін С. Ю. Доллі кидає виклик, або роздуми про клонування людей. Біологія. N 6, 1999.
8. Бутенко Р. Г. Біологія клітини та біотехнологія. Наука і людство, 1987.
9. Дейвор Сольтер. Розведення овець шляхом пересадки клітинних ядер. Біологія. N 38, 1997.
10. Кот М. М. Селекція тварин. Перспективи розвитку. Біологія в школі. N 2, 1991.
11. Передчасне старіння Доллі (огляд журналу "Nature"). Знання-сила. N 9-10, с. 10, 1999.
12. Рувінова Е. І. Ще раз про клонування. Біологія. N7, 1998.
13. Чижиков Максим. Клонування, сер! Комсомольська правда. 5 квітня 2000.
14. Чікін Максим. Овечка Доллі старіє не по днях, а по годинах! Комсомольська правда. 1999.
15. Чойриш А. І. Правові та етичні проблеми клонування людини. Держава і право. N 11, 1998, с. 87-93.
16. В. А. Струнників "Клонування тварин: теорія і практика", "Природа", № 7, 1998 р.
17. Є. В. Мохов. "У ЧОМУ СЕКРЕТИ ДОВГОЛІТТЯ. ЧОМУ МИ ЖИВЕМО ТАК МАЛО? .."
18. Соровский освітній журнал, 1999, № 4, клонування тварин, Л. І. Корочкін.
19. Журнал "Людина", 1998 № 3, Доллі - випадковість чи закономірність? Конюхов Б.В.
20. Журнал "Світло: природа і людина", 1999 № 1.
21. Журнал "Студентський меридіан", 2001 січень.
22. Журнал "Природа", 1998 № 7, клонування тварин: теорія і практика Струнників В.А.
23. Афонькін С. Ягнята Франкенштейна / / Хімія і життя. - 1999. - № 3.
24. Краснопільська І. Медицина, якої ми не знали / / Російська газета. - 2002. - № 40 (2908).
25. Кирпань В.П. Етика клонування: життя чи смерть? - Ставрополь, 2004.
26. Дягтерев Н.Д. Клонування: Правда і вигадка - 128 с. Наука і життя: За гранню очевидного
27. Корочкін Л.І. Клонування Наука сьогодні
28. Н. Грін, У. Стаут, Д. Тейлор, Біологія, Москва, "Світ", 1993 р.
29. Ф. Кіберштерн, Гени і генетика, Москва, "Параграф", 1995 р.
30. Стівен Вир "Клонування людини аргументи на захист" / / Російська газета
31.Кузіна С., Черкасов І: "Клонування людини: Підступи диявола або перемога науки" / / Комсомольська правда, 2007 р.
32. Кутковец Т.І., Юдін Б.Г. Уроки незакінченої дискусії / / Людина. 1998
33. Баєв А.А. "Геном людини": деякі етико-правові проблеми сьогодення і майбутнього / / Людина, 1995, № 2
34. Дубінін Н.П. Генетика вчора, сьогодні, завтра. М., "Радянська Росія", 1981