Дослідження процесу фізіологічної адаптації бактерій до важкій воді

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

ДОСЛІДЖЕННЯ ПРОЦЕСУ Фізіологічні адаптації БАКТЕРІЙ До ВАЖКОЇ ВОДІ

О. В. Мосіна

Московська державна академія тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, просп. Вернадського, д. 86.

Вивчено процес фізіологічної адаптації різних бактеріальних штамів-продуцентів амінокислот, білків і нуклеозидів, які належать до різних таксономічних груп мікроорганізмів (факультативні та облігатні метилотрофних бактерій - Brevibacterium methylicum і Methylobacilus flagellatum, галофільні бактерії - Halobacterium halobium і бацили - Bacillus subtilis) до зростання і біосинтезу необхідних сполук на середовищах, що містять максимальні концентрації важкої води. У роботі повідомляється про метод, який полягає в багатоступінчастої адаптації бактерій до дейтерію шляхом розсіву їх на середовищах, що містять зростаючі концентрації 2 Н 2 O і з подальшою селекцією окремих колоній, які виросли на цих середовищах. У результаті застосування даного підходу серед досліджуваних бактерій були відібрані окремі штами, зберегли високі ростові і біосинтетичні здатності при зростанні на 2 H 2 О. Представлені дані по зростанню і адаптації досліджуваних штамів бактерій як на мінімальних середовищах, що містять як джерел дейтерію 2 H 2 О, (2 H) метанол так і на комплексних середовищах, що містять (2 Н) біомасу метилотрофних бактерій B. methylicum, отриману в ході багатоступінчастої адаптації до 2 H 2 O. Для даних штамів при зростанні на 2 Н 2 О вивчений якісний і кількісний склад внутрішньоклітинних амінокислот, цукрів і ліпідів.

Ключові слова: важка вода; aдаптація; біосинтез

ВСТУП

В даний час в усьому світі зростає інтерес до отримання природних сполук, мічених стабільними ізотопами (2 Н, 13 С, 15 N, 18 O та інші), які необхідні для різнопрофільних біохімічних і діагностичних цілей, структурно-функціональних досліджень, а також для вивчення процесів метаболізму клітини [1-5]. Тенденції до застосування стабільних ізотопів порівняно з їх радіоактивними аналогами обумовлені відсутністю радіаційної небезпеки і можливістю визначення локалізації мітки в молекулі методами високого дозволу: спектроскопією ЯМР [6, 7], інфрачервоної [8, 9] та лазерної спектроскопією [10], мас-спектрометрією [11]. Це дозволило за останні роки підвищити ефективність проведення численних біологічних досліджень de novo, а також вивчати структуру і механізм дії біологічно активних сполук (БАС) на молекулярному рівні. Велике значення в цьому аспекті мають природні сполуки, що містять дейтерієву мітку, які зручніше за все отримувати з використанням мікроорганізмів. Саме тому розробка шляхів препаративного отримання дейтеріймечених БАС є актуальним завданням для сучасної біотехнології. Вартість біотехнологічно отриманих ізотопномечених сполук водню значно нижче, ніж хімічно синтезованих, що становить інтерес для пошуку нових штамів-продуцентів БАС, стійких до високих концентрацій дейтерію в ростових середовищах і для подальшого вивчення їх властивостей.

З розвитком нових біотехнологічних підходів з'явилася можливість використовувати отримані в результаті мутагенезу або генної інженерії штами-продуценти для спрямованого синтезу дейтеріймечених сполук [12, 13]. Традиційним підходом при цьому залишається культивування бактерій на середовищах, що містять максимальні концентрації важкої води або інших дейтерированного субстратів, наприклад, [U-2 Н] метанолу [14-17]. Проте подібні процеси рідко застосовуються в біотехнології, внаслідок наявності низки труднощів, пов'язаних з адаптацією та культивуванням мікроорганізмів на середовищах з максимальними концентраціями 2 H 2 О. Тому цілий ряд питань, які стосуються принципової можливості використання різних штамів-продуцентів БАС для зростання і біосинтезу на високодейтерірованних середовищах, залишаються до кінця нез'ясованими.

Важливою проблемою, яка потребує якнайшвидшого вирішення, є вивчення процесів фізіологічної адаптації клітини до 2 H 2 О. Відомо, що високі концентрації 2 H 2 О в ростової середовищі можуть викликати інгібування життєво-важливих функцій росту і розвитку багатьох мікроорганізмів [18]. Незважаючи на негативний біостатичні ефект, що надається важкою водою на клітини, деякі бактерії стійкі до високих концентрацій важкої води в середовищі [19], у той час як рослинні клітини можуть нормально розвиватися при концентраціях не більше 50-75% 2 H 2 О [20] , а клітини тварин не більше 35% 2 H 2 О [21]. Явище адаптації до 2 H 2 О цікаво не тільки саме по собі, але воно також дозволяє отримувати унікальний біологічний матеріал, дуже зручний для вирішення завдань молекулярної організації клітини за допомогою методу ЯМР-спектроскопії. Ці дані послужили основою для вибору об'єктів дослідження в наших експериментах. Ними були генетично марковані штами-продуценти амінокислот, білків і нуклеозидів, пов'язані з різним таксономічним пологах мікроорганізмів: факультативні метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum, облігатні метилотрофних бактерій Methylobacillus flagellatum, галофільні бактерії Halobacterium methylicum і бацили Bacillus subtilis.

Метою цієї роботи було дослідження процесу фізіологічної адаптації цих продуцентів БАС при зростанні на середовищах, що містять максимальні концентрації важкої води. Оскільки біосинтетичних потенціал використовуваних штамів при зростанні на важкій воді до початку проведення даної роботи було вивчено недостатньо, становило інтерес дослідження їх здатності до синтезу цільових продуктів в умовах максимально дейтерированного середовищ. Дослідження з адаптації до 2 H 2 O метилотрофних бактерій B. methylicum заклали основу для використання компонентів їх (2 Н) міченої біомаси, отриманої в ході багатоступінчастої адаптації до 2 H 2 O в якості ростових факторів для культивування інших мікробних продуцентів БАС.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Об'єктами дослідження служили генетично марковані штами-продуценти амінокислот, білків і нуклеозидів, отримані з Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ) Державного науково-дослідного інституту генетики та селекції промислових мікроорганізмів:

1. Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцінзавісімий штам факультативних метилотрофних бактерій, продуцент фенілаланіну.

2. Methylobacillus flagellatum КТ, ізолейцінзавісімий штам облігатних метилотрофних бактерій, продуцент лейцину.

3. Bacillus subtilis В-3157, поліауксотрофний по гістидину, тирозину, аденін і урацилом штам грамнегативних бактерій, продуцент інозину.

4. Halobacterium halobium ЕТ 1001, пігментсодержащій штам галофільних бактерій, здатний синтезувати бактеріородопсин.

Для приготування поживних середовищ та адаптації бактерій використовували 2 H 2 O (99.9% 2 H), і 2 HСl (95.5% 2 H) і [U-2 Н] метанол (97.5% 2 H), отримані з Російського науково-дослідного центру "Ізотоп" (Санкт-Петербург, РФ). За необхідності 2 H 2 O очищали від шкідливих домішок, переганяючи її над перманганатом калію [22].

Стартовим матеріалом для культивування галофільних бактерій і бацил служила (2 Н) мічена біомаса метилотрофних бактерій, отримана в умовах багатостадійної адаптації на твердих агаризованих середовищах (2% агар) з 2% [U-2 Н] метанолом, що містять східчасто збільшуються концентрації важкої води ( від 0 до 98% 2 Н 2 О). Отриману таким чином (2 Н) мічену біомасу B. methylicum (вихід склав 100 г по вологому вазі з 1 л. середовища) автоклавування в 0.5 н. розчині 2 HСl (у 2 H 2 O) (08 ати, 30 хв), нейтралізували 0.1 н. КОН (рН 7.0) і використовували далі в якості джерела ростових факторів для адаптації і культивування бацил і галофільних бактерій.

У цій роботі використовували такі поживні середовища (кількості компонентів наведені в г / л):

1. Мінімальна середу М9, на основі різних концентрацій 2 H 2 O (див. табл. 1 і табл. 2) і добавками 0.5-2% метанолу (залежно від фізіологічної потреби бактерій) або [U-2 H] метанолу: KH 2 PO 4 березня; Na 2 HPO 6 квітня; NaCl 0.5; NH 4 Cl 1. Середу використовували для культивування метилотрофних бактерій.

2. Гідролізна середу 1 (ГС1) для культивування бактерій (на основі 1 00% 2 H 2 О): глюкоза 120; (2 Н) мічена біомаса B. methylicum 25; NH 4 NO 3 30; MgSO 4 x 7H 2 O 20; крейда 20.

3. Гідролізна середу 2 (ГС2) для культивування галофільних бактерій (на основі 100% 2 H 2 О): NaCl 250; MgSO 4 x 7H 2 O 20; KCl 2; CaCl 2 x 6H 2 O 0.065; цитрат натрію 0.5; (2 Н) мічена біомаса B. methylicum 20.

Культивування метилотрофних бактерій і бацил проводили при 37 0 С в колбах Ерленмейера місткістю 250 мл з наповненням середовищем до 50 мл в умовах інтенсивної аерації за методиками [14] та [15], використовуючи як джерел дейтерію 2 H 2 O і [U-2 H] метанол. У випадку з галофільнимі бактеріями їхньою культивування проводили на 2 H 2 O-середовищі при висвітленні лампами денного світла ЛБ-40. Після 6-7 діб культивування клітини відокремлювали центрифугуванням (10000 об / хв, 20 хв). У культуральних рідинах аналізували секретуються амінокислоти і нуклеозиди.

Для виділення фракції сумарних білків біомаси клітини двічі промивали дистильованою водою з наступним центрифугуванням (10000 об / хв, 20 хв), експонували ультразвуком при 22 кГц (3 x 15 хв) і центрифугували. Ліпіди і пігменти екстрагували сумішшю органічних розчинників хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) за методом Блай і Дайера [23]. Отриманий осад висушували до постійної ваги (10-12 мг) і використовували його як фракції сумарних білків біомаси.

Сумарні білки біомаси гідролізувати в запаяних скляних ампулах у 50-ти кратному надлишку 6 н. 2 HCl (у 2 H 2 O). Ампули витримували при 110 0 протягом 24 ч. Після цього реакційну масу суспендировані в гарячій воді, що дистилює, фільтрували. Гідролізат упаривали в роторному випарнику при 40 0 С. Залишки дейтеросоляной кислоти видаляли шляхом витримування в ексикаторі над твердим NaOH.

Для проведення гідролізу внутрішньоклітинних полісахаридів 50 мг сухої деліпідізованной біомаси поміщали в круглодонну колбу вмесімостью 250 мл, додавали 50 мл дистильованої води і 1.6 мл 25% 2 H 2 SO 4 і кип'ятили зі зворотним водяним холодильником протягом 90 хв. Після охолоджування реакційну суміш суспендованих в одному об'ємі гарячої дистильованої води і нейтралізували 2 н. розчином Ba (ОН) 2 до рН 7.0. Випав осад сульфату барію відокремлювали центрифугуванням (15000 об / хв, 5 хв), супернатант декантировали і упаривали в роторному випарнику при 40 0 С.

Зростання бактерій оцінювали за здатністю до утворення окремих колоній на поверхні твердих агаризованих середовищ, а також за величиною оптичної щільності суспензії клітин, виміряної на спектрофотометрі Beckman-DU6 (США) при 540 нм у кюветі кварцовою з довжиною оптичного шляху 10 мм.

Тонкошарову хроматографію (ТШХ) проводили на пластинках Silufol UV-254 (Чехо-Словаччина) або на пластинках з закріпленим шаром селикагель фірми Merck (Німеччина) у системах розчинників: ізопропанол-аміак, (7:3) (A) для амінокислот і н- бутанол-оцтова кислота-вода, (2:1:1), (Б) для інозину.

Визначення вмісту глюкози в культуральній рідині проводили глюкозооксидазним методом [24].

Секретуються фенілаланін і інозин визначали на приладі Beckman DU-6 (США). Фенілаланін визначали при 540 нм в зразках культуральної рідини, об'ємом 10 мкл після обробки препаратів культуральної рідини нінгідрином, інозин - при 249 нм у зразках культуральної рідини, об'ємом 20 мкл.

Амінокислотний аналіз гідролізатів сумарних білків біомаси проводили на приладі Biotronic LC 5001 (ФРН); 230 x 3,2 мм; робочий тиск 50-60 атм; швидкість подачі натрійцітратного буфера 18.5; нингидрина 9.25 мл / год; детекція при 570 нм і 440 нм (для проліну).

Аналіз вуглеводів здійснювали на рідинному хроматографі Knauer (ФРН), обладнаним насосом Gilson (ФРН) і рефрактометром Waters До 401 (ФРН); нерухома фаза: Separon NH 2, 10 мкм, 10 x 250 мм; рухома фаза: ацетонітрил-вода, (75:25); швидкість подачі: 0.6 мл / хв.

Ліпіди аналізували на хроматографі Beckman Gold System (США), обладнаним насосом Model 166 (США) і детектором Model 126 (США); нерухома фаза: Ultrasphere ODS 5 мкм; 4.6 x 250 мм; рухома фаза: лінійний градієнт 5 мМ KH 2 PO 4 -ацетонітрил, 100% протягом 50 хв; швидкість подачі: 0.5 мл / хв; детекція при 210 нм.

Рівні включення дейтерію в амінокислоти білкових гідролізатів визначали методом мас-спектрометрії електронного удару у вигляді метилових ефірів N-діметіламінонафталін-5-сульфонільного (дансільних) похідних амінокислот на приладі MB-80A (Hitachi, Японія) при ионизирующем напрузі 70 еВ.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

Адаптація облігатних метилотрофних бактерій M. flagellatum.

Для проведення адаптації до важкої воді були використані представники двох різних таксономічних груп метилотрофних бактерій, узятих з колекції ДержНДІ Генетики: лейцінпродуцірующій штам облігатних метилотрофних бактерій Methylobacilus flagellatum, асиміляційний метанол по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазному варіанту рибулезо-5-монофосфатного (РМФ) циклу фіксації вуглецю [25] і фенілаланінпродуцірующій штам факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum, асиміляційний метанол по РМФ-циклу фіксації вуглецю [26]. Для культивування та адаптації даних штамів метилотрофних бактерій використовували мінімальні середовища М9, що містять в якості джерел дейтерію 2 H 2 O і [U-2 H] метанол. Залежно від фізіологічної потреби того чи іншого штаму бактерій в вуглецевому субстраті використовували 0.5-2% концентрації метанолу в ростових середовищах. Для компенсації ауксотрофності по лейцину і ізолейцин ці амінокислоти додавали в ростові середовища в протоновану вигляді в концентраціях 10 мг / л. У звичайних умовах культивування на протоновані середовищах рівні накопичення фенілаланіну і лейцину в культуральних рідинах штамів-продуцентів досягали величини 0.8 та 1.0 г / л відповідно.

Табл. 1

Вплив ізотопного складу середовища на ріст штаму M. flagellaum


Номер Компоненти середовища,% Величина Вихід Час

досвіду лаг-фази біомаси генер.

Н 2 О 2 H 2 О метанол [U-2 Н] метанол годинник% від конт-годинник

роля

1

99.0

0

1.0

0

0

100

1.1

2

99.0

0

0.5

0.5

0.2

91.0

0.8

3

99.0

0

0

1.0

0.8

81.0

1.0

4

49.5

49.5

1.0

0

2.4

76.0

1.4

5

49.5

49.5

0.5

0.5

5.7

75.0

1.2

6

49.5

49.5

0

1.0

6.7

70.0

1.3

7

24.5

74.5

1.0

0

5.6

29.0

1.4

Для проведення адаптації був обраний ступінчастий режим збільшення концентрації 2 H 2 О в ростових середовищах в присутності 0.5-1% метанолу / [U-2 H] метанолу, так як ми припустили, що поступове звикання організму до дейтерію буде позитивно впливати на параметри росту і загальне самопочуття культури (табл. 1). При цьому штам M. flagellatum виявив підвищену чутливість до 2 H 2 O: інгібування швидкості росту бактерій спостерігалося при концентрації 2 H 2 О в середовищі 74.5%, в той час як [U-2 H] метанол суттєво не впливав на швидкість росту культури. Так, на середовищі, що містить 74.5% 2 H 2 О вихід мікробної біомаси склав 29%, що в 3.4 рази нижче, ніж у контрольних експериментах, коли використовували звичайну воду і метанол (Табл. 1, досвід 1), в той час як вихід мікробної біомаси на водному середовищі з 1% [U-2 H] метанолом був знижений всього лише в 1.2 рази. У зв'язку з тим, що зростання бактерій на більш високій концентрації 2 H 2 O досягти не вдалося в подальших експериментах використовували біомасу M. flagellatum, отриману з середи, яка містить 74.5% 2 H 2 О.

Адаптація факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum.

Спроби адаптувати штам B. methylicum до зростання на максимально дейтерированного середовищі при збереженні здатності до біосинтезу фенілаланіну привели до позитивного результату. До даного штаму метилотрофних бактерій був застосований спеціальний підхід щодо адаптації, який полягав у серії з декількох адаптаційних пасажів вихідної культури на твердих агаризованих середовищах з 2% [U-2 H] метанолом при ступінчастому збільшенні концентрації важкої води в них (від 0 до 98% 2 H 2 О), як показано в табл. 2. При цьому послідовно відбирали окремі колонії, які виросли на середовищах, що містять дейтерій. Потім їх пересівали на середовища з більшим ступенем дейтерірованності, включаючи середовище з 98% 2 H 2 О (ступінь виживання бактерій на кінцевій максимально дейтерированного середовищі склала не більше 50%). За ходом адаптації стежили щодо змін тривалості лаг-фази, часу клітинної генерації і виходів мікробної біомаси, а також за максимальним рівнем накопичення фенілаланіну в культуральній рідині (рис. 1).

У відсутності дейтеріймеченних субстратів тривалість лаг-фази не перевищувала 20 год, в той час як зі збільшенням концентрації 2 H 2 О в ростових середовищах до 98% тривалість лаг-фази збільшувалася до 60 годин (таблиця 2, досвід 10). Відзначено, що тривалість часу клітинної генерації зі збільшенням концентрації 2 H 2 O у ростових середовищах поступово збільшується, досягаючи 4,9 годин на середовищі з 98% 2 H 2 O і 2% [U-2 H] метанолом (табл. 2, досвід 10). На відміну від важкої води, [U-2 H] метанол не викликав суттєвого інгібування росту і не впливав на виході мікробної біомаси. Навпаки, на максимально дейтерірованнной середовищі вихід мікробної біомаси був знижений в 3.3 рази в порівнянні з контролем. Важливо те, що вихід мікробної біомаси та рівень накопичення фенілаланіну в культуральній рідині при зростанні адаптованого до 2 Н 2 О мікроорганізму в максимально дейтерированного середовищі змінюються порівняно з контрольними умовами на 13 і 5%, тобто незначно (табл. 2, досвід 10 ').

Адаптовані до 2 Н 2 О клітки зберегли здатність синтезувати і екзогенно продукувати фенілаланін в ростовую середу. Причому спільною особливістю біосинтезу фенілаланіну в Н 2 О / 2 H 2 O-середовищах було збільшення його продукції на раней фазі експоненціального зростання B. methylicum, коли вихід мікробної біомаси був незначний (рис. 2). У всіх експериментах спостерігалося пригнічення біосинтезу фенілаланіну на пізній фазі експоненціального зростання і зниження його концентрації в ростових середовищах. Згідно даним по мікроскопічному дослідженню зростання популяції мікроорганізмів, подібний характер динаміки секреції фенілаланіну не корелював з якісними змінами ростових характеристик культури на різних стадіях росту, що служило підтвердженням морфологічної однорідності мікробної популяції. Швидше за все, накопичений у процесі росту фенілаланін ингибировал ферменти власного шляху біосинтезу. Крім того, не виключена можливість, що при ферментації без рН-статірованія може відбуватися як зворотне перетворення секретованої фенілаланіну в інтермедіаторние з'єднання його біосинтезу, так і асиміляція фенілаланіну клітиною для забезпечення власних метаболічних потреб, що зазначено в інших роботах [27, 28]. Дані з дослідження культуральної рідини методом ТШХ показали, що крім фенілаланіну штам B. methylicum синтезує і накопичує в культуральній рідині (на рівні 5-6 ммоль) інші амінокислоти (аланін, валін, лейцин, ізолейцин), присутність яких також підтверджувалося мас-спектрометричним аналізом метилових ефірів їхній DNS-похідних.

Табл. 2

Вплив ізотопного складу середовища на ріст штаму B. methylicum та рівень накопичення фенілаланіну в культуральній рідині (ЯЖ)

Номер Компоненти середовища,% Величина Вихід Час ген. Рівень

досвіду лаг-фази біомаси накопи-

Н 2 О 2 H 2 О метанол [U-2 Н] метанол годинник% від кон-ня Phe

контролю в ЯЖ

% Від

контролю

1

98

0

2

0

20

100

2.2

100

2

98

0

0

2

30

92.3

2.4

99.1

3

73.5

24.5

2

0

32

90.6

2.4

96.3

4

73.5

24.5

0

2

34

85.9

2.6

97.1

5

49.0

49,0

2

0

40

70.1

3.0

98.0

6

49.0

49.0

0

2

44

60.5

3.2

98.8

7

24.5

73.5

2

0

45

56.4

3.5

90.4

8

24.5

73.5

0

2

49

47.2

3.8

87.6

9

0

98.0

2

0

58

32.9

4.4

42.5

10

0

98.0

0

2

60

30.1

4.9

37.0

10 '

0

98.0

0

2

40

87.0

2.9

95.0

Оскільки даний штам метилотрофних бактерій вдалося адаптувати до 2 Н 2 О, дослідження принципової можливості використання гідролізатів його біомаси для культивування інших штамів продуцентів представлялося дуже актуальним. Слід підкреслити, що засвоюваність біомаси метілотрофов клітинами еукаріотів становить 85-99%, а продуктивність метілотрофов, виміряна за рівнем конверсії метилового спирту досягає 50% [29]. При цьому враховувалося, що метилотрофних бактерій при рості на метанолі здатні синтезувати велику кількість повноцінних білків (до 55% від ваги сухої речовини) [30], а також деяка кількість полісахаридів (до 10%) [31], причому ця здатність зберігається при зростанні на середовищах, що містять 2 Н 2 О і [U-2 H] метанол. Для виділення цих сполук з (2 Н) міченої біомаси метилотрофних бактерій було необхідно проводити її гідроліз. Для цього використовували два методи гідролізу біомаси - щадний гідроліз шляхом автоклавування в 0.5 н. розчині 2 HCl (у 2 H 2 O) (30 хв, 08 ати) і вичерпний гідроліз біомаси в 6 н. 2 HCl (у 2 H 2 O) (24 години, 110 0 С). У попередніх експериментах було показано, що по першому варіанту гідролізу біомаси реалізується набагато більша поживність суспензії метилотрофних бактерій у порівнянні з гідролізом в 6 н. 2 HСl. Тому ми віддали перевагу цьому методу проведення гідролізу біомаси.

Табл. 3

Якісний і кількісний склад амінокислот, виділених з білкових гідролізатів B. methylicum

Амінокислота Зміст в білку,% від сух. ваги 1 г біомаси

протоновані гідролізат гідролізат, отриманий 98%

2 H 2 О і 2% [U-2 Н] метанолу

Гліцин

8.03

9.69

Аланін

12.95

13.98

Валін

3.54

3.74

Лейцин

8.62

7.33

Ізолейцин

4.14

3.64

Фенілаланін

3.88

3.94

Тирозин

1.56

1.82

Аспарагінова кислота

7.88

9.59

Глутамінова кислота

11.68

10.38

Лізин

4.37

3.98

Гістидин

3.43

3.72

Треонін

4.81

5.51

Метіонін

4.94

2.25

Аргінін

4.67

5.27

Внаслідок того, що використовуються в роботі бактеріальні штами були представлені їх ауксотрофнимі за певними амінокислотам формами, було необхідно оцінити скільки даних амінокислот міститься в гидролизатах біомаси та які рівні їх дейтерірованності. У гидролизате біомаси, отриманої з 2 H 2 O-середовища було зафіксовано невелике зниження вмісту лейцину, ізолейцину, глутамінової кислоти, лізину та метіоніну в порівнянні з біомасою, отриманої на звичайній воді (табл. 3). Змісту аланіну, аспарагінової кислоти, треоніну і аргініну в дейтерированного білку, навпаки, трохи перевищують контрольні показники, зняті в Н 2 О. Таким чином, досягнутий результат у дослідах з адаптації B. methylicum до 2 H 2 О, дозволив використовувати гідролізати його (2 Н) міченої біомаси, отриманої в ході багатоступінчастої адаптації до 2 H 2 О в якості ростових субстратів для вирощування бацил Bacillus subtilis, а також штаму галофільних бактерій Halobacterium halobium. При цьому, показником , що дозволяє сподіватися на високу ефективність включення дейтерію в продукти, синтезуються даними бактеріальними штамами, служить високий рівень дейтерірованності амінокислот сумарного білка цих бактерій, виміряний на метилових ефірах DNS-похідних амінокислот, за винятком лейцину і метаболічно споріднених з ним амінокислот, знижені рівні дейтерірованності яких пояснюються ефектом ауксотрофності даного метилотрофних штаму в лейцину (табл. 4).

Табл. 4

Рівні дейтерірованності амінокислот сумарних білків B. methylicum, отриманих в ході багатоступінчастої адаптації до 2 H 2 O

Метилові ефіри дансілпроізводних амінокислот

Величина молекулярного іона (М +)

Кількість включених атомів дейтерію

Рівень дейтерірованності амінокислот,%



Dns-Gly-OMe

324.0

1.8

90.0



Dns-Ala-OMe

340.3

3.9

97.5



Dns-Val-OMe

368.5

4.0

50.0



Dns-Leu-OMe

(Dns-Ile-OMe)

383.4

4.9

49.0



Dns-Phe-OMe

419.6

7.6

95.0



Dns-Tyr-OMe

668.5

6.5

92.8



Dns-Ser-OMe

354.8

2.6

86.6



Dns-Thr-OMe

-

-

не визначали



Dns-Met-OMe

-

-

не визначали



Dns-Asp-OMe

396.4

2.0

66.6



Dns-Glu-OMe

411.0

3.5

70.0



Dns-Lys-OMe

632.4

5.3

58.9



Dns-Arg-OMe

-

-

не визначали



Dns-Нs-OMe

-

-

не визначали



Адаптація бацил B. subtilis.

У наступних дослідах була досліджена здатність до зростання на 2 H 2 О бацилярному штаму B. subtilis, продуцента інозину. Зростання даного штаму найкраще відбувався на ГС 1 середовищі, що містить в якості джерела вуглецю глюкозу, а як джерело ростових факторів гідролізати (2 Н) міченої біомаси метилотрофних бактерій B. methylicum.

Даний штам вдалося адаптувати до дейтерію шляхом розсіву на тверду агаризованому середу ГС 1 зі 100% 2 H 2 О. Він відразу виявив нормальний ріст у присутності 2 Н 2 О. При культивуванні адаптованого B. subtilis на рідкої ГС 1 середовищі, рівень накопичення інозину в культуральній рідині знижується по-порівнянні з вихідним штамом. Наприклад, при зростанні вихідного штаму B. subtilis на середовищі, що містить звичайну воду і протоновану біомасу рівень накопичення інозину в культуральній рідині досягав величини 17 г / л після п'яти діб культивування (рис. 3). Разом з тим рівень накопичення інозину на ГС 1 середовищі, було знижено в 4.4 рази в порівнянні з вихідним штамом на протоновану середовищі. Знижений рівень продукції інозину на в цих умовах корелює зі ступенем конверсії глюкози, яка на 2 H 2 O асимілювалася не повністю, про що свідчили значні кількості накопиченої в культуральній рідині глюкози після ферментації. Тому було цікаво оцінити зміст глюкози в гидролизатах біомаси B. subtilis. До складу гідролізатів внутрішньоклітинних цукрів даного штаму входять глюкоза, фруктоза, Рамноза, арабіноза, мальтоза та сахароза (табл. 5). Важливо, що вміст глюкози в дейтерированного біомасі 21.4%, тобто значно вище, ніж для інших цукрів. Вмісту інших цукрів в аналізованих зразках суттєво не відрізняються від таких для Н 2 О, за винятком сахарози, яка в дейтерированного зразку не детектується (табл. 5).

Табл. 5

Якісний і кількісний склад цукрів, виділених з гідролізатів біомаси B. subtilis.

Цукор Вміст у біомасі, у% від сухого ваги 1 г біомаси

протоновані гідролізат гідролізат, отриманий

з 100% 2 H 2 О

Глюкоза

20.01

21.40

Фруктоза

6.12

6.82

Рамноза

2.91

3.47

Арабіноза

3.26

3.69

Мальтоза

15.30

11.62

Сахароза

8.62

-

Адаптація галофільних бактерій H. halobium.

У випадку з H. halobium адаптацію проводили як на агарі, що містить 100% 2 H 2 О з додаванням гідролізатів (2 Н) міченої біомаси B. methylicum, шляхом розсіву штаму до окремих колоній, так і на рідкому ГС 2 середовищі. У звичайних для цієї культури умовах культивування (37 0 С, на світлі) в клітинах синтезувався фіолетовий пігмент за всіма характеристиками не відрізняється від нативного бактериородопсина.

Проведені дослідження підтвердили, що здатність до адаптації до 2 Н 2 O у різних родів і видів бактерій різна і може варіювати на прикладі метилотрофних бактерій в межах навіть однієї таксономічної групи. З цього можна зробити висновок, що адаптація до 2 H 2 О визначається як таксономічної специфічністю мікрооорганізмов, так і особливостями їх метаболізму, функціонуванням різних шляхів асиміляції субстратів, а також еволюційної ніжчої, яку займає досліджуваний об'єкт. При цьому чим нижче рівень еволюційного розвитку організму, тим краще вона пристосовується до присутності дейтерію в середовищі. Так, з вивчених об'єктів найпримітивнішими в еволюційному плані є галофільні бактерії, пов'язані з археобактеріям, практично не потребують адаптації до 2 Н 2 О, чого не можна сказати про метилотрофних бактеріях, які важче адаптуються до 2 Н 2 О. Для всіх вивчених мікроорганізмів зростання на високодейтерірованних середовищах супроводжувався зниженням ростових характеристик а також рівня продукції секретується БАС. Отримані для вивчених мікроорганізмів дані в цілому підтверджують стійке уявлення про те, що адаптація до 2 H 2 О є фенотипическим явищем, оскільки адаптовані до важкої воді клітини повертаються до нормального зростання і біосинтезу в протоновані середовищах після деякого лаг-періоду. Мабуть, метаболізм адаптованих клітин не зазнає істотних змін в 2 H 2 O. У той же час ефект оборотності зростання на 2 H 2 O / Н 2 O - середовищах теоретично не виключає можливості того, що ця ознака стабільно зберігається при зростанні в Н 2 О, але маскується при перенесенні клітин на дейтерированного середу. Проте, тут необхідно підкреслити, що для проведення адаптації відіграє важливу роль складу середовища культивування. При цьому не виключено, що при проведенні адаптації на мінімальних середовищах, що містять 2 Н 2 О утворюються форми бактерій, ауксотрофние за певними ростовим факторів, наприклад амінокислотам, і внаслідок цього бактеріальний ріст пригнічується. У той же час адаптація до 2 Н 2 О відбувається найкраще саме на комплексних середовищах, що містять широкий набір ростових факторів і амінокислот, що компенсують потребу бактерій в цих сполуках. Можна також припустити, що клітина реалізує лабільні адаптивні механізми, які сприяють функціональної реорганізації роботи життєво-важливих систем в 2 H 2 O. Так, наприклад, нормальному біосинтезу та функціонування в 2 H 2 О таких біологічно активних сполук, як нуклеїнові кислоти і білки сприяє підтримання їх структури за допомогою формування водневих (дейтерієва) зв'язків в молекулах. Зв'язки, сформовані атомами дейтерію розрізняються по міцності та енергії від аналогічних водневих зв'язків [32]. Відмінності в нуклеарною масі атома водню і дейтерію побічно можуть служити причиною відмінностей у синтезах нуклеїнових кислот, які можуть приводити у свою чергу до структурних відмінностей і, отже, до функціональних змін в клітці. Найімовірніше, що ферментативні функції і структура синтезованих білків також змінюються при зростанні клітин на 2 H 2 О, що може відбитися на процесах метаболізму і поділу клітини. Деякі дослідники повідомляють, що після зворотного ізотопного (1 Н-2 H)-обміну ферменти не припиняють своєї функції, але зміни в результаті ізотопного заміщення за рахунок первинного та вторинного ізотопних ефектів, а також дію 2 H 2 О як розчинника (велика структурованість і в'язкість порівняно з Н 2 О) приводили до зміни швидкостей і специфічності ферментативних реакцій в 2 H 2 O [33].

Структурно-динамічні властивості клітинної мембрани, які в більшості залежать від якісного та кількісного складу ліпідів, також можуть змінюватися в присутності 2 H 2 O. Так, порівняльний аналіз ліпідного складу дейтерированного клітин B. subtilis, отриманих при зростанні на 2 H 2 O показав розходження в кількісному складі мембранних ліпідів в порівнянні з Н 2 О (рис. 4). Примітно, що в дейтерированного зразку сполуки, що мають часи утримування - 33.38; 33.74 і 33.2 хв не детектируются (рис. 4 б). Отриманий результат, по видимому, пояснюється тим, що клітинна мембрана є однією з перших органел клітини, яка відчуває вплив 2 H 2 O, і тим самим компенсує реалогічних параметри мембрани (в'язкість, текучість, структурованість) зміною кількісного складу ліпідів.

У загальних рисах, при попаданні клітини в дейтерированного середу з неї не тільки зникає протоновану вода за рахунок реакції обміну Н 2 О - 2 H 2 О, а й відбувається дуже швидкий ізотопний (1 Н-2 H)-обмін у гідроксильних, карбоксильних, сульфгідрильних і аминогруппах всіх органічних сполук, включаючи нуклеїнові кислоти, ліпіди, білки і цукру. Відомо, що в цих умовах тільки С-Н зв'язок не піддається ізотопного обміну і внаслідок цього тільки з'єднання зі зв'язками типу С-2 H можуть синтезуватися de novo [34]. Крім вищеозначених ефектів, можлива зміна співвідношення основних метаболітів у процесі адаптації до важкої воді також може негативно позначатися на ріст клітини. Також не виключено, що ефекти, які спостерігаються при адаптації до 2 H 2 О пов'язані з утворенням в 2 H 2 O конформацій молекул з іншими структурно-динамічними властивостями, ніж конформацій, утворених за участю водню, і тому мають іншу активність і біологічні властивості. Так, з теорії абсолютних швидкостей розрив З 2 H-зв'язків може відбуватися швидше, ніж СH-зв'язків, рухливість іона 2 H + менше, ніж рухливість Н +, константа іонізації 2 H 2 О дещо менше константи іонізації Н 2 О [35]. Підсумовуючи отримані дані, можна зробити висновок, що чутливості різних клітинних систем до 2 H 2 O відмінні. З точки зору фізіології, найбільш чутливими до заміни Н + на 2 H + можуть виявитися апарат біосинтезу макромолекул і дихальна ланцюг, тобто, саме ті клітинні системи, які використовують високу рухливість протонів і високу швидкість розриву водневих зв'язків.

Нам представляється вибір бактерій в якості модельних об'єктів для даних досліджень найбільш доцільним, так як прокаріоти як організми, які стоять на нижчих щаблях розвитку живого, найбільш лабільні в генетичному аспекті і тим самим швидше реагують і пристосовуються до мінливих факторів середовища. На закінчення слід підкреслити, що для того щоб зробити більш конкретні висновки про природу і механізм адаптації клітин до важкій воді, необхідні експериментальні дані з фізіології і біохімії адаптованих клітин.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Young VR, Yu YM, Krempf M. Protein and amino acid turnover using the stable isotopes 15 N, 13 C, and 2 H as probes.: In New techniques in nutritional research, eds., HRG Whitehead, AJ Prentice, A . J .- Academic Press. - New York, 1990. - V. 9. - P. 17-72.

2. Harbison GS, Smith SO, Pardoen JA, Mulder PPJ, Lugtenburg J., Herzfeld R., Mathies R., Griffin RG / / Biochemistry. - 1984. - V. 23. - P. 2662-2667.

3. Ames JB, Ros M., Raap J., Lugtenburg J., Mathies RA / / Biochemistry. - 1992. - V. 31. - P. 5328-5335.

4. Fischer MR, de Groot HJM, Raap J., Winkel C., Hoff AJ, Lugtenburg J. / / Biochemistry. - 1992. - V. 31. - P. 11038-11043.

5. LeMaster DL, Richards F. M. / / Anal. Biochem. - 1982. - V. 122. - P. 238-247.

6. McIntosh LP, Dahlquist FW / / Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V. 23. - P. 1-38.

7. Fesik SW, Zuiderweg ERP / / Quarterly Reviewes of Biophysics. - 1990. - V. 23. - N. 2. - P. 97-131.

8. Rothschild, KJ, Braiman, MS, He, Yi-Wu., Marti, T., Khorana, HG / / J. of Biol. Chem. - 1990. - V. 28. - P. 16985-16991.

9. Haris PI, Robillard GT, Vandijk AA, Chapman D. / / Biochemistry. - 1992. - V. 31. - N 27. - P. 6279-6284.

10. Argade, PV, Rothschild, KJ, Kawamoto, AH, Herzfeld, J., Herlihy, W. C. / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1981. - V. 78. - N 3. - P. 1643-1646.

11. Raap J., Winkel C., de Wit AHM, van Houten AHH, Hoff AJ, Lugtenburg J. / / Anal. Biochem. - 1990. - V. 191. - P. 9-18.

12. Karnaukhova, EN, Reshetova, OS, Semenov, SY, Skladnev, DA, and Tsygankov, YD / / Amino Acids. - 1994. - V. 6. - P. 165-176.

13. Busujima UK, Shimiba S., Narita K., Okada S. / / Chem. Pharm. Bull. - 1988. - V. 36. - P. 1828-1832.

14. Мосін О. В., Карнаухова Є. Н., Пшеничникова О. Б., складні Д. А., Акімова О. Л. / / Біотехнологія. - 1993. - N 9. - С. 16-20.

15. Мосін О. В., складні Д. А., Єгорова Т. А., Юркевич О. М., Швець В. І. / / Біотехнологія. - 1996. - N 3. - С. 3-12.

16. Мосін О. В., складні Д. А., Єгорова Т. А., Юркевич О. М., Швець В. І. / / Біотехнологія. - 1996. - N 4. - С. 27-35.

17. Складне Д. А., Мосін О. В., Єгорова Т. А., Єрьомін С. В., Швець В. І. / / Біотехнологія. - 1996. - N 5. - С. 2 5-34.

18. Crespi HL Biosynthesis and uses of per-deuterated proteins. in: Synt. and Appl. of Isot. Label. Compd. / / Ed. RR Muccino. - Elsevier. - Amsterdam, 1986 - P. 111-112.

19. Katz J, Crespi HL / / Pure Appl. Chem. - 1972. - V.32. - P. 221-250.

20. Daboll HF, Crespi HL, Katz JJ / / Biotechnology and Bioengineering. - 1962. - V. 4. - P. 281-297.

21. Crespy HL Stable Isotopes in the Life Sciences. - International atomic energy agency. - Vienna. - 1977. - P. 111-121.

22. Кейл Б. Лабораторна техніка органічної хімії. - М.: Світ, 1966. - С. 504.

23. Bligh EG, Dyer WJ / / Can. J. Biochem. Physiol. - 1959. - V. 37. - N. 8. - P. 911-918.

24. Полюдек-Фабіньо Р., Бейра Т. / / Органічний аналіз. - Л. Хімія. - 1981. - С. 515-516.

25. Kletsova LV, Chibisova ES, Tsygankov YD / / Arch. Microbiol. - 1988. - V. 149. - P. 441-446.

26. Nesvera J., Patek M., Hochmannova J., Chibisova E., Serebrijski I., Tsygankov Y., Netrusov A. / / Appl. Microb. Biotechnol. - 1991. - V. 35. - P. 777-780.

27. Ворошилова Е. Б., Гусятінер М. М., Жданова Н. І. / / Біотехнологія. - 1989. - N 2. - С. 137-141.

28. Максимова Н. П., Олехновича І. М. Регуляція біосинтезу ароматичних амінокислот у метилотрофних бактерій: Біохімія і фізіологія метілотрофов. - Пущино, 1987. - С. 77-85.

29. Colby J., Dalton H. / / Ann. Rev. Microbiol. - 1979. - V. 33. - P. 481-517.

30. Мосін О. В., складні Д. А., Єгорова Т. А., Швець В. І. / / Біоорганічна хімія. - 1996. - Т. 22. - N 10-11. - С. 856-869.

31. Ніконова Є. С., Дороніна М. В., Троценко Ю. А. / / Приклад. биохим. і Микробиол. - 1986. - Т. 22. - С. 557-561.

32. Barksdale AD, Rosenberg A. / / Methods Biochem. Anal. - 1982. - V. 28. - P. 1-25.

33. Tuchsen E., Woodward CK / / J. Mol. Biol. - 1985. - V. 185. - P. 421-430.

34. Perrin CL, Arrhenius GML / / J. Am. Chem. Soc. - 1982. - V. 104. - P. 6693-6699.

35. Covington AK, Robinson RA, Bates RG / / J. Phys. Chem. - 1966. - V. 70. - P. 3820-3829

МО SIN Про. V. МО SIN

Moscow State Academy of Fine Chemical Technology named after MV Lomonosov, 117571

The study of physiological adaptation process of bacteria to heavy water

The physiological adaptation process of various bacterial producents of amino acids, proteins and nucleosides belonging to various taxsonomic groups of microorganisms (facultative and obligate methylotrophic bacteria - Brevibacterium methylicum and Methylobacills flagellatum, halophilic bacterium - Halobacterium halobium and bacills - Bacillus subtilis) to growth and biosynthesis of necessary compounds on media containing the maximum concentration of heavy water is investigated. О . In article is informed on a method, which consists in multistep adaptation of bacteria to deuterium with the folowing selection of individual colonies grown on 2 H 2 О. О . In the result of application of the given approach among the studied bacteria were selected the individual strains keeping high growth and biosynthetic abilities while growing on 2 H 2 О. О /( 2 H)methan о l and ( 2 H)biomass of methylotrophic bacteria B. Data on growth and adaptation of studied bacterial strains on selective growth media, both minimum, and complex media, containing as a source of deuterium 2 H 2 О / (2 H) methan про l and (2 H) biomass of methylotrophic bacteria B. methylicum, received during multistep adaptation to 2 H 2 O are submitted.

Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Стаття
161.6кб. | скачати


Схожі роботи:
Дослідження процесу фізіологічної адаптації бактерій до тяж лой
Проблеми адаптації і дезадаптації студентів до навчального процесу та феномен стресу
Дослідження соціально-психологічної адаптації підлітків
Дослідження соціально-психологічної адаптації підлітків
Вивчення фізіологічної явища сну
Педагогічна підтримка дітей перебувають у важкій життєвій ситуації
Соціальна допомога дітям знаходяться у важкій життєвій ситуації ГУ
Методика дослідження процесу запамятовування
Дослідження бюджетного процесу в Російській Федерації
© Усі права захищені
написати до нас