Геноміка як наукова дисципліна

(у прокариот) и Sacsharomyces cerevisiae (у эукариот). Прикладами таких модельних мікроорганізмів можуть служити Escherichia coli (у прокаріот) і Sacsharomyces cerevisiae (в еукаріот). Зіставлення гена у досліджуваного організму з близьким за ступенем гомології геном у модельного організму дає змогу припустити функції гена. Відсутність гомології вказує на необхідність спеціального вивчення функцій нового гена.

Особливе значення стосовно фармації функціональна геноміка має при встановленні так званої "суттєвості" окремих генів. Під "суттєвістю" мається на увазі необхідність гена для життєдіяльності клітини. Так, при створенні антимікробних лікарських препаратів саме "істотні" гени повинні бути мішенями для антимікробних речовин. Відзначимо, що іноді ген набуває значення "суттєвості" тільки в особливих умовах, в яких може опинитися патогенний мікроорганізм.

3. Секвенування генома

Виходячи з розмірів геному і кількості генів зрозуміло, що завдання повного секвенування генома вирішується швидше в разі мікроорганізмів на відміну від вищих еукаріот. До теперішнього часу повністю секвенований геном кількох десятків видів бактерій, у тому числі патогенних. У різних видів бактерій розмір генома варіює, але в цілому він близький до декількох тисяч генів або кільком мільйонам пар основ відповідно.

У клініці в даний час використовується порядки двохсот природних і синтетичних антибактеріальних речовин. Кожне з них має свою мішень. Як правило, це або фермент, або рибосомних білок. Всього реалізованих мішеней також близько двохсот. Отже, переважна кількість генів в якості мішеней для антибактеріальних агентів все ще не використовується. Для доказу "суттєвості" генів застосовується метод виборчого "вибивання" гена з генома з перевіркою виживання організму після такої процедури, який представляє великий інтерес як технологія скринінгу антибактеріальних (або ширше - антимікробних) агентів.

Традиційно первинний відбір останніх проводиться шляхом випробування їх дії на ріст тест-культури мікроорганізму. на лабораторных животных, а также токсичность как для макроорганизма в целом, так и для его отдельных органов и тканей. Високоактивні, що пригнічують зростання (природні або синтетичні) речовини, відібрані на цьому етапі, проходять подальші випробування, зокрема визначається антимікробний спектр їх дії і активність в дослідах in vivo на лабораторних тваринах, а також токсичність як для макроорганізму в цілому, так і для його окремих органів і тканин.

По завершенні доклінічних випробувань в разі отримання позитивних результатів ставиться питання про передачу препарату в клініку. Потім, як правило, починається поглиблене вивчення механізму дії антимікробної агента на субклітинному та молекулярному рівнях, тобто ведеться пошук його внутрішньоклітинної мішені - макромолекули або макромолекулярного комплексу - таргета (англ. мішень) по недавно прийнятої термінології. Далі виявляється ген, що кодує утворення цієї макромолекули, або гени, які кодують освіта макромолекул, що входять до макромолекулярний комплекс.

За новою технологією скринінгу (на відміну від вищевказаної) використовують інформацію про повністю секвенувати геномі патогена і про наявність у ньому "істотних" генів. У лабораторіях, що працюють в області створення нових антимікробних ліків, попередньо вибирається ген, який буде використаний для їх випробування як Таргет (точніше, в якості мішені буде використаний продукт цього гена).

Таргетних скринінг дозволяє у відповідності з вибором гена відбирати біологічно активні речовини з запланованим механізмом дії (на відміну від традиційного методу, коли пошук ведеться "від клітини до гену"). Перший етап таргетної скринінгу починається з виділення цього гена (відповідного фрагмента ДНК) з генома. Далі, використовуючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), фрагмент ДНК ампліфікує (створюється вірусний вектор, який вводиться в плазміду). Кількість копій гена множиться. Потім конструюються:

• безклітинна система, де напрацьована матриця служить для одержання інформаційної РНК, специфічною для гена;

• безклітинна рибосомная система, де ця інформаційна РНК служить для напрацювання білкового продукту, кодованого даним геном.

Безклітинна система, яка використовується для первинного відбору та оцінки активності потенційних лікарських речовин - інгібіторів ферменту (продукту досліджуваного гена), містить як фермент, так і його субстрат. Коли напрацьований білок (продукт обраного для вивчення гена), тоді виникає питання: як дізнатися функцію цього білка? Наприклад, яку реакцію він каталізує як фермент, щоб по придушенні цієї реакції відібрати інгібітори. При близькому схожості цього білка з білком з "модельного" організму підібрати безклітинну систему (субстрат для нового білка) неважко. Якщо схожість є, але не дуже близьке, то вдаються до аналізу "мотивів" - коротких ділянок амінокислотної послідовності, які розподілені по всій довжині білкового ланцюга і можуть виявитися схожими у двох білків.

Коли такої подібності не існує або подібність встановлена, але немає ясності у функції самого гомолога, тобто білка, узятого для порівняння, вдаються до ще одного способу: встановлюють, з якими білками він контранскрібіруется (переписується в послідовність матричної інформаційної РНК). Якщо транскрипт - частина Поліцистронна (еквівалентній гену) інформаційної РНК, необхідної для протікання в подальшому певного метаболічного процесу за участю декількох ферментів, тоді пошук функції досліджуваного білка, включеного до групи цих ферментів, звужується.

У цілому підходи до встановлення функцій продуктів досліджуваних генів численні, і їх різноманітність неухильно зростає. Таким чином, можна, в кінцевому рахунку, проводити серійні випробування потенційних інгібіторів функцій майже будь-якого з тисяч генів, що становлять геном патогена і виявляти всі можливі "вразливі точки" мікробної клітини. Подібний шлях досягнення мети породив у літературі термін "зворотній генетика", що означає ведення дослідження не від клітини і її фенотипу до гену, а, навпаки, від гена до клітки і до її фенотипом.

Повне секвенування генома в поєднанні із застосуванням методів генетичної інженерії вносить свій внесок у фармацію ще в одному відношенні. — на искусственных питательных средах. У патогенних мікроорганізмів відкриті гени, "істотні" для протікання інфекційного процесу, але "несуттєві" при зростанні in vitro - на штучних поживних середовищах. В останньому випадку вони вислизають від уваги дослідника, не піддаються ідентифікації і не можуть бути використані як таргети під час пошуку ліків. гены патогенных микроорганизмов получили название ivi генов (генов вирулентности), несмотря на то, что в их число входят не только гены, кодирующие образование токсинов, адгезинов и других факторов вирулентности. Приховані чи за образним висловом "мовчазні" in vitro гени патогенних мікроорганізмів отримали назву ivi генів (генів вірулентності), незважаючи на те, що в їх число входять не тільки гени, що кодують утворення токсинів, адгезинів та інших факторів вірулентності. До них відносять також гени ферментів і транспортних білків, що дозволяють патогенної мікробної клітці жити і розмножуватися в тканинах макроорганізму в умовах дефіциту деяких органічних речовин і неорганічних іонів.

4. Проект "Геном людини"

Повне секвенування генома людини (декілька мільярдів пар нуклеотидів та ідентифікація генів всіх сорока восьми хромосом) - завдання якісно більш важка, ніж секвенування генома прокаріот і нижчих еукаріот. На початку 1990-х рр.. був оприлюднений Міжнародний проект "Геном людини", метою якого було рішення зазначеної вище кардинальної проблеми з залученням сил і засобів ряду країн, в тому числі і Росії. У 2003 р. цей проект був успішно завершений. Вчені описали всі 25 000 генів, присутніх у хромосомах кожної клітини. За цей час були створені бази ДНК із зразків генів десятків тисяч людей.

У ДНК геному людини виявлені численні некодуючі послідовності. Спочатку до них додавалося умовне визначення "сміття", під яким малися на увазі "відходи-надлишки, що накопичуються в міру еволюції геному". Проте в даний час виявлено, що некодуючі послідовності в геномі людини не випадкові. Цікаві факти встановлено в останні роки при зіставленні геному людини і людиноподібних мавп. Очікувалося, що ці відмінності у порівнянні з парадигмою дарвінізму про те, що "людина походить від мавпи", виявляться досить значними і що наш загальний предок дуже віддалений від нас, а дивергенція відбулася дуже давно.

Однак ця подібність виявилося досить близьким, збільшуючи кількість загадок. До їх числа відноситься постійна присутність у геномі людини послідовностей вірусного походження (свого роду "насиченість" генома сучасної людини молекулами вірусних ДНК).

Також було виявлено відмінність між геномами представників різних націй. Це дуже делікатне питання, враховуючи ще зовсім недавні трагічні сторінки історії людства. Тим не менш закривати очі на об'єктивні факти через недосконалість людського суспільства було б нерозумно, тим більше що пізнання власного геному дає людству в новому тисячолітті передумови для свого вдосконалення, над якими не тяжіють ні релігійні догми, ні руйнівна революційна демагогія.

5. Генотерапія

Порівнюючи гени, учені зможуть виявити зв'язки різних генетичних варіацій і мутацій зі всілякими захворюваннями.

Прогрес у пізнанні людини привів до виникнення такого важливого практичного застосування геноміки до медицини, як генотерапія. З її допомогою можна лікувати багато спадкових захворювань, які диференціюються на моно-і полігенні.

Моногенні захворювання на молекулярному рівні зводяться до дефекту якого-небудь одного білка в клітині - ферменту транспортного або структурного білка. По-перше, білка може не вистачати, а, по-друге, його функції можуть бути порушені. Так, мутація, в результаті якої змінюється активність того чи іншого ферменту, може призводити чи до накопичення токсичного субстрату, або до дефіциту з'єднання, необхідного для нормального функціонування клітини; мутація в гені, що кодує структурний білок, - до серйозних порушень клітин, тканин або органів .

Крім того, мутація в гені, експресується в однієї тканини, може позначитися самим серйозним чином на інший тканини і привести до появи безлічі симптомів. Наприклад, мутація в гені печінкового ферменту фенілаланіндегідроксілази, в результаті якої блокується перетворення фенілаланіну в тирозин, призводить до підвищення рівня ендогенного фенілаланіну в крові, неправильного формування мієлінової оболонки навколо аксонів нервових клітин ЦНС і, як наслідок, - до важкої розумової відсталості.

Полигенное захворювання означає, що декілька білків у клітині володіють тими чи іншими дефектами. У кожної тканини організму експресується свій набір з усієї сукупності генів, але є мутації, які призводять до хвороб, які зачіпають буквально всі органи і тканини: м'язи, очі, печінку, кістки, серце і т.д. Відзначимо, що такі хвороби, як рак і гіпертонія вважаються полігенними. Деякі Неспадкові та інфекційні хвороби, зокрема вірусної етіології, також зараховуються до полігенним.

Цілком природно, що проведення генотерапії при моногенних захворюваннях показує кращі результати. До того ж ген, з яким ведеться робота, повинен бути не тільки картірован, але і ідентифікований (повинна бути відома його функція). До теперішнього часу картіровано близько однієї тисячі генів, включених в процес виникнення і розвитку моногенних спадкових захворювань, з яких ідентифіковано лише кілька сотень.

При генотерапії потрібні попереднє створення рекомбінантної генетичної конструкції з нормальною "здоровою" копією дефектного гена, а також створення для цієї конструкції вектора, що переносить її в клітини організму. Для нормального функціонування гена необхідні специфічні для кожного гена цис-і трансрегуляторние послідовності. Перші (цис) локалізовані в тій же хромосомі і можуть бути безпосередньо зчеплені з геном або знаходитися на деякій відстані від регульованого ними гена, виступаючи в якості промотору; нюрие (транс) розташовуються в інших хромосомах.

Методи введення генів у клітини-мішені при генотерапії дуже різні, але в більшості випадків недостатньо ефективні. Це пов'язано з вбудовуванням чужорідної ДНК в геном тільки невеликого відсотка клітин тканини, а також з руйнуванням її нуклеазами і т.д. Обнадійливі результати отримані при використанні генів, "упакованих" в ліпосоми.

В даний час найбільш перспективним шляхом переносу генів при генотерапії є включення їх до вектори, побудовані на основі ретро-або аденовірусів. Звичайно, тут перш за все виникає питання про безпеку подібних векторів. Віруси генетично модифікуються так, щоб при збереженні здатності проникати в клітину вони втрачали б здатність до автономної реплікації.

Для спрямованої доставки сконструйованої послідовності враховується різний тропізм різних вірусів до певних видів тканин. Так, представники аденовірусів високотропни щодо клітин епітелію дихальних шляхів, вірус герпесу високотропен щодо нейронів ЦНС і т.д. У перспективі планується проводити генотерапія за допомогою цілих рекомбінантних хромосом, що дозволяє оперувати поруч генів і їх регуляторних послідовностей одночасно.

Сучасна генотерапія спрямована тільки на соматичні, а не на статеві (зародкові) клітини.

(вне организма) означает, что нормальная копия гена вводится в соматические клетки, предварительно извлеченные из организма пациента. Генотерапія ех vivo (поза організмом) означає, що нормальна копія гена вводиться в соматичні клітини, попередньо витягнуті з організму пацієнта. Виправлені клітини нарощуються і вводяться пацієнтові трансфузією або трансплантацією. При цьому рекомендується використовувати клітини саме від цього хворого і їх "виправлене" потомство повертати йому ж, що знімає проблему відторгнення клітин за рахунок вродженого імунітету. Тим не менш використання тільки аутологічних клітин звужує можливість генотерапії, тому розроблено різні методи захисту від імунної відповіді і неаутологачних клітин, які включають, зокрема, застосування імуносупресорів.

доставка нормального гена осуществляется непосредственно в ткани человека (в клетки определенных тканей). При генотерапії in vivo доставка нормального гена здійснюється безпосередньо в тканини людини (у клітини певних тканин). При цьому промотор гена повинен бути трансспеціфічен.

Перелік спадкових хвороб, пов'язаних з недостатністю того чи іншого ферменту, зростає в міру розкриття їх біохімічного механізму. Відповідно і підходи до реалізації теоретичних можливостей генотерапії привертають все більшу увагу і конкретизуються. Як приклад можна привести використання генотерапії в лікуванні муковісцідо-за. Ген муковісцидозу - муковісцідозний трансмембранний регулятор (МТР) кодує мембранний білок - муковісцідозний трансмембранний регулятор провідності (МТРП). Основна функція МТРП - створення регульованого циклічним 3,5-аденозинмонофосфату (цАМФ) хлорного каналу. Мутації в гені ведуть до зміни кількості або структури даного білка, що порушує транспорт іонів хлору і води через мембрани клітин епітелію ряду органів. Виділяється при цьому екзокріновимі залозами слиз зневоднюється, і в'язкість її підвищується. Це призводить до запалення і розмноженню інфекційних агентів (вторинна патологія). При муковісцидозі найбільш сильно уражаються легені (бронхи).

Передумовами для застосування генотерапії при муковісцидозі послужили позитивні результати, отримані на клітинних культурах. Введення тільки однієї копії нормального гена у клітку з дефектним геномом було вже достатньо для нормалізації іонного транспорту. Ще більш обнадіювало, що достатньо було "виправити" 10% загального числа клітин в монослое, щоб домогтися нормалізації транспорту хлору в усьому монослое (ймовірно, за рахунок обміну іонами між сусідніми клітинами). Виявилося, що особливо сувора регуляція функцій нормального чужорідного гена, що кодує білок МТРП, не потрібна: цей білок (при його надмірному синтезі) не токсичний.

Після докладних доклінічних досліджень генотерапія муковісцидозу була апробована в клініці. Нормальний ген у складі модифікованих аденовірусів доставлявся в клітини епітелію легенів за допомогою ліпосом. Однак результати генотерапії в клініці виявилися не настільки блискучими: з кількох сотень випадків тільки окремі досліди виявилися вдалими. Проте сам по собі перехід від експериментів в області генотерапії муковісцидозу до клініки є великим успіхом.

Висновок

Генотерапія поступово починає залучати все більшу увагу науково-популярних видань та ЗМІ. Кілька десятків технологій генотерапії різних захворювань пройшли апробацію на тисячі хворих і добровольцях у США, Англії, Франції та інших країнах. У ряді клінік випробування пройшли благополучно. Перша фаза клінічних випробувань, як відомо, спрямована на перевірку безпеки нового засобу (методу) лікування. Є повідомлення про декілька випадків виникнення лейкемії-подібних захворювань після клінічної апробації деяких технологій генотерапії. Відзначається, що у всіх таких випадках використовувалися вектори на основі ретровірусів. Повідомляється також про окремі випадки, коли введений ген експресуватися не настільки довго, як було заплановано.

Однак незважаючи на те, що перші випробування в клініці пройшли менш успішно, ніж очікувалося на основі даних доклінічних випробувань, а застосування деяких видів технологій генотерапії у їхньому сьогоднішньому вигляді тимчасово зупинено, в цілому ці випробування тривають і технології вдосконалюються. Тим більше що при безнадійному стані хворого лікар за згодою або на вимогу останнього може проводити випробування технологій навіть за певних сумнівах, що виникли в ході їх доклінічної апробації.

Список літератури

1. ru.wikipedia.org / wiki /

2. www.biotechprogress.ru

3. www.liv.ac.uk/ ~ sd21/tisscult/what.htm

4. www.old.pharmvestnik.ru/cgi-bin/statya.pl?sid=1280

5. www.oxbow.ru/?page_id=213

6. Єліне Н.П. Основи біотехнології / Н.П. Елин. - СПб.: Наука, 1995. - 600 с.

7. Молекулярні та клітинні аспекти біотехнології / під ред. С.Г. Інге-Вечтомова. - Л.: Наука, 1986. - 143 с.

8. Северин С.Е. Біохімія і медицина - нові підходи та досягнення / С.Є. Северин. - М.: Російський лікар, 1998. - 94 с.