ДОСЛІДЖЕННЯ ПРОЦЕСУ Фізіологічні адаптації БАКТЕРІЙ До ВАЖКОЇ ВОДІ
О. В. Мосіна
Московська державна академія тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, просп. Вернадського, д. 86.
Вивчено процес фізіологічної адаптації різних бактеріальних штамів-продуцентів амінокислот, білків і нуклеозидів, які належать до різних таксономічних груп мікроорганізмів (факультативні та облігатні метилотрофних бактерій - Brevibacterium methylicum і Methylobacilus flagellatum, галофільні бактерії - Halobacterium halobium і бацили - Bacillus subtilis) до зростання і біосинтезу необхідних сполук на середовищах, що містять максимальні концентрації важкої води. У роботі повідомляється про метод, який полягає в багатоступінчастої адаптації бактерій до дейтерію шляхом розсіву їх на середовищах, що містять зростаючі концентрації 2 Н 2 O і з подальшою селекцією окремих колоній, які виросли на цих середовищах. У результаті застосування даного підходу серед досліджуваних бактерій були відібрані окремі штами, зберегли високі ростові і біосинтетичні здатності при зростанні на 2 H 2 О. Представлені дані по зростанню і адаптації досліджуваних штамів бактерій як на мінімальних середовищах, що містять як джерел дейтерію 2 H 2 О, (2 H) метанол так і на комплексних середовищах, що містять (2 Н) біомасу метилотрофних бактерій B. methylicum, отриману в ході багатоступінчастої адаптації до 2 H 2 O. Для даних штамів при зростанні на 2 Н 2 О вивчений якісний і кількісний склад внутрішньоклітинних амінокислот, цукрів і ліпідів.
Ключові слова: важка вода; aдаптація; біосинтез
ВСТУП
В даний час в усьому світі зростає інтерес до отримання природних сполук, мічених стабільними ізотопами (2 Н, 13 С, 15 N, 18 O та інші), які необхідні для різнопрофільних біохімічних і діагностичних цілей, структурно-функціональних досліджень, а також для вивчення процесів метаболізму клітини [1-5]. Тенденції до застосування стабільних ізотопів порівняно з їх радіоактивними аналогами обумовлені відсутністю радіаційної небезпеки і можливістю визначення локалізації мітки в молекулі методами високого дозволу: спектроскопією ЯМР [6, 7], інфрачервоної [8, 9] та лазерної спектроскопією [10], мас-спектрометрією [11]. Це дозволило за останні роки підвищити ефективність проведення численних біологічних досліджень de novo, а також вивчати структуру і механізм дії біологічно активних сполук (БАС) на молекулярному рівні. Велике значення в цьому аспекті мають природні сполуки, що містять дейтерієву мітку, які зручніше за все отримувати з використанням мікроорганізмів. Саме тому розробка шляхів препаративного отримання дейтеріймечених БАС є актуальним завданням для сучасної біотехнології. Вартість біотехнологічно отриманих ізотопномечених сполук водню значно нижче, ніж хімічно синтезованих, що становить інтерес для пошуку нових штамів-продуцентів БАС, стійких до високих концентрацій дейтерію в ростових середовищах і для подальшого вивчення їх властивостей.
З розвитком нових біотехнологічних підходів з'явилася можливість використовувати отримані в результаті мутагенезу або генної інженерії штами-продуценти для спрямованого синтезу дейтеріймечених сполук [12, 13]. Традиційним підходом при цьому залишається культивування бактерій на середовищах, що містять максимальні концентрації важкої води або інших дейтерированного субстратів, наприклад, [U-2 Н] метанолу [14-17]. Проте подібні процеси рідко застосовуються в біотехнології, внаслідок наявності низки труднощів, пов'язаних з адаптацією та культивуванням мікроорганізмів на середовищах з максимальними концентраціями 2 H 2 О. Тому цілий ряд питань, які стосуються принципової можливості використання різних штамів-продуцентів БАС для зростання і біосинтезу на високодейтерірованних середовищах, залишаються до кінця нез'ясованими.
Важливою проблемою, яка потребує якнайшвидшого вирішення, є вивчення процесів фізіологічної адаптації клітини до 2 H 2 О. Відомо, що високі концентрації 2 H 2 О в ростової середовищі можуть викликати інгібування життєво-важливих функцій росту і розвитку багатьох мікроорганізмів [18]. Незважаючи на негативний біостатичні ефект, що надається важкою водою на клітини, деякі бактерії стійкі до високих концентрацій важкої води в середовищі [19], у той час як рослинні клітини можуть нормально розвиватися при концентраціях не більше 50-75% 2 H 2 О [20] , а клітини тварин не більше 35% 2 H 2 О [21]. Явище адаптації до 2 H 2 О цікаво не тільки саме по собі, але воно також дозволяє отримувати унікальний біологічний матеріал, дуже зручний для вирішення завдань молекулярної організації клітини за допомогою методу ЯМР-спектроскопії. Ці дані послужили основою для вибору об'єктів дослідження в наших експериментах. Ними були генетично марковані штами-продуценти амінокислот, білків і нуклеозидів, пов'язані з різним таксономічним пологах мікроорганізмів: факультативні метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum, облігатні метилотрофних бактерій Methylobacillus flagellatum, галофільні бактерії Halobacterium methylicum і бацили Bacillus subtilis.
Метою цієї роботи було дослідження процесу фізіологічної адаптації цих продуцентів БАС при зростанні на середовищах, що містять максимальні концентрації важкої води. Оскільки біосинтетичних потенціал використовуваних штамів при зростанні на важкій воді до початку проведення даної роботи було вивчено недостатньо, становило інтерес дослідження їх здатності до синтезу цільових продуктів в умовах максимально дейтерированного середовищ. Дослідження з адаптації до 2 H 2 O метилотрофних бактерій B. methylicum заклали основу для використання компонентів їх (2 Н) міченої біомаси, отриманої в ході багатоступінчастої адаптації до 2 H 2 O в якості ростових факторів для культивування інших мікробних продуцентів БАС.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Об'єктами дослідження служили генетично марковані штами-продуценти амінокислот, білків і нуклеозидів, отримані з Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ) Державного науково-дослідного інституту генетики та селекції промислових мікроорганізмів:
1. Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцінзавісімий штам факультативних метилотрофних бактерій, продуцент фенілаланіну.
2. Methylobacillus flagellatum КТ, ізолейцінзавісімий штам облігатних метилотрофних бактерій, продуцент лейцину.
3. Bacillus subtilis В-3157, поліауксотрофний по гістидину, тирозину, аденін і урацилом штам грамнегативних бактерій, продуцент інозину.
4. Halobacterium halobium ЕТ 1001, пігментсодержащій штам галофільних бактерій, здатний синтезувати бактеріородопсин.
Для приготування поживних середовищ та адаптації бактерій використовували 2 H 2 O (99.9% 2 H), і 2 HСl (95.5% 2 H) і [U-2 Н] метанол (97.5% 2 H), отримані з Російського науково-дослідного центру "Ізотоп" (Санкт-Петербург, РФ). За необхідності 2 H 2 O очищали від шкідливих домішок, переганяючи її над перманганатом калію [22].
Стартовим матеріалом для культивування галофільних бактерій і бацил служила (2 Н) мічена біомаса метилотрофних бактерій, отримана в умовах багатостадійної адаптації на твердих агаризованих середовищах (2% агар) з 2% [U-2 Н] метанолом, що містять східчасто збільшуються концентрації важкої води ( від 0 до 98% 2 Н 2 О). Отриману таким чином (2 Н) мічену біомасу B. methylicum (вихід склав 100 г по вологому вазі з 1 л. середовища) автоклавування в 0.5 н. розчині 2 HСl (у 2 H 2 O) (08 ати, 30 хв), нейтралізували 0.1 н. КОН (рН 7.0) і використовували далі в якості джерела ростових факторів для адаптації і культивування бацил і галофільних бактерій.
У цій роботі використовували такі поживні середовища (кількості компонентів наведені в г / л):
1. Мінімальна середу М9, на основі різних концентрацій 2 H 2 O (див. табл. 1 і табл. 2) і добавками 0.5-2% метанолу (залежно від фізіологічної потреби бактерій) або [U-2 H] метанолу: KH 2 PO 4 березня; Na 2 HPO 6 квітня; NaCl 0.5; NH 4 Cl 1. Середу використовували для культивування метилотрофних бактерій.
2. Гідролізна середу 1 (ГС1) для культивування бактерій (на основі 1 00% 2 H 2 О): глюкоза 120; (2 Н) мічена біомаса B. methylicum 25; NH 4 NO 3 30; MgSO 4 x 7H 2 O 20; крейда 20.
3. Гідролізна середу 2 (ГС2) для культивування галофільних бактерій (на основі 100% 2 H 2 О): NaCl 250; MgSO 4 x 7H 2 O 20; KCl 2; CaCl 2 x 6H 2 O 0.065; цитрат натрію 0.5; (2 Н) мічена біомаса B. methylicum 20.
Культивування метилотрофних бактерій і бацил проводили при 37 0 С в колбах Ерленмейера місткістю 250 мл з наповненням середовищем до 50 мл в умовах інтенсивної аерації за методиками [14] та [15], використовуючи як джерел дейтерію 2 H 2 O і [U-2 H] метанол. У випадку з галофільнимі бактеріями їхньою культивування проводили на 2 H 2 O-середовищі при висвітленні лампами денного світла ЛБ-40. Після 6-7 діб культивування клітини відокремлювали центрифугуванням (10000 об / хв, 20 хв). У культуральних рідинах аналізували секретуються амінокислоти і нуклеозиди.
Для виділення фракції сумарних білків біомаси клітини двічі промивали дистильованою водою з наступним центрифугуванням (10000 об / хв, 20 хв), експонували ультразвуком при 22 кГц (3 x 15 хв) і центрифугували. Ліпіди і пігменти екстрагували сумішшю органічних розчинників хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) за методом Блай і Дайера [23]. Отриманий осад висушували до постійної ваги (10-12 мг) і використовували його як фракції сумарних білків біомаси.
Сумарні білки біомаси гідролізувати в запаяних скляних ампулах у 50-ти кратному надлишку 6 н. 2 HCl (у 2 H 2 O). Ампули витримували при 110 0 протягом 24 ч. Після цього реакційну масу суспендировані в гарячій воді, що дистилює, фільтрували. Гідролізат упаривали в роторному випарнику при 40 0 С. Залишки дейтеросоляной кислоти видаляли шляхом витримування в ексикаторі над твердим NaOH.
Для проведення гідролізу внутрішньоклітинних полісахаридів 50 мг сухої деліпідізованной біомаси поміщали в круглодонну колбу вмесімостью 250 мл, додавали 50 мл дистильованої води і 1.6 мл 25% 2 H 2 SO 4 і кип'ятили зі зворотним водяним холодильником протягом 90 хв. Після охолоджування реакційну суміш суспендованих в одному об'ємі гарячої дистильованої води і нейтралізували 2 н. розчином Ba (ОН) 2 до рН 7.0. Випав осад сульфату барію відокремлювали центрифугуванням (15000 об / хв, 5 хв), супернатант декантировали і упаривали в роторному випарнику при 40 0 С.
Зростання бактерій оцінювали за здатністю до утворення окремих колоній на поверхні твердих агаризованих середовищ, а також за величиною оптичної щільності суспензії клітин, виміряної на спектрофотометрі Beckman-DU6 (США) при 540 нм у кюветі кварцовою з довжиною оптичного шляху 10 мм.
Тонкошарову хроматографію (ТШХ) проводили на пластинках Silufol UV-254 (Чехо-Словаччина) або на пластинках з закріпленим шаром селикагель фірми Merck (Німеччина) у системах розчинників: ізопропанол-аміак, (7:3) (A) для амінокислот і н- бутанол-оцтова кислота-вода, (2:1:1), (Б) для інозину.
Визначення вмісту глюкози в культуральній рідині проводили глюкозооксидазним методом [24].
Секретуються фенілаланін і інозин визначали на приладі Beckman DU-6 (США). Фенілаланін визначали при 540 нм в зразках культуральної рідини, об'ємом 10 мкл після обробки препаратів культуральної рідини нінгідрином, інозин - при 249 нм у зразках культуральної рідини, об'ємом 20 мкл.
Амінокислотний аналіз гідролізатів сумарних білків біомаси проводили на приладі Biotronic LC 5001 (ФРН); 230 x 3,2 мм; робочий тиск 50-60 атм; швидкість подачі натрійцітратного буфера 18.5; нингидрина 9.25 мл / год; детекція при 570 нм і 440 нм (для проліну).
Аналіз вуглеводів здійснювали на рідинному хроматографі Knauer (ФРН), обладнаним насосом Gilson (ФРН) і рефрактометром Waters До 401 (ФРН); нерухома фаза: Separon NH 2, 10 мкм, 10 x 250 мм; рухома фаза: ацетонітрил-вода, (75:25); швидкість подачі: 0.6 мл / хв.
Ліпіди аналізували на хроматографі Beckman Gold System (США), обладнаним насосом Model 166 (США) і детектором Model 126 (США); нерухома фаза: Ultrasphere ODS 5 мкм; 4.6 x 250 мм; рухома фаза: лінійний градієнт 5 мМ KH 2 PO 4 -ацетонітрил, 100% протягом 50 хв; швидкість подачі: 0.5 мл / хв; детекція при 210 нм.
Рівні включення дейтерію в амінокислоти білкових гідролізатів визначали методом мас-спектрометрії електронного удару у вигляді метилових ефірів N-діметіламінонафталін-5-сульфонільного (дансільних) похідних амінокислот на приладі MB-80A (Hitachi, Японія) при ионизирующем напрузі 70 еВ.
РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ
Адаптація облігатних метилотрофних бактерій M. flagellatum.
Для проведення адаптації до важкої воді були використані представники двох різних таксономічних груп метилотрофних бактерій, узятих з колекції ДержНДІ Генетики: лейцінпродуцірующій штам облігатних метилотрофних бактерій Methylobacilus flagellatum, асиміляційний метанол по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазному варіанту рибулезо-5-монофосфатного (РМФ) циклу фіксації вуглецю [25] і фенілаланінпродуцірующій штам факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum, асиміляційний метанол по РМФ-циклу фіксації вуглецю [26]. Для культивування та адаптації даних штамів метилотрофних бактерій використовували мінімальні середовища М9, що містять в якості джерел дейтерію 2 H 2 O і [U-2 H] метанол. Залежно від фізіологічної потреби того чи іншого штаму бактерій в вуглецевому субстраті використовували 0.5-2% концентрації метанолу в ростових середовищах. Для компенсації ауксотрофності по лейцину і ізолейцин ці амінокислоти додавали в ростові середовища в протоновану вигляді в концентраціях 10 мг / л. У звичайних умовах культивування на протоновані середовищах рівні накопичення фенілаланіну і лейцину в культуральних рідинах штамів-продуцентів досягали величини 0.8 та 1.0 г / л відповідно.
Табл. 1
Вплив ізотопного складу середовища на ріст штаму M. flagellaum
Номер Компоненти середовища,% Величина Вихід Час досвіду лаг-фази біомаси генер. Н 2 О 2 H 2 О метанол [U-2 Н] метанол годинник% від конт-годинник роля | |||||||
1 | 99.0 | 0 | 1.0 | 0 | 0 | 100 | 1.1 |
2 | 99.0 | 0 | 0.5 | 0.5 | 0.2 | 91.0 | 0.8 |
3 | 99.0 | 0 | 0 | 1.0 | 0.8 | 81.0 | 1.0 |
4 | 49.5 | 49.5 | 1.0 | 0 | 2.4 | 76.0 | 1.4 |
5 | 49.5 | 49.5 | 0.5 | 0.5 | 5.7 | 75.0 |