Дефенсин безхребетних тварин

Дефенсин комах були відкриті незалежно один від одного двома групами дослідників. Спочатку вони були виявлені в культуральному середовищі клітин NIH -4, которые представляют собой поддерживаемую in Sape -4, які представляють собою підтримувану in линию эмбриональных клеток серой мясной мухи Sarcophaga vitro лінію ембріональних клітин сірої м'ясної мухи Sarcophaga . peregrina. Ці пептиди в літературі отримали назву сапеціни. У 1989 р. французькі дослідники виділили з гемолімфи личинки падальной мухи Phormia terranovae -1 из псевдоэозинофилов и альвеолярных макрофагов кролика. два антибактеріальних пептиду, що одержали назву форміцін А і форміцін В, які мали часткове структурний подібність з дефенсин NP -1 з псевдоеозінофілов і альвеолярних макрофагів кролика.

-1 из нейтрофилов кролика Порівняння первинної структури форміцін а, виділеного з гемолімфи личинки падальной мухи, і дефенсин NP -1 з нейтрофілів кролика

Первинні структури дефенсин комах

Жирним шрифтом позначені консервативні амінокислотні залишки. 0 LWDKYF . X - С-кінцева частина роялізіна: TSFK 0 LWDKYF.

Надалі з'ясувалося, що ця гомологія носить випадковий характер і, як правило, не властива пептидів, що належить до сімейства дефенсин комах, яких зараз вусі відомо більше десятка. Зокрема, з представників загону двокрилих крім форміцінов і сапецінов були виділені і секвенований дефенсин з мухи-пчеловідкі Eristalis , плодовой мушки Drosophila tenax, плодової мушки Drosophila , комара Aedes melanogaster, комара Aedes ; из отряда жесткокрылых, или жуков, — из Zophobas aegypti; із загону жорсткокрилих, або жуків, - з Zophobas , Tenebrio atrarus, Tenebrio , Allomyrina molitor, Allomyrina ; из отряда полужесткокрылых — из бескрылого красного клопа Pyrrhocoris dichotoma; із загону Клопи - з безкрилого червоного клопа Pyrrhocoris , зеленого древесного клопа Palomena apterus, зеленого деревного клопа Palomena ; из отряда перепончатокрылых — из медоносной пчелы Apis prasina; з ряду перетинчастокрилих - з медоносної бджоли Apis mellifera таким представителем является стрекоза Aeschia і джмеля; із загону Odonata таким представником є бабка Aeschia . cyanea.

Первинна структура більшості представників дефенсин комах характеризується помітною гомологією на всіх ділянках молекул. суа-пеа — представителя одного из наиболее эволюционно древних отрядов насекомых. Трохи особняком у сравниваемом ряду гомологічних пептидів варто структура дефенсин з бабки Aeschna суа-ПЕА - представника одного з найбільш еволюційно древніх загонів комах. Однак серед дефенсин, виділених з гемолімфи представників «молодих» загонів, також є й винятки, як у випадку сапеціна У з сірої м'ясної мухи Sarcophaga . Дефенсины насекомых являются катионными молекулами, состоящими из 38—43 аминокислотных остатков. peregrina. дефенсин комах є катіонними молекулами, що складаються з 38-43 амінокислотних залишків. Виняток з цього правила становлять 2 пептиду: - сапецін В і роялізін. Останній виділений як з маткового молочка бджіл, так і гемолімфи дорослої тварини. Для всіх дефенсин комах характерно присутність 6 консервативно розташованих цистеїнових залишків, що утворюють стереотипно 3 внутрішньомолекулярних дисульфідних містка. -концевой, включающий аминокислотные остатки от 1-го до 13-го, центральный, представленный амфипатической а-спиралью, и третий — С-концевой, являющийся р-слоем, сформированным 2 антипараллельными Р -тяжами, которые связаны Р -изгибом. Вивчення надпервічной структури форміціна А методом ядерного магнітного резонансу виявило в його молекулі 3 різна організованих ділянки в пептидного ланцюга: гнучкий і малоупорядоченний N-кінцевий, що включає амінокислотні залишки від 1-го до 13-го, центральний, представлений амфіпатіческой а-спіраллю, і третій - С-кінцевий, що є р-шаром, сформованим 2 антипаралельними Р-тяжами, які пов'язані Р-вигином. Дисульфідні містки є фактором, що стабілізує вторинні структури пептидів і підтримує їх третинну структуру, яка необхідна для максимальної реалізації антимікробних властивостей дефенсіновой молекули. На підставі порівняння первинних структур дефенсин комах можна допустити, що для більшості з них характерна подібна надпервічная структура, підтверджена експериментально, однак, тільки в разі сапецінов. Вона відрізняється від вторинної структури а-і р-дефенсин, яка представлена ​​3 антипаралельними р-тяжами. Відмінна від а-і Р-дефенсин аранжування дисульфідних зв'язків дефенсин комах поряд з особливостями їх первинної та вторинної структур визначає відмінності третинних структур аналізованих пептидів. У дефенсин комах вона ближче до тривимірної структурі пептидного нейротоксину з отрути скорпіона - харібдотоксин, який є інгібітором К ^{+-каналів.} У зв'язку з цим, мабуть, не випадковим є факт виявлення у сапеціна У здатності інгібувати К ^{+-канали} в клітинах Пуркіньє з мозочка щура.

Відмінності в структурах дефенсин комах, з одного боку, і а-і Р-дефенсин - з іншого, відповідальні, по всій видимості, за особливості їх антимікробної активності. Так, якщо дефенсин ссавців і птахів є універсальними антибіотичними пептидами, інактивуючих грампозитивні і грамнегативні бактерії, нижчі фіби і оболонкові віруси, то цього не можна сказати про дефенсин комах, останні діють переважно тільки на грампозитивні бактерії. Необхідні на 1-2 порядки більші концентрації для прояву антимікробної активності дефенсин комах щодо грамнегативних бактерій і ще більш значні - в разі дії на грибки. Обмежена функціональна активність дефенсин комах стосовно окремих груп мікробів компенсується на рівні організму продукцією інших антибіотичних пептидів, таких як цекропіни, апідаціни, дрозоцін, метальніковіни, які ефективно інактивують грамнегативні бактерії, і дрозоміцін, направлено впливає на грибки.

Вивчення механізмів антимікробної дії дефенсин комах виявило в принципі всі ті ж закономірності прояву їх активності, які були встановлені для а-і р-дефенсин. Основною мішенню їх вражаючої дії на бактерії є цитоплазматична мембрана. Перфоріруя плазмалемма бактерій, дефенсин комах порушують структурну цілісність клітини, її іонний го-меостаза, викликають часткову деполяризацію мембрани і зменшення концентрації цитоплазматичного аденозинтрифосфату внаслідок інгібування окисного фосфорилювання. Залишається, проте, не зовсім ясним питання, чому за таких загальних проявах впливу на цитоплазматичну мембрану дефенсин комах в порівнянні з дефенсин ссавців і птахів характеризуються настільки слабкою антимікробну активність відносно грамнегативних бактерій. Може бути, фактором, що обмежує антимікробну активність дефенсин комах у відношенні фамотріцательних бактерій, є зовнішня мембрана останніх, яка слабо проникна саме для даного типу пептидних молекул.

У більшості вивчених видів комах зміст антимікробних пептидів у гемолімфі знаходиться на фоновому рівні. Це стосується і присутності таких пептидів, як цекропіни і дефенсин комах. Синтез дефенсин у комах, як і більшості інших антибіотичних пептидів, носить переважно індуцибельних характер. Попадання бактерій і грибів, а також ліпополісахаридів та продуктів їх метаболізму у внутрішнє середовище тварин ініціює захисний процес продукції жировим тілом комах широкого спектру антимікробних пептидів, що секретуються у гемолімфу. Менший внесок у біосинтез цих пептидів вносять гемоцити та інші клітинно-тканинні структури організму. Антимікробні пептиди продукуються також епідермальними клітинами у відповідь на пошкодження або інфікування кутикули комах. У цьому спостерігається істотна подібність даного процесу з біосинтезом і продукцією Р-дефенсин епітелієм трахеї великої рогатої худоби. Більше того, існує дивовижний збіг низки молекулярно-генетичних процесів в епітелії у комахи і ссавця, що виражається в залученні до індуктивний синтез пептидів подібних генетичних структур і, зокрема, так званих кр-подібних промоторних ділянок генів, які відповідальні за синтез антибіотичних пептидів у настільки еволюційно віддалених видів тварин. Необхідно, однак, відзначити, що якщо для комах подібний індуцибельних характер біосинтезу антибіотичних пептидів є правилом, то для ссавців феномен індуцибельних синтезу р-дефенсин в епітелії трахеї і кератиноцитах шкіри людини - це поки що, швидше за все, виняток. Для вищих тварин властивий конститутивний синтез лейкоцитарних і епітеліальних антимікробних пептидів і білків тільки на певній стадії їх клітинного розвитку, з подальшою упаковкою цих захисних сполук у гранули на рівні апарату Гольджі і збереження їх у відповідних клітинах в преформованих, вже, як правило, готовому для функціонування стані. Пошкодження, які ініціюють фагоцитоз або запальну реакцію, запускають процес мобілізації депонованих у вигляді попередників антибіотичних пептидів і білків.

Контроль активності імунних генів комах подібний з таким генів імуноглобулінів і гострофазових білків хребетних. Вони мають у промоторної області генів енхансерних послідовності, отримали найменування кВ-мотивів, оскільки вперше були виявлені в структурі генів, відповідальних за синтез к-ланцюги імуноглобулінів ссавців. , обычно находящийся в цитоплазме в связанном с ингибитором состоянии. кВ-Мотив є елементом гена, з яким вибірково зв'язується регуляторний Фактор транскрипції NFkB, зазвичай знаходиться в цитоплазмі у зв'язаному з інгібітором стані. A kB , освобождению NFkB и его транслокации в ядро, где он взаимодействует с соответствующей промоторной областью генов острофазовых белков и иммуноглобулинов, активируя транскрипционный процесс. Впливу на організм, що запускають імунну відповідь або запальний процес, призводять до розпаду функціонально неактивного комплексу NFkb A kB, звільнення NFkB і його транслокації в ядро, де він взаємодіє з відповідною промоторної областю генів гострофазових білків та імуноглобулінів, активуючи транскрипції процес. Для дефенсин ссавців подібний механізм регуляції активності їх генів описаний поки тільки для де-фенсіна трахеї великої рогатої худоби, в той час як для процесів регуляції біосинтезу мієлоїдних і ентеральних дефенсин властиві інші закономірності.

В даний час описано структуру декількох генів, відповідальних за кодування індуцибельних антибактеріальних пептидів у Drosophila , Hyalophora melanogaster, Hyalophora cecropia і Sarcophaga . peregrina. Як правило, це - «мовчазні» гени в умовах, коли відсутні клітини і речовини, які ініціюють імунну відповідь. Активація таких генів при пошкодженні кутикули або інфікуванні комах відбувається протягом півгодини. Пік транскрипції спостерігається протягом 12-48 год і залежить від характеру і природи факторів, що ініціюють імунну реакцію. Деякі з цих генів містять невеликі інтрони, хоча більшість генів не включають у свою структуру таких. Як правило, антибіотичні пептиди синтезуються у формі великих молекул, що складаються з 3 частин: сигнальної, прочасті і кінцевого зрілого пептиду.

Проксимальная область даних генів містить кілька послідовностей, що мають структурну гомологію з цісрегуляторнимі елементами промоторів генів, відповідальних за синтез білків гострофазових у ссавців. Найчастіше в таких структурах ідентифікується кВ-споріднений елемент. Його існування у комах доведено і генетичними методами. -6 и у-интерферону. В якості додаткових регуляторних елементів проксимальної області промотора виступають послідовності ДНК, гомологічні елементам ссавців, відповідальних за реагування до IL -6 і у-інтерферону. З клітин Hyalophora cecropia / NF -кВ-семейству, которые избирательно связываются с соответствующей областью промотора при инициации иммунного ответа у насекомых. були виділені білки, пов'язані з Rel / NF-кВ-сімейства, які вибірково зв'язуються з відповідною областю промотора при ініціації імунної відповіді у комах. Це, зокрема, так званий фактор, відповідальний за імунну реакцію у цекропіі {Cecropia - responsiveness immune - responsiveness ; Sun , Faye , 1992 a , 1992 b ). factor; Sun, Faye, 1992 a, 1992 b). ( dorsal - related У дрозофіли він носить назву Dif (dorsal - related immunity ) и связывается специфически с промоторами генов, ответственных за синтез антибиотических пептидов. factor) і зв'язується специфічно з промоторами генів, відповідальних за синтез антибіотичних пептидів. переносится из цитоплазмы в ядро и запускает процессы активации соответствующих генов. В умовах ініціації імунної відповіді Dif переноситься з цитоплазми в ядро і запускає процеси активації відповідних генів. Як правило, ці процеси протікають в клітинах жирового тіла, епітелію кутикули і гемоцитів комах {Hyalophora , Drosophila cecropia, Drosophila , Bombyx melanogaster, Bombyx ) . tnori).

Виявлене подібність у механізмах регуляції генів комах, відповідальних за синтез індуцибельних антибіотичних пептидів, і генів ссавців, що визначають структуру гострофазових білків і Р-дефенсин епітелію трахеї, свідчить про існування ряду єдиних принципів молекулярної організації і регуляції генів в процесі еволюції тваринного світу.

2. Дефенсин скорпіонів

Скорпіони належать до того ж типу членистоногих, що й клас комах. в составе класса Arach - nida , входящего в подтип Chelicerata . Вони за однією з класифікацій складають підклас Scorpiones у складі класу Arach - nida, що входить до підтип Chelicerata. Тому з позиції порівняльної біохімії представляє інтерес оцінка структурної гомології антибіотичних пептидів з гемолімфи скорпіонів і про еволюційно близьких їм комах. В даний час виділено і секвенований дефенсин з гемолімфи 2 видів скорпіонів: Leiurus quinquestriatus і Androctonus , которые имеют максимальную степень структурной гомологии с дефенсинами из гемолимфы стрекозы Aeschna суапеа, представителя наиболее архаичного, а следовательно, и наиболее близкого скорпионам по эволюционному происхождению отряда насекомых. australis, які мають максимальну ступінь структурної гомології з дефенсин з гемолімфи бабки Aeschna суапеа, представника найбільш архаїчного, а отже, і найбільш близького скорпіонам по еволюційному походженням загону комах.

3. Дефенсин мечохвостів

класса меростомовых подтипа хелицеровые, входящего в тип членистоногих. Мечохвостів відносяться до підкласу Xiphosura класу Меростомові підтипу хеліцеровиє, що входить до тип членистоногих. Це одна з найдавніших, що збереглися до наших днів група членистоногих тварин, а тому природним представляється інтерес до факту виявлення в гемоцитів японського підковоподібного краба пептидів, подібних дефенсин:

Порівняння первинної структури дефенсин, що відносяться до класу комах, класу павукоподібних і класу пластінчатожаберних, або двостулкових

-2 из нейтрофилов крысы. Цей пептид отримав назву «великий дефенсин», тому що він складається з 79 амінокислотних залишків, 37 з яких в С-кінцевий області має схожість з послідовності і наявності 3 дисульфідних містків з дефенсин RtNP -2 з нейтрофілів щури. -концевого слабоосновного гидрофобного из 42 аминокислот и С-концевого, имеющего черты структурного сходства с миелоидным дефенсином крысы по первичной структуре, а по аранжировке дисульфидных мостиков аналогичного Р -дефенсинам из нейтрофилов коров. Молекула пептиду складається з 2 великих функціональних блоків: N-кінцевого слабоосновного гідрофобного з 42 амінокислот і С-кінцевого, має риси структурної схожості з мієлоїдний дефенсин щури з первинної структурі, а з аранжування дисульфідних містків аналогічного Р-дефенсин з нейтрофілів корів. Таким чином, розглянутий дефенсин за своїми структурно-функціональними властивостями випадає з кола сімейства дефенсин комах, характерних для ряду видів комах, скорпіонів і молюсків.

4. Дефенсин молюсків

Молюски є другим великим типом первичноротих безхребетних, окремі представники якого досягли у процесі еволюції високого рівня морфофункціонального розвитку. Понад 545 млн років тому, в геологічний період кембрію, 2 основних, найбільш розвинених типу безхребетних - членистоногі та молюски - розійшлися в своєму магістральному еволюційному розвитку. Загальні морфогенетичні коріння розглянутих типів припускають наявність у ряду їхніх представників подібних молекул, що забезпечують процеси розвитку й імунітету. У спільному російсько-французькому проекті були виділені і вивчені антимікробні пептиди з гемолімфи мідії Mytilus , представителя класса пластинчатожаберных, или двустворчатых моллюсков. edulis, представника класу пластінчатожаберних, або двостулкових молюсків. Серед кількох груп пептидів були охарактеризовані і представники дефенсин. суапеа и 2 видов скорпионов — Leiurus За своєю первинною структурою вони виявилися молекулами, максимально гомологічними дефенсин бабки Aeschna суапеа і 2 видів скорпіонів - Leiurus quenquestriatis і Androctonus . australis.

За висновками дослідників, структурна гомологія дефенсин, виділених з гемолімфи представників двох типів, може свідчити про їх походження від загального молекулярно-генетичного попередника. Цікаво, що у мідії, як і у скорпіонів, дефенсин присутні в гемолімфі конститутивно, незалежно від факторів мікробної природи і пошкоджень, що ведуть до запальної реакції і індуктивно підвищують продукцію дефенсин в організмі комах. У зв'язку з цим фактом представляє інтерес з'ясування відмінностей в молекулярно-генетичних основах біосинтезу дефенсин у комах, з одного боку, та скорпіонів, і молюсків - з іншого.