Вітаміни В12 і В15

Фактор В

Дослідники з лабораторії Глаксо знайшли, що молекулу вітаміну можна акуратно розділити на дві частини короткочасним нагріванням з концентрованою соляною кислотою або, ще краще, з хлорним кислотою. При ретельно контрольованих умовах (наприклад, 5 хв при 65 °) амідні групи майже не піддавалися гідролізу і головними продуктами були, нуклеотид і незмінена інша частина молекули. Останній продукт зберігав мікробіологічну активність і виявився ідентичним природному фактору, виділеного з вмісту рубця жуйних. У присутності ціаніду розчини цієї речовини мали пурпурну забарвлення навіть при слабо кислої реакції середовища. Спектр поглинання був дуже подібний зі спектром діціанкобаламіна, так що в цьому стані речовина майже напевно містив дві залишку ціаніду, з'єднаних координаційної зв'язком з кобальтом. Однак у той час як діціанкобаламін мав кислотні властивості, нове з'єднання було нейтральним. Причина такої відмінності полягала в відщепленні кислого нуклеотидного залишку. Це спостереження по суті стало головною підставою для подання про вітамін B ₁₂ як внутрішньої солі.Ряд кислот, що утворюються при гідролізі амідних груп в факторі В, мав тієї ж відносною стабільністю в їх діціано-конфігураціі.Билі отримані вказівки на те, що існує 7 - я карбоксильна група, пов'язана не з аміаком, а через амін з нуклеотидом. Це підтверджувало більш раннє припущення про те, що амінопропіловий спирт служить містком між двома частинами молекули, будучи сполученим амідній зв'язком з одним із ланцюжків пропіонової кислоти в планарної групі і ефірним зв'язком - з фосфорною кислотою. У кислих розчинах (з рН приблизно менше 3) фактор У втрачає обидві групи ціаніду і веде себе як підстава. Відповідні кислоти ведуть себе подібним чином, так як карбоксильні групи не піддаються помітною іонізації. Тому всі речовини, що не містять нуклеотиду, можна відокремити від речовин, ще зберегли його.

Лужний гідроліз

Жорсткий лужний гідроліз призводить до відщеплювання 5,6-діметілбензімідазола і освіти ділактампента-і монолактамгексакарбонових кислот. При обробці вітаміну B ₁₂ перекисом водню і розведеною лугом на холоду і виходять мікробіологічно активні кислі продукти червоного кольору. Реакція полягає в гідролізі, що каталізується перекисом водню. Однак отримані кристалічні продукти, мабуть, являли собою суміші моно-і дикарбонових кислот, що утворилися в результаті м'якого гідролізу, з незміненим вітаміном B _12, який обумовлював їх біологічну активність. Під дією холодної розведеною лугу, мабуть, утворюються ті ж продукти, що і при м'якому кислотному гідролізі. Однак у присутності гарячої лугу реакція йде по-іншому. Якщо нагрівати вітамін B ₁₂ в розчині NaOH за відсутності кисню, то забарвлення стає коричневою, а потім набуває зеленуватий відтінок, це може вказувати на зменшення валентності атома кобальту, що супроводжується окисленням якийсь інший частини молекули. При доступі повітря колір знову стає червоним. Короткочасне кип'ятіння з лугом при доступі повітря дає в якості головного продукту нейтральне кристаллизующейся червоне речовина. Воно майже не відрізняються від вітаміну B ₁₂ по фізичним властивостям, але не володіє мікробіологічної активністю. Структура цього з'єднання була з'ясована головним чином шляхом рентгеноструктурного аналізу кристалів. Продукт, мабуть, містить лактамное кільце, має 2 загальних атома з кільцем У і що утворюється з ацетамідной ланцюга; інша частина молекули така ж, що і в самому вітаміні. Додавання тіогліколата натрію або ціаніду натрію до розчину вітаміну в основному захищає його від впливу лугу і кисню. Вважають, що реакція протікає за участю вільних радикалів. Похідна, що містить лактам, було названо дегідровітаміном B _12. Лактамное кільце надзвичайно стійке і при подальшому впливі лугу зберігається.
При гідролізі послідовно відщеплюються залишаються амідні групи і нуклеотид. Таким чином, виходять два ряди кислот - з нуклеотидом і без нуклеотиду, - але всі вони відрізняються від відповідних продуктів кислотного гідролізу.
Кінцевим продуктом лужного гідролізу є гексакарбоновая кислота, а не гептакарбоновая, як при кислотному гідролізі. Це пов'язано з участю однієї з потенційних кислотних груп у побудові лактамной кільця.
Основне значення цього кристалічного продукту розпаду полягає у використанні його для рентгеноструктурного аналізу.

Продукти окислення

Дослідження гідролізу дало цінні відомості про те, що можна було б назвати периферією молекули. Набагато важче виявилося вивчити хімічними методами структуру частини молекули, що безпосередньо оточує атом кобальту. Кембриджська група показала, що серед продуктів окислення вітаміну B ₁₂ не можна виявити аміду малеїнової кислоти, так що навряд чи можна було відносити вітамін до дійсних порфірину. Але ці дослідники виділили в досить великій кількості оксамовую кислоту.
Єдині азотвмісні продукти розщеплювання "ядра" молекули виділили у 1955 р. Фолкерс і співроб. Контрольоване окислення хроматом натрію в оцтовій кислоті призвело до утворення двох продуктів, зображених на малюнку 6 (1 і 2). Думали, що вони утворюються з угрупування, що має пірролідіновую, пірроліновую або пірроленіновую структуру (рис. 6, 3). Це були перші хімічні дані, що вказують на присутність пірролоподобной структури в молекулі, якщо не вважати більш ранніх даних по піролізу, що дозволяли припускати таку структуру. Трохи пізніше був виділений і відповідний продукт, що містить амідну групу (амід кислоти, представленої на рис. 6, 2). Це стало прямим хімічним підтвердженням місця розташування, принаймні, однієї з амідних груп.
При окисленні ціанкобаламін Н ₂ О ₂ в середовищі з рН менше семи спостерігається вихід продуктів, які мають антагоністичним біологічним дією для lactobacillus leichmannii, на відміну від ростового для Euglena gracilis.
При окисленні перманганатом калію відщеплюється синильна кислота, а також утворюються оцтова кислота, щавлева кислота і її амід, бутандіовая кислота, 2-метілбутандіовая і 2,2-діметілпропандіовая кислоти.

Відновлення вітаміну B ₁₂

При каталітичному гідруванні на платиновому каталізаторі ціанкобаламін приєднує п'ять атомів водню і відщеплює метиламін, кобальт переходить в двовалентне стан з освітою т. н. У _{12 r.} При тривалому відновленні і при використанні більш сильних відновників, таких як ацетат хрому при рН 9,5 або борогідридом натрію отримують так званий У _{12 s,} що містить одновалентних кобальт. Відновлення внесло разочаровивающе малий внесок в наші знання про будову вітаміну, і навіть тепер детальна структура продуктів відновлення ще достатньо не з'ясована. Обробка воднем в якості каталізатора або деякими іншими відновлювальними агентами викликає перехід забарвлення в коричневу і, нарешті, у сіро-зелену. Ці зміни, за винятком втрати ціаніду, оборотні при контакті з киснем повітря, причому утворюється вітамін B _12а. Питання про зміни валентності кобальту, що відбуваються при відновленні. Робота Бівена і Джонсона, що з'явилася після опублікування імовірною структури вітаміну, пролила певне світло на не вирішене ще питання про те, містить він 5 або 6 спряжених подвійних зв'язків.
Оборотне відновлення легко продемонструвати, додаючи до лужного розчину вітаміну B ₁₂ тиогликолевой кислоту. Червоне забарвлення повільно переходить в оранжево-буру; після струшування розчину в присутності повітря вона негайно ж знову стає червоною. В міру використання кисню знову повільно з'являється колір відновленого вітаміну B _12.
Ці зміни забарвлення можна повторно викликати майже до безкінечності: остаточний результат полягає в тому, що вітамін каталізує окислення тиогликолевой кислоти (мабуть, до дисульфіду) киснем повітря

Реакція з галогенами

Хлор знебарвлює розчин ціанкобаламін, інші галогени - ні. Продуктом хлорування є фіолетове кристалічна речовина. Енергійне хлорування вітаміну B ₁₂ давало продукт, що містить 30% хлору, природа його не була охарактеризована точніше. Петров і співр. описали ряд продуктів, що утворюються при обробці вітаміну хлором або хлораміном Т, які можна було розділити методом хроматографії. Ці речовини мали пурпурний колір, який при надлишку ціаніду в блакитний, і містили 2 атома хлору в молекулі. Вплив однієї молекули хлораміну Т або брому дає в якості головного продукту нейтральне кристаллизующейся речовина червоного кольору. За фізичними властивостями воно було дуже схоже з вітаміном B _12, але не володіло мікробіологічної активністю. Електрофорез і інфрачервона спектроскопія довели, що це був лактон; вважають, що його будова ідентично будовою лактами показаного на рис. 5, тільки замість NH слід поставити О. Освіта лактона, мабуть, пов'язано з проміжним утворенням іона карбону в активованому β-положенні кільця В. Йод діє на вітамін B ₁₂ тільки в лужних розчинах, і при цьому утворюються як лактам, так і лактон, відносні кількості яких залежать від концентрації лугу і йоду. Подальша обробка хлораміном Т або бромом вела до утворення пурпурних речовин, які ставали блакитними при надлишку ціаніду і містили в молекулі відповідно хлор або бром. Ці продукти не були повністю охарактеризовані, але схоже речовина, як прагнув при дії хлораміну Т на лактам (дегідровітамін B _12), було вивчено в Кембриджі, і виявилося, що воно містить тільки один атом хлору. Вважають, що хлор заміщав водень при мезоуглеродном атомі між кільцями В і С. Ця робота в поєднанні з іншими даними допомогла встановити, що в молекулі вітаміну є 6 спряжених подвійних зв'язків, а не 5, як передбачалося спочатку

Метилювання

При дії надлишку СН ₃ - HgJ на J Cbl в спиртовому розчині при температурі 65 ^о С протягом трьох годин можна отримати метилкобаламін з виходом близько 50%. Взагалі реакціями корріноідов з сильними нуклеофилами отримують відповідні органокорріноіди. Між диметилсульфатом і самим вітаміном B ₁₂ ніякої реакції не відбувається, тому що атом азоту бере участь у координаційній зв'язку з кобальтом. Цей зв'язок має бути спочатку розірвана шляхом перетворення вітаміну B ₁₂ в діціанкобаламін; навіть і після цього реакція залежить від значення рН. Утворений при цьому четвертинний азот обумовлює виникнення додаткової основної групи в молекулі діціаніда, яка в результаті цього, володіє нейтральною реакцією (а не кислої, як молекула діціанкобаламіна); ця структура стійка в кислих розчинах, так як метилювання перешкоджає утворенню координаційної зв'язку між N3 і Со . Ця реакція була використана для вивчення більш складних властивостей аналога вітаміну B ₁₂ - фактора III, який може бути метиловано або в будь-якому з двох положень або в обох одночасно.

Рентгеноструктурний аналіз

Вивчення вітаміну B12 методом рентгеноструктурного аналізу початку Дороті Ходжкін в Оксфорді у 1948 р., Як тільки були отримані перші кристали. Незалежно подібну ж роботу проводив Уайт у Прінстоні; пізніше обидві групи дослідників об'єднали свої сили. Трудомісткі обчислення на основі результатів вимірювання відображенні рентгенівських променів дозволили скласти карти електронної щільності в трьох вимірах. Поступово, в кілька послідовних етапів, у міру того як визначалося положення все більшого числа атомів у структурі, розрахунки уточнювалися. Вся програма роботи з вітаміном B ₁₂ і тими його аналогами, які були отримані, зажадала приблизно близько 10 млн. обчислень. Для цього на останніх етапах довелося використовувати електронні лічильні машини. Ніколи ще рентгеноструктурний аналіз не застосовувався для вивчення структури настільки складної молекули, і повний успіх цієї програми вивчення з'явився чудовим досягненням, дещо збентежили хіміків-органіків і, здається, здивував навіть самих фахівців з рентгеноструктурному аналізу. Як зауважила Дороті Ходжкін, "можливість записати хімічну структуру головним чином на підставі чисто кристалографічних даних про розміщення атомів в просторі - і до того ж для такої страхітливо складної молекули - це для будь-якого кристалограф щось схоже на мрію". Величезна перевага цього методу полягала в тому, що на відміну від хімічних методів він "працює" від центру до периферії. Іншими словами, щодо важкий атом кобальту з найбільшою точністю вказував положення найближчих до нього атомів, а саме атомів макрокільця. Коли робота наближалася до завершення, виявилося, що єдиними атомами, положення яких залишалося дещо сумнівним, були ті, для яких воно було з'ясовано Фолкерсом і його співробітниками в результаті вивчення продуктів окислення вітаміну. Обчислення, належали до самого вітаміну B _12, були на час відкладені, коли дослідники змогли отримати кристалічну гексакарбоновую кислоту. Це більш просте з'єднання несподівано легко піддавалося рентгеноструктурному аналізу, у зв'язку з чим і були досягнуті великі успіхи. На щастя, основні структурні особливості цієї речовини і самого вітаміну виявилися ідентичними, так що дослідження цих речовин взаємно доповнювали один одного. Однак вони в обох випадках незалежно призвели до досить рідкісної структурі макрокільця. Макрокільця містить 4 відновлених піррольних кільця з прямою α-α-зв'язок між кільцями А і D. Подальші уточнення в розрахунках стали можливими в результаті вивчення двох кобаламін, містять відносно важкі атоми, а саме похідних тіоціанат і селеноціанати; пізніше для цієї ж мети був використаний аналог вітаміну B _12, містив два атоми хлору на місці метильних груп у бензіміназола. Нарешті, з'ясувалася природа бічних ланцюгів, і можна було майже з повною впевненістю написати всю структурну формулу. Все, що залишилися сумніви були, мабуть, дозволені подальшими обчисленнями, що дозволили навіть встановити, що в макрокільця 6 подвійних зв'язків.

Стійкість

У літературі накопичилося багато даних про стійкість вітаміну B ₁₂ до дії як реактивів, так і лікарських препаратів; багато хто з цих даних можна тепер витлумачити, виходячи з будови та реактивності різних частин молекули вітаміну. Кристалічний ціанкобаламін у твердому стані стійкий навіть при дії температури 100 ° протягом кількох годин. За Березовському, при нагріванні кристалічного ціанкобаламін при 100 ° відбувається повільне розкладання. У водних розчинах він найбільш стійкий при рН від 4 до 6 (по Березовському до 7), у цих межах рН розчини можна стерилізувати автоклавуванням при 120 ° з втратою лише кількох відсотків активності. При pH 9 відбувається швидке розкладання (приблизно 90% на добу). Аквокобаламін менш стійкий, особливо в лужному розчині, але обидві речовини інактивуються приблизно на 90% протягом 1 години при 100 ° при рН 8. Нагрівання в сильно лужному розчині використовували для кількісного руйнування вітаміну B ₁₂ з метою контролю при деяких методах мікробіологічного визначення активності. Проте в неочищених препаратах деякі відновлюють речовини можуть чинити захисну дію. Нейтральні або злегка кислі розчини вітаміну B ₁₂ при кімнатній температурі в темряві зберігаються роками, тільки в дуже сильно розведених розчинах йде повільний гідроліз з утворенням невеликих кількостей чинник В. У сильно кислих і, особливо в лужних розчинах при кімнатній температурі відбувається повільний гідроліз до карбонових кислот . На світлі ціанід повільно відщеплюється і утворюється Оксікобаламін, але при дотриманні розчину в темряві відбувається зворотний процес. Тривалий вплив сонячного світла веде до незворотного руйнування. Характер дії відновників не завжди можна передбачити з упевненістю. Стверджують, що тіолові з'єднання в низьких концентраціях захищають вітамін від руйнування, і їх навіть використовують іноді з цією метою при мікробіологічних визначеннях, однак у великих кількостях вони самі можуть викликати руйнування вітаміну. Сульфіт також рекомендували застосовувати для захисту кобаламін, особливо оксікобаламіна. Аскорбінова кислота діє не так, як інші, відновники. Вона досить швидко руйнує вітамін B _12b, але майже не діє на вітамін B _12. Дане спостереження використовували при аналізі сумішей цих двох речовин, але такий метод придатний лише для порівняно чистих розчинів. У печінкових екстрактах міститься захисний фактор, яким виявилося залізо, інші метали, наприклад мідь, каталізують реакцію. У сухих лікарських препаратах вітамін B ₁₂ стійкий при розтиранні в порошок з хлористим натрієм або з манітом. Розчини можна стабілізувати фенолом, підданих подвійній перегонці, хоча домішки, що містяться іноді в фенолу, можуть викликати руйнування вітаміну. Спільне присутність тіаміну (вітаміну B ₁₎ і нікотинаміду (або нікотинової кислоти) веде до повільного руйнування вітаміну B ₁₂ в розчині. Залізо захищає вітамін В ₁₂ від взаємодії з нікотиновою кислотою

Механізм дії

Недолік в їжі вітаміну B ₁₂ призводить до макроцитарною мегалобластической анемії. Порушується робота нервової системи, спостерігається різке зниження кислотності шлункового соку. Втім, авітаміноз В ₁₂ може розвинутися навіть при повноцінному харчуванні, тому що для процесу всмоктування вітаміну в тонкій кишці обов'язкова наявність в шлунковому соку особливого білка - гастромукопротеина (фактор Касла). У повній відповідності з буквальним перекладом свого латинської назви, цей білок виділяється стінками шлунка, тими ж клітинами, які виділяють кислоту. Фактор Касла специфічно зв'язує вітамін В12. Точна роль цього фактора не з'ясована. Вважають, що в складі комплексу з гастромукопротеином вітамін всмоктується в тонкому кишечнику і надходить у кров портальної системи в комплексі з транскобаламіном I і II, при цьому чинник Касла гідролізується. Коли біохіміки звикли до думки, що вітамін В ₁₂ не просто специфічний антіперніціозний фактор, а один з вітамінів групи В, вони стали припускати, що він подібно до інших водорозчинних вітамінів виявиться кофактором принаймні в одній ферментної системі. Але всупереч сподіванням функції, приписувані вітаміну B ₁₂ різними дослідниками, виявилися настільки численними і різноманітними, що важко було уявити собі, як всі вони могли бути пов'язані з такою роллю кофактора. Тому почали шукати його основну функцію. Наприклад, здавалося ймовірним, що він якимось чином відповідальність за підтримання сульфгідрильних сполук у відновленому реактивному стані; він міг би, скажімо, "активувати" різні SH-ферменти, перешкоджаючи їх окислення в неактивні SS-форми. Або якщо він пов'язаний із синтезом білка, він був би необхідний для синтезу білкової частини (апофермента) ряду ферментів. Пізніші дослідження, особливо із застосуванням ізотопів, поставили під сумнів деякі з приписуваних вітаміну В ₁₂ функцій і висунули на перший план інші. Проте ряд новітніх результатів ще не підтверджено.

Ставлення до сульфгідрильних ферментам

Вплив концентрату вітаміну B ₁₂ на відновлення деяких SS-з'єднань в SH-форму вивчав у o1950 р. Дубнов на ферментних системах in vitro. Він висловив припущення, що відновленням гомоцистину в гомоцистеїн, легко приєднують метильную групу, можна, було б пояснити дію вітаміну B ₁₂ на синтез метіоніну. Підтримання глутатіону в восстановленномм стані могло б грати роль в активації SH-ферментів. Ці гіпотези були підкріплені подальшими спостереженнями. При рецидивах перніциозної анемії, а також у щурів, які отримують раціон з недоліком вітаміну В ₁₂ концентрація сульфгідрильних сполук (головним образ6м глутатіону) у крові нижче нормальної, і в обох випадках вона піднімається до норми або після введення вітаміну. Швидкість цієї реакції дозволяє думати, що це безпосередній результат дії вітаміну. Однак Жаффе зовсім не виявив такої дії у мишей. Згідно Лінг і Чоу та іншим авторам, при авітамінозі В ₁₂ порушено використання вуглеводів. Це могло б бути пов'язане з низькою концентрацією глутатіону двояким чином. Сульфгідрильні групи деяких гликолитических ферментів могли б окислюватися до неактивній SS-форми: зокрема, глутатіон є простетичної групою одного ключового ферменту - гліцеральдегид-3-фосфатдегідрогенази. Пізніше Дубнов піддав подальшій перевірці свою гіпотезу реактивації SH-ферментів, використавши покояться клітини мутанта Є. co li, що потребує вітаміні B _12. Він знайшов, що активність ряду таких ферментів спочатку була так само висока, як і в клітинах "дикого" штаму, але знижувалася в міру старіння культур і могла бути знову підвищена додаванням вітаміну B ₁₂ або глутатіону, причому набагато ефективніше було додавання їх обох

Обмін жирів і каротину

  Доброчинна дія вітаміну В ₁₂ на обмін жирів у тварин аналогічним чином приписували підтримання коферменту А в активному відновленому стані. У щурят, які отримують раціон з недоліком вітаміну B _12, організм не здатний синтезувати жири, а у дорослих щурів порушується використання жирів їжі так що тварини стають огрядними в результаті надмірного накопичення жиру. Вважають, що цей ефект лише частково пояснюється, дією вітаміну B ₁₂ на синтез метіоніну, в результаті якого, у свою чергу, збільшується кількість ліпотропних речовин - холіну та бетаїну. Встановлено, що вітамін B ₁₂ підвищує всмоктування каротину або перетворення його у вітамін А у щурів (на що вказує підвищене накопичення останнього в печінці); хоча і не впливає на накопичення готового вітаміну А. Механізм цієї дії ще неясний.

Участь вітаміну B ₁₂ в біохімічних відновних процесах

Стверджували, що вітамін В ₁₂ крім дії на сульфгідрильні з'єднання підтримує у відновленому стані інші важливі речовини. Так, Уілл і співр. встановили, що в плазмі хворих перніциозної анемією вміст аскорбінової кислоти знижений; крім того, при ін'єкції таким хворим аскорбінової кислоти вона швидко окислюється до дегідроаскорбінової. Після лікування вітаміном B ₁₂ ці явища зникають, а ін'єкції аскорбінової кислоти ведуть до підвищення її концентрації в плазмі. Чоу і співр. знайшли, що в печінці щурів з недостатністю вітаміну В ₁₂ загальний вміст діфосфопірідіннуклеотіда підвищено, але кількість його відновленої форми (ДПН-Н) знижений.
Ненормально високе відношення ДПН / ДПН-Н знижувалося вдвічі після введення вітаміну B _12. Було висловлено припущення, що вітамін B ₁₂ здатний грати роль відновника, коли його тривалентний кобальт відновлено до двовалентного стану.
Однак потрібні сильні відновники, щоб викликати цю реакцію, яка в присутності атмосферного кисню йде у зворотному напрямку.
Припущення про те, що з'єднання з білком могло б зрушити окислювально-відновний потенціал в область фізіологічних величин, не цілком переконливо, оскільки здатність зв'язувати білок після відновлення, можливо, втрачається.
Біосинтез метіоніну і серину
Метилкобаламін бере участь у реакціях синтезу метіоніну як кофактора. Заключним етапом синтезу метіоніну у бактерій, грибів, вищих рослин і тварин складається в перенесенні метильної групи від СН _3-ТГФК до сульфгідрильної групі гомоцистеїну. Існує два типи ферментів, що здійснюють синтез метіоніну - перший, незалежний від кобаламін, може використовувати в якості донора метильної групи тільки тріглутаматную форму СН _3-ТГФК. Другий тип ферментів, залежний від кобаламінових кофакторів, може використовувати як моно-, так і тріглутаматную форму СН _3-ТГФК. Для активації ферментів другого типу, крім того, потрібно S-аденозілметіонін (S - AdoMet). Останній необхідний для початкового метилювання кобаламина. Мутант Є. coli, використовуваний для визначення вітаміну В _12, здатний так само добре рости і при додаванні до мінімальної живильному середовищі метіоніну, тільки для оптимального зростання потрібно приблизно в 10000 разів більше метіоніну, ніж вітаміну. Очевидний висновок, що в клітинах цього організму вітамін діє як каталізатор синтезу метіоніну, був підтверджений експериментально. Однак для будь-якого іншого мікроорганізму, що потребує вітаміні B _12, цей вітамін не може бути замінений метіоніном, так що він, очевидно, здійснює у цих організмів якусь додаткову функцію.

Згодовуваних попередник	Радіоактивність метильного вуглецю метіоніну, μ с / г-атом		Підвищення біосинтезу метіоніну,%
	У присутності віт. У 12	У відсутність віт. У 12
При необмеженій споживанні їжі
α-14С-Гліцин (2%) β-14С-Серін (0,7%) 14С-Форміат натрію (0,1%)	156 81,5 33,8	95,5 47,4 20,0	63 72 69
При обмеженому споживанні їжі
14С-Форміат натрію (0,1%)	32,0	28,6	12

Ранні експерименти з вивченням зростання курчат і щурів також показали, що вітамін B ₁₂ зменшує потребу в метіонін, особливо при введенні гомоцистеїну. Спочатку це було витлумачено як дію вітаміну на трансметілірованія, тобто на передачу лабільною метильної групи від холіну або бетаїну до гомоцистеїну з утворенням метіоніну. Точно так само вітамін B ₁₂ може, принаймні частково, замінювати холін для курчат, щурів і поросят-сисунів. Ряд досліджень (деякі з них з використанням ¹⁴ С) показав, що вітамін B ₁₂ не робить ніякого впливу на трансметілірованія, але бере участь у прямому синтезі лабільною метильної групи з більш окислених попередників - таких, як форміат, α-вуглець гліцину або β-вуглець серину. Труднощі тлумачення результатів, одержуваних на інтактних тварин, добре ілюструє таблиця 1. При авітамінозі В ₁₂ сильно погіршується апетит і спостережувані результати часто можуть бути обумовлені просто зниженим споживанням їжі в порівнянні з контрольними тваринами. Цю неясність можна усунути, обмеживши споживання їжі контрольними тваринами до рівня, характерного для авітамінозних тварин (метод "парного годування"). Підтвердження даних для поросят і курчат в дослідах з ¹⁴ С-Форміат і ¹⁴ С-серин отримали Джонсон і співр. Однак при використанні міченого формальдегіду результат виявився несподіваним: інтенсивність включення мітки в метильні групи метіоніну і холіну у курчат з недостатністю вітаміну B ₁₂ виявилася значно підвищеною. Є грунтовні дані на користь того, що новостворені метильні групи з'являються в метіонін, але потім в результаті трансметілірованія вони можуть опинитися в холине або креатині. Ці висновки ніхто не заперечував, але деякі дослідження дозволяли припустити, що, крім того, при недостатності вітаміну B ₁₂ у щурів активність трансметілази в печінці знижена. Значення вітаміну B ₁₂ в перенесенні груп з одним атомом вуглецю майже нероздільно переплітається з функціями фолієвої кислоти (точніше, похідних тетрагідрофолевой кислоти). Ці процеси переносу, які можуть відбуватися на трьох різних рівнях окислення, схематично представлені на схемі 2, показані також пов'язані з ними реакції окислення і відновлення. Деякі з цих процесів переносу відбуваються в декілька етапів (не показаних на схемі 2) це, безумовно, відноситься до перетворення гомоцистину в метіонін, і майже немає сумнівів, що для реакції в цілому необхідні обидва вітаміну. Можлива послідовність етапів показана на схемі 3. Як вже говорилося, вітаміну B ₁₂ приписували участь у відновленні гомоцистину до гомоцистеїну - акцептора метильної групи. Проте подальші досліди з міченими амінокислотами показали, що вітамін, можливо, не потрібний для цього відновлення. Якийсь похідне фолієвої кислоти, безсумнівно, бере участь в саме перенесення радикала з одним вуглецевим атомом. Тоді єдина функція, що залишається для вітаміну B _12, полягає у відновленні цієї групи в метильную групу метіоніну - якщо тільки вітамін не діє лише непрямим чином, сприяючи, наприклад, синтезу ферментів.
У всякому разі, синтез метіоніну не може бути єдиною біохімічної функцією вітаміну В ₁₂ у вищих тварин, так вони гинуть від його недостатності навіть при великій кількості метіоніну і холіну в їжі. Зіставлення даних, наведених на користь і проти участі вітаміну B ₁₂ під взаємоперетвореннях гліцину і серину, призводило скоріше до висновку про відсутність впливу вітаміну, але робота Злодія і співроб. розкрила нову сторону проблеми.
Ці автори не виявили зниження загального синтезу серину з ^α-14 С-гли-цина в зрізах печінки індички, але спостерігали значне зменшення включення ¹⁴ С в положенні 3. Вони пояснюють це тим, що вітамін B ₁₂ діє на етапі відщеплення від гліцину радикала з одним вуглецевим атомом, перенесення якого здійснює тетрагідрофолевая кислота. Якщо це підтвердиться, то, мабуть, такий же механізм міг би діяти у синтезі метильної групи метіоніну de novo.
Синтез нуклеїнових кислот
З самого початку робіт у цій галузі вважали майже безсумнівним, що вітамін B ₁₂ стимулює синтез дезоксирибонуклеїнової і, ймовірно, рибонуклеїнової кислот. Молочнокислі бактерії, що використовуються для визначення вітаміну B _12, майже так само добре ростуть при заміні його великими кількостями тимідину або інших дезоксірібонуклеозідов; простіше за все це можна пояснити тим, що вітамін B ₁₂ бере участь в якомусь етапі синтезу ДНК. З'ясувалося, що дія вітаміну пов'язано із синтезом дезоксірібозного компонента ДНК. Деякі вчені вважають, що в деяких бактерій вітамін B ₁₂ стимулює синтез не тільки ДНК, але і РНК. Однак інші мікроорганізми, які потребують вітаміні B _12, не здатні рости на дезоксірібозідах, і немає даних про те, що у цих видів вітамін контролює синтез ДНК. У мутанта Є. coli рівномірно мічений уридин перетворювався на тимін не тільки в присутності вітаміну B _12, але і в присутності метіоніну; крім того, у нього не спостерігалося перетворення міченої рибози в дезоксірібозід. Тим не менше була тенденція переносити висновки з дослідів з молочнокислими бактеріями також і на вищих тварин, включаючи людину. Цьому сприяв факт енергійної регенерації еритроцитів і зростання епітелію мови після лікування рецидивів перніциозної анемії ціанкобаламін. Тут дійсно повинен відбуватися швидкий синтез нуклеїнових кислот, але можливо, що цей процес пригнічується при недостатності вітаміну, так як для проліферації клітин необхідні й інші компоненти. Крім того, активність кісткового мозку при перніциозної анемії аж ніяк не пригнічена; справді, кругообіг компонентів гема приблизно втричі перевищує нормальний рівень, але більша частина цієї активності марна для утворення нових еритроцитів. Ряд дослідників відзначає знижений вміст ДНК, РНК або обох нуклеїнових кислот в організмі тварин при авітамінозі В _12; тлумачення таких результатів ускладнюється тим, що авітамінозна тварини споживають менше їжі. О `Делл і Бруммер використовували радіоактивний фосфат і знайшли, що позбавлення як вітаміну B _12, так і їжі взагалі дійсно надає подібне вплив на синтез нуклеїнових кислот. Глейзер і співр. встановили, що в мегалобластической кістковому мозку людини ставлення урацил / тимін і відповідно ставлення РНК / ДНК значно вище нормального. Після лікування вітаміном B ₁₂ або фолієвої кислотою обидві величини швидко зменшувалися до норми. Запропоноване пояснення полягало в тому, що вітамін B ₁₂ каталізує синтез компонента ДНК - тиміну; метилювання урацилу з утворенням тиміну формально аналогічно метилюванні гомоцистеїну з утворенням метіоніну - реакції, яку, як відомо, стимулює вітамін B _12. Проте в цьому дослідженні, на жаль, визначали відносні, а не абсолютні кількості, між тим більш рання робота Девідсона і вказує на можливість іншого пояснення результатів. Ці автори знайшли, що в мегалобластической кістковому мозку вміст ДНК і особливо РНК ненормально підвищений у розрахунку як на 1 г, так і на 1 клітину; після лікування кількість обох кислот зменшувалася (правда, кількість РНК - швидше), що й повинно було вести до зміни відносин, знайденому Глейзером і його співробітниками

Таблиця 2. Вплив вітаміну В12 на синтез нуклеїнових кислот
Пізніше в дослідах з ізотопами стали шукати більш прямих даних. Досліджували, наприклад, вплив вітаміну B ₁₂ на включення радіоактивного фосфору в нуклеїнові кислоти. Вітамін B ₁₂ стимулював включення його до фракції ДНК кишечника і селезінки, але не печінці і в той же час не впливав на радіоактивність РНК. Джонсон і співр. використовували ще більш прямий підхід до проблеми: вони вивчали включення ¹⁴ С з різних попередників (Форміат, формальдегіду, гліцину, серину і глюкози) у нуклеїнові кислоти печінки свиней, курей та щурів; у щурів вони визначали також перетворення деяких з цих попередників у алантоїн. Ні в одному випадку не можна було виявити скільки-небудь значного впливу вітаміну B ₁₂ на радіоактивність ДНК, РНК або алантоїн. Якщо ці дані будуть підтверджені, то важко буде визнавати зв'язок між вітаміном В ₁₂ і синтезом нуклеїнових кислот у вищих тварин. Мистри і Джонсон в дослідах на курях дійсно встановили, що вітамін B ₁₂ підвищує синтез сечової кислоти з Форміат, метильної групи метіоніну або β-вуглецевого атома серину, але не з формальдегіду або гліцину, а проте вони трактують це не як результат прямої дії на біосинтез пуринів , а як можливий вплив на якусь окислювальну реакцію в обміні сполук з одним вуглецевим атомом.
Білковий обмін
Очевидно, що завдяки своєму впливу на синтез метіоніну вітамін B ₁₂ надає якусь дію на білковий обмін. Наприклад, можна очікувати, що ціанкобаламін буде поліпшувати використання білка з раціонів, в яких цієї амінокислоти недостатньо. Таким чином пояснювали деякі із зазначених вище доброчинних ефектів вітаміну. Значне збільшення у вазі тіла, навіть якщо вона пов'язана зі збільшенням кількості не лише жиру (як часто буває), але й білка, зазвичай можна пояснити просто підвищеним споживанням їжі тваринами, які отримують вітамін B _12. Не було виявлено ніякого впливу вітаміну B ₁₂ на баланс азоту і ефективність використання білків у щурів. Різні дослідження, однак, вказували на більш пряму роль цього вітаміну в синтезі білка. Так, було встановлено, що у щурів з гіпертиреозом (гіперфункцією щитовидної залози) вітамін B ₁₂ сприяє утриманню азоту. У курей при недостатності вітаміну B ₁₂ концентрація амінокислот в крові підвищена, а білків у плазмі - знижена; у людини також показано зворотне відношення між концентраціями амінокислот і вітаміну B ₁₂ в крові, що пояснюється стимулюючим дією вітаміну на синтез білків. Повідомляється про надмірне виведення з сечею амінокислот, особливо лізину (але також і таурину) при загостренні перніциозної анемії і дегенерації спинного мозку. Порушення нормального обміну тирозину і триптофану могло б вести до надмірного виділення фенольних речовин, теж зазначеного при перніциозної анемії, і, можливо, до утворення токсичних речовин, що викликають гемоліз, яким іноді супроводжується це захворювання, і всі ці обмінні порушення швидко зникають після введення вітаміну B ₁₂ . Було відзначено, що при дегенерації спинного мозку, що часто супроводжує Перніціозна анемію, уражаються деякі великі аксони, нормальний стан яких підтримується швидким оновленням білка. Тому дослідники припустили, що вітамін B _12, специфічно излечивающий це стан, непрямим чином контролює синтез білка; вважаючи, що пряма дія вітаміну направлено на синтез нуклеїнових кислот, вони зв'язали своє припущення з гіпотезою про те, що РНК служить "шаблоном" для синтезу білка ; їх дані було б логічніше витлумачити на користь прямої дії вітаміну B ₁₂ на синтез білків. Вивчався вплив вітаміну B ₁₂ на включення міченого серину чи міченої глюкози в білки печінки і в деякі окремі амінокислоти у свиней і щурів. У всіх дослідах отримані величини були помітно нижче у тварин з авітамінозом. Дослідники наводять міркування на користь того, що це не було наслідком одного лише зниженого споживання їжі. Дані спостереження були доповнені дослідженнями, проведеними in vitro на препаратах мікросом з печінки та селезінки нормальних щурів та щурів з авітамінозом. Як показано, між цими групами тварин виявилися великі відмінності у включенні мічених амінокислот; крім того, при додаванні вітаміну B ₁₂ до препаратів мікросом, отриманих від тварин з авітамінозом, включення амінокислот помітно зростала. Учені пішли далі і показали, що в надосадової рідини після центрифугування мікросом печінки знаходиться містить вітамін B ₁₂ «рН5-фермент», що каталізує включення мічених амінокислот у білок. Цікаво було б з'ясувати, чи не чи має ферментативною активністю комплекс вітаміну B12 з пептидом, виділений раніше з печінки. Пізніше було показано, що «рН5-фермент» містить велику частину вітаміну В _12, спочатку знаходився в мікросомах печінки. Цей фермент піддали подальшому фракціонування; він, мабуть, каталізував як активацію амінокислот аденозинтрифосфату, так і їх подальше включення в білкову фракцію мікросом. Крім того, обидва процеси придушувалися антагоністами вітаміну В ₁₂ містять залишок аніліди замість однієї з амідних груп. Дослідники висловили гіпотезу, що вітамін В _{12-фермент} діє як активатор-переносник: він переносить амінокислоти (після активації їх карбоксильних груп аденозинтрифосфату) на "шаблон", можливо, шляхом транспептидирования, в якому беруть участь 6 карбоксамідних груп молекули вітаміну. Деякі вчені наводять міркування, що дозволяють припускати, що деякі з карбоксамідних груп є біохімічно активними частинами молекули. Іншим дослідникам поки не вдалося підтвердити ці дані, вони вказують також, що включення амінокислот у білок мікросом не обов'язково являє собою нормальний синтез білка. Таким чином, ці результати не можна вважати остаточним доказом прямої дії ціанкобаламін на білковий синтез. Однак це приваблива гіпотеза; контролем синтезу апоферментом можна було б пояснити вплив вітаміну В ₁₂ на ряд, здавалося б, не пов'язаних між собою ферментних систем. На користь цього можна навести й інші дані; різні дослідники стверджували, що недостатність вітаміну B ₁₂ у щурів веде до зменшення вмісту в їх печінці деяких ферментів, а саме трансметілази, рибонуклеази, цитохромоксидази і різних дегідрогеназ. Інші автори встановили, що при відсутності вітаміну B ₁₂ не відбувається регенерації тканини печінки після часткової гепатектомії. Всі ці дані свідчать на користь прямого або непрямого впливу вітаміну на синтез білка.
Інші можливі функції
Недолік ціанкобаламін в їжі веде до підвищеного виділення тіоціанат, у зв'язку з чим була висунута гіпотеза, заснована на передбачуваній лабільності груп ціаніду і конкуренції за ціанід між оксікобаламіна і ферментом роданезой. Тісний взаємозв'язок між функціями фолієвої кислоти і ціанкобаламін призвела до припущення про те, що останній каталізує перетворення фолієвої кислоти в "цітроворум-фактор" або якусь іншу активну форму; переконливих експериментальних даних на користь цього, мабуть, немає. Цікаві взаємини, мабуть, існують також між вітаміном B ₁₂ та пантотенової кислотою. Деякі дослідники стверджували, що в дослідах з годуванням курей кожен з цих факторів знижував потреба в іншому. Еванс і співр. виявили зменшення вмісту пантотенової кислоти в печінці після введення вітаміну В ₁₂ курям з авітамінозом і припустили, що вітамін мобілізує печінкові резерви пантотенової кислоти. Інші дослідники підтвердили цей взаємозв'язок і відзначили підвищений вміст вітаміну B ₁₂ в організмі щурів з недостатністю пантотенової кислоти. Гершоф і співроб. довели наявність взаємозв'язку між тироксином, магнієм і вітаміном B _12. Як магній, так і вітамін B12 частково знімають ряд ефектів введення тироксину, втрату вітаміну B ₁₂ тканинами, пригнічення росту, роз'єднання окислення і фосфорилювання, зміна білкових фракцій сироватки. Ці результати ще чекають свого пояснення. «Кінця шляху ще не видно, але є підстави сподіватися, що скоро ми будемо знати про механізм дії вітаміну B12 більше, ніж ми знаємо про дію деяких інших вітамінів, відкритих набагато раніше».
Деякі У _{12-залежні} ферменти
В 12-коферменти численні і різні. Вони відрізняються тим, що містять два типи лігандів: метильную групу і 5 `-дезоксіаденозін. Перетворення вільного вітаміну В12 у кофермент відбувається у присутності специфічних ферментів і за участю в якості кофакторів ФАД, відновленого НАД, АТФ та глутатіону. При утворенні 5-дезоксікобаламінового коферменту АТФ піддається незвичайного розпаду з відщепленням метаболізмі препаратутрифосфатні залишку за аналогією з реакцією синтезу 5-аденозілметіонін з метіоніну і АТФ. Вперше В12-коферменти були виділені Г. Баркером із співробітниками у 1958 р. з мікробів. Хімічні реакції з участю В12-коферментів поділяють на дві групи: реакції трансметілірованія та ізомеризації. У реакціях першої групи коферменти грають роль проміжних переносників метильної групи. До таких реакцій відносяться, наприклад, синтези метіоніну і ацетату. Гомоцистеїн під впливом метилкобаламина і тетрагидроилглутаматметилтрансферазы у присутності відновленого ФАД і N ^5-СН _3-ТГФК перетворюється на метіонін. Метильная група N ^5-СН _3-ТГФК переноситься спочатку на активний центр ферменту, потім на гомоцистеїн. До другої групи реакцій відноситься ізомеризація L-метілмалоніл-КоА в сукцініл-КоА.
Діолдегідратаза
Наведемо спочатку найважливіші дані, отримані за останні роки при дослідженні діолдегідратази, тобто ферменту, який каталізує перетворення етандіола-1, 2, і пропандіолу-1, 2, відповідно, в оцтовий альдегід пропіонової альдегіди. Виявилося, що один і той же фермент здатний каталізувати перетворення і етандіола-1, 2 і пропандіолу-1, 2 у відповідні альдегіди. Примітною особливістю цього ферменту, як і всіх інших аденозилкобаламін-залежних ферментів, було те, що закінчення реакції супроводжується деструкцією і вивільненням коферменту з фермент-коферментной комплексу. Діолдегідратаза являє собою білок з мовляв. масою 250000 з єдиним активним центром містить аденозилкобаламін. Хроматографія дозволяє розділити фермент на дві субодиниці з різними молекулярними масами. Кожна з субодиниць неактивна, рекомбінація їх приводить до відновлення активності. Дуже важливим і, мабуть, загальною властивістю всіх аденозилкобаламін-ферментів, є чутливість діолдегідратази до сульфгідрильних інгібіторів. Освіта потрійного ферментного комплексу (апофермент-аденозилкобаламін-пропандіол-1, 2) повністю захищає фермент від дії ртутьвмісних інгібіторів. Це дозволяє стверджувати, що HS-група (чи групи) ферменту може мати велике значення для прояву біокаталітичний активності. Важливо підкреслити, що захищає дією, крім аденозилкобаламін, володіють і інші кобаламін (CN-кобаламін, метилкобаламін), введення яких в ферментний комплекс замість коферменту призводить до його інактивації. Тим не менш розщеплення такого комплексу після обробки SH-з'єднанням і подальша реконструкція з аденозилкобаламін знову відновлює активність. Вивчення хімічної модифікації цього ферменту виявило велике значення різних амінокислотних залишків в активному центрі ферменту. Так виявилося, що один залишок аргініну на міль ферменту є необхідним для здійснення каталітичної активності діолдегідратази. Нарешті, недавно було продемонстровано значення іншої основної амінокислоти - лізину для прояву ферментативної активності. Залишок лізину, важливий для забезпечення активної олігомерної структури ферменту і зв'язування аденозилкобаламін, локалізована в низькомолекулярної субодиниці. Залишки основних амінокислот забезпечують іонне взаємодія між субодиницями.
Гліцеролдегідратаза
Інший фермент, що каталізує перетворення віцінальних гликолей в альдегіди - гліцеролдегідратаза або гліцеролгідроліаза відповідальний за изомеризацию гліцерину в β-оксипропіонова альдегід і продукується як деякими штамами Klebsiella р., Так і Propionibactereciae. Кофакторами, необхідними для прояву активності гліцеролдегідратази, є аденозилкобаламін і К ^+. Очищення ферменту з К l. р. призвела до виділення ферментного комплексу з мовляв. масою 188000, що містить дві субодиниці різного розміру і 1 моль аденозилкобаламін на 1 моль ферменту. Менша субодиниця з мовляв. масою 22 000 в свою чергу розпадається на два білки з мовляв. масою близько 12 000. Самозбірка субодиниць в ферментному комплексі промотуючу субстратом - гліцерином, аденозилкобаламін і іоном К ^+. Цікаво, що іон Na ⁺ інгібує активність ферменту і жодна з субодиниць окремо не здатна зв'язувати аденозилкобаламін. Аналогічно діолдегідратазе, гліцеролдегідратаза інгібується сульфгідрильними інгібіторами, причому в дослідах з обробкою субодиниць і подальшої складанням було показано, що менша субодиниця після обробки ще зберігає 25% від початкової активності, в той час як більша повністю її втрачає.
Етаноламін-амміакліаза
Фермент, що здійснює перетворення етаноламіну в оцтовий альдегід аміак - етаноламін-аміак-ліази - був описаний в 1965 р, очищений і виділений у гомогенному стані в 1968 р. Цей аденозилкобаламін-фермент інтенсивно досліджувався в роботах Бебіора і Ейбіліса. Підсумки вивчення ферменту можна підсумувати таким чином: виявилося, що, на відміну від діолдегідратази, єдиним субстратом етаноламін-аміак-ліази є етаноламін. Пізніше було з'ясовано, що L-2-амінопропанол також може перетворюватися на пропіонової альдегід і аміак. Однак це перетворення супроводжується необоротним розщепленням кофермент. При реакції NH _2-г py пп a завжди переміщається від С2 до С1 (тобто до атома, з яким пов'язана ОН-група). У дослідах з міченим ¹⁸ Про Н ₂ О було показано, що гідроксил при С1 завжди залишається в продукті. Тим самим був виключений механізм утворення ацетальдегіду через проміжний імін, гідроліз якого обов'язково привів би до включення мітки в продукт. Спостережуваний у всіх аденозилкобаламін-залежних реакціях перенесення водню С1 → С2 був виявлений і в цій реакції. Досліди з енантіомером багаторазово міченого субстрату - 2-аміно-[2 ² H, 2 ³ Н]-етанолу свідчили про рацемізації продукту (ацетальдегіду). Незважаючи на те, що прямих доказів переміщення NH _2-групи від С2 до С1 не було отримано, процес перетворення етаноламіну в оцтовий альдегід аміак описується за аналогією з іншими реакціями. Фермент являє собою досить великий білок з мовляв. масою 520000. У пятімолярном розчині гуанидин-НС l він дисоціює - на субодиниці з мовляв. масою 50000. Показано, що фермент містить два незалежних активних центру. Подібно діолдегідратазе фермент активується одновалентними катіонами К ⁺ і NH ₄ ⁺ і інгібується сульфгідрильними інгібіторами.
Аденозилкобаламін-залежні мутази
Наступну групу аденозилкобаламін-ферментів, складають мутази, каталізують перегрупування вуглецевого скелета і призводять до оборотних перетворенням субстратів з розгалуженою ланцюгом у з'єднання з прямою ланцюгом.
Серед цих ферментів добре вивчені два - глутаматмутаза і метілмалоніл-СоА-мутаза.
Глутаматмутаза
Фермент, що каталізує перетворення L-глутамату в L-трео-β-метіласпартат, був виділений, з Clostridium tetanomorphum. Показано, що численні фотосинтезуючі мікроорганізми також містять глутаматмутазу. Фермент, крім аденозилкобаламін, потребує SH-з'єднанні, проте, на відміну від діолдегідратаз та інших аналогічних ферментів, для здійснення каталітичної активності не потрібні одновалентні катіони. Фермент високоспеціфічен щодо структури субстратів. Ні аналоги глутамінової кислоти, ні аналоги β-метіласпарагіновой кислоти (як, наприклад, β-етіласпартат) не є субстратами мутази. Досліди з очищення ферменту дозволили встановити суб'едінічная структуру і цього аденозилкобаламін-залежного ферменту. Були отримані в гомогенному стані дві субодиниці, які були названі S - і Е-білками. Кожен з білків не мав порізно активністю. Рекомбінація їх і взаємодія з коферментом приводили до відновлення активності. Першим був очищений Е-білок. Визначення молекулярної ваги показало, що це досить великий білок з мовляв. масою близько 128 000. На відміну від ферментів, розглянутих вище, додавання кобаламін не захищало Е-компонент глутаматмутази від інактивації в розчині. Е-компонент пов'язував 1 моль аденозилкобаламін, а в присутності семикратного надлишку S-компоненту додатково пов'язував ще один моль кофермент. Компонент S після очищення, як виявилося, мав набагато меншою мовляв. масою 17000 і, мабуть, містив важливі для прояву ферментативної активності SH - групи. Титрування S-білка сульфгідрильними реагентами показало, що на 1 моль білка припадає п'ять SH-груп. Примітною особливістю компонента була його здатність до димеризації в присутності О _2. Розщеплення димеру здійснювалося обробкою останнього яких-небудь RSH-з'єднанням. Це свідчило про освіту міжмолекулярної дисульфідного містка. Інактивація S-білка за допомогою AsO ₂ ^- доводила наявність в активному центрі принаймні однієї з двох віцінальних тіольних груп.
Метілмалоніл-СоА-мутаза
Інший аденозилкобаламін-залежний фермент, що здійснює перегрупування вуглецевого скелета метілмалоніл-СоА в сукцініл-СоА був також спочатку виділений з мікроорганізмів, а потім з тканин ссавців. Виявилося, що цей кобаламін-залежний фермент виконує метаболічно важливу роль на шляху перетворення пропіоніл-СоА в сукцініл-СоА. Схема цієї ділянки метаболізму включає 3 ферменту: біотин-залежну карбоксилазою, рацемазу, що перетворює D-метілмалоніл-СоА в L-ізомер і розглянуту кобаламін-мутазу. Після очищення метілмалоніл-СоА-мутази виявилося, що це субодиничний фермент з мовляв. масою 124000, розщеплюється на два компоненти з мовляв. масою 61 000 та 63000. Виділена з печінки вівці метілмалоніл-СоА-мутаза представляє собою окрашений в помаранчевий колір білок з мовляв. масою 165000. Фермент пов'язував 1 моль аденозилкобаламін на 75 тисяч 2-метіленглутаратмутаза Наступний подібний за дії аденозилкобаламін-залежний фермент-це 2-метіленглутаратмутаза, що каталізує оборотне перетворення між 2-метіленглутаратом і 2-метилен-З-метілсукцінатом. Фермент був виділений з мікробіологічних джерел при вирощуванні Clostridium на середовищах, що містять нікотинову кислоту. Визначення молекулярної маси частково очищеного препарату дало величину 170000. Обробка йодацетатом призводить до втрати активності, що, очевидно, свідчить про наявність важливих для каталізу SH-груп. Дія AsО ₂ ^-, однак, не виявило присутності віцінальних дітіольних груп.