Електронно-мікроскопічні методи дослідження в медицині

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

ЕЛЕКТРОННА МІКРОСКОПІЯ


Електронна мікроскопія - метод морфологічного дослідження об'єктів за допомогою потоку електронів, що дозволяють вивчити структуру цих об'єктів на макромолекулярному і субклітинному рівнях.

Після випуску першої промислової моделі просвічує (трансмісійного) електронного мікроскопа ЕМ пройшла великий шлях розвитку і дала змогу перейти на якісно новий рівень вивчення матерії. ЕМ знайшла широке застосування в морфології, мікробіології, вірусології, біохімії, онкології, медичної генетики, імунології. Завдяки ЕМ розкрита субмікроскопічних структура клітин, відкрито ряд невідомих раніше клітинних органел, таких як лізосоми, рибосоми, ендоплазматичний ретикулум, мікротрубочки, цитоскелет, структури, специфічні для окремих видів кліток. ЕМ дозволила зрозуміти багато тонкі механізми розвитку хвороб, в тому числі на ранніх етапах їх виникнення, ще до появи чіткої клінічної симптоматики.

ЕМ все ширше застосовується для ранньої діагностики захворювань, а також для виявлення етіології інформаційних процесів. Її використовують в онкології для визначення гістогенезу пухлин, що має важливе значення в лікуванні і прогнозі онкологічного захворювання. У нефрології дослідження за допомогою ЕМ матеріалу, отриманого при пункційної біопсії, дозволяє виявити раніше морфологічні зміни структур пачок, діагностувати форму гломерулонефриту і т.п. При ЕМ пунктатів печінки вдається провести диференційну діагностику гепатитів, гепатозов та інших захворювань печінки, визначити активність процесу і нерідко його етіологію.

Дослідження будови матерії на субклітинному і макромолекулярному рівнях стримуються можливостями роздільної здатності електронних мікроскопів. Використання ЕМ в поєднанні з іншими методами, наприклад, з авторадіографія, гістохімічними, імунологічними, зумовило появу електронної авторадіографії, електронної гістохімії, імунної електронної мікроскопії (електронною імуноморфологія) та інших. Це дозволило значно розширити інформацію, що отримується за допомогою ЕМ, спостерігати структурне вираження перебігу біохімічних процесів в клітці, що, у свою чергу, підтвердило один з основних методологічних принципів сучасної біології - діалектична єдність структури і функції.

ЕМ вимагає спеціальної підготовки об'єктів вивчення, від якої значною мірою залежать можливості методу. Відповідно до цілей дослідження методика такої підготовки може бути різною. Однак неодмінною умовою для будь-яких електронно-мікроскопічних досліджень є фіксація тканин або мікробів з максимальним збереженням їх прижиттєвого будови. Існують два принципово різних способу фіксації: хімічний і фізичний, кожен з яких має різні варіанти.

У ЕМ, як правило, використовують хімічну фіксацію за допомогою фіксаторів, що володіють стабілізуючими властивостями. Універсального для будь-яких тканин фіксатора не існує, тому в залежності від завдання конкретного дослідження застосовують відповідні фіксатори. При виборі хімічних фіксаторів виходять з їхньої здатності коагулювати білки (спирти, ацетон, деякі кислоти, солі важких металів та ін) або стабілізувати ліпіди і гелі (чотириокис осмію, глутаровий альдегід, формалін, двухромовоксільний калій та ін.)

Для дослідження беруть біопсійний матеріал або матеріал від трупа людини або тварин незабаром після настання смерті. Існують оптимальні терміни взяття різних тканин і клітин, зазвичай обчислюються хвилинами. Чим раніше тканину завадять у фіксатор, тим більш достовірні дані одержують про прижиттєвої структурі клітин. Фіксатори володіють різною швидкістю проникнення в тканину: від цього залежить можлива величина об'єкта дослідження. Так, чотириокис осмію і глутаровий альдегід проникають у тканину на 0,1-0,5 мм приблизно за 1 - 1,5 години, але для деяких тканин воно може бути збільшене до 4 годин або до 20-30 хв. В окремих випадках допускається протягом однієї доби. Найбільшого поширення набула фіксація матеріалу в глутарового альдегіду з наступною дофіксаціей в четирехокісі осмію. Глутаровий альдегід краще, ніж чотириокис осмію фіксує білки, але гірше стабілізує ліпіди, що й обумовлює використання обох фіксаторів як доповнюють один одного.

Для виборчої фіксації окремих субклітинних структур використовують більш специфічні фіксатори (перманганат калію, діохромат калій та ін.) Якість фіксації в значній мірі залежить від рН і осмотичного тиску фіксуючого розчину. Оптимальним є рН 7,2-7,4, що відповідає фізіологічним параметрам. Тому застосовують буферні розчини. Найчастіше застосовують фосфатні або какоділатний буфери. Фізіологічне осмотичний тиск створюють шляхом додавання осмотично активних речовин, наприклад сахарози або деяких солей.

Є декілька методів хімічної фіксації: перфузійний, коли фіксатор вводять в потік крові, фіксація на місці, коли фіксатор вводять в тканину до її посічення, метод занурення посічених шматочків тканини у фіксатор. Для уповільнення аутолітичних процесів, що протікають в посічених шматочків тканини до повної їх фіксації, останню проводять при температурі 2-5 градусів.

Після фіксації необхідно здійснити зневоднення тканини. Цей процес повинен бути відносно швидким, поступовим і разом з тим забезпечити максимально повне видалення води із зразка, що досягається проведенням підлягає дослідженню тканини через батарею спиртів або ацетоном висхідної концентрації (від 30 до 100%) протягом однієї години.

Наступним важливим етапом підготовки матеріалу для ЕМ є заливка (висновок) тканин у заливальні середовища з метою отримання блоку, що володіє оптимальним поєднанням твердості і еластичності, що дозволяє приготувати тонкий зріз тканини (завтовшки не менше 100 нм), через який може пройти електронний промінь. Першими заливальним матеріалами були метилметакрилат і бутилметакрилат. В даний час вони майже не застосовуються, тому що токсичні і легко возгоняются під пучком електронів, що призводить до виражених артефактів і забруднення електронного мікроскопа. Найбільш широко для заливки тканин використовують епоксидні смоли, в основному аралдіт і епонім, часто застосовуються спільно. Менш поширені поліефірні смоли (вестопал), водорозчинні заливальні суміші, з яких частіше користуються глікольметакрілатом і дуркупаном. Однак, не одна заливальне середовище не є хімічно інертною і в якійсь мірі впливає на тканину: це необхідно враховувати при інтерпретації результатів мікрокопірованія.

В останні роки широке застосування знайшла заливка в так звані компаунди, тобто в суміш певних речовин: основу (мономеру), затверджувача, що додає утворюється полімеру міцність і твердість, пластифікатора, що забезпечує еластичність і пружність полімеру, ініціатора, діссаціірующего з утворенням вільних радикалів, прискорювача, який, взаємодіючи з мономером, звільняє активні додаткові радикали, і каталізатора , що сприяє початку реакції полімеризації. У практиці зазвичай використовують компаунд, що складається з основи, затверджувача, пластифікатора і каталізатора, роль якого може грати прискорювач або ініціатор. Є досить велика кількість способів просочення тканини заливальним засобами. Процес просочення зазвичай протікає при кімнатній температурі або в термостаті при температурі 30 ˚ протягом 48 годин. Потім шматочки тканини переносять в марковані желатинові капсули або спеціальні форми, наповнені заливальної сумішшю. Для полімеризації суміші капсули на 48 годин поміщають в термостат при температурі 60 ˚. У результаті полімеризації утворюється блок, що володіє відповідними властивостями.

Для отримання ультратонких зрізів товщиною 30-50 нм використовуються скляні або алмазні ножі. Алмазні ножі довговічніше скляних, але через високу вартість вони не набули широкого поширення.

До задній стороні ножа прикріплюють спеціальну ванну і встановлюють на ультратом, у ванночку наливають 10% розчин етилового спирту і 10% розчин ацетону на дистильованій воді. У рухомому утримувачі ультратома закріплюють блок з тканиною. Різка блоку здійснюється за рахунок поступального руху стрижня утримувача, а підйом і опускання утримувача щодо ріжучої кромки ножа забезпечуються електронною схемою. Зазвичай на початку виготовляють так звані тонкі зрізи товщиною 1 мкм, вивчаючи які, вибирають цікавить дослідника ділянку. Зорієнтуємося відповідним чином напівтонких зріз і блок, проводять заточування блоку з таким розрахунком, щоб на вершині що утворився піраміди знаходився необхідну ділянку. Потім виготовляють ультратонкі зрізи товщиною 30-50 нм. З ванночки зрізи переносять на металеві сітки.

Для констатування зрізів застосовують речовини з великою атомною вагою, такі як солі важких металів, природно розсіюючі електрони. Іони деяких з цих речовин можуть утворювати зв'язку з киснем і приєднаються до фосфатним групам нуклеїнових кислот. Інші, особливо уранилацетатом, крім цього, діють як універсальні фарбники. Свинець зв'язується з комплексами тканини і осмієва чинниками. Звичайно проводять контрастування ультратонких зрізів або поєднують контрастування шматочків і ультратонких зрізів тканини, після чого вивчають в електронному мікроскопі.

Хімічні методи фіксації і заливки матеріалу мають ряд недоліків. Так, при їх використанні відбуваються хімічні зміни макромолекулярної структури клітин: при фіксації і зневодненні клітин і тканини втрачають деякі речовини: при взаємодії тканини, фіксатора і заливальної середовища може мінятися локалізація внутріклітинних структур. Тому інтенсивно розробляються фізичні методи приготування тканини для ЕМ і особливо гістохімії і цитохімії. Велика частина цих методів заснована на дуже швидкому заморожуванні шматочків тканини.

При використанні методу заморожування-висушування шматочки тканини поміщають в холодоагенти (пропан, ізопентан або фреон), охолоджені до -150 ˚, і в клітинах миттєво припиняються обмінні процеси. При цьому в тканині не встигають утворюватися кристали льоду, і тому субклітинні структури не руйнуються, а вода переходить у склоподібний стан. Потім у високому вакуумі (10 -6 -10 -7 мм рт.ст.) відбувається сублімація, після чого в тканині спеціальним чином заливають заморожені метакрилат, аралдіт або вестопал В. Однак, не завжди вдається досить швидко рівномірно заморозити тканину, а, отже , повністю уникнути утворення кристалів льоду, які при підвищення температури ушкоджують внутрішньоклітинні структури. Виникають і інші труднощі, що призводять до появи артефактів. Тому, частіше застосовують різновид цього методу: заморожування-заміщення. Після заморожування воду, яка перейшла в склоподібний стан, видаляють, поміщаючи тканину в обезводнювання речовини при низькій температурі. У цих умовах спирт і ацетон мало впливають на структуру клітин. Метод кріоскаливанія (заморожування-травлення) дозволяє уникнути виникнення хімічної реакції при обробці тканин. Фрагменти тканин заморожують в холодоагенті зі швидкістю перевищує 1000 ˚ в 1 с. Об'єкт поміщають у вакуумну камеру і тим або іншим способом розколюють або розривають. На поверхні відколу наносять платіноуглеродное покриття (репліку). Потім репліку очищають від органічних залишків в розчині сильного окислювача, промивають у воді і поміщають на сіточку для електронної мікроскопії.

Для досліджень поверхні біологічних тканин використовують і метод відтінення. Найбільшого поширення набув метод приготування реплік шляхом напилення у вакуумній камері вуглецю на поверхню зразка тканин. Для контрастування утворилася репліки на неї під гострим кутом напилюють електронно-щільні речовини (платину або платіноірідіевого сплав). При цьому кількість атомів металу значно більше, на тій стороні контурів зразка, яка ближче до джерела напилення: при дослідженні в електронному мікроскопі вона виглядає неконтрастною. Протилежна поверхня контура має мало атомів металу: у електронному мікроскопі вона контрастна і як би відтіняє неконтрастних поверхню контуру. Метод відображення дозволяє розрахувати висоту контурів досліджуваного об'єкта, так як відомий кут напилення, довжина тіні і збільшення, при якому вироблялося фотографування репліки в електронному мікроскопі.

Для вивчення поверхні ізольованих клітин і тканин служить скануюча (растрова) ЕМ. Одним з основних умовою приготування об'єкта для скануючої ЕМ є необхідність збереження відповідного поверхневого натягу клітин, щоб уникнути їх деформації. Поверхня досліджуваної тканини промивають збалансованими ізотонічними забуференной сольовими розчинами або безбілкових культуральними середовищами з рН 7,3-7,4, підігрітими до температури 37 ˚. Для фіксації зазвичай застосовують ізотонічний розчин глутаровоальдегіда з подальшою дофіксаціей четирехокісі осмію. Тканина зневоднюють в спирті або ацетоні, а потім висушують методами заморожування-висушування або переходу критичної точки. Останній заснований на використанні такого фізичного явища як виникнення за певних умов критичного стану рівноваги пари і рідини. При цьому методі тканина виявляється в газовому середовищі (тобто висушеної), що дозволяє уникнути ушкоджувальної дії поверхневого натягу. Для досягнення високих ступенів дозволу підвищують електропровідність об'єкту, напиляя на нього важкі метали: золото, платину, срібло або їх сплави.

Застосовується також метод іонного бомбардування у вакуумі пластинки металу іонами інертного газу. «Вибиті» атоми металу осідають на поверхні об'єкту дослідження. Для виявлення внутрішньотканинним і внутрішньоклітинних структур застосовують механічні, термічні, хімічні та інші методи.

Для ЕМ мікробів застосовують подібні методи з урахуванням будови мікробів їх розмірів, осмотичного тиску і ін Особливий підхід здійснюється при ЕМ вірусів. Вивчення структур вірусів утруднене із-за малих розмірів і слабкою розсіює здібності віріона. На перших етапах ЕМ вірусів ця трудність долалася оттенененіем частинок при випаровуванні важких металів у вакуумі. Аж до кінця 50-их років 20 століття методика відтінення вірусних частинок була основною при вивченні вірусів у суспензіях. Частіше для цієї методики використовували уран 238, платину, паладій або сплави платини з паладієм. Найбільшого поширення набув сплав платини з паладієм у співвідношенні 4:1. Знаючи заданий кут відтінення, по довжині утворюється тіні визначають висоту вірусної частинки і її діаметр. Оттенение металами досліджуваного об'єкта при поєднанні з кріогенними методиками (заморожування-висушування) дозволяє отримати важливу інформацію при вивченні структури вириона ізометричних вірусів.

Широкого поширення набула методика негативного контрастування вірусів за допомогою вольфрамофосфорной кислоти (Н 3 РW 12 Про 40), яка при подщелачіваніі їдким калієм або їдким натрієм (від значення рН 2,0 до рН 7,0) змінюється і після нанесення препарату на вірус створює зону високого розсіювання електронів, у результаті чого виявляються морфологічні ознаки вірусу.

Розвитку знань про структуру віріону сприяли криогенні методики. Один з найпростіших варіантів таких методик полягає в наступному: сітки з підкладкою і знаходяться на них вірусами після нанесення контрастує розчину поміщають у зріджений пропан (температура -150 ˚) або переохолоджений азот (температура -200 ˚). Подальше висушування зразка при температурі -100 ˚ в глибокому вакуумі сприяє збереженню тривимірної організації віріона. Виняток у цих умовах деформуючою ролі сил поверхневого натягу води призвело до перегляду точки зору, що форма вириона у ліпідосодержащіх вірусів має високу лабільністю. Більш складні криогенні методики, застосовувані в електронній мікроскопії (наприклад, кріоскаливаніе), також внесли помітний внесок у розвиток уявлень про структуру віріонів, особливо про що мають липопротеидной оболонку.

Структура геному вірусів вивчається з допомогою модифікованої в 1959 році Клейштейном і Лангом методики відтінення лінійних макромолекул важкими металами, які випаровуються з В-образним катодів під кутом в 5-10 ˚.

Умовою, що дозволяє вивчити нуклеїнові кислоти, і особливо одноніческіе (поперечний розмір 1-1,1 нм), є зв'язування їх з основними білками, тому що при цьому утворюється нуклеопротеїд має діаметр до 18 нм в двунитчатой ​​структурах і до 15 нм - в однонітчатих. В якості такого білка частіше використовують цитохром С. Вміщена на підкладку нуклеїнова кислота в білковому чохлі має самий химерний контур, і можливість побачити її на всьому протязі здійсненна тільки в тому випадку, якщо під час відтінення металами буде здійснений хоча б один поворот сітки з об'єктом для напилення на 360 ˚. Кращі результати досягаються при тривалому відтінення (до 10 хвилин) сплавом платини з паладієм та багаторазовому поворачивании напиляний сітки на обертовому столику.

Численні модифікації методики Клейшмідта і Ланга дозволяють отримувати дані не тільки про довжину геному, але вивчати і ступінь гомології геному різних вірусів, локалізувати вставку того чи іншого гена до складу гібридних молекул, досліджувати гібридні молекули нуклеїнових кислот.

Загальна інформація про морфогенез вірусів отримана за допомогою ультратонких зрізів вірусів. Техніка отримання ультратонких зрізів вірусів не відрізняється від загальноприйнятої.

В останні роки зростає питома вага ЕМ як експрес-методу або діагностики вірусних інфекцій. Особливо велика роль методу імунної мікроскопії, що дозволяє встановити родову приналежність вірусу.

Імунна ЕМ зіграла вирішальну роль на перших етапах дослідження інфекційного гепатиту (гепатиту А), а також вірусних гастроентеритів і внесла істотний внесок у вивчення гепатиту В.

Теоретичні основи імуноморфологія на світлооптичному рівні розроблені в 1942 році Кунсом зі співробітниками, які вперше показали, що в молекулу антитіла можна ввести деякі речовини, не порушуючи істотно їх специфічності. Розвиток цієї ідеї дозволило в 1959 році Зінгер розробити іммунноморфологіческій метод на електронномікроскопічні рівні, заснований на використання антитіл, мічених феритину. Феритин-білок з високим вмістом заліза, в якому атоми металу організовані в 4 субодиниці, розташовані близько один до одного, що забезпечує високу розсіювання електронів при ЕМ і чітке виявлення молекули.

Кон'югація білка з антитілом можлива за допомогою різних біфункціональних агентів, найбільше поширення серед яких отримали 3,4-толуендіізоціанат і ксіленметадіізоцеанат. Імунна електронна мікроскопія за допомогою антитіл, мічених феритином, ефективна для виявлення екстрацеллярних антигенів мікробів в інфікованих тканинах, у тому числі вірусних антигенів на поверхні клітини, а також поверхневих антигенів в клітці. Разом з тим ця методика в ряді випадків неефективна, наприклад, якщо необхідно дослідити внутрішньоклітинні об'єкти, антигени мікробів усередині клітки, що має місце, в першу чергу, при вірусних інфекціях. Це обумовлено тим, що молекулярна вага (маса) антитіл, мічених феритином, близько 800 тис., і тому проіхожденіе їх через плазматичну мембрану клітини неможливо, а антитіла, мічені феритином, проникли через неї шляхом ендоцитозу не вступають у контакт зі специфічним антигеном. Тому основна маса досліджень, пов'язана з виявленням внутрішньоклітинних антигенів за допомогою антитіл, мічених феритином, виконана при руйнуванні плазматичної мембрани шляхів заморожування-відтавання або обробки компліментом. Заміна феритину низькомолекулярними сполуками, що містять ртуть, йод, не знайшла широкого застосування через низьку специфічність методу.

З кінця 60-их років 20-го століття в імунології застосовується іммуннопероксідазная методика ЕМ для виявлення антигенів всередині і на поверхні клітин. Перексідаза, використовувана для мітки антитіл, дозволяє отримати найкращий ефект у порівнянні з іншими ферментами (фосфотаза, деякі оксидази) завдяки більш низькому молекулярній вазі (близько 40 тис) і стійкості до різних гістологічним процедур. Антитіла, мічені пероксидазою, проникають в клітку і зв'язуються з гомологічним антигеном. Кон'югування антитіл з ферментом здійснюється рядом біфункціональних агентів, серед яких найбільш доступним є глутаровий альдегід. Після того як сталася зв'язок антитіла з відповідним антигеном, локалізація ферменту виявляється після контакту його з відповідним субстратом - бензидином, а-нафтолом, сумішшю а-нафтолу, з р-ферментом. У присутності перекису водню утворюється продукт з більш вираженою розсіює здатністю електронів у порівнянні з навколишніми структурами.

Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Медицина | Реферат
41.6кб. | скачати


Схожі роботи:
Дослідження щитовидної залози в ядерній медицині
Методи фізіотерапії в ветеринарній медицині
Методи обстеження в спортивній медицині та фізичній реабілітації
Повірка електронно рахункових частотомеров Повірка універсальних електронно променевих осцилографів
Повірка електронно-лічильних частотомеров Повірка універсальних електронно-променевих осцилографів
Кабінетні дослідження і методи збору вторинних даних Дослідження переваг студентів
Методи дослідження сечовивідної системи Дослідження в гінекології і акушерстві
Методи прояви системної ідеї Евристичні методи дослідження систем управління
Ультразвукове дослідження МРТ і методи дослідження легень
© Усі права захищені
написати до нас