Пензенська ДЕРЖАВНИЙ ПЕДАГОГІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ В.Г. БЕЛІНСЬКА
На правах рукопису
Фірстова Наталія Вадимівна
Вплив попередників ЛЕЙ-енкефалінів НА АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМІНУ РЕГУЛЯТОРНИХ ПЕПТИДІВ головного мозку і периферичних ОРГАНІВ ЩУРІВ У НОРМІ І ПРИ емоційно-больового стресу
03.00.04 - Біохімія
Дисертація на здобуття
наукового ступеня кандидата
біологічних наук
Науковий керівник
кандидат біологічних наук
професор Генгін М.Т.
Пенза - 1999
ЗМІСТ
СПИСОК СКОРОЧЕНЬ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... .5
ВСТУП ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... .6
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ ... .. ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 11
1.1. Опіоїдні пептиди та фізіолого-біохімічні аспекти їх дії ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 11
1.2. Обмін регуляторних пептидів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... .. 18
1.2.1. Біогенез нейропептидів ... ... ... ... ....................................... ... ... ... .18
1.2.2. Механізми регуляції активності ферментів обміну нейропептидів .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ... ... ... .. ... ... ... .. 30
1.3. Опіоїдні пептиди при дії стресових факторів .. ... ... ... 34
1.4. Ферменти обміну нейропептидів при стресі ... ... ... ... ... ... ... ....... ... 41
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ... .... ... ... ... ... 48
2.1. Матеріали дослідження ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... .... 48
2.2. Методи дослідження ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... .. 49
2.2.1. Схема введення попередника лей-енкефаліну ... ... ... ... ... ... 49
2.2.2. Моделювання гострого емоційно-больового стресу ... ... ... .49
2.2.3. Метод визначення активності карбоксипептидази Н ... ... .. ... ... 50
2.2.4. Метод визначення активності ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ... ... ... 51
2.2.5. Метод визначення активності ангіотензинперетворювального ферменту ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .51
2.2.6. Методи визначення активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ in vitro ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... .. 52
2.2.7. Метод визначення білка за Лоурі ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... 52
2.2.8. Статистична обробка результатів дослідження ... ... ... ... ... .52
РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ... ... ... ... ... ... .... ... ... ... ... .53
3.1. Регіональне та тканинне розподіл ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ у самців щурів .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... 53
3.1.1. Розподіл активності ВПП ... ... ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... 53
3.1.2. Розподіл активності АПФ ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ... ... ... 54
3.1.3. Розподіл активності ФМСФ-інгібіруемой КП ... ... ... ... ... 55
3.2. Дослідження впливу гострого емоційно-больового стресу на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази та АПФ ... ... 56
3.2.1. Активність ВПП у головному мозку надниркових і насіння-ках щурів при дії гострого емоційно-больового стресу ... ... .57
3.2.2. Активність ФМСФ-інгібіруемой КП в головному мозку надниркових і сім'яниках щурів при дії гострого емоційно-больового стресу ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... .... 60
3.2.3 Активність АПФ в головному мозку надниркових і сім'яниках щурів при дії гострого емоційно-больового стресу ... ... .... 62
3.3. Дослідження впливу попередника лей-енкефаліну на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ ... .. ... ... ... ... ... ... ... 65
3.3.1. Активність ВПП у головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів при введенні лей-енкефалінів-арг ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 67
3.3.2. Активність ФМСФ-інгібіруемой КП в головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів при введенні лей-енкефалінарг .. ... ... 69
3.3.3. Активність АПФ в головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів при введенні лей-енкефалінів-арг ... ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... ... 72
3.4. Дослідження впливу лей-енкефалінів-арг на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ in vitro ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... .. ... .. 74
3.5. Дослідження вплив лей-енкефалінів-арг на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази та АПФ у щурів на тлі гострого емоційно-больового стресу .......... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... 75
3.5.1. Активність ВПП при введенні лей-енкефалінів-арг на тлі гострого емоційно-больового стресу .. ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... 77
3.5.2. Активність ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази при введенні лей-енкефалінів-арг на тлі гострого емоційно-больового стресу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... 80
3.5.3. Активність АПФ при введенні лей-енкефалінів-арг на тлі гострого емоційно-больового стресу ... ... ... ........ ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... 84
ГЛАВА 4. ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ ... ... ... ... 88
ВИСНОВКИ ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 114
ЛІТЕРАТУРА ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... 116
ДОДАТОК ... ... ... ... .... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..... 146
СПИСОК СКОРОЧЕНЬ
АКТГ - адренокортикотропний гормон
АПФ-ангиотензинпревращающий фермент
ГГНС-гіпоталамо-гіпофізарно-надниркова система
ГГБ-гісто-гематіческій бар'єр
ГЕБ-гематоенцефалічний бар'єр
ГЕМЯК - гуанидилэтилмеркаптоянтарная кислота
КП - карбоксипептидаза
ВПП - карбоксипептидаза Н
ПВДС (ДСІП) - пептид, що викликає дельта сон (дельта-сон інду-
цірующій пептид)
САС-симпато-адреналової системи
ФМСФ-фенілметілсульфонілфторід
ЕБС-емоційно-больовий стрес
ВСТУП.
Однією з найбільш актуальних проблем сучасної біології та медицини є дослідження впливу гострих стрес-факторів на організм. Особливий інтерес викликає вивчення молекулярних механізмів виникнення і розвитку стресу. Відомо, що короткочасне гостре стрессірованіе призводить до екстреної та генералізованої активації ряду фізіологічних систем, що беруть участь як у процесах розвитку (стрес-реалізують), так і в процесах гальмування (стрес-лімітуючі) стрес-реакції [4, 5, 21, 29, 33 , 116, 121, 125, 144, 145]. Провідна роль у регуляції функцій цих систем належить нейропептидів, речовин, виступаючим в організмі в ролі нейромедіаторів, нейромодулятора і гормонів [126, 134, 204, 221, 258]. У відповідь на стрес в першу чергу залучаються пептиди гіпофіза: адренокортикотропіну (АКТГ), b-ендорфін, пролактин [136]. Важливу роль в адаптації організму до стресу грають ендогенні біологічно активні пептиди - компоненти стрес-лімітуючих систем: речовина Р, пептид, що викликає дельта сон, енкефаліни [27, 28, 69, 107, 110, 135, 152, 241]. Однією з найбільш універсальних стрес-лімітуючих систем, які забезпечують адаптацію до змін, викликаних реакцією на дію екстремального чинника, є система ендогенних опіоїдних пептидів [14, 103, 104, 116, 125, 266]. Вираженим антистресовий дію мають, зокрема, енкефаліни [23, 69, 134, 140, 266]. Встановлено, що при дії стресу зміст опіоїдів у структурах мозку, крові і лікворі тварин збільшується [33, 34, 140, 243].
Рівень біологічно активних пептидів, а, отже, і ступінь реалізації відповідної реакції фізіологічних і біохімічних систем на вплив стрес-фактора значною мірою визначається активністю пептідгідролаз - ферментів, які беруть участь в освіті та / або деградації молекул регуляторних пептидів [20, 40, 71, 193 , 209, 212, 218, 241, 256, 262].
Нейропептиди синтезуються в організмі у вигляді неактивних високомолекулярних попередників. На заключних етапах процесингу регуляторних пептидів, що призводять до утворення їх активних форм, беруть участь карбоксипептидази-Б-подібні ферменти, що каталізують відщеплення залишків основних амінокислот - аргініну і лізину - з С-кінця попередників біологічно активних пептидів [39, 188, 192, 264, 268]. Одним з основних ферментів генезу таких нейропептидів як енкефаліни, речовина Р, АКТГ, окситоцин, вазопресин є карбоксипептидаза Н (ВПП) (Кф 3.4.17.10) [39, 40, 63, 68, 192, 264]. Нещодавно з'явилися відомості про участь в обміні регуляторних пептидів ферменту, активність якого інгібується фенілметілсульфоніл-фторидом - ФМСФ-інгібіруемой КП [49, 53]. Даний фермент володіє подібною з ВПП субстратної специфічністю, що ж стосується біологічної ролі ферменту, то це питання до цих пір залишається відкритим. Відомо, що рівень активних форм енкефалінів та інших нейропептидів в організмі контролюється також ангіотензинперетворюючого ферменту (АПФ) (Кф 3.4.15.1), які беруть участь як у процессингу, так і в деградації регуляторних пептидів [66, 180, 183, 196, 209, 259] . Однак, незважаючи на настільки важливу роль цих ферментів в організмі, багато аспектів прояву їх функціональної активності вивчені недостатньо. Практично відсутні відомості про ендогенних механізми регуляції активності цих ферментів, а також їх властивості при різних патологічних і функціональних станах організму.
Одним з видів впливу, який впливає на рівень нейропептидів в структурах мозку і периферичних тканинах і що призводить до екстреного підвищення адаптивних здібностей організму тварини, є гострий емоційно-больовий стрес (ЕБС) [37, 52, 70, 112, 145]. Збільшення синтезу і секреції багатьох регуляторних пептидів при розвитку стрес-реакції, поряд з ініціацією ряду адаптаційних механізмів, призводить до виснаження нейрогуморальних і ферментативних систем. У зв'язку з цим, однією з найбільш актуальних завдань функціональної біохімії і медицини є пошук шляхів корекції змін, що виникають у функціонуванні ряду фізіологічних систем при впливі гострих стрес-факторів. Найбільш сприятливим способом усунення та / або обмеження стрес-порушень є штучне підвищення активності ендогенних стрес-лімітуючих систем за рахунок екзогенного введення стрес-протективних речовин пептидної природи, зокрема енкефалінів [69, 116, 135]. Відомо, що вираженим адаптогенним дією володіє попередник лей-енкефаліну - лей 5-енкефалінів-арг 6 [69, 135] Введення ззовні компонентів стрес-лімітуючих систем сприяє не тільки посиленню потенційних можливостей організму, а й ініціації синтезу ряду біологічно активних речовин, які також володіють антистресовий дією [11, 13, 59, 78, 107, 119, 132].
Однією з основних причин, що обмежують широке застосування речовин пептидної природи в клінічній практиці при різного роду стрес-пошкодженнях, є труднощі при проходженні ними гистогематических бар'єрів (ГГБ), зокрема гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) [30, 108]. Показано, що при периферичному введенні речовин модуляторної типу, спостерігається загальна закономірність: самі речовини не проходять гематоенцефалічний бар'єр, у той час як їхні найближчі попередники добре проникають через гемато-енцефалічний бар'єр і викликають відповідні зміни у функціонуванні фізіологічних систем [82]. Крім того, велике значення має вибір способу введення досліджуваного стрес-протективні речовини. Відомо, що одним з найбільш сприятливих способів введення речовин є інстиляція на кон'юнктиву ока [1, 119], оскільки таке введення сприяє максимальному проникненню речовини в мозок і практично не травмує тварина.
Введення ззовні біологічно-активних пептидів, їх попередників, а також синтетичних аналогів впливає на обмін ендогенних регуляторних пептидів [6, 69, 79, 101, 105, 198], а, отже, і на активність ферментів їх генезу. Проте механізми модуляції такого роду біохімічних процесів практично не вивчені.
У зв'язку з вищесказаним, особливий інтерес представляє порівняльний аналіз змін активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ - ферментів розрізняються за своєю тканинної локалізації та біологічної ролі, при дії гострого ЕБС і речовини, що коригує зрушення в метаболізмі при стресі - лей 5-енкефалінів- арг 6.
Виходячи з вищевикладеного, метою цієї роботи було дослідження впливу попередника лей-енкефаліну (лей 5-енкефалінів-арг 6) на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ головного мозку і периферичних тканин щурів, підданих впливу гострого емоційно-больового стресу. При виконанні роботи були поставлені наступні завдання:
Дослідження регіонального і тканинного розподілу активності карбоксипептидази Н, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ в головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів.
Дослідження впливу гострого емоційно-больового стресу на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ в головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів через різні проміжки часу.
Вивчення впливу лей-енкефалінів-арг на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ головного мозку, надниркових залоз і сім'яників щурів в різні терміни після інстиляції.
Дослідження впливу попередника лей-енкефаліну на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ головного мозку і периферичних тканин щурів в динаміці гострого емоційно-больового стресу.
Отримані дані дозволять повніше розкрити роль досліджуваних ферментів в механізмах функціонування пептідергіческіх систем при виникненні і розвитку стрес-реакції, більш детально вивчити механізми регуляції активності ферментів обміну нейропептидів, а також зрозуміти роль протеолітичних ферментів - ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ у розвитку адаптаційних реакцій організму при гострому ЕБС, ініційованих введенням лей-енкефалінів-арг.
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1. Опіоїдні пептиди І фізіолого-біохімічні аспекти ЇХ ДІЇ.
Регуляторні пептиди представляють собою поліфункціональну групу біологічно активних речовин, яким належить важлива роль серед відомих природних біорегуляторів [126, 181, 204, 221, 258]. До теперішнього часу описано і вивчено понад шестисот біологічно активних пептидів [62], що діють в організмі як нейромедіаторів, нейромодулятора і гормонів [62, 126, 134, 221]. Вони широко представлені в центральній, периферичної нервової системи, присутність регуляторних петідов відзначено також у деяких біологічних рідинах організму і периферичних органах [156, 166, 197, 221].
Важливою особливістю дії біологічно активних пептидів є здатність одних і тих же пептидних молекул викликати різні як за характером, так і за місцем прояви реакції [62, 174, 184, 204, 271]. Крім того, було доведено, що один пептид може бути фактором регулювання, як приватних метаболічних реакцій організму, так і глобальних форм системного поведінки [29, 35, 51, 62, 199]. Показано, що нейропептиди беруть участь у регуляції таких процесів, як пам'ять, навчання [96, 243], сон [117,131, 200, 217, 254], поведінка, регуляція апетиту, спраги, дихання, сексуальна і локомоторна активність, м'язовий тонус [51 , 162, 164, 204], відчуття болю [29], стрес-реакції [27, 26, 89, 101, 154, 161, 236] та ін
Сучасна класифікація регуляторних пептидів заснована на поєднанні функціонального, структурного і топологічного принципів. В даний час виділяють близько 40 сімейств нейропептидів [12].
Найбільш численним (понад 30) і різноманітним за функціями і впливам в організмі є сімейство опіоїдних пептидів.
Виявлення в мозку високоспецифічних рецепторів класичних непептидним опіатів - морфіну і ін дозволило розпочати целенаправ-ленний пошук їх ендогенних лігандів. Перші роботи з вивчення опіоїдних пептидів належать А. Голдстайн, Дж. Х'юса, Х. Костерлиц, С. Снайдеру, Л. Тереніусу [211, 258]. У дослідженнях Дж. Х'юса і Х. Костерлиц в 1975 році вперше з мозку свині були виділені і ідентифіковані два морфіноподібних кислото-розчинних пентапептіда - тир-гли-гли-фен-лей і тир-гли-гли-фен-мет, згодом названих лей -і мет-енкефалінів [211].
У екстрактах гіпофізів тварин було виявлено присутність інших, більш великих агоністів морфіну - b - a - і g - ендорфінів [225, 242, 253]. В даний час визначена структура практично всіх ендогенних опіоїдних пептидів. Крім мозку вони виявлені в легенях, кишечнику, серці, печінці, нирках, підшлунковій залозі, м'язах, а також в біологічних рідинах організму: спинномозкової рідини, крові [157, 166, 197, 219, 221].
Більш детальне вивчення ефектів, які проявляються опіоїдними пептидами, показало ряд значних відмінностей у відповідях організму на морфін і опіоїдні пептиди [95, 133]. Отримані дані дозволили припустити існування більш ніж одного класу опіатних рецепторів [95]. Сьогодні відомо 7 основних типів опіатних рецепторів: m -, d -, k -, l -, s -, e -, c - рецептори [81, 95, 235, 254]. Вони являють собою специфічні до опіоїдних пептидів регулюючі центри ферментативних комплексів або іонних каналів, локалізованих переважно на цитоплазматичній мембрані відповідних клітин-мішеней [95, 169, 173, 265].
Показано, що, опіоїдні пептиди здатні впливати на нейрональну активність [15, 139, 159, 198], пам'ять [96], поведінка [51, 168, 199], брати участь у регуляції процесів сприйняття болю [29, 86, 216, 266 ], ендокринних функцій організму [93, 235], імунних реакцій [148, 167, 172, 173, 214, 244], стресових впливів [14, 125, 238], серцево-судинної діяльності [35, 115], залучаються у розвиток і патогенез багатьох психічних і неврологічних захворювань [32, 120, 129,134, 158, 253] і ін
З великого числа біологічних властивостей опіоїдних пептидів особливо слід виділити наступні: дія у вельми низьких концентраціях, висока селективність, відсутність накопичення в організмі і низька токсичність [3, 16]. Зазначені властивості дозволяють використовувати опіоїдні пептиди в комплексі терапевтичних впливів, спрямованих на підвищення потенційних можливостей організму при різних функціональних станах організму.
Одним з факторів, що обмежують широке застосування цих пептидів в клінічній практиці, є складність при проходженні ними гистогематических бар'єрів (ГГБ) [82, 108]. ГГБ розглядаються як складна фізіолого-гомеостатична система, яка зберігає сталість внутрішнього середовища організму в цілому та мозку зокрема [30, 108]. Відомо, що проникнення в мозок більшості досліджених речовин відбувається, переважно, через стінку кровоносних капілярів [82, 108]. Таким чином, проникність ГГБ залежить більшою мірою від щільності мережі капілярів в структурах, на які безпосередньо наноситься досліджувана речовина, тобто від способу його введення в організм [108]. Відомо, що максимальна кількість речовини проникає в мозок при внутрішньовенному, внутрішньоартеріальному, а також внутрішньошлуночковому введення, внутрішньом'язове і внутрішньоочеревинне введення показують менший ефект [108]. Виявлено, що досить ефективно речовини проникають через гемато-офтальміческій бар'єр (ГОБ) [1, 24, 30].
Особливе місце в ряду опіоїдних пептидів відводиться енкефалінів. На відміну від ендорфінів вони широко поширені як в мозку, так і в периферичних тканинах [34, 172, 185, 197, 212]. Імуногістохімічними методами енкефалінів-містять клітини і їх термінали були виявлені в ядрах середнього мозку, ретикулярної формації, ядрах гіпоталамуса, лімбічної системи, довгастому мозку, таламусі, желатінозной субстанції спинного мозку [84, 156, 212]. Радіоіммунохіміческіе дослідження показали максимальний вміст енкефалінів в блідій кулі і хвостатому ядрі, далі у порядку спадання у гіпоталамусі, гіпофізі, середньому мозку, таламусі, довгастому мозку, гіпокампі, корі [14, 96, 147, 185]. Серед периферичних органів високий вміст енкефалінів зазначено в наднирниках, де вони зосереджені переважно в мозковому шарі [34], підшлунковій залозі, печінці [219], сім'яниках [197].
Роботи перших дослідників були присвячені вивченню переважно анальгетичної дії енкефалінів [165]. Виявлено, що введення опіоїдних пептидів викликає ефект знеболювання або зниження порогу больової чутливості [75, 86, 165, 228]. Аналгетичну дію пептидів реалізується переважно через δ-рецептори гіпоталамуса, стріатума і спинного мозку [86, 237, 271].
Досить детально досліджувалося участь ендогенних енкефалінів і ендорфінів у патогенезі психічних і неврологічних захворювань [32, 36, 134]. Передбачається, що опіоїди пептиди беруть участь у патогенезі шизофренії та депресії [216]. Показано, що при депресіях відзначається зниження опіоїдів в організмі, а їх системне запровадження призводить до тимчасового поліпшення стану депресивних хворих [216]. Подібність ефектів опіоїдних пептидів з дією нейролептиків дозволило припустити, що причиною психо-патологічних станів може бути порушення освіти або надмірної інактивації цих регуляторних пептидів [114]. Багатогранна нейротропної активності енкефалінів і ендорфінів дає підставу вважати, що вони можуть грати певну роль в нейрохімічних механізми дії різних нейортропних препаратів, у тому числі і антидепресантів [114, 120]. Показане зміна змісту ендогенних опіоїдних пептидів і вплив їх екзогенного введення було виявлено і у хворих, схильних до наркоманії та алкоголізму [32, 64].
Імуногістохімічними методами була виявлена висока концентрація опіоїдів в зонах мозку, здійснюють центральну регуляцію кровообігу [35]. Подальші дослідження показали участь ендогенних енкефалінів в діяльності серцево-судинної і дихальної системи [104, 273], у регуляції артеріального тиску через систему ренін-ангіотензин [87].
Виявлення опіатних рецепторів d - і k - класів на іммуноцітних мембранах, показало, що енкефаліни є активними регуляторами імунних реакцій [93, 148, 152, 173, 244], здійснюючи свою дію за допомогою активації Т-лімфоцитів мембран [172]. Експери-ментальні роботи ряду авторів підтвердили модулюючий дію енкефалінів на захисні механізми в периферичних і, особливо запалених тканинах [214].
Присутність високих концентрацій опіоїдних пептидів в гіпоталамусі і наднирниках [34, 156], пов'язаних з реалізацією ряду ендокринних функцій в організмі, дозволило припустити участь енкефалінів і ендорфінів у регуляції дії ендокринної системи [15, 159, 176]. Показано, що енкефаліни і ендорфіни впливають на секрецію гормону росту, меланостатіна, тіріоідного гормону [15, 172]. Крім того, відомо, що через опіатні шляху здійснюється зв'язок між імунною і ендокринною системою, що дає можливість діагностувати специфічні захворювання, які мають у своїй основі нейроендокринні та імунні розлади [93].
Дані ряду дослідників вказують на вплив енкефалінів на рухову активність і поведінку щурів [51, 168, 199]. Виявлено, що опіоїдні пептиди, що вводяться у високій концентрації всередину мозку, викликають стан тонічної нерухомості. Введення цих пептидів в більш низьких концентраціях тягне за собою менш глибокі зміни локомоторной активності у щурів, і характеризується первісною фазою зниження активності і наступним періодом гіперактивності. Мінімальні концентрації опіоїдних пептидів викликають стимулюючий ефект.
Різна локалізація по відділам мозку і периферичних тканин лей-і мет-енкефалінів свідчить про можливе розходження у функціях цих опіоїдних пептидів в регіонах [62, 242]. Використання різних методів введення енкефалінів дозволяє повніше уявити картину впливу їх на фізіологічні процеси в організмі. Так, наприклад, при внутрішньошлуночковому введенні було отримано підтвердження того, що мет-енкефалінів проявляє більш виражену анальгетичну дію, ніж лей-енкефалінів [29, 75]. Мет-енкефалінів також є більш дієвим імуностимулятором [214]. Найбільш виражений наркотичний і ейфорігенний потенціал навпаки властивий лей-енкефалінів, мет-енкефалінів практично не виявляє таких властивостей [32].
Настільки широкий спектр ефектів опіоїдних пептидів пов'язаний не тільки з гетерогенністю опіатних рецепторів і різноманітною локалізацією їх в організмі, але і з тим, що опіоїдні пептиди можуть реалізовувати свою дію і за допомогою функціональних зв'язків з різними біологічно активними речовинами, зокрема, з регуляторними пептидами інших родин [125, 239, 240] і біогенними амінами [31].
Відомо, що енкефаліни на відміну від ендорфінів швидко руйнуються амінопетідазамі - час напівжиття енкефалінів в крові щурів при введенні їх in vivo становить приблизно дві хвилини [20, 166, 189]. Проте згідно з даними сучасних досліджень, фізіологи-чеський дію короткоживучих пептидів може бути досить тривалим [11, 78, 107, 117]. Подібні ефекти описані для енкефалінів, ПВДС та ін [11, 13, 117]. Основний з гіпотез, що пояснюють пролонговану дію регуляторних пептидів, визнана концепція Ашмаріна І.П. про регуляторний континуумі [11, 13, 78]. Передбачається, що екзогенно введені або ендогенно синтезовані, при якій-небудь дії, регуляторні пептиди, є своєрідними індуктора-ми для вивільнення ряду інших регуляторних пептидів [11, 13, 78, 107].
Таким чином, експериментальні дані вказують на те, що опіоїдні пептиди можуть надавати різноманітне фармакологічне та фізіологічний вплив не тільки на центральну нервову систему, але і на безліч інших функціональних систем організму. Подібна дія здійснюється як безпосередньо - через опіатні рецептори відповідних клітин-мішеней, так і шляхом формування складних регуляторних ланцюгів і каскадів освіти інших регуляторних пептидів.
Ступінь реалізації тих чи інших ефектів опіоїдних пептидів залежить від рівня активних форм ендогенних пептидів, який визначається активністю ферментних систем обміну нейропептидів, що беруть участь в освіті та / або деградації молекул регуляторних пептидів [2, 65, 189, 204, 218, 257, 262, 268 ].
1.2. ОБМІН РЕГУЛЯТОРНИХ ПЕПТИДІВ.
1.2.1. Біогенез нейропептидів.
Виділяють два можливі шляхи утворення нейропептидів [55, 89]. Один з них нерібосомальний, біосинтез при цьому здійснюється за участю специфічних ферментів-синтетаз. Інший шлях пов'язаний з рибосомами, локалізованими на мембранах шорсткого ендоплазма-тичного ретикулуму. У цьому випадку нейропептиди синтезуються в організмі у вигляді неактивних високомолекулярних попередників, які перетворюються в активну форму в результаті обмеженого протеолізу [71, 229, 268]. Більш детальне вивчення молекулярно-біологічних характеристик опіоїдних пептидів дозволило встановити деякі закономірності їх утворення. Так до цього часу показано існування трьох високомолекулярних білкових попередників, які є джерелами всіх відомих опіоїдних пептидів: проопиомеланокортина, проенкефалін і продинорфіну [268]. Кожен з них закодований окремим геном в молекулі ДНК [268].
Для всіх нейропептидів характерна наявність ряду загальних особливостей у структурі і процессингу препропептідов:
наявність з N-кінця сигнальної послідовності, що складається з 15-20 залишків гідрофобних амінокислот. Функція її полягає в забезпеченні транслокації синтезованого пептиду через мембрани шорсткого ендоплазматичного ретикулума (ЕПР) [71, 268]. У порожнині ЕПР відщеплення цієї послідовності здійснюється за участю ендоолігопептідази - сигнальної пептидази, яка специфічна для певної послідовності гідрофобних амінокислот [268];
у структурі попередників, біологічно активні пептиди обмежені парами залишків аргініну і лізину, за якими відбувається розщеплення [71,268], причому розщеплення може відбуватися не по всіх парах залишків основних амінокислот. У зв'язку з цим слід припускати наявність різноманіття і високої специфічності ендопептидаз до ділянок розщеплення;
попередники нейропептидів можуть містити кілька копій різних пептидів. Наприклад, проопиомеланокортина містить у своїй структурі послідовності мет-енкефаліну, адренокортикотропіну, a-меланотропін, b-ліпотропін і b-ендорфіну, причому в різних відділах один і той же попередник може стати джерелом різних активних пептидів. Це характерно, наприклад, для попередника енкефаліну в мозку і наднирниках [272].
Ендопептидаз процесингу представляють собою досить велику групу ферментів [171, 203, 227, 267]. На основі їх субстратної специфічності виділяють наступні групи:
ендопептидаз специфічні для пар залишків основних амінокислот (серинові, аспартільние, тіолові);
ендопептидаз, розщеплюють зв'язку при одиничних залишках основних амінокислот (тіолові, металлопептідази);
ендопептидаз, розщеплюють пропептид не за основним залишкам амінокислот (тіолові, металлопептідази);
високомолекулярні мультиферментного протеази;
Слід зазначити, що деякі з ендопептидаз мають дуже вузької субстратної специфічністю, що важливо для генезу структур пептидної природи.
Результатом дії ендопептидаз є неактивні пептиди, що містять з боку С-або N-кінця залишки аргініну або лізину, які потім видаляються екзопептидаза з карбоксипептидаза-Б-і амінопептідазу-Б-подібної активністю [208, 229, 268]. Утворені в результаті біологічно активні пептиди, під впливом якого-небудь стимулу викидаються з клітини або у кров'яне русло, або в синаптичну щілину і мігрують до клітин-мішеней, де відбувається їх зв'язування зі специфічними рецепторами.
За локалізацією ферменти обміну нейропептидів ділять на дві великі групи [48]:
Ферменти секреторних везикул та ендоплазматичного ретикулуму (карбоксипептидаза Н (Кф 3.4.17.10), амінопептідазу-В-подібний фермент та ін). Ці ферменти беруть участь в утворенні активних форм нейропептидів.
Ферменти вневізікулярной локалізації - позаклітинної рідини і зовнішньої поверхні цитоплазматичних мембран - ангиотензинпревращающий фермент (Кф 3.4.15.1), карбоксипептидаза N (Кф 3.4.12.7), різні амінопептидази та ін Роль ферментів вневізікулярной локалізації полягає не тільки в освіті активних форм нейропептидів, тобто процессингу, але і в інактивації нейропептидів.
Таким чином, основну роль в регуляції рівня активних нейропептидів, а, отже, і в запуску реакцій їх біологічної дії, відіграють ферменти кінцевої стадії процесінгу та інактивації [189, 209]. Особливої уваги в цьому зв'язку заслуговують основні КП, оскільки ці ферменти беруть участь не тільки у кінцевій стадії утворення активних пептидів, але і в початкових стадіях їх деградації.
Ключову роль у генезі нейропептидів мозку відіграє ВПП - фермент секреторних везикул, відщеплюється залишки аргініну і лізину з С-кінця неактивних пептидів [187, 193, 195, 248]. Відомо, також, що даний фермент може брати участь в початкових стадіях інактивації активних пептидів, що містять залишки основних амінокислот з С-кінця молекули [40, 248].
Нещодавно в лабораторії нейрохімії Пензенського державного педагогічного університету ім. В. Г. Бєлінського в розчинній фракції сірої речовини головного мозку кішки була виявлена нова екзопептидаза, відщеплюється залишки аргініну з С-кінця синтетичних аналогів енкефалінів [49, 53]. Активність цієї основної КП повністю інгібувати фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ), у зв'язку, з чим фермент був названий ФМСФ-інгібіруемой КП [49]. Особливості тканинного і регіонального розподілу ферменту дозволяють віднести ФМСФ-інгібіруемую КП, до ферментів, які поряд з ВПП втягується в обмін регуляторних пептидів [48, 53].
Відомо, що важливу роль в обміні таких біологічно активних пептидів як енкефаліни, ангіотензину, АКТГ, ПВДС, речовина Р та ін грає ангиотензинпревращающий фермент (АПФ), що бере участь не тільки в процессингу, але і в інактивації активних форм пептидів [180, 182, 183]. Останнім часом особлива увага дослідників звернена на дослідження АПФ мозку.
Нижче представлені відомості про фізико-хімічні властивості цієї групи ферментів.
Карбоксипептидази Н (Кф 3.4.17.10).
Карбоксипептидаза Н (ВПП, енкефалінконвертаза, КПЕ) була вперше виділена з хромафінних гранул надниркових залоз бика Fricker і Snyder в 1982 році [192, 193]. Пізніше ВПП була виявлена і виділена з різних органів і тканин [191, 194, 203, 206, 230]. При цьому було показано, що каталітичні та фізико-хімічні властивості ВПП з різних джерел були досить близькі.
Фермент є глікопротеїном і складається з однієї поліпептидного ланцюга, максимальну активність проявляє при рН 5,6-6,0, що відповідає рН всередині секреторних гранул, М r 50-55кДа [40, 192, 193]. Показано також, що ВПП є тіолзавісімим металоферментів, в активному центрі якого знаходиться Zn 2 + [189]. Фермент активізується іонами Co 2 + та Ni 2 +, ингибируются ЕДТА, реагентами на сульфгідрильні групи і органічними кислотами, до складу яких входять аміно-або гуаніновий групи при останньому атомі вуглецю (GEMSA-гуанидилэтилмеркаптоянтарная кислота, GPSA - гуанідінопропілянтарная кислота, APMSA - амінопропілмеркапто- бурштинова кислота і 2 меркапто-3 гуанідінтіопропановая кислота) [256].
Запропоновані різні методи визначення активності ВПП. Найбільш широко застосовується метод Fricker і Snyder [194], з використанням дансілірованних тріпептідов - данс-фен-ала-арг і данс-фен-лей-арг - в якості субстратів. Для визначення активності ВПП запропоновані також даларгін [127], лей 5-енкефалінів-арг 6 [127], [3 Н]-бензоїл-фен-лей-арг [247], [3 Н]-бензоїл-фен-ала-арг [247]. Кількісне визначення ВПП у тканинах проводиться методом зв'язування [3 Н] ГЕМЯК [263].
Відповідно до початкових досліджень фермент представлений в організмі двома формами - розчинної і мембранозв'язаних, які відрізняються за величиною М r [187, 193, 205, 264], значення якої для мембранозв'язаних форми вище. Таку відзнаку пов'язували з наявністю у мембранозв'язаних форми С-кінцевий "якірної" послідовності, що складається з 15-20 гідрофобних амінокислотних залишків, основне призначення якої полягає у забезпеченні рН - залежною асоціації ВПП з мембранами. Показано також, що активність мембранозв'язаних ВПП набагато менше активності розчинної форми даного ферменту [189, 264]. Було висунуто припущення, що фермент, пов'язаний з мембранами секреторних гранул, є попередником розчинної форми ВПП і перетворюється на неї в результаті протеолитического розщеплення зв'язку c C-кінця біля основи "якірної" послідовності. Показано, що при цьому активність ферменту зростає в 2-3 рази [186]. На думку ряду авторів, така різниця в активності мембранозв'язаних і розчинної форм ВПП може бути пов'язано асоціацією менш активної форми з компонентами мембран [71], що ставить під сумнів гіпотезу про залежність активності мембранозв'язаних форми від наявності гідрофобною "якірної" послідовності.
Надалі було виявлено, що фермент, пов'язаний з мембраною секреторних гранул відрізняється від розчинної форми не тільки за величиною М r, але і по локалізації. Так в хромафінних гранулах надниркових залоз, в мозку, передньої і проміжної долі гіпофіза переважає розчинна форма ВПП, а мембранозв'язаних форма локалізована переважно в задній частині гіпофізу [37, 40, 186]. У зв'язку з цим, було висловлено припущення, що описані форми ВПП беруть участь у процессингу різних за своєю функціональною ролі пептидів: розчинна ВПП бере участь переважно в освіті секреторних пептидів, в той час як мембранозв'язаних форма бере участь процессингу пептидів, що володіють місцевою дією [40, 65 ].
Тканинна, регіональна, клітинному і субклітинному локалізація ферменту була вивчена з застосуванням флюоріметріческіх і радіометричних методів визначення активності ВПП. Найбільш висока активність ВПП виявлена в хромафінних гранулах надниркових залоз, аденогипофизе і острівцях Лангерганса підшлункової залози [191, 194, 203, 206]. Більш низька - в задній частині гіпофізу, стріатумі, гіпоталамусі, гіпокампі, середньому мозку, корі великих півкуль [37, 149, 194]. Найнижча активність ВПП відзначена в стовбурної частини головного мозку, спинному мозку, серці, легенях, шлунково-кишковому тракті, печінці та нирках [149]. Встановлено, що фермент локалізований в хромафінних гранулах надниркових залоз, нейронах мозку, що містять речовину Р, енкефаліни і інші нейропептиди, гормон-продукуючих клітинах гіпофіза, a - і b - клітинах острівців Лангерганса підшлункової залози, які продукують інсулін і глюкагон [189, 192, 194, 248, 256]. Дані про субклітинному локалізації ВПП показали, що фермент асоційований з структукнимі елементами комплексу Гольджі, ЕПР і секреторними везикулами, де здійснюється процесинг попередників біологічно активних пептидів [195].
Спочатку ВПП була описана як фермент, що бере участь в утворенні енкефалінів з їх попередника, однак дані наступних досліджень показали участь його в процессингу багатьох нейропептидів: глюкагону, інсуліну, пролактину, речовини Р, вазопресину і окситоцину та інших регуляторних пептидів [38, 175, 187, 190].
Ряд експериментальних досліджень показав, що ВПП втягується у відповідь організму на вплив різних чинників, таких як стрес [37, 42, 45, 56, 57, 64], введення in vivo етанолу [19, 54, 60, 67], резерпіну, діазепаму [58] та інших
ФМСФ-ІНГІБІРУЕМАЯ КАРБОКСІПЕТІДАЗА.
ФСМФ-інгібіруемая КП вперше була виявлена в розчинній фракції сірої речовини головного мозку котів [49]. Фермент має М r в межах 100-110 кДа, максимальна активність ферменту проявляється при рН 6,0 - 6,5, однак вона зберігається і при рН 5,5, що відповідає рН всередині секреторних везикул [49, 53]. Активність даного ферменту повністю інгібується ФМСФ і п-хлормеркурійбензоатом, 2-меркаптоетанол, ГЕМЯК, ЕДТА і N-етілмалеімід не чинили впливу на активність ФСМФ-інгібіруемой КП. Отримані відомості про відсутність впливу хелатуючим агентів, а також специфічних інгібіторів металлозавісімих КП на активність ФСМФ-інгібіруемой КП, свідчать про те, що даний фермент не є металлозавісімим. Показано, що активність ферменту змінюється в присутності іонів деяких металів, так іони Zn 2 + сильно пригнічують активність ФСМФ-інгібіруемой КП, що, ймовірно пов'язано з їх впливом на стабільність даного ферменту. Літературні дані свідчать також про збільшення активності ФСМФ-інгібіруемой КП в присутності NaCl, Na 2 SO 4, NaBr, що дозволяє використовувати їх для підвищення стабільності досліджуваного ферменту в розчинах [49].
За субстратної специфічності ФСМФ-інгібіруемая КП схожа з ВПП та КПN: відщеплює залишки основних амінокислот з С-кінця відповідного субстрату [49, 53]. Однак на відміну від ВПП, кращими субстратами для якої є пропептид містять як передостанніх залишки гліцину і аланіну, ФСМФ-інгібіруемая КП, володіє великим спорідненістю до тих субстратів, у яких залишку основної амінокислоти передує лейцин і метіонін [53, 119]. Так показано, що величина До m для гідролізу данс-фен-лей-арг ФСМФ-інгібіруемой КП приблизно дорівнює 48 мкМ, а для данс-фен-ала-арг - 96 мкМ [49].
За своїми фізико-хімічними властивостями фермент подібний з лізосомальної КПА (Кф 3.4.16.1), проте є відмінності по субстратної специфічності і, можливо, субклітинному локалізації [49, 53, 233]. Дані про тканинному і регіональному розподілі ФМСФ-інгібіруемой КП добре корелюють з даними для ВПП, що дозволяє припустити участь даного ферменту в процессингу попередників біологічно активних пептидів і секретується білків [49, 50, 149]. Так зазначено, що активність ФСМФ-інгібіруемой КП в гіпофізі - відділі, де синтезуються пептидні гормони - значно вище, ніж у відділах центральної нервової системи, що, ймовірно, свідчить про участь даного ферменту в процессингу попередників цих гормонів. Найбільш висока активність ФСМФ-інгібіруемой КП в мозку показана у нюхових частках і сірій речовині - відділах, утворених тілами нейронів [49, 149]. Активність ферменту у відділах з високим вмістом провідних шляхів (великих півкулях, варолієва мосту і довгастому мозку) значно нижче [149]. Отримані дані дозволили висунути припущення, що активність ФСМФ-інгібіруемой КП переважно пов'язана з тілами нейронів. Висока активність ФСМФ-інгібіруемой КП виявлена також у тканинах, пов'язаних переважно з деградацією білка (нирки, селезінка) [149]. У зв'язку з цим, не виключається можливість залучення ФМСФ-інгібіруемой КП в катаболізм білків або інактивацію біологічно активних пептидів.
Таким чином, питання про біологічної ролі ФСМФ-інгібіруемой КП до цих пір залишається відкритим. Наявний ряд припущень, може бути підтверджений або спростований тільки в результаті досліджень впливу на її активність факторів, які викликають уже відомі перебудови в метаболізмі, наприклад, стрес-вплив, введення різних біологічно активних речовин. Цікавим, для з'ясування біологічної ролі, представляється також порівняння активності ФСМФ-інгібіруемой КП з іншими КП, біологічні функції яких відомі.
Ангіотензинперетворюючого ферменту (Кф 3.4.15.1).
Ангиотензинпревращающий фермент (АПФ, дипептидилкарбоксипептидаза, пептидил діпептідаз А) вперше був виділений Скеггом і співавт. із сироватки крові коня [255]. В даний час відомо, що АПФ досить широко представлений в різних органах і тканинах організму: в ендотелії кровоносних судин легенів, мозку, серцевої тканини, в сироватці крові, Т-лімфоцитах, фібробластах, в епітеліальних клітинах нирок, плаценти, кишечника, репродуктивних органах [ 182, 196, 209, 223, 259].
За структурою АПФ представляє собою мембранозв'язаних глікопротеїн, що складається з однієї великої поліпептидного ланцюга, активується іонами Сl -, NO 3 -, SO 4 2 - [66, 170], інгібується 2-меркаптоетанолом [66]. Детальне вивчення фізико-хімічних властивостей даного ферменту сприяло створенню ряду високоспецифічних інгібіторів, першим з яких став каптоприл [178]. Сьогодні відомо принаймні сім інгібіторів АПФ - це еналаприл, лізиноприл, раміприл, цілазапріл, фосфопріл та ін [179], що виявляють характерну селективність по відношенню до АПФ різної тканинної локалізації
Згідно сучасним уявленням АПФ існує вигляді двох ізоформ: "соматичної", зосередженої на поверхні ендотеліальних, епітеліальних і нейроепітеліальних клітин і "репродуктивної", знайденої в спермі більшості ссавців [182, 183]. "Соматична" форма АПФ має молекулярну масу 170кДа і включає С-і-N-гомологічні домени, які мають ензиматичною активністю. "Репродуктивна" форма має молекулярну масу близько 100кДа і відповідає С-домену першої форми [182].
Відомо, що АПФ бере участь у відщепленні З-кінцевого гістіділлейціна від декапептид ангіотензину I і перетворення його у фізіологічно активний октапептид ангіотензин II [209, 222, 234, 259]. Крім того, АПФ бере участь в деструкції брадикініну, пептиду, функціональне дія якого протилежна дії ангіотензину II, шляхом послідовного видалення двох С-кінцевих дипептиду [66, 222, 234]. Таким чином, АПФ виявляє подвійну функцію щодо основних субстратів - брадикініну та ангіотензину I.
Початком нового напряму в дослідженні ролі АПФ в організмі послужили роботи Ганта та інші, які виявили в тканини мозку весь спектр компонентів ренін-ангіотензинової системи - ангиотензиногена, ангіотензину I, ангіотензину II і АПФ [196]. АПФ був знайдений в мозку в тілах і аксонах нервових клітин, в гіпофізі, базальних гангліях та чорній субстанції [183, 210]. Виявлене відповідність між регіональним розподілом АПФ і ряду нейропептидів в мозку дозволило припустити, що АПФ бере участь не тільки у метаболізмі ангіотензину і кінінів. Сьогодні відомо, що АПФ може гідролізувати такі функціонально активні пептиди, як мет-енкефалінів, нейротензин, b-ендорфін, речовина Р, b-ланцюг інсуліну (у цих перетвореннях АПФ діє ще й як ендопептидаз), граючи роль одного з регулюючих факторів в обміні цих біологічно активних речовин [180, 182, 183]. Виявлено також, що АПФ може брати участь у процессингу енкефалінів, гидролизуя енкефалінсодержащіе пептиди - мет-енк-арг 6-фен 7 у мет-енкефаліну і мет-енк-арг 6-гли 7-лей 8 в мет-енк-арг 6 [250 ]. Остаточно роль АПФ у мозку ще не з'ясована.
Таким чином, в даний час первинне визначення АПФ як чинника, що пов'язує калікреїн-кінінової і ренінангіотензинової системи крові дещо розширено. Показано, що АПФ бере участь у регуляції роботи серця, нирок, рівня артеріального тиску крові, імунної та репродуктивної системи, пов'язаний з метаболізмом нейротрансмітерів [180, 182, 183, 209, 223, 224, 251, 259]. Крім того, відомо, що ангиотензинпревращающий фермент втягується у відповідь організму на вплив стрес-факторів різної природи [64, 99]. На даний момент особливу увагу дослідників звернена на створення можливих методів регуляції активності АПФ при різних фізіологічних і патологічних станах організму.
1.2.2. Механізми регуляції активності ферментів обміну нейропептидів
Дані про залучення ряду ферментів у процесинг нейропептидів, а також про можливості контролю активності ферментів фізіологічно активними пептидами є причиною підвищеного інтересу до дослідження маловивчених механізмів регуляції їх активності. Вивчення механізмів, за якими здійснюється регуляція активності ферментів, має велике практичне значення, оскільки передбачає управління перебігом процесів утворення або деградації біологічно активних пептидів.
Відомо, що регулювання активності ферментів процесингу може здійснюватися in vivo на різних рівнях [38, 39, 48, 246]:
на рівні експресії гена;
на рівні процесингу попередників ферментів;
на рівні зрілої, активної форми ферментів;
В даний час не викликає сумнівів, що активність ВПП in vivo може регулюватися на рівні експресії гена [38, 202]. Оскільки ген ВПП складається з великої кількості регуляторних ділянок, структура яких різна в різних типах клітин, отже, і вплив агентів на експресію гена ВПП буде різним і виборчим. Так, стимуляція наднирників інсуліном веде за собою значне підвищення рівня мРНК ВПП, зміни у рівні мРНК ферменту при цьому менш значні, ніж для нейропептида [213, 246]. Той факт, що вплив різних чинників не завжди узгоджено і однаково для експресії генів ВПП та експресії нейропептидів, дозволяє припустити, що регуляція на рівні експресії генів не єдиний механізм, за яким здійснюється регуляція активності ВПП.
Відомо, що ВПП синтезується у вигляді препрофермента, який не володіє ферментативною активністю [38, 39]. Активація неактивної форми ферменту відбувається в результаті відщеплення N-кінцевий послідовності попередника в секреторних везикулах по мірі їх просування від тіл нервових клітин по аксона, тобто у міру їх дозрівання [38]. Протеолітична видалення С-кінцевий послідовник-ності проформи ВПП відбувається у секреторних везикулах за участю ферменту, який активується іонами Са 2 +, що призводить до перетворення мембранозв'язаних форми в розчинну [38, 186, 264]. Теоретично, можна припустити, що регулювання активності ВПП на цьому етапі можлива за рахунок зміни концентрації іонів Са 2 +. Однак той факт, що в розподілі активності між розчинної і мембранозв'язаних формами в клітинах з різним рівнем експресії та активності ВПП немає відмінностей [264], говорить на користь того, що регулювання активності ВПП на рівні перетворення мембранозв'язаних форми в розчинну неможливо [38]. Таким чином, доказів регуляції процесингу ВПП у процесі дозрівання секреторних везикул немає. Що ж стосується припущення про регуляцію активності ВПП на рівні перетворення неактивного попередника ферменту в активну форму, то воно залишається в силі, хоча, на даному етапі ще немає достовірних доказів цього.
Особливий інтерес у дослідників викликає регуляція активності ферментів обміну регуляторних пептидів на рівні зрілої форми. Відомо, що зміни активності ферментів досягаються при дії іонів металів, продуктів ферментативних реакцій, їх субстратів, ендогенних активаторів та інгібіторів, а також зміною рН [38, 39, 48].
Можливість регуляції активності ферментів обміну регуляторних пептидів ендогенними активаторами та інгібіторами пептидної природи описана для вневезікулярних ферментів, зокрема для ангіотензинперетворюючого ферменту [73]. Для внутрівезікулярних ферментів (наприклад, ВПП) такі дані повністю відсутні, оскільки механізмів проникнення в секреторні везикули речовин пептидної природи не виявлено.
Виявлено, що активність внутрівезікулярних і вневезікулярних ферментів in vitro пригнічується біологічно активними пептидами і їх попередниками [188, 206, 215, 233]. Так показано, що активність ВПП in vitro інгібує її субстратами - мет 5-енкефалінів-арг 6, лей 5-енкефалінів-арг 6, мет 5-енкефалінів-ліз 6, лей 5-енкефалінів-ліз 6 [119, 193, 194, 205], а також продуктами каталітичних реакцій ферменту - мет-і лей-енкефалінів, арг-вазопресином, речовиною Р, тиротропін-рилізинг чинником [119, 193]. Регуляція активності ферментів внутрівезікулярних таким способом можлива тільки в тому випадку, якщо при нанесенні речовин пептидної природи в секреторних везикулах змінюється сумарна концентрація і нейропептида і його попередника, що передбачає проникнення субстратів та продуктів каталітичних реакцій на сформовані везикули. Проте встановлено, що концентрація активного пептиду та пропептид у секреторних везикулах, де здійснюється їх процесинг, залишається постійною, що свідчить про неможливість регуляції активності ферментів внутрівезікулярной локалізації таким способом.
У разі вневезікулярних ферментів (наприклад, АПФ) регуляція активності біологічно активними пептидами і їх попередниками може мати місце, оскільки фермент є більш "доступним" для них. Показано, що активність АПФ in vitro пригнічується енкефалінів, b-ендорфіном, речовиною Р, АКТГ, брадикініну, b-ліпотропін [160].
Виявлено, що in vivo активність ВПП і ФМСФ-інгібіруемой КП головного мозку, надниркових залоз і сім'яників активується лей-і мет-енкефа-лінамі, введеними методом інстиляції на кон'юнктиву ока, причому вплив лей-енкефаліну більш виражено [119]. Механізми впливу дослід-ванних пептидів на активність ферментів не вивчені. Передбачається, що екзогенні лей-і мет-енкефаліни впливають на рівень експресії мРНК ВПП і ФМСФ-інгібіруемой КП, що призводить до зміни активності ферменту.
Схожа тенденція до підвищення активності при введенні лей-і мет-енкефалінів виявлена для АПФ [119]. Ймовірно, що дані пептиди можуть впливати на рівень та активність ендогенних активаторів, які сприяють збільшенню активність даного ферменту.
Виявлене під впливом субстратів та продуктів каталітичних реакцій, зміна активності ферментів обміну регуляторних пептидів, ймовірно має важливий біологічний сенс для регулювання рівня нейропептидів при різних патологічних станах організму, таких як алкоголізм, стрес-реакції і т.д.
У цілому ряді робіт є дані про підвищення активності деяких ферментів обміну нейропептидів (ВПП та АПФ) при введенні етанолу [19, 41], глюкокортикоїдів [47], резерпіну, каптоприлу [58]. Оскільки in vitro подібних ефектів не виявлено, то передбачається, що показане вплив опосередковано механізмами регуляції активності даних ферментів і є однією з ланок неспецифічної реакції організму на дію екстремальних факторів.
Таким чином, відомості, що стосуються механізмів регуляції активності ферментів обміну регуляторних пептидів активними формами нейропептидів, а також їх попередниками носять фрагментарний характер. Разом з тим вивчення цього питання дозволить зрозуміти принципи функціональної організації ферментів, з тим, щоб використовувати ці відомості на практиці при різного роду патологічних станах організму, таких як алкоголізм, стрес-реакції і т.д.
1.3. Опіоїдні пептиди ПРИ ДІЇ стресорні факторів.
У числі актуальних проблем сучасної біології та медицини все більша увага приділяється проблемі стресу. Такий інтерес до вивчення цього питання зумовлений багатьма факторами, серед яких постійне прискорення темпів життя, шум, урбанізація, які, так чи інакше, впливають на організм людини і тварин, провокуючи розвиток стресу. Досить сильне і тривалу дію стрес-факторів може стати причиною різних функціональних порушень і патологій [4, 90].
Визначення стресу як "неспецифічної реакції організму на будь-яку вимогу ззовні", дане Г. Сельє [132], а також запропонована ним концепція розвитку стрес-реакції, піддалися критичному аналізу з боку багатьох учених. Сьогодні, стрес розглядається як сукупність загальних, неспецифічних біохімічних, фізіологічних і психічних реакцій організму, що виникають у відповідь на дію надзвичайних подразників різної природи і характеру, що забезпечують мобілізацію організму з метою підтримання гомеостазу або його адаптації [144].
Загальною концепцією обмеження стрес-реакції визнана концепція сполучення дії стрес-лімітуючих і стрес-реалізуючих (АКТГ-подібних) систем [116, 138, 144]. Існування в організмі спеціалізованих стрес-лімітуючих систем, що обмежують саме порушення стрес-реалізуючих систем, забезпечує резистентність до стресу [124, 125, 134, 135]. Відомо, що при дії стресових факторів відбувається активація центральних та місцевих (антиоксидантна та аденозінергіческая системи) стрес-лімітуючих систем і механізмів. Серед центральних лімітуючих систем активуються такі як: ГАМК-ергічні, серотонінергіческой, холінергичеськую і опіоідергіческая системи [29, 116]. Виявлено, що характер та інтенсивність розвитку стрес-реакції, а також ступінь участі в ній різних функціональних систем, багато в чому залежить від вихідного стану організму [80, 232, 270]. Відмінності тварин по вродженої реакції на стрес-подразники, послужили підставою для розподілу їх на стрессустойчівих (нізкоемоціональних) і стресснеустойчівих (високоемоціональних, схильних до стресу). Основним показником приналежності тварин до того чи іншого типу є прояв їх рухової активності в тесті "відкрите поле": високий рівень активності дозволяє віднести тварин до сильного типу (стрессустойчівому) і навпаки [51, 80]. Показано, що стійкість до емоційного стресу обумовлена перш за все високим рівнем опіоїдних пептидів, речовини Р, ПВДС [131, 236, 243].
Ступінь розвитку стрес-реакції, багато в чому, визначається видом стрес-впливу. Наприклад, відомо, що, короткочасне гостре імпульсне стрессірованіе призводить до екстреного підвищення адаптивних здібностей організму [37, 70, 145, 151]. Одним з таких впливів може бути визнаний гострий емоційно-больовий стрес (ЕБС) [37, 52, 64, 121]. Показано, що при ЕБС відбувається мобілізація ГГНС, адренергіческіх, симпато-адрееналовой і опіоідергічекой систем. Літературні дані свідчать про можливість включення в коло цих систем і мозкової залози - епіфіза [7]. Здійснення епіфізом своєї антистресовий захисту досягається за участю ендогенних опіоїдів.
Таким чином, опіоїдним пептидів належить важлива роль серед відомих природних біорегуляторів, які беруть участь у формуванні адаптації до стресових факторів. Нижче представлені відомості про роль даної групи пептидів в реакціях стресу.
Система ендогенних опіоїдних пептидів являє собою одну з основних регуляторних систем, що функціонують в умовах стресу і адаптації [8, 102, 106, 134, 242]. Перебіг стрес-реакції супроводжується глибоким зрушенням у опіоїдної системі, причому у відповідь на вплив больового фактора спостерігається підвищення рівня опіоїдних пептидів, а при впливі емоційного - зниження їх змісту [14, 18, 72, 239]. Збільшення вмісту опіоїдів при дії стрес-факторів відзначається в крові, лікворі, головному і спинному мозку [33, 34, 72, 140, 243]. Зміни метаболізму в головному мозку при дії сильних подразників, викликають підвищення проникності гемато-енцефалічний бар'єр (ГЕБ) у всіх його відділах [88, 97, 108]. Подібні зміни сприяють більш інтенсивному проникненню різних біологічно активних речовин в структури головного мозку, особливо емоціогенние і гіпофіз [88]. Підвищена проникність ГЕБ відзначена в гіпоталамусі, що пов'язують з великою щільністю мережі капілярів у ньому [88]. При цьому концентрація різних представників сімейства опіоїдних пептидів також неоднакова, тому що при емоційному стресі в гіпоталамусі переважає мет-енкефалінів, а рівень b-ендорфіну досить низький, якщо ж до цього впливу приєднується больовий фактор, то відзначається переважання лей-енкефаліну і концентрація b - ендорфіну підвищена [14, 18, 140, 242]. Підвищення рівня енкефалінів сприяє стабілізації внутрішнього середовища організму, результатом чого є обмеження або переривання стрес-реакції [6, 33, 100, 134, 238].
Функціонування цієї системи самостійно, без взаємодії з деякими регуляторними системами представляється малоймовірним. Встановлено антагоністичні взаємовідносини між опіоїдними пептидами і симпатоадреналової, гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової системами [74, 124, 139, 176, 270], які відіграють ключову роль в генерації першій стадії загального адаптаційного синдрому.
Протягом першої доби (фаза тривоги) спостерігається зниження рівня енкефалінів в крові [134, 135, 140], в результаті чого розвивається гострий адаптаційний синдром, який супроводжується активацією ГГНС [21, 25, 128, 142, 143]. Подальше, підвищення рівня ендогенних опіоїдних пептидів, у відповідь на стрес-вплив, сприяє блокаді ГГНС [135, 261]. Гальмування ГГНС опіоїдними пептидами ефективно і перешкоджає надлишкової стимуляції ГГНС, якщо стрес-вплив здійснюється у легкій формі і недовго за часом. При тривалому стрес-впливі опіоїдна система не ефективна, в результаті чого розвивається гіперергіческая реакція з боку ГГНС, що закінчується загальним стрес-пошкодженням організму [128, 142].
Однією з важливих характеристик стресу є активація симпато-адреналової системи (САС) [21, 150]. До загального відповідь САС на дію подразника залучаються в першу чергу катехоламіни - дофамін, норадреналін і адреналін. Встановлено, що активація системи катехоламінів є основним чинником, що обумовлює збільшення концентрації опіоїдних пептидів в мозку, а також викид b-ендорфіну з гіпофіза в кров [52, 79, 125, 139]. Опіоїдні пептиди, діючи через m-рецептори, знижують рівень катехоламінів у мозку, наближаючи їх зміст до норми, тим самим послаблюючи стрес-реакцію [125, 144]. Активація САС супроводжується також інтенсивним вивільненням АКТГ [18, 106, 232]. Встановлено, що ендогенні опіоїдні пептиди модулюють процеси надлишкового синтезу і секреції АКТГ, наближаючи їх рівень до норми [18, 125].
Показані вище взаємодії системи опіоїдних пептидів з іншими функціональними системами організму, а також виявлене модулюючий вплив на процеси транссінаптіческого передачі нервового імпульсу і активність нейронів, є наслідком включення ланцюга складних механізмів усередині клітини [10, 118, 122, 135, 261, 269]. У першу чергу до них слід віднести депресивний вплив опіоїдних пептидів на систему циклічних нуклеотидів, концентрація яких при впливі екстремальних факторів емоційної і больовий природи, підвищується [18, 109]. Така зміна концентрації циклічних нуклеотидів в клітині при дії стрес-фактора призводить до значного зниження збудливості нейронів і впливає на транспорт нейротрансмітерів. Дія опіоїдних пептидів засноване на пригніченні активності аденілатциклази і, як наслідок, зниження концентрації цАМФ в клітці [18, 109, 135]. Можливо, також, що енкефаліни в першу чергу індукують підвищення рівня цГМФ, після чого спостерігається активація фосфодіестерази і лише потім йде гальмування аденілатциклази [18]. У будь-якому випадку, результатом є зниження надлишкового синтезу цАМФ в клітці, що веде до гальмування ряду фізіологічних реакцій, що посилюють стрес-ушкодження систем організму [18, 109 135].
Відомо, що при важких і тривалих видах стресу тієї активації, яка досягається під впливом опіоїдних пептидів при легких і короткочасних стресах недостатньо, в результаті чого спостерігається неадекватність синтезу і секреції опіоїдних пептидів і / або блокада опіоїдних рецепторів продуктами метаболізму [112, 134, 145, 261]. Ці зміни спричиняють за собою виснаження нейрогуморальної системи. У зв'язку з цим, необхідним стає екзогенне введення опіоїдних пептидів з метою підвищення потенційних можливостей системи ендогенних опіоїдів [102, 116, 125, 134, 135].
Показано, що екзогенне введення пептидних лігандів опіатних рецепторів призводить до зниження ступеня гіпертрофії надниркових залоз [9, 34, 100], ослаблення інволютивних процесів в тимусі і селезінці [6], зниження ступеня стрес-пошкодження серця [102, 104, 238], а також позитивно впливає на загальний стан тварин при гострій ішемії міокарда [103, 145, 269]. У ряді робіт показана здатність екзогенних опіоїдів надавати седативну дію при афективних станах на синтез і секрецію стрес-гормонів [129], а також впливати на емоційний компонент стресу [136, 141, 151]. Стрес-лімітуючий характер дії опіоїдних пептидів опосередковується через інгібування надлишкової секреції АКТГ, катехоламінів та інших катаболічних гормонів на початкових етапах розвитку загального адаптаційного синдрому. У фазу резистентності реалізація ефектів екзогенних опіоїдних пептидів здійснюється через стимуляцію утворення анаболічних инкретов - пролактину, соматотропіну та ін [101].
Передбачається, що адаптогенним дією володіє попередник лей-енкефаліну - лей 5-енкефалінів-арг 6 [69, 134, 135].
Основними причинами, що обмежують широке використання регуляторних пептидів у клініці є: слабовиражений ефект при прийомі всередину, залежність ефекту від вихідного функціонального стану організму, труднощі при проходженні гематоенцефалічний бар'єр, а також короткочасність дії, обумовлена в основному їх швидким протеолізу. Одним з найбільш відомих препаратів, стійким до дії пептид-гідролаз, що володіє селективним пролонговану дію, а також біодоступним, є даларгін - аргінінсодержащій гексапептідний аналог лей-енкефаліну (Д-ала 2-лей 5-арг 6-енк) [69, 94, 105, 123, 146]. Внутрішньом'язове введення його стимулює репаративну регенерацію периферичних нервових утворень в умовах їх пошкодження, підвищує активність кори надниркових залоз при стресі [34], позитивно впливає на організм після перенесеного інфаркту міокарда, симптоматика якого схожа з змінами, що виникають в організмі, схильному гострого емоційно-больового стресу [ 245]. Показана також можливість використання даларгіну для профілактики та патогенетичної корекції стрес-індукованих порушень імунітету [148]. Виражене антістресорное дію аргінінсодержащего гексапептідного аналога обумовлено наявністю аргінінових компанента [101]. Важливе значення в механізмах дії даларгіну при стресі має стимулюючий вплив його на опіатні рецептори нейрональних структур мозку, а також на гальмівну ГАМК-ергічні систему [101, 146]. Виявлені ефекти сприяють обмеженню стрес-реакції на стадії тривоги і формуванню резистентності до дії стресу в ході загального адаптаційного синдрому [89, 101].
Таким чином, експериментально і теоретично доведено значущість системи опіоїдних пептидів в адаптації та стійкості організму до стресу. Одним з важливих, і в той же час маловивчених, питань у розумінні механізмів регуляції активності нейропептидів в організмі при дії стресу є з'ясування шляхів їх синтезу і деградації при екстремальних умовах.
ФЕРМЕНТИ ОБМІНУ Нейропептиди ПРИ СТРЕСІ
В даний час протеоліз розглядається не лише як процес катаболической утилізації біологічно активних пептидів, але і як регуляторний фактор, функція якого полягає у запуску і перериванні ряду біохімічних і фізіологічних процесів при різних функціональних станах організму [22, 77, 177, 226]. Практично невивченим залишається питання про зміни у функції ферментів обміну нейропептидів при стресі, в той час як саме активність цих ферментів визначає рівень біологічно активних пептидів в організмі і, отже, ступінь реалізації відповідної реакції організму на вплив екстремальних факторів.
Згідно з літературними даними характер зміни активності ферментів обміну нейропептидів при стресі залежить від емоційного статусу тварини, який у свою чергу визначається генетично запрограмованої схильністю до тієї чи іншій формі експериментальних неврозів [22, 48, 80, 83, 138, 210, 236]. Дослідження показують, що у щурів з різним поведінкою в тесті "відкритого поля" спостерігаються відмінності в рівні катехоламінів у мозку [232]. Оскільки регуляція функцій САС при стресі реалізується за участю опіоїдних пептидів, здатних впливати на напрямок адаптивних процесів в організмі [139, 146], то не виключається, що стійкість до стресу залежить від функціональної активності ферментів обміну опіоїдних пептидів.
Подібна залежність відзначена для ВПП, АПФ, КПN при емоційному стресі [43, 44]. Відзначено, що у стійких до стресу тварин активність ферментів обміну нейропептидів більш чутлива до впливу емоційного стресу, ніж у схильних.
Виявлено, що у стійких до стресу тварин в гіпоталамусі і стріатумі активність ВПП при дії стресу підвищується [41, 42, 43, 56]. Авторами висловлено припущення, що такий ефект спостерігається у зв'язку з активацією синтезу в досліджених відділах нейропептидів (енкефалінів, речовини Р та ін), які відіграють ключову роль при адаптації до стресу. У гіпофізі, де синтезується АКТГ, активність розчинній фракції ВПП, навпаки, істотно підвищувалася у схильних до стресу тварин. Передбачається, що причина зазначених змін полягає в тому, що ВПП бере участь у процессингу АКТГ, який у свою чергу підсилює почуття страху і тривоги і тим самим погіршує емоційний стрес [189].
Відомо, що КПN та АПФ також беруть участь в обміні ПВДС, b-ендорфіну [40, 209], рівень яких різний у схильних і стійких до стресу тварин [92, 130,131]. Підвищення зміст цих пептидів в мозку і крові у тварин пов'язують, перш за все, з високою швидкістю їх обміну. Показано, що у стійких до емоційного стресу тварин, активність КП N і АПФ у сироватці крові вище, ніж у схильних [44]. У зв'язку з цим, авторами висловлено припущення про більш інтенсивний обмін нейропептидів у цих тварин і непрямий вплив КПN та АПФ на емоційний статус організму [44].
Важливу роль у зміні функціональної активності ферментативних систем мозку і периферичних тканин при стресі грає вид стрес-впливу (хронічний і гострий звуковий, іммобілізаційний, емоційно-больовий і т.д.).
Така залежність показана, зокрема, для ВПП [37, 41, 42, 43, 45, 64]. Активність даного ферменту при дії стресу різної природи, в основному, підвищувалася, проте, ступінь її підвищення була різною, що обумовлюють специфікою впливу, що викликає стрес. Так при хронічному емоційно-больовому стресі (ЕБС) підвищення активності ферменту було меншим, ніж при гострій дії стрес-факторів [37, 42]. Крім того, показано, що підвищення активності ферменту було різним для розчинної і мембранозв'язаних форм ВПП, що свідчить про різну роль цих форм ферменту в організмі [45, 186]. Найбільш вираженими зміни активності ферменту були в гіпофізі - відділі, що відповідає за синтез і секрецію стрес-пептидів [37, 45]. Значне підвищення активності показано також у стріатумі - відділі, де синтезується ряд біологічно активних пептидів стрес-протективні дії. Причому відмічено, що при одноразовому ЕБС таке підвищення активності зберігалося протягом досить тривалого проміжку часу, що вказує, на тривалий характер біосинтезу нейропептидів при зробленому впливі. Передбачається, що причина розбіжності у динаміці зміни активності ВПП при гострому та хронічному впливі стресу полягає в розвитку адаптації організму до несприятливих факторів середовища при хронічному (багаторазовому) стрес-впливі [37].
Особливий інтерес представляють дослідження, що стосуються впливу різних речовин на ферменти обміну нейропептидів при стресі. Відомо, що етанол послаблює деякі фізіологічні прояви стресу, посилює секрецію стрес-пептидів, а так само активує енкефалінергічного систему [19, 41]. Оскільки рівень опіоїдних і стрес-пептидів в організмі контролюється ВПП, то представляється можливим, що ВПП визначає характер впливу етанолу на організм при стресі [19, 41]. Характер впливу етанолу на фізіологічні прояви стресу пов'язаний з особливостями стрессірующего чинника [61]. Відомості про гіперактивації ВПП при спільній дії етанолу іммобілізаційного або хронічного ЕБС у відділах мозку, де синтезуються опіоїдні пептиди, речовина Р, підтверджують дані про стимулюючу дію етанолу при стресі. Однак така активація пептідергіческіх систем веде до важких наслідків для організму, тому що викликає більш швидке виснаження цих систем [41].
Подальше вивчення механізмів, що запобігають виникнення стрес-реакції, сприяло пошуку нових речовин, що володіють стрес - протективного дією. Особливе місце в ряду таких речовин відводиться транквілізаторів (резерпін, діазепам), які широко використовуються в клінічній практиці. Проте вплив їх на пептідергіческіе системи і ферменти обміну нейропептидів вивчено недостатньо. Між тим це питання досить важливе, для розуміння механізмів розвитку стресу.
Відомо, що резерпін підвищує рівень енкефалінів в організмі [58]. При введенні резерпіну, активність ферментів процесингу, що володіли КПБ-подібної активністю (ВПП і КПN), підвищувалася в 2-3 рази [58]. Передбачається, що зміна активності досліджуваних ферментів є причиною активізації енкефалінергічного системи.
Транквілізатори бензодиазепиновой природи також володіють стрес - протективного дією. Вивчення їх впливу на ферменти обміну нейропептидів при стресі стає тим більш цікавим, що в ланцюзі реакцій, які вони здійснюють в організмі є речовини, які є або продуктами їх діяльності, або вони беруть участь у регуляції їх синтезу. Так бензодіазепіновие транквілізатори модулюють рівень АКТГ як в нормі так і при дії стрес-факторів [114, 252], зокрема введення фенозепама зменшує концентрацію АКТГ при стресі. Оскільки відомо, що ВПП бере участь у біосинтезі АКТГ, то особливий інтерес представляє вивчення можливості залучення цього ферменту в стрес-протективное дію транквілізаторів.
Дані досліджень показують, що активність ВПП за спільної дії діазепаму і стресу, в основному, нижче, ніж тільки при стресі [39]. Активність АПФ у сироватці при введенні діазепаму змінюється подібним чином. Оскільки АПФ бере участь у деградації енкефалінів, речовини Р і ПВДС - біологічно активних пептидів, основна роль яких полягає в адаптації організму до стресу [107, 135, 152], то не виключається, що антистрессорного дію діазепаму обумовлено його модулюючим дією на активність ВПП та АПФ . Зміна активності даних ферментів може призвести до зменшення вмісту АКТГ і збільшенню змісту опіоїдних нейропептидів, сприяючи тим самим розвитку адаптаційних реакцій в організмі.
Таким чином, зміни в прояві функціональної активності ферментів процесінгу та інактивації біологічно активних пептидів при стресі свідчать про важливу роль цих ферментів у регуляції рівня активних нейропептидів, що беруть участь, як у розвитку, так і у гальмуванні розмаху стрес-реакції.
Підсумовуючи вищевикладені відомості необхідно зазначити наступне:
Опіоїдні пептиди, їх синтетичні аналоги (наприклад, даларгін), а також попередники (лей 5-енкефалінів-арг 6) володіють стрес-протективного властивістю.
При впливі на організм стрес-факторів різної природи спостерігаються значні зміни в обміні біологічно активних пептидів, а також життєдіяльності організму в цілому. Найбільш істотні зміни відзначаються при гострому стрес-вплив.
Важлива роль в обміні регуляторних пептидів належить ферментам пептид-гідролаз, які регулюють рівень біологічно активних пептидів при різних функціональних станах організму, в тому числі і при стресі. Особливе місце в ряду цих ферментів займають основні карбоксипептидази, які діють на кінцевому етапі процесингу попередників регуляторних пептидів, а також ферменти, які беруть участь в інактивації активних форм нейропептидів.
Стрес-протективні речовини різної природи впливають на активність ферментів обміну нейропептидів мозку і периферичних тканин стресованих тварин, що свідчить про зміни в метаболізмі нейропептидів у цих тварин.
У зв'язку з цим, становить інтерес вивчення впливу попередника лей-енкефаліну на активність деяких ферментів обміну нейропептидів головного мозку і периферичних тканин тварин, підданих впливу гострого ЕБС. Отримані дані можуть сприяти з'ясуванню ролі пептідгідролаз в механізмах розвитку стрес-реакції, а також у реалізації ефектів екзогенного попередника на організм, здатний до стресу.
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.
2.1. МАТЕРІАЛИ ДОСЛІДЖЕННЯ.
Об'єктом дослідження служили головний мозок і периферичні тканини (надниркові залози і насінники) самців білих безпородних щурів у віці 5 місяців, масою 160-190 р. Тварин утримували в стандартних умовах віваріум.
Тварин декапітованих, витягували головний мозок, гіпофіз, надниркові залози і насінники. Потім тканини поміщали в охолоджений фізіологічний розчин, очищали від оболонок і кровоносних судин, висушували фільтрувальним папером. Потім виділяли відділи мозку - гіпоталамус, середній мозок, гіпокамп, стріатум, великі півкулі.
Зразки виділених відділів мозку і тканин гомогенізували в скляному гомогенизаторе Поттера в 20 мМ натрій ацетатному (NaAc) буфері рН 5,6, що містить 50 мМ NaCl. Співвідношення вага / обсяг були різні: 1/400- для гіпофіза, 1/200- для надниркових залоз, 1/100- для насінників, 1/50- для відділів мозку. Гомогенат використовували як джерела ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ.
У роботі були використані 4 групи тварин. 1 група - інтактні тварини. Тваринам 2 групи вводили розчин лей 5-енкефалінів-арг 6 в дозі 20 мкг / кг відповідно. Тварини 3 групи піддавалися впливу гострого ЕБС. Тваринам 4 групи під впливом гострого ЕБС инстиллировать на кон'юнктиву ока 2 мкл розчину попередника лей-енкефаліну - лей 5-енкефалінів-арг 6 в дозі 20 мкг / кг.
2.2. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.
2.2.1. Схема введення попередника лей-енкефаліну
Введення попередника лей-енкефаліну - тир-гли-гли-фен-лей-арг (лей-енкефалінів-арг) здійснювалося способом інстиляції на кон'юнктиву ока (доза 20 мкг / кг ваги). Розчин лей-енкефалінів-арг наносився на праве око щури, за допомогою дозатора з м'яким катетером з полівінілхлориду (обсяг спричинених розчину 2 мкл). Введення попередника енкефаліну здійснювалося вранці в один і той же час.
Розчин лей-енкефалінів-арг був приготований на фізіологічному розчині.
Декапітацію тварин здійснювали через 0,5 години, 4 години, 24 години, 72 години і 10 діб після введення лей-енкефалінів-арг, фізіологічного розчину і через 0,5 години, 4 години, 24 години, 72 години і 10 діб з початку впливу гострого ЕБС.
2.2.2. Моделювання гострого емоційно-больового стресу
Для моделювання гострого емоційно-больового стресу (ЕБС) щурів поміщали в клітку з підлогою з металевого дроту і вбудованої в неї електричною лампочкою і дзвінком.
Для створення моделі стресу щурів протягом 20 хв через кожні 10 секунд у хаотичному режимі піддавали дії одного з трьох факторів: спалах світла (лампа розжарювання потужністю 100 Вт, відстань 0,5 м), звуку силою 70 Дб, електрошкірний роздратуванню порогової сили (2 мА). Тривалість кожного впливу становила 1 сек.
2.2.3. Метод визначення активності ВПП.
Активність ВПП визначали флюоріметріческі, використовуючи метод Fricker і Snayder c деякими модифікаціями [193]. Активність ферменту визначали за звільнення данс-фен-ала з данс-фен-ала-арг при рН 5,6, як активність інгібіруемая ГЕМЯК - високоспецифічним інгібітором ВПП [193].
Для визначення активності ВПП змішували 150 мкл 50 мМ NaAc буфера рН 5,6, що містить 50 мМ NaCl (проба без ГЕМЯК - контрольна) або 150 мкл розчину, що містить ГЕМЯК, в тому ж буфері - досвідчена проба (концентрація в пробі 1 мкМ) з 50 мкл препарату ферменту. Після цього проби преінкубіровалі 8 хв, при 37 0 С, після закінчення цього часу додавали попередньо нагрітий до 37 0 С розчин данс-фен-ала-арг (концентрація 210 мкМ), об'ємом 50 мкл (кінцева концентрація субстрату в пробі 42 мкМ). Реакційну суміш інкубували 60 хв при t = 37 0 С, реакцію зупиняли додаванням 50 мкл 1 н. НСl.
До пробам доливали хлороформ об'ємом 1,5 мл. і ретельно струшували протягом 60 сек. При цьому продукти реакції переходять в хлороформний фазу, а субстрат, нерозчинний в хлороформі, залишається у водній фазі. Для розділення хлороформно і водної фаз проби центрифугували протягом 5 хв при 1000 об / хв.
Флюоресценцію хлороформно фази вимірювали на флюоріметре ФМЦ - 2 в кюветі товщиною 1 см при l ex = 360 нм і l em = 530 нм. В якості стандартного розчину використовували 1 мкМ розчин данс-фен-ала в хлороформі.
Активність ВПП визначали як різницю в накопиченні продуктів реакції в пробах, що містять і не містять ГЕМЯК. Активність виражали в нмоль данс-фен-ала, що утворився за 1 хв інкубації в перерахунку на 1 мг білка.
Метод визначення активності
ФМСФ - інгібіруемой карбоксипептидази.
Активність ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази визначалася флюоріметріческі, методом, розробленим у лабораторії нейрохімії ПДПУ ім. В.Г. Бєлінського [49]. Як субстрат використовували розчин данс-фен-лей-арг.
У контрольні проби вносили 150 мкл 50 мМ NaAc буфера, що містить 50 мМ NaCl рН 5,6 і 50 мкл препарату ферменту. Досвідчені проби містили 140 мкл зазначеного буфера і 50 мкл препарату ферменту, інгібітор фенілметілсульфонілфторід (ФМСФ), приготовлений на етанолі, вносився в пробу безпосередньо перед преінкубаціей в обсязі 10 мкл. Проби преінкубіровалі 8 хв при 37 0 С, потім вносили 50 мкл 210 мкМ розчину данс-фен-лей-арг. Далі контрольні та досвідчені проби обробляли, як описано для ВПП.
Активність ФМСФ - інгібіруемой карбоксипептидази визначали як різницю в накопиченні продуктів реакції в пробах, що містять і не містять ФМСФ і виражали в нмоль данс-фен-лей, образовавше-гося за 1 хв інкубації в перерахунку на 1 мг білка.
2.2.5.Метод визначення активності АПФ.
Активність АПФ також визначалася флюоріметріческі. Як субстрат використовували данс-фен-ала-арг, приготовлений на воді. В якості інгібітора використовували високоспецифічний інгібітор АПФ - каптоприл.
Контрольні проби містили 100 мкл 200 мМ трис НСl рН 7,6 і 100 мкл препарату ферменту. У досвідчені проби вносили 90 мкл зазначеного буфера, 10 мкл 25 мМ каптоприлу, приготовленого на воді і 100 мкл гомогенату. Проби преінкубіровалі протягом 8 хв при 37 0 С, потім у кожну пробу додавали попередньо нагрітий до 37 0 С розчин субстрату данс-фен-ала-арг об'ємом 50 мкл. Реакційні суміші инкубировали протягом 30 хв при 37 0 С, реакцію зупиняли додаванням 50 мкл 1н розчину НСl. Далі проби обробляли за схемою, наведеною для ВПП.
Активність ферменту визначали як різницю в прирості флюорісценціі в пробах містять і не містять інгібітор АПФ - каптоприл і виражали в нмоль данс-фен-ала, що утворився за 1 хв інкубації в перерахунку на 1 мг білка.
2.2.6. Методи визначення активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ in vitro
У дослідах in vitro, вплив лей-енкефалінів-арг на активність ферментів вивчали в гомогенатах гіпофізу, надниркових залоз і великих півкуль. Розчин лей-енкефалінів-арг додавали безпосередньо в середовище інкубації, концентрація досліджуваного попередника становила 2,4 мМ. Усі наступні операції по визначенню активності ферментів проводили за схемою, описаною вище.
2.2.7. Метод визначення вмісту білка
Вміст білка в пробах визначали за методом Лоурі [65]. Метод заснований на здатності білка забарвлюватися розчином Фоліна. В якості стандарту для побудови калібрувальної кривої використовували БСА.
2.2.8.Статістіческая обробка результатів дослідження.
Результати піддавали статистичній обробці з використанням t-критерію Стьюдента, розходження вважали достовірними при p <0,05 [98].
РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ.
3.1. РЕГІОНАЛЬНЕ і тканинної РОЗПОДІЛ АКТИВНОСТІ ВПП, ФМСФ-ІНГІБІРУЕМОЙ КП І АПФ у самців щурів.
Відомо, що рівень біологічно активних пептидів регулюється пептідгідролазамі, які отщепляют залишки аргініну і лізину з С-кінця пропептид. Неоднорідний розподіл нейропептидів, а також різниця протягом процесингу регуляторних пептидів у тканинах (нервової і периферичної) [14, 212, 271] вказують на необхідність вивчення тканинного і регіонального розподілу активності ферментів їх обміну. Особливий інтерес викликає вивчення розподілу активності ФМСФ-інгібіруемой КП - ферменту, біологічна роль якого в повній мірі не визначена. Важливим видається, також, порівняння рівня активності цього ферменту з активністю ВПП та АПФ - ферментів, тканинне і регіональний розподіл і біологічна роль яких відомі.
Результати дослідження розподілу активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ у відділах мозку та деяких периферичних тканинах представлені в таблиці 1 (додаток).
3.1.1.Распределеніе активності ВПП.
Максимальна активність ВПП виявлена в гіпофізі - відділі, синтезирующем групу біологічно активних пептидів. У відділах мозку активність ВПП приблизно в 6-7 разів нижче, ніж у гіпофізі. За зменшенням активності ВПП відділи мозку можна розташувати наступним чином: середній мозок, гіпоталамус, гіпокамп. У цих регіонах мозку секреторні пептиди не синтезуються, проте дані відділи характеризуються досить високим їх вмістом [221]. Далі за спаданням активності ВПП слідують стріатум і великі півкулі, рівень активності ферменту, в яких приблизно однаковий. У сім'яниках і наднирниках активність ВПП на порядок нижче, ніж у відділах мозку.
Таким чином, висока активність ВПП виявлена у відділах мозку, пов'язаних з утворенням, секрецією або високим вмістом регуляторних пептидів [221]. Отримані дані добре узгоджуються з літературними про розподіл активності ВПП [39, 40, 193, 194].
Слід вказати на те, що в наших дослідженнях активність ВПП визначалася як активність, інгібіруемая ГЕМЯК, що є високоспецифічним інгібітором ВПП, у той час як інші автори використовували дані по активності ВПП, стимулируемой іонами Со 2 + [188, 193, 194], що припускає дещо завищені результати, не завжди відповідні дійсному рівню активності цього ферменту в мозку і тканинах. У зв'язку з цим значення активності ВПП у наших дослідженнях трохи нижче значень, що є в літературі.
3.1.2. Розподіл активності АПФ.
Максимальна активність АПФ у інтактних тварин виявлена в гіпофізі. У стріатумі активність АПФ приблизно в 3 рази нижче. В інших відділах мозку і наднирниках активність ферменту знаходиться на рівні межі чутливості методу. Висока активність АПФ виявлена також у насінниках.
Таким чином, отримані дані добре узгоджуються з розподілом регуляторних пептидів в мозку і периферичних тканинах щурів, що підтверджує участь даного ферменту в процесах модифікації білків і пептидів в цих регіонах.
3.1.3.Распределеніе активності ФМСФ-інгібіруемой КП
Отримані дані свідчать, що активність ФМСФ-інгібіруемой КП виявлена у всіх досліджуваних регіонах мозку і периферичних тканинах щурів (табл.1). Найбільша активність ферменту показана в наднирниках, в гіпофізі активність становить 74% від активності ФМСФ-інгібіруемой КП в наднирниках, в інших відділах активність приблизно однакова і становить 23% від активності ферменту в гіпофізі.
Дані наших досліджень про порівняно високої активності ФМСФ-інгібіруемой КП у надниркових і гіпофізі, відділах, що характеризуються високим вмістом нейропептидів, а також їх інтенсивним метаболізмом [14, 34], вказують на ймовірність залучення цього ферменту в обмін біологічно активних пептидів.
Порівняння регіонального розподілу ВПП і ФМСФ-інгібіруемой КП показує деяку схожість, так максимальний рівень активності цих ферментів відзначений у гіпофізі. Однак якщо активність ФМСФ-інгібіруемой КП характеризується високими показниками в наднирниках, де синтезується велика кількість енкефалінів, то для ВПП ці значення на порядок нижче. Крім того, відмінності у рівні активності ФМСФ-інгібіруемой КП, виявлені між гіпофізом та відділами мозку, менш значні в порівнянні з такими для ВПП. Отримані дані дозволяють висунути припущення про деякі відмінності у біологічній функції цих ферментів. Ймовірно, що ВПП і ФМСФ-інгібіруемая КП беруть участь в обміні різних регуляторних пептидів або в процесах модифікації одних і тих же нейропептидів, але на різних етапах їх обміну.
3.2. ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ ГОСТРОГО емоційно-больового стресу НА АКТИВНІСТЬ ВПП, ФМСФ-ІНГІБІРУЕМОЙ КП І АПФ
Відомо, що вплив стрес-факторів викликає значні зміни у функціонуванні багатьох систем організму, таких як гіпоталамо-гіпофізарно-надниркова (ГГНС), симпато-адреналової (САС) та ін [5, 21, 76, 270]. Невід'ємною частиною розвиваються гормонально-медіаторних змін при стресі є активація пептідергіческіх систем головного мозку і периферичних тканин [8, 91, 111, 137]. Однією з найбільш багатофункціональних регуляторних систем, що діють в умовах стресу і адаптації, є система ендогенних опіоїдних пептидів [116, 118, 242]. Виявлено, зокрема, що стрес-вплив є стимулюючим фактором, що приводить до генералізованої активації стрес-лімітуючої енкефалінергічного системи [79, 100, 101]. Причому, найбільш виражене підвищення адаптивних здібностей організму досягається при короткочасному гострій дії стрес-факторів [144, 145]. У зв'язку з цим, нетривалий гостре стрессірованіе розглядається як фізіологічно адекватний спосіб вивчення властивостей ендогенних регуляторних пептидів при екстремальних впливах. Крім того відомо, що сильні подразники, такі як електричний струм, різкий звук, викликають підвищення проникності ГЕБ для ендогенних біологічно активних речовин, синтезованих у відповідь на стрес-вплив [88, 97].
Практично не вивчені ферментативні механізми, що забезпечують обмін регуляторних пептидів при гострому ЕБС. Відомо, що рівень нейропептидів при різних фізіологічних і патологічних станах, а, отже, і ступінь реалізації відповідної реакції організму на вчинений вплив, залежать від прояву функціональної активності ферментів їх обміну. Участь ВПП та АПФ в освіті та / або деградації енкефалінів, пептидних гормонів гіпофізу та інших регуляторних пептидів при стресі сьогодні не викликають сумнівів. Що ж стосується включення в процеси обміну нейропептидів ФМСФ-інгібіруемой КП, то, на даний момент, це є лише припущенням. У зв'язку з цим, для більш детального визначення біологічної ролі цього маловивченого ферменту, особливий інтерес викликає порівняння змін активності ФМСФ-інгібіруемой КП з активністю ВПП та АПФ при гострому емоційно-больовому стресі (ЕБС). Великий інтерес у зв'язку з даними про тривалий і фазному викиді нейропептидів при дії стрес-факторів [134, 135, 144], викликає вивчення динаміки зміни активності досліджуваних ферментів.
Проведено дослідження впливу гострого ЕБС на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ в головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів через 0,5 години, 4 години, 24 години, 72 години і 10 діб після впливу гострого ЕБС. Порівняння активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ проводилося відносно інтактною групи тварин (норма). Результати даної серії дослідження представлені в таблиці 2 (додаток).
3.2.1. Активність ВПП у головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів при дії гострого емоційно-больового стресу
Виявлено, що гострий ЕБС викликав статистично достовірне зміна активності ВПП у всіх досліджених відділах мозку і гіпофізі (табл.2, рис.1). Активність ВПП у надниркових і сім'яниках щурів при дії гострого ЕБС практично не змінювалася. Показано, що зміни активності досліджуваного ферменту у відділах мозку і гіпофізі відрізнялися за динамікою, спрямованості і ступеня вираженості. Найбільш виражене підвищення активності ВПП виявлено в гіпофізі і стріатумі. У гіпокампі, середньому мозку і наднирниках після впливу ЕБС відзначено зниження активності ВПП.
Активність ВПП у гіпофізі через 0,5, 4, 24 і 72 години була вище норми. Найбільш істотне підвищення активності ферменту відзначалося через 0,5 і 72 години після впливу гострого ЕБС, активність ВПП перевищувала показники інтактних тварин на 43%, p <0,01 і 54%, p <0,001, відповідно. Через 10 діб статистично достовірних відхилень від норми не виявлено
У стріатумі активність ферменту підвищувалася поступово. Максимальне підвищення активності ферменту відзначалося через 24 години після початку впливу стрес-фактора і відрізнялося від контрольного рівня на 44%, p <0,01. Через 72 години активність ВПП становила 133%, p <0,05, від показників активності ферменту у інтактних тварин. Через 10 діб достовірних змін не виявлено.
У великих півкулях гострий ЕБС викликав статистично значуще збільшення активності ВПП через 72 години (+33%, p <0,05) після початку експерименту.
Через 4 години після впливу гострого ЕБС активність ВПП у середньому мозку і гіпокампі була нижче показників активності інтактних тварин на 18%, p <0,05 і 32%, p <0,01, відповідно.
У наднирниках активність ВПП також знижена в порівнянні з показниками активності тварин, не піддавалися впливу ЕБС через 4 і 24 години на 40%, p <0,05.
Таким чином, найбільш виражені зміни активності ВПП при гострому ЕБС спостерігалися в гіпофізі. Отримані дані узгоджуються з даними про збільшення синтезу і секреції гормонів гіпофізу пептидної природи при стресі [232], а також з даними про підвищення активності ВПП при інших видах стресу [42, 64]. Висока активність ферменту виявлена також у стріатумі - відділі, де синтезуються такі нейропептиди, як енкефаліни, речовина Р, тобто біологічно активні пептиди володіють вираженим антистресовий дією, [134, 153].
3.2.2. Активність ФМСФ-інгібіруемой КП в головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів при дії гострого емоційно-больового стресу
Вплив ЕБС на активність ФМСФ-інгібіруемой КП спостерігається практично у всіх відділах мозку, гіпофізі, надниркових і сім'яниках, проте динаміка зміни активності відрізняється від такої для ВПП (табл.2, рис.2).
Так у всіх відділах мозку після гострого ЕБС активність ФМСФ-інгібіруемой КП була трохи нижче показників активності інтактних тварин через 0,5, 4 і 24 години при цьому статистично достовірних відмінностей від норми виявлено не було. Через 72 години після початку впливу активність ФМСФ-інгібіруемой КП підвищувалася і становила в гіпофізі - 123%, p <0,01, у середньому мозку - 119%, p <0,05, в гіпоталамусі - 121%, p <0,01 , в гіпокампі - 127%, p <0,01, у великих півкулях - 157%, p <0,001 від активності ферменту в нормі (рис.2).
На відміну від ВПП, найбільш виражені зміни активності ФМСФ-інгібіруемой КП у порівнянні з групою інтактних тварин відзначені в наднирниках. Так через 4 і 24 години після гострого ЕБС активність ферменту була нижче показників норми на 12 (p <0,05) і 21 (p <0,01)%, відповідно. Потім активність ФМСФ-інгібіруемой КП підвищувалася і через 72 години перевищувала показники активності інтактних тварин на 57%, p <0,01.
У сім'яниках статистично достовірні зміни в активності ФМСФ-інгібіруемой КП у порівнянні з інтактною групою тварин виявлені тільки через 0,5 години. Активність ферменту в цьому регіоні перевищувала показники групи тварин, що не піддавалися впливу стресу, на 50%.
Таким чином, при дії гострого ЕБС статистично достовірні відхилення активності від норми, у всіх досліджуваних відділах мозку і наднирниках, відзначені лише через 72 години після початку впливу. На відміну від ВПП максимальне підвищення активності ферменту виявлено у великих півкулях і наднирниках. Отримані відомості можуть свідчити про відмінність в біологічної функції ВПП і ФМСФ-інгібіруемой КП при стресі.
3.2.3. Активність АПФ в головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів при дії гострого емоційно-больового стресу
Результати визначення активності АПФ в головному мозку, надниркових і сім'яниках при дії гострого ЕБС наведені в табл.2 і на рис.3.
Отримані дані показують, що при дії гострого ЕБС статистично достовірних змін активності АПФ у головному мозку, гіпофізі та наднирникових залозах не виявлено. Гострий ЕБС викликав зміну активності АПФ у насінниках.
Активність ферменту через 0,5 години після початку стрес-впливу була вищою за норму на 51%, p <0,05. Через 4 години активність знижувалася і до 72 годин залишалася приблизно на одному рівні. Показники активності при цьому були нижче відповідних показників групи інтактних тварин на 11-23%. Через 10 діб після гострого ЕБС достовірних відмінностей від норми не виявлено.
У середньому мозку, гіпокампі, гіпоталамусі і великих півкулях активність АПФ була нижче рівня чутливості методу визначення (табл.2).
У гіпофізі і стріатумі через 4 години після впливу гострого ЕБС виявлено достовірне зниження активності АПФ. Активність ферменту в цих відділах була нижче відповідних показників активності тварин, не піддавалися впливу гострого ЕБС на 28%, p <0,01 і 32%, p <0,01, відповідно.
Таким чином, виявлено, що гострий ЕБС викликав зниження активності АПФ у гіпофізі і стріатумі через 4 години. У сім'яниках через 0,5 години після впливу виявлено підвищення, а 4 і 24 години зниження активності ферменту. В інших відділах мозку і наднирниках активність ферменту характеризується дуже низькими показниками.
Отримані дані показують, що при дії гострого ЕБС активність ВПП змінювалася у всіх досліджуваних регіонах мозку і гіпофізі, активність ФМСФ-інгібіруемой КП у всіх відділах мозку (виняток стріатум), гіпофізі, надниркових і сім'яниках і активність АПФ - у гіпофізі, стріатумі і насінниках. Виявлено, що гострий ЕБС викликав різні за динамікою, ступеня вираженості і спрямованості зміни активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ. Найбільш виражене підвищення активності ВПП зазначено у гіпофізі - через 0,5 і 72 години і стріатумі - через 24 години. У середньому мозку і гіпокампі показано зниження активності ферменту через 4 години після впливу стресу. На відміну від ВПП найбільш виражене підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП в головному мозку, гіпофізі та надниркових зазначалося через 72 години після початку стрес-впливу. Гострий ЕБС викликав різноспрямовані зміни активності АПФ у насінниках. Активність ферменту в гіпофізі і стріатумі через 4 години після впливу знижувалася. В інших відділах мозку і наднирниках змін активності АПФ не виявлено.
3.3. ДОСЛІДЖЕННЯ Вплив попередників ЛЕЙ-енкефалінів НА АКТИВНІСТЬ ВПП, ФМСФ-ІНГІБІРУЕМОЙ КП І АПФ
Останнім часом інтенсивний розвиток отримало вчення про пептидах - природних регуляторах, причому, саме малих пептидів, здатних проникати в клітину, взаємодіючи з клітинними рецепторами. Швидка реакція організму на введення пептидів, висока біологічна активність, ендогенне походження - усі ці важливі якості привертають увагу багатьох дослідників. Особливо цікаві в цьому відношенні енкефаліни.
Відомо, що при периферичному введенні нейромедіаторів, в тому числі і опіоїдних пептидів, зазначається загальна закономірність: самі речовини практично не проходять гематоенцефалічний бар'єр, у той час як їхні найближчі попередники добре проникають до структур мозку і викликають відповідні зміни у функціонування інших систем, зокрема тих , які включаються у відповідь організму на дію екстремального фактору [82]. Результати цих робіт з'явилися визначаються-ючим фактором для використання в наших дослідженнях попередника лей-енкефаліну - лей 5-енкефалінів-арг 6.
Відомо, що екзогенне введення додаткового джерела рідини призводить до зміни у функціонуванні пептідергіческіх систем, таких як ренін-ангіотензинова, гіпофізарно-надниркова та опіоідергіческая [34, 86, 104, 125, 134], діяльність яких багато в чому визначається ферментами обміну біологічно активних пептидів. Безсумнівно, що подібний вплив відбивається і на активності цих ферментів. Згідно з даними досліджень, при введенні фізіологічного розчину у відділах мозку відзначається збільшення активності ВПП [46]. Зміни такого характеру можуть бути пов'язані, перш за все, з реакцією організму на введення надлишкової кількості рідини, а також з розвитком стресорні ушкоджень, викликаних внутрішньочеревно ін'єкцією. Показано, що введення фізіологічного розчину методом инстиляции на кон'юнктиву ока, є досить м'яким способом введення, не травмуючи тварина [119]. У зв'язку з цим, а, також, враховуючи той факт, що нашим дослідженням передбачено вивчення механізмів виникнення і розвитку стрес-реакції, найбільш кращим буде саме цей спосіб введення. Крім того, метод інстиляції речовини на кон'юнктиву ока дозволяє використовувати мінімальний обсяг рідини, забезпечує високу ймовірність проникнення речовини крізь гематоенцефалічний бар'єр [1, 24, 119], що передбачає активне включення вводиться речовини в обмін регуляторних пептидів у досліджуваних регіонах.
Активність досліджуваних ферментів обміну нейропептидів - ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ - у мозку, надниркових і сім'яниках щурів визначалася через 0,5 години, 4 години, 24 години, 72 години і 10 діб після інстиляції лей-енкефалінів-арг в дозі 20 мкг / кг ваги тварини. Порівняння рівня активності ферментів при введенні лей-енкефалінів-арг проводилося відносно інтактною групи тварин (контроль). Отримані дані представлені в таблиці 3 (додаток).
3.3.1. Активність ВПП у головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів при введенні лей-енкефалінів-арг.
При введенні лей-енкефалінів-арг у всіх досліджених відділах мозку і тканинах спостерігалося підвищення активності ВПП щодо контрольної групи тварин (табл. 3, рис.4). Найбільш виражені зміни активності ферменту виявлено в гіпофізі, стріатумі і наднирниках. Статистично достовірні зміни активності ВПП у досліджених відділах мозку і периферичних тканинах відзначені вже через 0,5 години після введення лей-енкефалінів-арг. Крім того, показано досить тривала дія досліджуваного пропептид, що проявлялося підвищенням активності ВПП до 72 годин після введення попередника у відділах і тканинах, пов'язаних з утворенням і секрецією біологічно активних пептидів. Так у гіпофізі активність ферменту була вище відповідних показників контрольної групи тварин через 0,5, 4, 24 і 72 години на 152, 111, 64 і 78%, відповідно, p <0,001. Через 10 діб достовірних змін не виявлено. Схожа динаміка зміни активності ВПП виявлена в середньому мозку, гіпоталамусі, гіпокампі і великих півкулях, проте в них зміни носили менш виражений характер. Максимальне підвищення активності ферменту відзначено також через 0,5 години, потім активність ВПП плавно знижувалася. Через 10 діб статистично достовірних змін виявлено не було. У стріатумі, відділі, де синтезуються багато нейропептиди [62, 156, 221], зміни носили більш виражений характер, ніж в інших досліджуваних відділах мозку і дещо відрізнялися від останніх динамікою. Так, активність ВПП у них перевищувала відповідні показники групи контрольних тварин через 0,5 години на 139%, p <0,001, через 4 години активність знижувалася (+56%, p <0,001), а через 24 і 72 години відзначений сплеск активності ВПП ( +72%, p <0,001).
Схожа з стріатума динаміка зміни активності ВПП показана в наднирниках, органі пов'язаному переважно з утворенням енкефалінів, проте підвищення активності ВПП щодо контрольної групи тварин було більш вираженим. Активність ферменту перевищувала контрольні показники на 150, 100,130 та 80%, p <0,001, через 0,5, 4, 24 і 72 години відповідно. У сім'яниках активність ВПП була вище показників контрольної групи тварин протягом усіх досліджуваних проміжків часу і перевищувала їх в 1,8-2 рази.
Таким чином, введення лей-енкефалінів-арг викликає в цілому подібний характер зміни активності ВПП: підвищення через 0,5 години і подальше зниження з незначними коливаннями, що свідчить про включення даного ферменту в реакцію організму на введення попередника енкефаліну.
3.3.2. Активність ФМСФ - інгібіруемой КП в головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів при введенні лей-енкефалінів-арг
При введенні лей-енкефалінів-арг у всіх досліджуваних відділах мозку і наднирниках спостерігалося достовірне підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП у порівнянні з показниками контрольної групи (табл. 3, рис.5). Найбільш виражені зміни активності ферменту виявлено у надниркових і гіпоталамусі. У сім'яниках активність ФМСФ-інгібіруемой КП була нижче відповідних контрольних показників. Схожа динаміка зміни активності ферменту виявлена в гіпофізі, середньому мозку, гіпоталамусі, стріатумі і наднирниках. У гіпокампі, великих півкулях і сім'яниках зміни носили дещо інший характер.
Максимальне підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП відзначалося через 0,5 години після введення лей-енкефалінів-арг. Найбільш виражене підвищення активності ферменту показано в наднирниках, де активність ФМСФ-інгібіруемой КП перевищувала показники контрольної групи тварин на 184%, p <0,001. Потім в порядку убування досліджувані відділи розташовуються в такий спосіб: гіпоталамус (+130%, p <0,001), гіпокамп (+109%, p <0,001), в гіпофізі і середньому мозку активність ФМСФ-інгібіруемой КП перевищувала контрольні показники в 2 рази, p <0,001, в стріатумі на 88%, p <0,001, у великих півкулях на 46%, p <0,001. Через 4 години статистично достовірне підвищення активності зареєстровано тільки в наднирниках (+140%, p <0,001), середньому мозку (+74%, p <0,01), гіпоталамусі (+52%, p <0,01), гіпофізі ( +37,5%, p <0,01) і стріатумі (+29%, p <0,01). Через 24 години підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП у порівнянні з контрольними показниками виявлено не було. Через 72 години підвищена в порівнянні з контролем активність ферменту відзначена в гіпофізі (+38%, p <0,05)
Таким чином, можна виділити наступні закономірності у впливі лей-енкефалінів-арг на активність ФМСФ - інгібіруемой карбоксипептидази: підвищення активності ферменту практично у всіх відділах мозку і наднирниках через 0,5 і 4 години і подальше зниження її. Найбільш істотне і тривале підвищення активності ферменту при введенні лей-енкефалінів-арг виявлено у відділах, пов'язаних із синтезом і секрецією регуляторних пептидів. Показана динаміка зміни активності ферменту схожа з такою ВПП, що свідчить про включення ФМСФ-інгібіруемой КП, поряд з ВПП, у відповідну реакцію організму на введення попередника лей-енкефаліну.
3.3.3. Активність АПФ в головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів при введенні лей-енкефалінів-арг
При одноразової інстиляції лей-енкефалінів-арг статистично достовірні відхилення в активності АПФ виявлені в гіпофізі, стріатумі і сім'яниках (табл. 3, рис.6). В інших відділах мозку і наднирниках статистично значущих змін активності ферменту не відзначено.
Активність ферменту в сім'яниках, гіпоталамусі, стріатумі і гіпофізі і через 0,5 години після введення лей-енкефалінів-арг перевищувала показники контрольної групи тварин на 116, 83, 63 і 56% відповідно, p <0,001. Активність АПФ через 4, 24, 72 і 240 годин на стріатумі і гіпофізі практично не відрізнялася від показників інтактної групи тварин.
У сім'яниках відзначено більш тривалий вплив лей-енкефалінів-арг на активність АПФ, тут вона перевищувала контрольні значення через 4 і 24 години на 47%, p <0,01 і 26%, p <0,05 відповідно. Через 72 години зміни вже не носили статистично достовірного характеру.
Таким чином, динаміка зміни активності АПФ при введенні лей-енкефалінів-арг дещо відрізняється від такої для ВПП і ФМСФ-інгібіруемой КП, як у відділах мозку, так і в периферичних тканинах. Що свідчить про специфічну роль АПФ, у досліджених регіонах. Показане істотне і досить тривале підвищення активності АПФ в сім'яниках при одноразової інстиляції лей-енкефалінів-арг, ймовірно, свідчить про включення даного ферменту в процеси синтезу біологічно активних пептидів в даній тканині.
Порівняння рівня активності досліджуваних пептид-гідролаз показує наявність низки схожих рис в динаміці зміни активності ферментів. Так ВПП і ФМСФ-інгібіруемая КП практично у всіх досліджених відділах мозку і тканинах, а також АПФ у гіпофізі, стріатумі і сім'яниках характеризуються достовірним підвищенням активності через 0,5 і 4 години. Найбільш виражений характер зміни носили в тих відділах мозку та органах, які характеризуються підвищеним вмістом таких регуляторних пептидів як ПВДС, енкефаліни, речовина Р [156]. Збільшення активності досліджуваних ферментів при введенні лей-енкефалінів-арг показано також у відділах синтезують нейропептиди. Отримані дані, свідчать про включення ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ у відповідь організму на введення попередника лей-енкефаліну.
3.4. ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ ЛЕЙ-енкефалінів-АРГ НА АКТИВНІСТЬ ВПП, ФМСФ-ІНГІБІРУЕМОЙ КП І АПФ IN VITRO
Згідно з літературними даними активність ВПП in vitro пригнічується такими нейропептидами, як енкефаліни, вазопресин, речовина Р, окситоцин [207]. Подібна дія надають опіоїдні пептиди і b-ліпотропін на активність АПФ [160].
Особливий інтерес для з'ясування механізмів дії екзогенно-введеного лей-енкефалінів-арг становить дослідження in vitro впливу попередника лей-енкефаліну на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ. Отримані дані представлені в таблиці 3.
У дослідах in vitro на ізольованих наднирниках, гіпофізі і великих півкулях виявлено, що додавання лей-енкефалінів-арг в концентрації 2,4 мМ, призводить до пригнічення активності ВПП та АПФ. Більш виражене пригнічення активності ВПП та АПФ виявлено в наднирниках. Активність ФМСФ-інгібіруемой КП в ізольованих наднирниках, гіпофізі і великих півкулях in vitro практично не змінюється в порівнянні з контрольними пробами.
Як було показано вище, в дослідах in vivo активність ферментів при інстиляції пропептид підвищувалася. Виявлене невідповідність у впливі лей-енкефалінів-арг на активності досліджуваних ферментів обміну регуляторних пептидів in vitro та in vivo показує, що вплив попередника лей-енкефаліну на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ опосередковано.
ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ ЛЕЙ-енкефалінів-АРГ НА АКТИВНІСТЬ ВПП, ФМСФ-ІНГІБІРУЕМОЙ КП І АПФ НА ТЛІ ГОСТРОГО емоційно-больовий стрес.
Відомо, що корекція наслідків гострих стрес-впливів з використанням традиційних засобів у більшості випадків не є достатньо ефективною. Видимий після впливу стресу невідповідність процесів синтезу і секреції багатьох регуляторних пептидів, а також блокада їх рецепторів продуктами метаболізму призводить до виснаження нейрогуморальних систем [22, 106, 111, 176]. Одним із способів природної профілактики пошкоджень, викликаних надмірною реакцією на дію екстремальних факторів, є активація ендогенної стрес-лімітуючої системи опіоїдних пептидів за рахунок їх екзогенного введення [116, 135]. Однак поліфункціональність опіоїдів, стає лімітуючим фактором для їх застосування при різних патологіях ЦНС. Відомо, що введення ззовні енкефалінів, їх попередників і синтетичних аналогів, стійких до дії пептідгідролаз, може значною мірою послабити або навіть усунути патологічні зміни в умовах різних видів стрес-впливу [23, 69, 102]. При цьому, особливості фармакологічної дії енкефалінів залежать від їх ензімоустойчівості і стабільності в крові, здатності проникати через гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ).
Відомо, що при стресі попереднє введення лей-енкефаліну або його синтетичного аналога даларгін зменшує підйом рівня кортикостерону в організмі - одного з компанентов стрес-реалізуючих систем [69, 105, 123]. Вважають, що екзогенно вводяться опіоїдні пептиди можуть сприяти "запуску" низки ендогенних реакцій синтезу або деградації інших біологічно активних пептидів, в тому числі і володіють антистресовий дією [11, 13, 78, 113, 119]. Відомо, що освіта і інактивація регуляторних пептидів здійснюється за участю ферментів пептид-гідролаз.
У зв'язку з вищесказаним цікавим видається дослідження впливу попередника лей-енкефаліну на активність досліджуваних ферментів обміну регуляторних пептидів в динаміці гострого ЕБС.
Проведено дослідження впливу лей-енкефалінів-арг на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ в головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів, схильних до гострого ЕБС. Попередник лей-енкефаліну вводився безпосередньо перед початком стрессірованія в дозі 20 мкг / кг ваги тварини. Активність ферментів у головному мозку, надниркових і сім'яниках щурів визначали через 0,5 години, 4 години, 24 години, 72 години і 10 діб після спільного впливу пропептид і гострого ЕБС. Порівняння отриманих даних проводилося відносно відповідних показників активності ферментів інтактних і тварин, схильних до ЕБС. Результати дослідження представлені в таблицях 5-7 (додаток) і рис. 7-9.
3.5.1. Активність ВПП при введенні лей-енкефалінів-арг на тлі гострого ЕБС.
Дані проведених досліджень (табл.5, рис. 7) показують, що при введенні попередника лей-енкефаліну стресованих тварин, активність ВПП змінюється в тих відділах мозку, які, за класичними уявленнями, пов'язані із синтезом стрес-протективних речовин [14, 140, 156, 185]. Найбільш виражене підвищення активності ферменту, у порівнянні і групою інтактних тварин, виявлено в гіпофізі, стріатумі, гіпоталамусі і великих півкулях. Істотне підвищення активності відзначено також у насінниках. Як було показано вище (розділ 3.2.1.) Активність ВПП у гіпофізі і стріатумі при дії гострого ЕБС також підвищується.
Однак, як показують дані проведених досліджень, зміни активності ВПП у групи тварин, яким на тлі стресу вводився лей-енкефалінів-арг відрізняється від таких при впливі гострого ЕБС з динаміки і ступеня вираженості.
Введення лей-енкефалінів-арг перед початком стрес-впливу запобігало підвищення активності ВПП у гіпофізі (табл.5, рис.7). Активність ферменту через 0,5 і 4 години не відрізнялася від норми. Через 24 і 72 години вона була вища за активність ферменту у інтактних тварин на 21% (p <0,05) і 40% (p <0,01), відповідно (рис.7). Однак підвищення активності ВПП було меншим порівняно з тваринами, не отримували лей-енкефалінів-арг перед стресом (рис.7). Через 10 діб статистично значущих змін активності ферменту, в порівнянні з нормою і з стресованих тварин, виявлено не було.
У стріатумі через 0,5 і 4 години активність ВПП перевищувала показники інтактних тварин на 28% (p <0,001) і 33% (p <0,01) і стресованих тварин на 28% (p <0,01) і 20% ( p <0,01), відповідно (табл.5, рис.7). Через 24 години не відрізнялася від активності ферменту в обох порівнюваних груп. Через 72 години активність ВПП була вищою за норму на 39% (p <0,01) і не відрізнялася від такої при стресі. Через 10 діб після спільного впливу лей-енкефалінів-арг і гострого ЕБС активність ферменту не відрізнялася показників норми і стресованих тварин.
Статистично достовірне підвищення активності ВПП, як у порівнянні з інтактними тваринами, так і в порівнянні з групою тварин, підданих впливу гострого ЕБС, відзначалося через 4 години в великих півкулях - відділі, що характеризується високим вмістом нейропептидів (табл.5, рис.7). Активність ферменту при цьому перевищувала відповідні показники на 33% (p <0,01).
Попереднє введення перед стресом лей-енкефалінів-арг запобігало зниження активності ВПП у середньому мозку і гіпокампі через 4 години після впливу. Активність ферменту при цьому практично не відрізнялася від норми і перевищувала відповідні показники стресованих тварин на 33% (p <0,01) у середньому мозку і на 63% (p <0,001) в гіпокампі (рис.7). Через 0,5, 24, 72 години і 10 діб після спільного впливу лей-енкефалінів-арг і стресу не відрізнялася від такої у обох порівнюваних груп (рис.7).
У наднирниках через 0,5, 24, 72 години і 10 діб активність ВПП не відрізнялася від відповідних показників стресованих та інтактних тварин, а через 4 години була вище за таку, у тварин схильних до впливу гострого ЕБС (117%, p <0,001) і не відрізнялася від норми (рис.7).
У сім'яниках після спільного впливу двох факторів виявлені статистично достовірні відмінності від групи інтактних тварин. Активність ВПП у них через 0,5 і 4 години перевищувала відповідні показники норми на 50%, p <0,01 (рис.7).
Таким чином, попереднє введення лей-енкефалінів-арг способом інстиляції на кон'юнктиву ока тваринам перед гострим ЕБС запобігало, виявлене при стресі, підвищення активності ВПП у гіпофізі, зниження активності ферменту в середньому мозку і гіпокампі, і, навпаки, призводило до підвищення активності ферменту в стріатумі гіпоталамусі і великих півкулях.
Отримані дані показують, що при спільній дії гострого ЕБС і попередника лей-енкефаліну зміни в активності ВПП у всіх досліджених регіонах мозку і тканинах, носять менш виражений характер, ніж при дії тільки лей-енкефалінів-арг, де активність ферменту підвищується в 1,5 -2 рази (рис. 4).
3.5.2. Активність ФМСФ - інгібіруемой КП при введенні лей-енкефалінів-арг у щурів на тлі гострого ЕБС.
При введенні попередника лей-енкефаліну стресованих тварин у всіх досліджених відділах мозку і тканинах відмічено підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП у порівнянні з нормою (табл.6, рис.8). Динаміка зміни активності дещо відрізняється від такої для ВПП. Крім того, слід зазначити, що якщо при дії гострого ЕБС підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП, в порівнянні з нормою, виявлено через 72 години, то при спільній дії двох факторів зміни такого роду відзначаються вже через 0,5 години після початку впливу. Потім активність ФМСФ-інгібіруемой КП плавно знижується і через 24 години наближається до норми. Через 72 години і 10 діб активність ферменту у всіх відділах мозку і тканинах (виняток насінники) близька до показників інтактних щурів.
Найбільш виражене підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП у порівнянні з групою інтактних і стресованих тварин зазначено в гіпофізі і великих півкулях (рис.8) через 0,5 години після спільного впливу пропептид і гострого ЕБС. Активність ферменту в гіпофізі і великих півкулях була вищою за норму на 26,5 і 26% (p <0,05) (рис. 8), відповідно і перевищувала відповідні показники стресованих тварин на 46% (p <0,05) і 38% (p <0,01) (рис. 8). В інші проміжки часу статистично достовірних відмінностей не виявлено, тобто показники активності були близькі до відповідних показників інтактних тварин. Виявленого після впливу гострого ЕБС підвищення активності ВПП через 72 години (рис.2) не зазначено (рис.8). Активність ферменту в гіпофізі і великих півкулях через 72 години після спільного впливу лей-енкефалінів-арг і гострого ЕБС була нижче відповідних показників стресованих тварин на 26% (p <0,01) і 30% (р <0,001), відповідно (рис. 8).
Динаміка зміни активності ФМСФ-інгібіруемой КП в наднирниках при впливі попередника лей-енкефаліну й гострого ЕБС була схожою з такої в гіпофізі і великих півкулях, проте, зміни були менш виражені (рис.8). Активність ферменту в них також перевищувала показники тварин, підданих впливу гострого ЕБС та інтактних тварин через 0,5 години на 21% (p <0,05) і 15% (p <0,05), відповідно.
У гіпоталамусі, гіпокампі і сім'яниках при введенні пропептид стресованих тварин активність ФМСФ-інгібіруемой КП перевищувала показники обох порівнюваних груп через 0,5 і 4 години, 0,5 години і 4, 24 і 72 години, відповідно (рис. 8).
Введення лей-енкефалінів-арг перед початком стресу викликало суттєве в порівнянні з стресованих тваринами підвищення активності в середньому мозку через 0,5 і 4 години на 41% (p <0,01) і 24% (p <0,05), відповідно (рис.8). Активності ферменту при цьому практично не відрізнялася від інтактних тварин (рис. 8).
Схожа тенденція спостерігалася в стріатумі, тут активність ФМСФ-інгібіруемой КП через 0,5 години перевищувала відповідні показники групи тварин, які піддавалися впливу гострого ЕБС на 32%, p <0,05 і не відрізнялася від норми у всі досліджувані проміжки часу. Введення попередника лей-енкефаліну запобігало виявлене при стресі підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП в стріатумі через 72 години (рис.8).
Таким чином, практично у всіх досліджених регіонах мозку введення лей-енкефалінів-арг перед гострим ЕБС викликало підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП через 0,5 години, у порівнянні з відповідними показниками стресованих тварин і запобігало підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП через 72 години. Активність ферменту при цьому була близька до норми.
Дані досліджень показують, що у всіх досліджених відділах мозку і тканинах активність ФМСФ-інгібіруемой КП при спільній дії стресу і лей-енкефалінів-арг (рис.8) була нижче відповідних показників активності ферменту тварин, яким инстиллировать попередник пептиду (мал. 5).
3.5.3. Активність АПФ при введенні лей-енкефалінів-арг у щурів на тлі гострого ЕБС.
Отримані дані про зміну активності АПФ при введенні лей-енкефалінів-арг стресованих тварин представлені в таблиці 7 (додаток) і на рис. 9.
Результати дослідження показують, що при попередньому введення проенкефаліна статистично достовірні відмінності від групи інтактних тварин виявлені тільки в гіпофізі. Показники активності АПФ при цьому вище таких у інтактних тварин через 24 години на 36%, p <0,05 (рис.9).
При порівнянні змін активності АПФ при спільній дії лей-енкефалінів-арг і гострого ЕБС з відповідними показниками стресованих тварин статистично достовірні відхилення виявлені в гіпофізі через 24 години і в стріатумі через 4 години (рис.9). Активність АПФ при попередньому введенні лей-енкефалінів-арг перед стресом була вище показників активності стресованих тварин на 36% (p <0,001) і 40% (p <0,05), відповідно. В інші досліджені проміжки часу статистично достовірних змін не виявлено.
У сім'яниках через 0,5 години після введення лей-енкефалінів-арг активність АПФ була нижче відповідних показників тварин підданих впливу гострого ЕБС на 20% (p <0,05). Однак, вже через 4 години відмічено підвищення активності АПФ в порівнянні з групою стресованих тварин на 30% (p <0,01). В інші досліджені проміжки часу активність ферменту зберігалася на досить високому рівні і перевищувала показники активності АПФ стресованих тварин через 24 години на 23% (p <0,01), а через 72 години на 41% (p <0,01).
Таким чином якщо ЕБС у досліджуваних відділах мозку практично не викликав зміни активності АПФ, то введення лей-енкефалінів-арг на тлі гострого ЕБС викликає деякі зміни в активності АПФ в цих відділах, особливо яскраво ця тенденція простежується в гіпофізі через 24 години, а також у стріатумі через 4 години. Стійка динаміка збільшення активності АПФ показана також у насінниках.
Порівняння активності АПФ після введення лей-енк-арг стресованих тварин з введенням цього пропептид інтактним щурам показує, що більш виражений вплив на активність ферменту попередник лей-енкефаліну надає при введенні його тваринам, не піддається стрес-впливу.
Таким чином, введення лей-енкефалінів-арг перед початком гострого ЕБС викликає підвищення активності ВПП в порівнянні з відповідними показниками активності стресованих та інтактних тварин у стріатумі - відділі мозку, пов'язаному переваж-громадської із синтезом регуляторних пептидів стресспротектівного дії. Попереднє введення попередника лей-енкефаліну запобігало підвищення активності ВПП у гіпофізі - відділі, де синтезуються стрес-пептиди.
Введення лей-енкефалінів-арг перед гострим ЕБС викликало підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП через 0,5 години, у порівнянні з відповідними показниками стресованих тварин і запобігало підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП через 72 години. Особливо яскраво така тенденція простежується в тих відділах мозку і тканинах, де здійснюється синтез біологічно активних пептидів, що виявляють виражену антистресорну активність. Активність ФМСФ-інгібіруемой КП при цьому була близька до норми.
Аргінізірованний лей-енкефалінів впливав на активність АПФ головного мозку, надниркових залоз і сім'яників стресованих тварин у набагато меншій мірі, ніж на активність ВПП і ФМСФ-інгібіруемой КП. Найбільший вплив пептиду виявлено у сім'яниках.
Виявлено, що введення лей-енкефалінів-арг інтактним і стресованих тварин викликає різні за ступенем вираже-ності і спрямованості зміни активності досліджуваних ферментів. Найбільш значні зміни активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ виявлені у тварин, що не піддавалися впливу стресу.
ГЛАВА 4. ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ.
В даний час однією з найбільш актуальних проблем біохімії, фізіології і медицини є вивчення молекулярних механізмів виникнення і розвитку стресу. Особливу значимість при цьому набуває вивчення гострого стрес-впливу на організм, оскільки саме короткочасне імпульсне стрессірованіе призводить до екстреного підвищення адаптивних здібностей. Найменше вивчено вплив гострого емоційно-больового стресу (ЕБС). Важливу роль в усуненні та / або обмеження стресорні порушень відіграє система ендогенних опіоїдів [8, 14, 102, 106, 135, 236, 242]. Синтез природних опіоїдних пептидів і їх синтетичних аналогів відкрив перспективи для їх використання при різного роду стрес-пошкодженнях організму [123]. Було показано, що вираженим антистресовий дією володіють лей-і мет-енкефаліни, лей-енкефалінів-арг, синтетичний аналог лей-енкефаліну - даларгін [69, 105]. Незважаючи на коротку тривалість життя екзогенних опіоїдних пептидів в організмі, що проявляються ними ефекти зберігаються протягом досить тривалих проміжків часу [10, 11, 13, 119]. Одним з маловивчених питань в розумінні механізмів довготривалої післядії екзогенних опіоїдних пептидів є з'ясування шляхів утворення та інактивації інших регуляторних пептидів, синтезованих у відповідь на введення опіоїдів. Оскільки відомо, що рівень більшості біологічно активних пептидів і, отже, ступінь реалізації адаптаційних реакцій при стрес-пошкодженнях організму, в значній мірі визначається активністю пептідгідролаз, то особливий інтерес викликає вивчення механізмів регуляції активності ферментів обміну нейропептидів при стрес-вплив.
Виходячи з вищевикладеного, цікавим видається вивчення впливу екзогенного попередника лей-енкефаліну - лей 5-енкефалінів-арг 6 на активність деяких ферментів обміну нейропептидів - ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ в нормі і при дії гострого ЕБС.
Оскільки ВПП та АПФ беруть участь у формуванні стресової реакції організму, а додаткове екзогенне введення рідини тягне за собою виникнення стресу, то введення пропептид здійснювалося способом, який згідно з даними [1, 24, 119] найменше травмує тварина, забезпечує більш повне проникнення екзогенного речовини в мозок і дозволяє використовувати менші концентрації речовин - інстиляції на кон'юнктиву ока.
Істотну роль у прояві специфічної активності досліджуваних ферментів по відношенню до регуляторних пептидів грають особливості їх тканинної локалізації. У зв'язку з цим, представляється необхідним більш детальне вивчення регіонального і тканинного розподілу активності ВПП, ФМСФ - інгібіруемой КП та АПФ.
Максимальна активність ВПП у інтактних тварин показана в гіпофізі - відділі, де синтезуються стрес-пептиди і багато нейропептиди стрес-протективні дії (табл.1). Високий рівень активності ферменту виявлено також у гіпоталамусі, четверохолміе, стріатумі - відділах лімбічної системи, багатих опіоїдними та іншими нейропептидами [156, 168, 169, 221, 247]. Наднирники та насінники характеризуються низькими показниками активності ВПП. Отримані дані про регіональний і тканинному розподіл активності ВПП, добре узгоджуються з літературними [37, 187, 248]. Таким чином, отримані нами відомості про високий рівень активності цього ферменту у відділах мозку і тканинах, пов'язаних з утворенням і секрецією багатьох регуляторних пептидів [235] підтверджують участь ВПП у процессингу нейропептидів в цих регіонах.
Біологічна роль ФМСФ-інгібіруемой КП в організмі на цей момент залишається неясною. Відомості про тканинному і регіональному розподілі ФМСФ-інгібіруемой КП носять фрагментарний характер. У досліджених нами груп тварин висока активність ФМСФ-інгібіруемой КП виявлена у надниркових і гіпофізі (табл.1). Регіони мозку характеризуються більш низькими показниками, при цьому активність ФМСФ-інгібіруемой КП розподілена досить рівномірно. Отримані нами дані про розподіл активності ФМСФ-інгібіруемой КП узгоджуються з рівнем нейропептидів в цих структурах, що підтверджує раніше висунуті припущення [49, 53, 119, 149] про залучення цього ферменту в обмін регуляторних пептидів. Однак більш конкретне визначення ролі цього ферменту в обмінних процесах залишається на даному етапі відкритим питанням. У зв'язку з вищесказаним, представляється необхідним більш детальне вивчення деяких характеристик цього ферменту: порівняння рівня його активності з активністю ВПП - ферменту, біологічна роль якого визначена, а також дослідження розподілу активності ФМСФ-інгібіруемой КП у відділах мозку та органах при різних функціональних і патологічних станах організму.
Цікаво відзначити, що в гіпофізі - відділі, в якому синтези-ються багато нейропептиди і гормони пептидної природи [232], активність ВПП суттєво не відрізняється від такої для ФМСФ-інгібіруемой КП, в той час як у надниркових - відділі, де синтезуються переважно енкефаліни [33, 34], активність ФМСФ-інгібіруемой КП істотно вища за активність ВПП. Як показують дані деяких досліджень, пептидні гормони, що синтезуються в гіпофізі, містять в неактивній формі перед залишком основний амінокислоти залишки амінокислот - аланіну і гліцину [62]. Утворені в наднирниках енкефаліни містять в якості передостанніх залишки гідрофобних амінокислот (лейцину та метіоніну) [62]. Беручи до уваги, також, особливості регіонального розподілу ВПП і ФМСФ-інгібіруемой КП можна висловити припущення про участь цих ферментів у процессингу попередників нейропептидів, різних за своїм якісним складом. Можливо, що ФМСФ-інгібіруемая КП бере участь у процессингу проформ, що містять як попередньої основним амінокислотам - аргініну і лізину, гідрофобною амінокислоти. Що ж стосується ВПП, то вона, ймовірно, бере участь у процесах модифікації проформи з попередньою амінокислотою, яка містить короткий аліфатичний радикал (аланін і гліцин).
Досить високий рівень активності ФМСФ-інгібіруемой КП, в порівнянні з ВПП, виявлений в насінниках. Оскільки відомо, що насінники, поряд з утворенням деяких регуляторних пептидів, характеризуються і досить високим рівнем катаболізму білків, а властивості ФМСФ-інгібіруемой КП багато в чому схожі з такими в лізосомальної КПА (Кф 3.4.16.1), яка втягується в інтенсивний катаболізм білка, то показана висока активність ФМСФ-інгібі-руемой КП може бути свідченням залучення її в процеси інактивації регуляторних пептидів у периферичних тканинах. У зв'язку з цим, можна висунути припущення про існування різних форм ферменту, по-різному виявляють свою активність в мозку і периферичних тканинах.
Розподіл активності АПФ добре вивчено у екстрамедуллярних утвореннях, що ж стосується дослідження активності цього ферменту в різних регіонах мозку, то цього питання, до недавнього часу приділялась недостатня увага. Відомо, що АПФ бере участь у процессингу ангіотензину I, інактивації брадикініну, в послідовно-вальному гідролізі енкефаліновимі молекули [66, 180, 182, 196, 209, 234].
Вивчення активності АПФ у інтактної групи тварин показало, що найбільша активність ферменту виявляється в гіпофізі і сім'яниках (табл.1), де синтезуються багато біологічно активні пептиди. Досить високі показники активності відзначені, також, в стріатумі - відділі, що характеризується високим вмістом нейропептидів [62, 221]. Дані ряду досліджень свідчать про те, що закономірності, що описують роль периферичної ренін-ангіотензинової системи не можуть бути перенесені на системи центральної регуляції, зважаючи на існування певної автономії і біохімічної специфічності АПФ в мозку і на периферії [66, 196, 222]. У зв'язку з цим, присутність високої активності АПФ як у відділах мозку, так і в сім'яниках може бути визнано як свідчення участі цього ферменту в обміні різних за своїм функціональним складом нейропептидів, що містяться в мозку і периферичних тканинах. Не виключена також можливість участі АПФ в обміні нейропептидів, однакових за своїм функціональним складом, хоча цей процес, ймовірно, по-різному протікає в мозку і тканинах, що може свідчити на користь існування ізоферменту [66].
Таким чином, отримані нами відомості про регіональний і органному розподілі АПФ добре узгоджуються з літературними даними по локалізації нейропептидів в структурах мозку і тканинах [156, 196, 221], що підтверджує участь АПФ в обміні регуляторних пептидів [182, 183].
Основою для більш детального уявлення про біологічну роль досліджуваних ферментів в мозку і периферичних тканинах можуть послужити дослідження з вивчення їх активності при екстремальних впливах.
Відомо, що при дії стрес-факторів здійснюється мобілізація найважливіших фізіологічних систем організму, спрямована на підтримку його гомеостазу та адаптації до несприятливих умов середовища [144]. Розвиток адаптаційних реакцій є наслідком активації стрес-лімітуючих систем, таких як ГАМК-ергічні, серотонінергіческой, енкефалінергічного [5, 116], що в першу чергу виражається в посиленні синтезу їх основних компонентів. Відомо, що одним з видів впливу, що призводить до генералізованої мобілізації стрес-лімітуючих і стрес-реалізуючих систем організму є гострий ЕБС [37, 70, 121, 141, 145, 155]. Однак багато аспектів виникнення та розвитку стрес-реакції при дії ЕБС вивчені недостатньо. Найменше досліджені ферментативні механізми, що забезпечують функціо-вання фізіологічних систем при гострому ЕБС.
Вивчення активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ у щурів при дії гострого ЕБС показало зміна їх активності в досліджуваних відділах мозку і периферичних тканинах (табл. 2, рис.1-3).
Найбільш виражене підвищення активності ВПП при гострому ЕБС зазначено у гіпофізі. Активність ферменту була вище показників інтактних тварин (табл.2, рис.1), що узгоджується зі змінами його активності при інших видах стресу [42, 64]. Підвищення активності ВПП у ранній період після стресу в гіпофізі - відділі, де синтези-ються стрес-пептиди [142, 232, 243], мабуть, пов'язано із збільшенням їх синтезу і секреції. Оскільки відомо, що ВПП in vivo втягується в освіту АКТГ [189], що є важливим компонентом стрес-реалізуючих систем, то підвищення активності ВПП через 0,5 і 4 години після впливу є специфічним відповіддю організму на стрес і сприяє збільшенню розмаху стрес-реакції в організмі. Досить тривале підвищення активності ВПП відображає тривалий характер відповідної реакції організму на вплив стрес-фактора. Відомо, що після одноразового ЕБС слідом за катаболической стадією, розвивається більш тривала - анаболічні, яка характе-теризується генералізованою активацією синтезу різних фізіологічно активних речовин, що сприяють адаптації організму до стресової ситуації [121, 122]. Оскільки гіпофіз володіє підвищеним вмістом енкефалінів [221], речовини Р [241], то, ймовірно, підвищення в ньому активності ВПП через 24 і 72 години пов'язане з участю ферменту в процессингу цих регуляторних пептидів. Необхідність у додатковому синтезі пептидів стрес-протективні дії обумовлена інтенсивної секрецією їх у початковому періоді розвитку стрес-реакції і, отже, виснаженням їх запасу. Таким чином, отримані результати узгоджуються з літературними даними про участь ВПП не тільки в розвитку стресу, а й в обмеженні інтенсивності стрес-реакції [37, 142, 232, 243].
Встановлено, що при дії стресу в мозку збільшується вміст опіоїдів, речовини Р, та ін [35, 138, 139, 236]. Виявлене на пізній стадії розвитку стресу підвищення активності ВПП у стріатумі і великих півкулях свідчить про залучення ферменту в процесинг цих біологічно активних пептидів, що призводить до збільшення їх вмісту в названих структурах мозку при гострому ЕБС і сприяє згасання стрес-реакції.
Зміст стрес-протективних пептидів - енкефалінів, речовини Р - у середньому мозку і гіпокампі при стресі також збільшується [56]. Однак у цих структурах мозку через 4 години після впливу активність ферменту була нижче показників інтактної групи. Схожа тенденція до зниження активності ВПП відзначена і в наднирниках. Відомо, що ВПП локалізована переважно у везикулах секреторних клітин [195]. У результаті їх спустошення після впливу стресу вивільняються як пептиди, так і локалізовані в них молекули ВПП. Отже, виявлене зниження активності ВПП може бути обумовлено зменшенням числа активних молекул ферменту в секреторних везикулах.
Таким чином, показане після гострого впливу ЕБС, зміна активності ВПП у відділах мозку, гіпофізі та надниркових викликано змінами в метаболічних процесах, які пов'язані, перш за все, з мобілізацією стрес-лімітуючих і стрес-реалізуючих систем.
На відміну від ВПП, виражене підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП у всіх відділах мозку і наднирниках спостерігалося через 72 години після впливу (табл.2, рис.2). Найбільш істотні зміни відзначені у великих півкулях і наднирниках.
Відомо, що при гострому ЕБС виявляється значне збільшення активності лізосомальних ферментів, які залучаються до деградацію надлишку нейропептидів, синтезованих у відповідь на стрес [121]. При цьому зазначено, що активність лізосомальних ферментів залишається підвищеною навіть через 5 діб після завершення стрес-впливу [121]. Оскільки ФМСФ-інгібіруемая КП, імовірно, є ізоферментом лізосомальної КПА [53], то збільшення активності ферменту через 72 години після гострого ЕБС може бути свідченням участі ФМСФ-інгібіруемой КП в деградації надлишку регуляторних пептидів, синтезованих у відповідь на стрес. Підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП в наднирниках - органі, зміст енкефалінів в якому при впливі стресу збільшується [34] і великих півкулях, що характеризуються високим рівнем катаболізму [17, 22], підтверджує висунуте припущення.
На відміну від ФМСФ-інгібіруемой КП, активність якої істотно підвищувалася в наднирниках, найбільш виражені зміни активності ВПП спостерігалися в гіпофізі. Оскільки відомо, що в наднирниках синтезуються переважно енкефаліни, а в гіпофізі - гормони пептидної природи, то отримані дані можуть свідчити про участь цих ферментів в обміні різних біологічно активних пептидів.
Схожа з ВПП тенденція до підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП в ранні періоди після стресу відзначена в сім'яниках, де активність ферменту була вищою за норму тільки через 0,5 години. Не виключено, що в сім'яниках даний фермент може залучатися і в процесинг регуляторних пептидів при стресі.
Таким чином, у відповідь на вплив гострого ЕБС залучається як ВПП, так і ФМСФ-інгібіруемая КП. Різна динаміка змін активності цих ферментів в мозку і периферичних тканинах дозволяє висунути припущення про включення цих ферментів на різних етапах обміну нейропептидів. При цьому, обидві КП беруть участь в обміні регуляторних пептидів у тих відділах мозку та органах, які оберігають стрес-систему організму від виснаження.
Одним з важливих ланок у механізмах функціонального взаімодейтсвія енкефалінергічного, ренін-ангіотензинової та гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової системи (ГГНС) є АПФ [209]. У зв'язку з цим, дослідження активності АПФ після впливу гострого ЕБС розглядається як важлива ланка в ланцюзі досліджуваних реакцій організму, тому що зміни в активності АПФ у відділах мозку і периферичних тканинах можуть відображати регіональну функцію ангіотензин-утворюючої системи в умовах стресу.
Отримані нами дані показали зниження активності АПФ у стріатумі і гіпофізі через 4 години після впливу ЕБС (табл.2, рис.3). При дії стресу спостерігається порушення проникності мембран і підвищення вмісту іонів Na +, що може викликати гальмування синтезу АПФ [64], чим, ймовірно, і пояснюється спостережуване зниження активності АПФ.
До теперішнього часу функціональна роль АПФ в статевих органах ссавців залишається не до кінця вивченою. Відомо, що функції сім'яників модулюються опіоїдними пептидами [197], утворення яких при впливі гострого ЕБС збільшується. Структура енкефалінів така, що АПФ може розщеплювати їх до ди-і три-пептидів [180]. У зв'язку з цим, підвищення активності АПФ у сім'яниках через 0,5 години після гострого ЕБС може бути охарактеризоване як відповідна реакція організму на підвищення рівня опіоїдних пептидів, що спрямовано на стабілізацію викликаного стресом підвищеного балансу опіоїдних пептидів. Можливо, що зниження активності АПФ в сім'яниках у наступні проміжки часу є наслідком уповільнення процесу інактивації синтезованих у відповідь на стрес-вплив нейропептидів.
Таким чином, виявлені при дії гострого ЕБС зміни активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ є, ймовірно, наслідком їхньої участі в процесах синтезу та / або деградації компонентів стрес-лімітуючих і стрес-реалізуючих систем.
Бачимо після стрес-впливу збільшення синтезу і секреції багатьох біологічно активних пептидів, призводить не тільки до розвитку адаптаційних реакцій, а й до виснаження нейрогуморальних систем [4, 145]. Інтенсивне дослідження системи ендогенних опіоїдних пептидів показало їх участь у механізмах фізіолого-біохімічної регуляції процесів, що виникають при стрес-пошкодженні організму [100, 101, 102, 125, 134]. Особливе практичне значення, у зв'язку з цим, має використання опіоїдних пептидів і їх синтетичних аналогів в якості агентів, що компенсують зміни у метаболізмі мозку і органів тварин при стресі. Підвищений стрес-протективное властивість аргінінсодержащего гексапептідного аналога лей-енкефаліну - даларгін пояснюється, перш за все, наявністю в його молекулі кінцевого аргінінових компонента [105, 146]. У зв'язку з цим, не виключено, що в регуляцію метаболічних процесів у мозку та органах може залучатися і аргінізірованний попередник лей-енкефаліну (лей 5-енкефалінів-арг 6). Встановлено, що при периферичному введенні підвищеною проникністю гематоенцефалічний бар'єр, а, отже, і більш вираженим впливом на функціональні системи, характеризуються не самі біологічно активні речовини, а їх найближчі попередники [82]. Це зумовило використання в наших дослідженнях лей 5-енкефалінів-арг 6. Оскільки відомо, що модулюючий дію екзогенних речовин залежить від вихідного стану фізіологічних систем і може по-різному проявляється при оптимальному і різних функціональних станах організму [107], то представляється необхідним дослідження впливу лей 5-енкефалінів-арг 6 на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ у інтактних тварин.
Введення попередника лей-енкефаліну в дозі 20 мкг / кг маси щура викликало істотне підвищення активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ у всіх досліджених відділах мозку і тканинах у порівнянні з контролем (табл.3, рис.4-6). Отримані дані свідчать про залучення досліджуваних ферментів у відповідь організму на введення лей 5-енкефалінів-арг 6.
Максимальна зміна активності ферментів у відділах мозку і периферичних тканинах виявлено через 0,5 години після інстиляції. Найбільш виражене підвищення активності ВПП показано в гіпофізі, ФМСФ-інгібіруемой КП - в наднирниках, АПФ - у насінниках.
Отримані нами дані (рис.4-6) вказують на наявність досить тривалого впливу лей-енкефалінів-арг на активність даних ферментів, що узгоджується з уже проведеними дослідженнями [59, 107, 113, 119] про пролонгованим дії багатьох регуляторних пептидів. Одним з механізмів, що сприяють прояву такого роду тривалих ефектів є їх зв'язування з білками-переносниками [78], які здатні захищати пептид від досить швидкої дії протеаз. Поступова дисоціація комплексу, що утворюється "пептид-носій" призводить до підтримання концентрації пептиду на рівні, необхідному для реалізації фізіологічних ефектів протягом досить тривалих проміжків часу. Прояв тривалих ефектів екзогенно вводяться речовин пояснюють, також, на основі теорії про функціональну безперервності [59, 113]. Суттєвою особливістю якої є здатність кожного регуляторного пептиду індукувати або інгібувати освіту або деградацію інших пептидів. Внаслідок розвиваються при цьому каскадів біохімічних реакцій, ефект екзогенного пептиду буде проявлятися і тоді, коли вихідна речовина вже повністю зруйновано. Однак ці відомості представлені тільки для активних пептидів. У нашій же роботі пролонговану дію спостерігалося і при введенні попередника лей-енкефаліну - лей-енкефалінів-арг. Не виключено що досліджувані ферменти - ВПП, ФМСФ-інгібіруемая КП та АПФ беруть участь у біогенезу біологічно активних пептидів, синтезованих у відповідь на введення лей-енкефалінів-арг, що виступає в ролі індуктора.
Тривале підвищення активності ВПП після введення лей-енкефалінів-арг зазначено у гіпофізі, стріатумі і гіпоталамусі (табл.3, рис.4), де здійснюється синтез багатьох регуляторних пептидів [156, 221]. Найбільш істотне підвищення активності ВПП виявлено в гіпофізі. Ймовірно, що екзогенно введений лей-енкефалінів-арг ініціював ряд послідовних реакцій синтезу інших регуляторних пептидів, в процессингу яких бере участь ВПП, що і викликало тривале підвищення активності досліджуваного ферменту.
Значне збільшення активності ФМСФ-інгібіруемой КП спостерігалося в надниркових залозах, гіпофізі, гіпоталамусі і середньому мозку (табл. 3), що характеризуються високим вмістом нейропептидів. Отже, можна висунути припущення про залучення досліджуваного ферменту в процесинг регуляторних пептидів у цих регіонах при введенні лей-енкефалінів-арг. Не виключено, що зростання активності ферменту в перші 0,5 години після початку експерименту може бути пов'язано із залученням його в процеси перетворення в активну форму введеного пропептид (індуктора). Подальше ж збільшення активності, ймовірно, є наслідком участі ФМСФ-інгібіруемой КП в процессингу регуляторних пептидів, які утворюються у відповідь на введення індуктора в досліджених регіонах мозку і наднирниках.
Відомо, що АПФ бере участь як в процессингу, так і в інактивації нейропептидів, проявляючи при цьому дипептидилкарбоксипептидазную і ендопептідазную активності [182, 183, 209, 223, 241]. Оскільки передбачається, що екзогенний лей-енкефалінів-арг ініціює процеси утворення активних форм деяких нейропептидів, то, не виключено, що АПФ може грати роль регулюючого чинника в цих реакціях, контролюючи рівень введеного пропептид. Досить висока активність АПФ після введення попередника лей-енкефаліну виявлена в гіпофізі і стріатумі (рис.6). Причому, слід підкреслити, що статистично достовірне підвищення активності в цих відділах зареєстровано тільки через 0,5 години (рис.2). Можливо, що настільки короткочасне підвищення активності АПФ у досліджуваних регіонах мозку пов'язане з його участю в інактивації введеного проенкефаліна або в деструкції надлишку синтезованих регуляторних пептидів. Істотне і тривале підвищення активності АПФ при введенні лей-енкефалінів-арг зазначено у насінниках. Ймовірно, що АПФ бере участь у процессингу ряду біологічно активних речовин, що синтезуються в цьому органі у відповідь на введення лей-енкефалінів-арг. Відомо також, що в сім'яниках високий рівень процесів катаболізму. Отже, не виключена можливість участі АПФ і в процесах інактивації надлишку синтезованих нейропептидів.
Таким чином, виявлений після введення лей-енкефалінів-арг підвищення активності досліджуваних ферментів в тих відділах мозку і тканинах, де синтезується велика кількість нейропептидів, є свідченням зміни метаболічної активності головного мозку і периферичних тканин. Ймовірно, що ВПП, ФМСФ-інгібіруемая КП та АПФ беруть участь у процесах синтезу та / або інактивації ряду біологічно активних пептидів, синтезованих у відповідь на введення лей 5-енкефалінів-арг 6. У зв'язку з цим, не виключено, що ланцюгові реакції утворення або деградації регуляторних пептидів у відповідь на введення індуктора "запускаються" за допомогою зміни активності даних пептідгідролаз.
Отже, представляється цікавим питання про механізм регуляції активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ під впливом лей-енкефалінів-арг. Виявлено, що in vitro активність ВПП та АПФ інгібується пропептид, що узгоджується з літературними даними [160, 207]. На активність ФМСФ-інгібіруемой КП попередник лей-енкефаліну не чинив впливу (табл.4).
Показаний ефект інгібування активності ВПП може бути обумовлений конкуренцією двох субстратів (данс-фен-ала-арг - субстрат для визначення активності ферменту та екзогенно введений лей-енкефалінів-арг) за зв'язування з ферментом [38]. Однак відомо, що ВПП локалізована в секреторних везикулах, проникнення в які екзогенного пропептид представляється малоймовірним [187, 195]. Відомо також, що енкефаліни впливають на рівень експресії мРНК ряду нейропептидів [231, 246]. Рівень мРНК ВПП і багатьох нейропептидів координовано регулюється секретогенний. Тому видається більш вірогідним, що екзогенно введений лей-енкефалінів-арг, впливає на рівень експресії мРНК ВПП, що призводить до зміни активності ферменту. Активація АПФ, ймовірно, пояснюється дією екзогенного лей-енкефалінів-арг на активність ендогенних інгібіторів АПФ [73, 85]. Таким чином, показане невідповідність у впливі лей-енкефалінів-арг на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ in vivo і in vitro свідчить про існування in vivo механізмів, опосередковуючи дію екзогенного попередника лей-енкефаліну.
Відомо, що екзогенне введення опіоїдних пептидів сприяє стимуляції утворення і викиду ендогенних опіоїдів, що є одним з чинників природного профілактики виснаження стрес-лімітуючих систем і спрямоване на адаптацію організму до стресу [69, 116, 198]. Запропоноване раніше припущення про ініціації процесів синтезу і деградації деяких біологічно активних пептидів при введенні лей-енкефалінів-арг, послужило підставою для використання цієї речовини в якості агента, що підвищує активність ендогенної енкефалінергічного системи.
При введенні лей-енкефалінів-арг безпосередньо перед моделюванням гострого ЕБС активність усіх досліджуваних протея-літичних ферментів змінювалася в порівнянні з відповідними показниками у тварин, схильних до стресу, введенню пропептид та інтактних тварин.
При спільному впливі гострого ЕБС і лей-енкефалінів-арг активність ВПП у всіх досліджуваних відділах мозку і периферичних тканинах щурів достовірно відрізнялася від відповідних показників стресованих тварин (табл.5, рис.7). Отримані дані свідчать про залучення ВПП у реалізацію біохімічних процесів, індукованих введенням пропептид. Найбільш істотне підвищення активності ферменту зазначено у відділах мозку, що характеризуються високим вмістом стрес-протективних речовин. Не виключено, що попередник лей-енкефаліну, попередньо введений в організм тварини, сприяв "запуску" каскаду біохімічних реакцій синтезу речовин, що беруть участь в адаптації організму до стрес-факторів [116, 132, 241, 242].
Згідно з отриманими даними, введення лей-енкефалінів-арг перед початком стрес-впливу запобігало підвищення активності ВПП у гіпофізі (табл.5, рис.7), зазначене при гострому ЕБС. Відомо, що при будь-якій формі стресу загальним і найбільш істотним моментом є активація ГГНС, що характеризується надмірною освітою і секрецією гормонів стресу [21, 128, 134, 143, 144, 150]. Показано також, що введення енкефалінів блокує активність ГГНС [74, 124, 134], припиняючи процеси синтезу гормонів пептидної природи, зокрема АКТГ. Оскільки, ВПП бере участь у біосинтезі АКТГ у гіпофізі, то показане після введення лей-енкефалінів-арг зниження активності ВПП в порівнянні з групою стресованих тварин дозволяє висунути припущення про здатність лей-енкефалінів-арг виявляти ефекти подібні з такими активних форм енкефалінів. Раніше ми припустили, що підвищення активності карбоксипептидази Н в гіпофізі на пізніх етапах дослідження (24 і 72 години) після впливу гострого ЕБС показує її участь у активізуються при стресі процесах синтезу стрес-протективних пептидів. Отримані в даній серії експерименту результати про збільшення активності ВПП через 24 і 72 години на гіпофізі в порівнянні з інтактною групою, можуть бути свідченням того, що при введенні пропептид стресованих тварин фермент також включається в процеси синтезу пептидів, що сприяють адаптації організму до стрес-впливу.
Таким чином, зниження активності ВПП у гіпофізі при спільній дії лей-енкефалінів-арг і стресу через 0,5 і 4 години може сприяти зменшенню вироблення і секреції стрес-пептидів, а підвищення активності через 24 і 72 години - активізації процесів синтезу стрес-протективних речовин і, отже, адаптації до стресу.
Істотне підвищення активності ВПП зазначено у стріатумі - відділі, де синтезуються нейропептиди, що володіють вираженим антистресовий дією [221] (табл.5, рис.7). У ранні проміжки часу (0,5 і 4 години) активність ВПП була вищою порівняно з активністю в стресованих та інтактних тварин. Навпаки, при дії гострого ЕБС активність ферменту в стріатумі підвищувалася (табл.2, рис.1) на більш пізніх етапах дослідження (через 24 і 72 години). Відомо, що попереднє введення компонентів стрес-лімітуючих систем викликає обмеження катаболічних і подовження анаболической стадії, яка характеризується активацією синтезу речовин, що грають важливу роль у розвитку адаптаційних реакцій [121]. На підставі отриманих нами даних про підвищення активності ВПП у стріатумі на ранніх стадіях після спільного впливу двох факторів, можна припустити, що при інстиляції попередника лей-енкефаліну при ЕБС відбувається активація синтезу багатьох стрес-протективних речовин (речовина Р, енкефаліни та ін), що сприяє зменшенню розмаху стрес-реакції.
Виявлене збільшення активності досліджуваного ферменту через 4 години після введення лей-енкефалінів-арг на тлі стресу (щодо групи стресованих тварин, що не отримували пропептид) в гіпокампі, великих півкулях, гіпоталамусі і наднирниках - характеризуються високим вмістом нейропептидів [156] (табл.5, рис.7) свідчить, ймовірно, про включення ВПП у процесинг регуляторних пептидів у цих структурах.
Таким чином, попереднє введення стресованих тварин попередника лей-енкефаліну викликає зміни активності ВПП у регіонах мозку і периферичних тканинах, що сприяють адаптації до стресу. Оскільки проникнення екзогенного пропептид в секреторні везикули, де локалізована фермент [38, 189] представляється малоймовірним, отже, лей-енкефалінів-арг при стресі опосередковано впливає на активність ВПП, ймовірно, через зміну рівня експресії гена ферменту.
При спільній дії лей-енкефалінів-арг і гострого ЕБС виявлені різнонаправлені зміни активності ФМСФ-інгібіруемой КП у відділах головного мозку і периферичних тканинах щурів.
Попереднє введення лей-енкефалінів-арг стресованих тварин запобігає підвищення активності ферменту через 72 години, зазначене при дії гострого ЕБС. У більш ранні проміжки часу активність ФМСФ-інгібіруемой КП була вище (табл.6, рис.8). Найбільш виражені зміни виявлені у гіпофізі, середньому мозку, гіпоталамусі і наднирниках (рис.8) - структурах, багатих нейропептидами, синтез яких, за нашим припущенням, посилюється під впливом введеного пропептид.
Відомо, що при спільній дії опіоїдних пептидів і стресу обмін речовин, через більше ніж однієї години після впливу, прискорюється, проте зміщення його в бік катаболізму, як це зазначається при стресі, не відбувається [18, 22, 121, 138]. ФМСФ-інгібіруемая КП, імовірно, є ізоферментом лізосомальної КПА, що бере участь у деградації біологічно активних речовин [49, 53, 233]. Отже, зазначене через 72 години після введення лей-енкефалінів-арг стресованих тварин зниження активності ферменту в гіпофізі, середньому мозку, гіпоталамусі, великих півкулях в порівнянні з показниками стресованих тварин свідчить про зниження рівня катаболічних процесів у досліджуваних відділах. Активність ферменту при цьому практично не відрізняється від відповідних показників норми (рис.8).
Інша динаміка зміни активності ФМСФ-інгібіруемой КП виявлена в стріатумі і гіпокампі - відділах лімбічної системи, що характеризуються високим вмістом нейропептидів, які беруть участь у регуляції емоційного статусу організму [145, 221]. Підвищення активності ферменту спостерігалося лише через 0,5 години після спільного впливу двох факторів. Зниження активності через 72 години не виявлено. У стресованих тварин активність ФМСФ-інгібіруемой КП в стріатумі і гіпокампі через 72 години підвищувалася незначно (рис.2). На підставі отриманих експериментальних даних можна припустити, що ФМСФ-інгібіруемая КП стріатума та гіпокампу не втягується в деградацію надлишку синтезованих у відповідь на вчинений вплив нейропептидів. Не виключено, що істотне підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП в стріатумі і гіпокампі може бути пов'язане з участю ферменту в процессингу біологічно активних пептидів у цих відділах.
Принципово відмінна динаміка зміни активності ФМСФ-інгібіруемой КП відзначена в сім'яниках (рис.8). Активність досліджуваного ферменту в них через 4, 24 і 72 години істотно підвищена, у порівнянні з показниками активності як інтактних, так і стресованих тварин. Відомо, що в сім'яниках синтезуються багато біологічно активні пептиди, крім того, в них досить високий рівень катаболізму. Оскільки активність ФМСФ-інгібіруемой КП при стресі підвищувалася тільки через 0,5 години, а процес деградації є досить тривалим процесом, то ми припустили, що досліджуваний фермент не втягується в процеси катаболізму в насінниках. Відомо також, що функції сім'яників модулюються опіоїдними пептидами [197]. У зв'язку з вищесказаним, істотне підвищення активності ФМСФ-інгібіруемой КП в сім'яниках при спільній дії стресу і лей-енкефалінів-арг може бути пов'язане з включенням ферменту в процесинг біологічно активних пептидів у цьому органі.
Таким чином, у досліджуваних відділах мозку і периферичних тканинах відзначені різні, як за ступенем вираженості, так і за спрямованістю, зміни в активності ФМСФ-інгібіруемой КП. Показані відмінності можуть бути пов'язані з присутністю в досліджуваних тканинах різних форм ферменту з близькими фізико-хімічними властивостями, але, що відрізняються при цьому своєї біологічної роллю.
За нашим припущенням, лей-енкефалінів-арг бере участь в ініціації синтезу багатьох нейропептидів, в тому числі і опіоїдних. Відомо, що ендогенні опіоїдні пептиди надають стимулюючу дію на стрес-лімітовано - ГАМК-ергічні систему, здатні обмежувати активацію стрес-реалізуючої адренергічної і симпатоадреналової системи [5, 74, 121, 240], наслідком чого є обмеження стрес-реакції. Таким чином, можна зробити висновок, що показані зміни активності ФМСФ-інгібіруемой КП в досліджених регіонах мозку та органах свідчать про залучення цього ферменту в реалізацію адаптаційних реакцій, індукованих введенням лей-енкефалінів-арг.
При спільному впливі на організм тварини гострого ЕБС і лей-енкефалінів-арг виявлено, що активність АПФ змінювалася. Найбільш виражене і тривале підвищення активності ферменту у порівнянні з стресованих тварин виявлено у сім'яниках (рис. 9, табл. 7). Проте, в порівнянні з нормою, статистично достовірних відмінностей не виявлено. Відомо, що АПФ бере участь в інактивації енкефалінів і субстанції Р [180, 209]. Встановлено, також, що клітини сім'яників пов'язують речовина Р, а їх функції регулюються опіоїдні пептиди [197, 260]. У зв'язку з цим, показане в сім'яниках - органі, що характеризується досить високим рівнем катаболізму білка, початкове (через 0,5 години) зниження й істотне (через 4, 24 і 72 години) підвищення активності АПФ в порівнянні з групою стресованих тварин (рис. 9), свідчить, ймовірно, про участь досліджуваного ферменту в інактивації надлишку регуляторних пептидів, синтезованих у відповідь на вплив.
У гіпофізі і стріатумі - регіонах, де синтезуються багато нейропептиди, що володіють антистресовий дією [156, 201, 221], активність АПФ підвищувалася у порівнянні з стресованих тваринами (рис.9). Відомо, що введення даларгіну викликає підвищення активності АПФ і змісту ангіотензину II в мозку [87] і сприяє обмеженню активації ГГНС - важливої складової стрес-реалізуючих систем [87, 125, 134, 150]. Активація ГГНС характеризується, перш за все, підвищенням синтезу стрес-гормонів в гіпофізі [150]. На підставі отриманих нами даних, можна припустити, що попередник лей-енкефаліну, при введенні якого в гіпофізі і стріатумі відмічено підвищення активності досліджуваного ферменту (рис.9), також бере участь у регуляції функцій ГГНС, ймовірно, блокуючи її активність. Підтвердженням цього є зазначене раніше зниження активності ВПП - ферменту, який бере участь у синтезі АКТГ у гіпофізі. Оскільки, ВПП включається також у процесинг ряду стрес-протективних речовин у відділах мозку, а АПФ - в освіті ангіотензину II - регуляторного пептиду, що володіє протилежною дією, то показане більш істотне і тривале підвищення активності ВПП в мозку при спільному вплив двох чинників може свідчити про превалирующем вмісті в ньому компонентів стрес-лімітуючих систем. Висунуте припущення підтверджується експериментальними даними про зниження ролі ангіотензинової ланки при збільшенні активності енкефалінобразующей системи [87].
Отримані дані про зміну активності АПФ при сумісному впливі лей-енкефалінів-арг і гострого ЕБС, свідчать про залучення ферменту, поряд з ВПП та ФМСФ-інгібіруемой КП, у реалізацію адаптивних ефектів лей-енкефалінів-арг.
Таким чином, інстиляція попередника лей-енкефаліну на кон'юнктиву ока щурів перед гострим ЕБС викликає зміни ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ і сприяє адаптації до стресу. Отримані дані дозволяють висунути припущення, що одним з механізмів регулюючого дії лей-енкефалінів-арг при стресі може бути його вплив на активність досліджуваних ферментів.
При порівнянні отриманих даних щодо впливу попередника лей-енкефаліну на активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ головного мозку і периферичних тканин інтактних щурів і щурів, що піддавалися впливу гострого ЕБС, виявлені деякі відмінності (рис. 4-6 і 7-9). При введенні лей-енкефалінів-арг інтактним щурам спостерігалося більш виражене збільшення активності всіх досліджуваних ферментів. Відомо, що важливим чинником, що визначає проникнення в мозок екзогенно введених речовин, є рівень обмінних процесів в ЦНС [108]. У зв'язку з цим, виявлену невідповідність у впливі екзогенного пропептид на активність досліджуваних ферментів при оптимальному функціонуванні фізіологічних систем і при патологічних змінах, викликаних стресом, ймовірно, пояснюється зниженням проникності ГЕБ для екзогенних речовин при впливі гострого ЕБС.
Таким чином, результати проведених досліджень показали, що у відповідь на вплив гострого ЕБС залучаються всі досліджувані ферменти. Зміни в активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ в різні строки після впливу гострого ЕБС, за нашим припущенням, пов'язані з їх участю в ініційованих при стресі процесах синтезу та / або деградації регуляторних пептидів у відділах мозку і периферичних тканинах. Відмінності в динаміці зміни активності ВПП і ФМСФ-інгібіруемой КП при дії гострих стрес-факторів дозволили припустити, що дані ферменти включаються в обмін регуляторних пептидів на різних етапах. Ймовірно, що ФМСФ-інгібіруемая КП бере участь у процесах деградації надлишку нейропептидів, синтезованих у відповідь на стрес.
Вивчення впливу попередника лей-енкефаліну на активність ВПП, АПФ і ФМСФ-інгібіруемой КП в нормі і при дії гострого емоційно-больового стресу, показало, що всі досліджувані ферменти залучаються у відповідь на введення пропептид. Проте виявлені зміни активності при введенні лей-енкефалінів-арг інтактним тваринам дещо відрізнялися від таких при спільній дії стресу і пропептид і за ступенем вираженості та по спрямованості. Найбільш значні зміни активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ при введенні попередника лей-енкефаліну виявлені у відділах мозку і периферичних тканинах тварин, що не піддавалися впливу стресу.
Введення лей-енкефалінів-арг перед гострим ЕБС запобігало підвищення активності ферментів у відділах мозку, пов'язаних із синтезом і секрецією стрес-пептидів. Активність ферментів при цьому практично не відрізнялася від норми. У відділах мозку і периферичних органах, де здійснюється синтез стрес-протективних речовин, активність ферментів підвищувалася в початковий період після введення лей-енкефалінів-арг. Таким чином, інстиляція попередника лей-енкефаліну на кон'юнктиву ока викликає зміни активності ферментів, що сприяють адаптації до стресу. Беручи до уваги дані ряду дослідників про здатність екзогенних нейропептидів стимулювати синтез та викид інших біологічно активних пептидів в організмі [12, 13, 78, 113, 119, 132,], а також отримані в нашій роботі результати, ми припустили, що екзогенний лей- енкефалінів-арг ініціює процеси синтезу регуляторних пептидів стрес-протективні дії. Утворені в результаті каталітичних реакцій біологічно активні пептиди здатні в свою чергу модулювати діяльність різних функціональних систем організму [78]. Виявлені відмінності в динаміці зміни активності ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ між стресованих тваринами і тваринами, що одержували перед стресом лей-енкефалінів-арг, можуть свідчити про участь досліджуваних ферментів в каталітичних реакціях синтезу і / або деградації регуляторних пептидів, індукованих введенням попередника лей -енкефаліну.
Реалізація показаних ефектів лей-енкефалінів-арг в нормі і при дії гострого ЕБС, ймовірно, здійснюється за допомогою впливу його на активність ендогенних активаторів та інгібіторів і / або рівень експресії генів досліджуваних ферментів. Оскільки, в даний час ендогенні інгібітори виявлені тільки для АПФ [73, 85], то зміни активності даного ферменту, ймовірно, пояснюються ініціюванням лей-енкефалінів-арг механізмів дії цих ендогенних регуляторів. Зміни в активності ВПП не можуть бути наслідком прямої дії екзогенного лей-енкефалінів-арг на фермент, тому що проникнення пропептид в секреторні везикули, де локалізована ВПП представляється малоймовірним. Ми припустили, що дія екзогенного лей-енкефалінів-арг на активності ВПП опосередковано через зміну рівня експресії гена ферменту. ФМСФ-інгібіруемая КП на даний момент є маловивченим ферментом. Можливо, що in vivo існують подібні з ВПП та / або АПФ механізми, що опосередковують вплив екзогенного попередника лей-енкефаліну на активність ФМСФ-інгібіруемой КП.
Таким чином, отримані в нашій роботі дані свідчать про залучення протеолітичних ферментів - ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ в процеси адаптації організму до дії гострих стрес-факторів, які посилюються при введенні лей-енкефалінів-арг. Одним з механізмів адаптогенної дії лей-енкефалінів-арг при стресі може бути вплив на активність досліджуваних ферментів обміну нейропептидів.
ЛІТЕРАТУРА
Аврорів В.М. ГОБ, його значення в нормі і при патології ока та шляхи регулювання з метою отримання терапевтичного ефекту. - Воронеж.-1982.-10с.
Азарян А.В. Пептідгідролази нервової системи та їх біологічна функція / / Єреван .- Айастан .- 1989. - 208с.
Акопян Т.М. Протеолітичні перетворення нейропептидів та шляхи їх регулювання в центральній нервовій системі / / Дисертація. на конкурувати. ступеня доктор біол.наук .- М. - 1989
Альошин Б.В., Бондаренко Л.А. Стрес, адаптація і функціональні порушення. - Кишинів: Штіінца. - 1984 .- С.11-12
Андрєєв Б.В., Ігнатов Ю.Д., Нікітіна З.С., ситинські І.А. Антистресовий роль ГАМК-ергічні системи мозку / / Журн. вищ. нервн. деят. - 1982.-т.32, № 3 .- С.511-519.
Аргінтаев Е.С. Взаємини між паращитовидної залозою і системою опіоїдних пептидів у фізіологічних умовах і в динаміці стрес-реакції / / Дисертація. на соіск. ступеня канд.мед.наук. - Томськ .- 1989
Арушанян Е.Б. Участь епіфіза в антистресовий захист мозку / / Усп. Фізіол.наук .- 1996.-т.27 .- № 3.-С.31-50
Ашмарин І.П. Малі пептиди в нормі і при патології / / Патологічна фізіологія і експериментальна терапія. - 1982 .- № 4 .- С.13-27
Ашмарин І.П. Перспективи практичного застосування та деякі фундаментальні дослідження малих регуляторних пептидів / / Зап. мед. хімії. - 1984 .- № 3 .- С.2-7
Ашмарин І.П. Регуляторні пептиди сильного і швидкого дії / / Патологічна фізіологія і експериментальна терапія. - 1988. - № 3 .- С.3.
Ашмарин І.П., Каменська М.А. Нейропептиди в синаптичній передачі / / Підсумки наук. і техн .- ВІНІТІ .- Фізіологія людини і тварин. - 1988.-т. 34.-С.184-192
Ашмарин І.П. Каразеева Є.П. Нейропептиди / / в кн. "Нейрохімія" під ред. Ашмаріна І.П., Стукалова П.В. - К.: Видавництво інституту біомедичної хімії РАМН.-1996 .- С.296-333
Ашмарин І.П., Обухова М.Ф. Регуляторні пептиди. Функціонально-безперервна сукупність / / Біохімія.-1986.-т.51, № 4 .- С.531-542
Ашмарин І.П., Обухова М.Ф. Зміст опіоїдних пептидів в корі головного мозку та їх центральна активність / / Журн. вищ. нервн. деят .- 1985 .- т.36. - Вип.2.-С.211-222.
Бабічев В.М., Миронов С.Ф. Нейропептиди мозку та їх нейроендокринні ефекти / / Проблеми ендокринології. - 1981 .- № 3.-С.78-85.
Бахарєв В.Д. Клінічна нейрофізіологія регуляторних пептидів. - Свердловськ: Видавництво Уральського університету .- 1989 .- 133с.
Бєлік Я.В., Гріренко А.Г. Розпад білків у морфологічно і функціонально різних макро-і мікроструктурних утвореннях головного мозку. / / Питання біохімії нервової та м'язової систем. - Тбілісі: Мецніереба. - 1979 .- т.3.-С.105-113
Білоконь Л.Є. Особливості обміну нейропептидів гіпоталамуса і гормонів гіпофізу при стресі і некрозі міокарда / / дис. на соіск.степені канд.біол.наук. - Дніпропетровськ. - 1991
Бєляєв Н.А., Генгін М.Т., Година С.В., Каліхевіч В.М., Панченко Л.Ф. Активність енкефалінконвертази у відділах мозку щурів при алкогольної інтоксикації / / Зап. мед.хіміі .- 1988.-34, № 4 .- С.118-122.
Бєляєв Н.А., Колесанова Є.Ф. та ін До питання про роль амінопептідазу в катаболізмі енкефалінів: порівняння дослідження регіонального розподілу амінопептідазу і енкефалінази А в головному мозку щурів / / Біохімія .- 1990 .- 55, № 10.-С.1778-1785.
Белякова Є.І. Взаємодія симпато-адреналової та гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової системи в ініціальному періоді стресу / / дис. на соіск.степені канд.біол.наук .- Ростов Н/Д.- 1984
Блехман Г.І. Синтез і розпад макромолекул в умовах стресу / / Усп.совр.біол. - 1992.-вип.2 .- С.281-297.
Бобков А.І., Семавін І.Є., Виноградов В.А. та ін Про значення лей-енкефаліну в механізмах стрессорной реакції. / / Тез. докл. Всесоюзн. Конфер. ''Нейропептиди: їх роль у фізіології і патології''.- Томськ .- 1985.-С.161-162.
Боброва І.І. До питання про проникності гемато-офтальміческого бар'єру при експериментальному запаленні судинного тракту ока / / в кн. "Фізіологія і патологія гісто-гематіческіх бар'єрів" .- М. - Наука.-1968 .- с.256-259
Богданов А.І., Филаретовой Л.П., Філаретов А.А. Градуальная реакції гіпофізарно-адренокортикальної системи на активуючий і гальмівної сигнали / / Фізіол.журн. - 1982 .- № 6 .- С. 804-808.
Бондаренко Т.І., Метаболізм гомокарнозіна в мозку тварин різного віку в екстремальних умовах середовища / / дис. на конкурувати. ступеня доктор біол.наук .- Ростов Н / Д. - 1990
Бондаренко Т.І., Кричевська А.А., Шейкіна І.В., Кірюхіна Є.В. Вплив ПДС на вміст адреналіну в тканинах щурів у нормі і при дії холодового стресу / / Укр. біохім.журн. - 1990 .- т.62 .- № 5 .- С.34-37.
Бондаренко Т.І., Мілютіна Н.П.., Михалева Н.І., Носкова Н.В. Мембраностабілізірующий ефект?-Сон індукуючого пептиду при стресі / / Бюл. Експер.біол. і мед .- 1990. - № 9 .- С.325-327.
Брагін Є.О. Нейрохимические механізми регуляції больової чутливості / / М. - Видавництво університету дружби народів .- 1991 .- 248с.
Бредбері М. Концепція гематоенцефалічний бар'єр / / М. - Медицина .- 1983 .- 478с.
Булаєв В.М, Раєвський К.С. Взаємодія опіатів і опіоїдних пептидів з медіаторнимі системами мозку / / Успіхи физиол. наук.-1982 .- т.13 .- № 2.-С.65-92.
Буров Ю.В., Ведернікрва М.М. Нейрохімія та фармакологія алкоголізму / / М. - Медицина .- 1985.-23с
Вакуліна О.П. Зміст опіоїдних пептидів в різних тканинах тварин при екстремальних впливах / / дис. на соіск. ступеня канд.біол.наук .- М.-1984
Вальдман А.В., Арефолов В.А., Дмитрієв А.Д. Зміна змісту опіоїдних пептидів в наднирниках щурів при іммобілізаційному стресі / / Бюл.Експер.Біол.і Мед. - 1985 .- т.99 .- № 4 .- с.404-406.
Вальдман А.В., Медведєв О.С., Рожанська Н.І. Аналіз ролі ендогенних опіоїдних пептидів при експериментальній гіпертензії / / фізіолого. журн .- 1982 .- № 8.-С.1091-1095.
Ведерников М.М., Травневий А.І. Опіати і ендогенні морфіноподібні пептиди / / Усп.совр.біол. - 1981. - Т.91 .- С.380-392.
Вернигора О.М. Карбоксипептидаза Н мозку тварин в нормі і при дії стрес-факторів / / дис. на соіск. ступеня канд.біол.наук. - Дніпропетровськ. - 1991.
Вернигора А.Н, Генгін М.Т. Механізми регуляції активності та біологічна роль карбоксипептидази Н - ферменту процесингу нейропептидів / / Біохімія. - 1995. - Т.60. - № 12 .- С.1491-1497.
Вернигора А.Н, Генгін М.Т. Протеолітичні ферменти: субклітинних локалізація, властивості і роль в обміні нейропептидів / / Біохімія. - 1996. - Т.61. - № 5. - С.771-785.
Вернигора О.М., Генгін М.Т. Властивості основних, відщеплюється залишки аргініну і лізину карбоксипептидази та їх роль у функціонуванні біологічно активних пептидів / / Укр. биохим. журн .- 1993.-т.65 .- № 1.-С.3-12.
Вернигора А.Н, Генгін М.Т. Ефект етанолу на активність розчинної і мембранозв'язаних ВПП у областях головного мозку щурів протягом іммобілізаційного стресу / / Зап. мед.хіміі. - 1994. - Т.40. - № 1 .- С.54-56.
Вернигора А.Н, Генгін М.Т., Макарова В.В. Вплив стресових чинників на активність ВПП у відділах головного мозку щурів / / Укр. біохім.журн. - 1992. - Т.64. - № 2. - С.45-49.
Вернигора О.М., Генгін М.Т., Нікішин М.М. Про участь деяких ферментів нейропептидів в механізмах емоційного стресу / / фізіолого. журн.-1995 .- т.81 .- № 5 .- С.1025-1028
Вернигора О.М., Генгін М.Т., Нікішин М.М., Щетиніна Н.В. Активність карбоксипептидази N і ангіотензіпревращающего ферменту в сироватці крові щурів з різною стійкістю до емоційного стресу / / Фізіол.журн.-1994 .- № 4 .- С.23-25
Вернигора О.М., Генгін М.Т., Нікішин М.М., Щетиніна Н.В. Активність розчинної і мембранозв'язаних форм ВПП у відділах головного мозку щурів при емоційному стресі / / Укр.біохім.журн.-1994.-т.66 .- № 4.-с.130-134
Вернигора А.Н, Нікішин М.М., Генгін М.Т. Вплив внутрішньочеревно введення фізіологічного розчину на поведінку щурів у тесті "відкрите поле" і активність ферментів беруть участь у обмінений нейропептидів / / фізіолого. журн. - 1995.-т.81 .- № 12.-С.23-26
Вернигора О.М., Нікішин М.М., Генгін М.Т. Вплив глюкокортикоїдів на активність розчинної і мембранозв'язаних форм карбоксипептидази Н in vivo / / Укр.біохім.журн.-1995.-т.67 .- № 6.-С99-104
Вернигора А.Н, Нікішин М.М., Генгін М.Т. Протеолітичні ферменти та регуляція рівня активності нейропептидів / / Біохімія. - 1995. - Т.60. - № 10. - С.1575-1579.
Вернигора А.Н, Нікішин М.М., Генгін М.Т. Часткова характеристика основної ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази з головного мозку кішки / / Біохімія. - 1995. - Т.60. - № 11. - С.1423-1427.
Вернигора О.М., Щетініна Н.В., Генгін М.Т. Дослідження активності основних (відщеплюють залишки аргініну і лізину) карбоксипептидази у щурів різного віку / / Біохімія. - 1997 .- т.62 .- вип.3 .- С.1848-1856.
Власова Т.І., Каменський А.А., Ашмарин Н.П. Вплив енкефалінів на рухову активність і поведінку щурів в умовах "відкритого поля" / / Журн.висш.нервн.деят. - 1983. - Т. 33. - Вип.6. - С.1079-1084.
Воронцов Є.Я. Порушення розтяжності і скоротливості функцій міокарда при ЕБС, їх попередження та усунення / / дис. на соіск. ступеня канд.біол.наук .- М. - 1985
Генгін М.Т. Нова КП нервової тканини. Регіональний розподіл і деякі фізико-хімічні властивості / / Нервова система. - Л. - ЛДУ. - 1991 .- С. 29-30
Генгін М.Т., Вернигора О.М. Вплив етанолу на активність карбоксипептидази Н в мозку щурів. / / Укр.біохім.журн. - 1993. - Т.65. - № 1. - С.100-103.
Генгін М.Т., Вернигора О.М. Ферменти процесингу опіоїдних пептидів і методи визначення їх активності / / Укр.біохім.журн. - 1994. - Т.66. - № 2. - С.3-17.
Генгін М.Т., Вернигора О.М., Нікішин М.М. Вплив емоційно-больового стресу на активність ВПП - ферменту процесингу нейропептидів головного мозку щурів / / фізіолого. журн. - 1994.-80 .- № 3 .- С.23-27.
Генгін М.Т., Вернигора О.М., Нікішин М.М., Керімов В.Ю. Ефект емоційного стресу на активність карбоксипептидази Н у відділах головного мозку щурів з різною до нього стійкістю / / Вопр.мед.хіміі.-1995.-т.41, № 4 .- С.8-9
Генгін М.Т., Вернигора О.М., Нікішин М.М., Макєєва Н.В. Вплив каптоприлу і резерпіну на активність деяких ферментів обміну нейропептидів. / / Вопр.мед.хіміі. - 1995. - Т.41. - № 5. - С.37-39.
Герштейн Л.М., Доведова Є.Л., Узбеков М.Г., Галікова Т.Л., Сергубіна А.В., Ашмарин І.П. Пролонгована дія татрапептідаміна, особливості обміну білків і медіаторів в окремих мікроструктурах мозку / / Нейрохімія .- 1984 .- т. 3 .- № 3.-С.236-243
Година С.В. Протеолітичні ферменти головного мозку при алкогольної інтоксикації / / дис. на соіск. ступеня канд.біол.наук .- Дніпропетровськ .- 1988
Голова І.Д. Вплив етанолу на механізми емоційного стресу / / Алкоголізм .- М. - 1989 .- С.53-54
Гомазков О.А. Мозок і нейропептиди / / Довідково-інформаційне видання .- М.-1997
Гомазков О.А. Роль ферментних систем у регуляції "критичної" функції фізіологічно активних пептидів / / Вопр.мед.хіміі. - 1988 .- № 1 .- С.12-18.
Гомазков О.А. Функціональна біохімія регуляторних пептидів. - М. - Наука .- 1993 .- 159с.
Гомазков О.А., Грігорьянц О.О. Регуляція біосинтезу енкефалінів: біохімічні і фізіологічні аспекти / / Усп.совр.біол. - 1989. - Т.108. - № 1. - С.109-124.
Гомазков О.А., Калініна Є.В. Ангиотензинпревращающий фермент: бінарна активність. Інгібітори і функціональна роль кінінової ланки / / Усп. сучас. біол .- 1997.-117 .- № 2.-С.172-183.
Гомазков О.А., Панфілов А.Д., Ростовцев А.П., Коміссарова Н.В., Фомін В.В., Грігорьянц О.О. Регіональна активність енкефалінів-і-ангіотензин ІІ утворюють пептидаз мозку у щурів з різним потягом до етанолу / / Вопр.мед.хіміі. - 1991. - Т.37. - № 4. - С.33-37.
Григор О.О. Гомазков О.А. Енкефалінобразующіе ферменти / / Вопр.мед.хіміі .- 1986 .- № 3 .- С.15-20
Дворцин Г.Ф., Шаталов В.Н. Антистресовий ефект даларгіну при іммобілізаційному стресі у щурів / / Бюл.Експер.Біол.і Мед. - 1991.-111 .- № 6 .- С.617-619.
Дев'яткіна Т.А. Антиоксидантна система при стресі і пошук нових антистресорних засобів / / дис. на соіск. ступеня док.мед.наук .- Київ .- 1990
Дмитрієв А.Д. Біосинтез нейропептидів / / Підсумки наук. і техн. ВІНІТІ.-Фізіологія людини і тварин .- 1982.-13.-С.7-49.
Дмитрієв А.Д., Чиркова С.К., Дмитрієва О.Ф., Теннов А.В., Шурин М.Р., Чирков А.М. Зменшення змісту імунореактивних? - І?-Ендорфінів в крові і придушення їх гіперсекреції під впливом дексаметазону при емоційному стресі у мавп / / Бюл. Експер. Біол. і мед.-1989.-57 .- № 5.-С.572-574
Єлісєєва Ю.Є., Барсукова І.С., Орєхович В.М. Виявлення інгібіторів карбоксікатепсіна (ангіотензин-I-перетворюючого ферменту) в лейкоцитах людини / / Докл. АН СССР.-1988 .- 302 .- С.992-994
Єльський В.М., Сергєєва Л.А., Самсоненко Р.А. Роль опіоїдних пептидів у здійсненні функцій гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової системи в нормі і при шоку. / / Тез.докл.всесоюзн.конференции "Нейропептиди: їх роль у фізіології і патології". - Томськ. - 1985. - С.53-54.
Єнін Л.Д., Акоев Г.Н., Лебедєв В.П., Потєхіна І.П. Вплив опіоїдних пептидів мозку на сенсорні закінчення шкіри як один з механізмів анальгетічеського ефекту. / / В зб. докл. наук. конфер. "Фізіологічне та клінічне значення регуляторних пептидів". - Пущино. - 1990. - С.55-63.
Єрьоміна С.А., Белякова Є.І., Кондрух Т.В. Роль катехоламінів різних класів в центральній регуляції гіпоталамо-гіпофізарно-адреналової системи / / фізіолого. жур. ім. Сєченова. - 1988 .- № 9 .- С.1316-1320.
Еропкин М.Ю. Роль протеолізу в процессингу та інактивації нейропептидів: його можлива роль у деяких функціях мозку / / Усп.совр.біолог. - 1983 .- 95 .- № 1 .- С.65-67.
Єрошенко Т.М., Тітов С.А., Лук'янова Л.Л. Каскадні ефекти регуляторних пептидів / / Підсумки наук. і техн. ВІНІТІ.-Фізіологія людини і тварин .- 1991 .- 46 .- 203с.
Захарова О.Ю Про модулює вплив енкефалінів на реакції системи крові при іммобілізаційному стресі / / дис. на соіск. ступеня канд.мед.наук. - Томськ .- 1988
Іванова Т.М., Скоцеляс Ю.Г., Болякін В.І., Анохіна І.П., Бєлова Т.І., Юматов Е.А., Судаков К.В. Стійкість серцево-судинної функції у щурів різних генетичних ліній в умовах емоційного стресу / / Жур.висш.нервн.деят .- 1979.-29 .- № 5 .- С.1052 - 1060
Ігнатов Ю.Д. Гетерогенність опіоїдних рецепторів мозку і властивості їх лігандів. / / В зб. "Нейрофармакология. Регулювання больової чутливості ". - Л. - 1984. - С.9-93.
Ільюченок Р.Ю. Центральні ефекти фармакологічних речовин і гематоенцефалічний бар'єр. / / В кн. "Фізіологія і патологія гісто-гематіческіх бар'єрів". - М. - Наука. - 1968. - С.179-186.
Ісмайлова Х.Ю., Гасанов Г.Г та ін Дослідницьке поведінка у відкритому полі і норковій камері щурів з різною схильністю до стресу / / Бюл.Експер. Біол. Мед. - 1992.-114 .- № 8.-с.130-132.
Йохансон О., Хекфельд Т., Ельді Р.П., Шульценберг М., Терреніус Л. Імуногістохімічні розподіл енкефаліновимі нейронів / / в кн. "Е ндорфіни" під ред. Коста Е., Трабука М. - М. - 1981.-С.61-79
Калініна Є.В., Позднев В.Ф., Коміссарова Н.В., Гомазков О.А. Вплив нових пептидних інгібіторів на співвідношення ангіотензин I конвертуються і кініндеградірующей активностей дипептидилкарбоксипептидазы (АПФ) / / Біохімія. - 1997 .- 62 .- 3 .- С.440-444.
Калюжний Л.В. Фізіологічні механізми регуляції больової чутливості / М. - Медицина .- 1984 .- 215с.
Каменська Л.М., Кононенко В.О. Взаємодія ренін-ангіотензинової і енкефалінергічного систем мозку і гіпофіза щурів в нормі і при експериментальній патології гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової комплексу / / Фізіол.журн .- 1996.-82 .- № 4 .- С.60-64.
Кассиль Г.М. Деякі аспекти сучасних уявлень про гематоенцефалічний бар'єр. / / В кн. "Фізіологія і патологія гісто-гематіческіх бар'єрів". - М. - 1968. - С.170-178.
Квочка В.Є. Пептиди - регулятори функцій мозку .- Рига. - 1984 .- с.
Кокс Т. Стрес / / М. - Світ .- 1980 .- 180с.
Кольдиц М. Участь ангіотензину ІІ у здійсненні негативних емоційних реакцій. / / Жур.висш нервн. деят. - 1985.-т.35 .- с.280-287.
Коплика Є.В., ведучи Д.Ф., Михалева І.І. Пептид дельта-сну як фактор викликає стійкість тварин до емоційного стресу / / тез. Докл. АН СРСР .- 1982.-267 .- № 1.-С.230-234.
Корнєва Є.А. Регуляторні пептиди як модулятори захисних функцій організму / / Фізіол.журн. -1989.-75, № 5 .- С. 656-665
Коробов Н.В. Даларгін - опіоідоподобний пептид периферичного дії / / Фармакологія і токсикологія .- 1988 .- № 4.-С.35-38
Костерлиц Т.В., Х'юс Д. Розвиток концепцій опіатних рецепторів і їх лігандів / / в кн. "Ендорфіни", під ред. Коста Е., Трабуккі М. - М. - Світ .- 1981.-С.43-55.
Кругліков Р.І., Діш Т.М., Коштоянц О.Х. Макарова М.Ю., Пузирьова Т.Г. Про деякі механізми дії нейропептидів та їх аналогів на процеси навчання і пам'яті. / / Нейрохімія. - 1987. - Т.6. - № 6. - С.199-205.
Кузовков А.Г. Функціональний стан гематоенцефалічний бар'єр і центральної нервової системи при впливі деяких екстремальних факторів / / дис. на соіск. ступеня доктора мед. наук .- Л. - 1971
Лакин Г.Ф. Біометрія. - М. - Вища школа.-1990.-352с.
Ламзіна Н.А. Закономірності дії АПФ в іммобілізаційному стані / / дис. на соіск. ступеня канд.хім.наук .- М.-1990
Ласукова Т.В. Вплив опіоїдних пептидів на функцію кори надниркових залоз в нормі і при стресі / / дис. на соіск. ступеня канд.біол.наук .- Томск.-1991
Лішманов Ю.Б., Братцев Н.Ф., Ламбін С.А. Нейропептиди. Їх роль у фізіології та патології / / Томск.-1985.-С. 92-93.
Лішманов Ю.Б., Маслов П.М. Опіоїдні нейропептиди, стрес і адаптаційна захист серця. - Томськ. - 1994
Лішманов Ю.Б., Маслов П.Н., Крилатов А.В., Ускіна Є.В. Роль ендогенних опіоїдних пептидів в механізмах антиаритмічного ефекту адаптації / / Фізіол.журн.-1996.-82 .- № 5-6.-С.56-59
Лішманов Ю.Б., Маслов П.Н., Ласукова Т.В. Роль опіоїдної системи в адаптації організму і захисту серця при стресі / / Усп.фізіол.наук. - 1997. - Т.28. - № 1. - С.75-97.
Лішманов Ю.Б., Маслов Л.М., Тітов М.І. Про механізм антистрессорного дії Д-ала 2-лей 5-арг 6-енк / / Бюл. Експер.Біол.і мед.-1985 .- № 9.-с.268-270.
Лішманов Ю.Б., Маслова Л.В., Цибін А.М., Трифонова Ж.А. Опіоїдні пептиди і нейрогормональні реакції при стресі та адаптації / / Пат.фізіологія .- 1987 .- № 6.-С.51-53.
Лисенко А.В. Протеолітичні процеси в мозку щурів при стресі і адаптації, вплив d-сон індукуючого пептиду / / дис. на соіск. ступеня канд.біол.наук .- Ростов Н / Д. -1993
Майзеліс М.Я. Гематоенцефалічний бар'єр і його регуляція. - М. - Медицина. - 1973. - 183с.
Майзеліс М.Я., Заблудовський А.А., Шихов С.М. Про участь циклічних нуклеотидів у механізмах дії енкефалінів / / Бюл.Експер.Біол.і мед.-1982 .- № 3.-С.33-35.
Малишенко Н.М., Єрошкін С.В. До механізму антистрессорного дії ПДС / / Стрес, адаптація та функціональні нарушенія.-Кишинів: Штіінца .- 1984.-С 84-85.
Малишенко Н.М., Попова Н.С. Гормони і нейропептиди в інтеграційних процесах / / Усп.фізіол.наук .- 1990.-21 .- № 2.-С.94-110.
Маслов Л.М., Лішманов Ю.Б., Нарижна Н.В. Про участь різних типів опіатних рецепторів у механізмах стресорного ушкодження серця / / Фізіол.журн.-1996 .- 82, № 5-6.-С.53-58
Масюк Т.В., Весельський С.Г., Масюк А.І. Вплив енкефалінів на секреторну функцію печінки / / Фізіол.журн. - 1998.-84 .- № 4 .- С.399-405
Машковский М.Д. Фармакологія антидепресантів / під ред. Машковского М.Д., Андрєєвої Н.І, Полежаєва А.І. - М. - Медицина .- 1983 .- 240с.
Медведєв О.С., Тітов М.І. Опіоїдні пептиди і регуляція серцево-судинної системи. / / Фармакологія нейропептидів. - М.: Изд-во ін-ту фармакології .- 1982.-С.88-101.
Меерсон Ф.З., Пшенніков М.Г. Адаптація до стрес-ситуації та фізіологічної навантаженню. - М. - Медицина. -1988.-25 c.
Менджеріцкій А.М., Маклецова М.Г. та ін антистресовий ефект?-сон індукуючого пептиду при гіпокінетичним стресі / / Укр.біохім.-1991.-63 .- № 1.-С.34-37.
Механізми розвитку стресу / / Сб.статей .- Кишинів: Штіінца .- 1987.-222с.
Мітюшина Н.В. Вплив енкефалінів на активність ферментів обміну регуляторних пептидів у головному мозку і периферичних тканинах щурів / / дис. на соіск. степені.канд.біол.наук .- Пенза.-1999
Наркевич В.Б. Інгібітори ендогенних пептидаз мозку: антідепрессантний властивості і взаємодію з нейромедіаторні системи мозку / / дис. на соіск. ступеня канд.біол.наук. - М.-1995
Павлова В.І. Стрес-ушкодження організму і його попередження метаболітами стрес-лімітуючих систем / / дис. на соіск. ступеня доктора біол.наук.-Томск.-1990
Панін Л.Є. Біохімічні механізми стресу / Новосібірск.-Наука.-1983.-232с.
Пашутін С.Б. Синтетичні пептиди біорегулятори у забезпеченні адаптації організму до екстремальних впливів / / дис. на соіск. ступеня доктора біол.наук.-М.-1991
Подвігіна Т.Т., Богданова Т.С., Філаретов А.А. Значення нейропептидів у зміні властивостей гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи після стресу. / / Фізіол.журн. - 1992. - Т.78. - № 4. - С.149-154.
Пшеннікова М.Т. Роль опіоїдних пептидів в реакції організму на стрес / / Пат.фізіол. і експер.терапія. - 1987. - Вип.3. - С.85-90.
Раєвський К.С. Ендогенні опіоїдні пептиди як можливі нейропередатчики / / в кн. "Опіоїдні пептиди та їх рецептори" .- Підсумки науки і техніки ВІНІТІ.-1982 .- № 13.-С.185-200.
Ростовцев А.П., Грігорьянц О.О., Гомазков О.А. Субстрати для дослідження енкефалінобразующей карбоксипептидази в мозку і наднирниках щурів / / Вопр.мед.хіміі .- 1988.-34, № 1.-С. 126-129
Рочас С.В., Подвігіна Т.Т. Зміна реакції гіпофізарно-адренокортикальної системи на стресор при багаторазовому її повторенні / / Фізіол.журн .- 1998 .- т.84 .- № 12 .- С.1386-1394
Саксон М.Є., Сафронова В.Г., Белоярцев Ф.Ф. Опіатні рецептори серця їх роль у реалізації іонотропного ефектів наркотичних анальгетиків і опіоїдних пептидів / / Вісник АМН СССР.-1983 .- № 10 .- С. 48-55
Салієва Р.М., Коплика Є.В., Каменєв З.А., Полєтаєв А.Б. Вплив бета-ендорфіну і пептиду, що викликає дельта сон, на стійкістю до емоційного стресу / / Бюл. Експер. Біол. і Мед .- 1989.-т.58 .- № 10.-С.464-465
Салієва Р.М. Яновський К. та ін ПВДС, як фактор підвищує вміст речовини Р в гіпоталамусі і стійкості щурів до емоційного стресу / / Журн.висш.нервн.деят.-1991 .- т.41 .- № 3.-С.558-563 .
Сельє Г. Стрес без дистресу. - М.-Прогрес .- 1979 .- 124с.
Сергєєва М.Г. Кінетичні закономірності рецептор-лігандного комплексоутворення в механізмі дії нейропептидів і морфіну / М.-1995.-55с.
Слепушкин В.Д., Золоєв Г.К., Виноградов В.А., Тітов М.І. Нейропептиди, їх роль у фізіології та патології / Томськ .- Изд-во Томського ун-та .- 1988.-143с.
Слепушкин В.Д., Лішманов Ю.Б., Золоєв П.К., Прум І.А. Сучасні смерті про деяких нетрадиційних механізмах стресу / / Успіхи фізіол.наук .- 1985.-16 .- № 4.-с.422-424.
Судаков К.В. Нейрохімічних природа "застійного" збудження в структурах мозку при емоційному стресі / / Пат.фізіол.і експер.терапія .- 1995 .- № 1 .- С.3-8.
Судаков К.С., Іванов В.Т., бадік В.І. та ін Механізми антистрессорного дії ПВДС / / Стрес, адаптація та функціональні порушення .- Кишинів: Штіінца.-1984.-С356-357.
Тигранян Р.А. Гормонально-метаболічний статус організму при екстремальних впливах / М. - Наука .- 1990 .- 228с.
Тигранян Р.А. Реакція опіоїдної системи головного мозку на стрес і її залежності від стану катехоламінергіческой системи / / Нейрохімія.-1987.-6 .- № 1.-С.63-71
Тигранян Р.А., Вакуліна О.П. Зміст енкефалінів і ендорфінів у різних відділах головного мозку щурів при стресі / / тез. 9 всесоюзн. конф. з біохімії нервової системи. - Єреван. - 1983. - С.321-372.
Ткаченко Л.М. Відображення індивідуально-типологічних властивостей вегетативної нервової системи в характері вегетативних і поведінкових реакцій при емоційно-больовому стресі / / Бюл. Експер. Біол. і Мед. - 1998. - Т.126. - № 12. - С.621-625.
Тонких А.В. Роль гіпоталамо-гіпофізарної області в реакціях організму при екстремальних (стресорні) ситуаціях / / Усп.фізіол.наук. - 1976. - Т.7. - № 2. - С.3-12.
Філаретов А.А., Богданов А.І., Ярушкіна Н.І. Стрес-викликана аналгезія. Роль гормонів гіпофізарно-адренокортикальної системи / / Фізіол.журн.-1995.-81 .- № 2.-С.40-46.
Фурдуй Ф.І. Сучасні уявлення про фізіологічні механізми розвитку стресу. / / В кн. "Механізми розвитку стресу". - Кишинів. - "Штіінца". - 1987. - С.8-33.
Фурдуй Ф.І. Фізіологічні механізми стресу і адаптації при гострому дії стрес-факторів / / дис. на соіск. ступеня доктора біол. наук.-Л.-1987
Хайсман І.Д., Арефолов Ю.П. Роль периферичних катехоламінергіческіх систем в антистрессорного дії нейропептидів / / Бюл. Експер. Біол. і мед.-1991 .- № 6. - С.328-333
Чайлдерс С.Р., Шварц Р., Койл Дж.Т., Снайдер С.Х. Радиоиммунологический тест на енкефаліни. Зміст метіонін-і лейцин-енкефаліну в мозку морфінозавісімих і пошкоджених каїновою кислотою щурів / / в кн. "Е ндорфіни" під ред. Коста Е., Трабука М. - М. - 1981.-С.61-79
Шурин М.Р. Імумономодуляторної властивості опіоїдних пептидів / / "Структура та функції імунорегуляторних пептидів" .- Підсумки науки і техн .- Імунологія. - М.-1988.-т.26.-с.168-173
Щетиніна Н.В. Активність основних карбоксипептидази в тканинах і відділах мозку щурів в онтогенезі. / / Дис. на соіск. ступеня канд.біол.наук.-Пенза .- 1997
Емоційний стрес в умовах норми і патології людини / Л. - Медицина .- 1976.-223с.
Юматов Є.А. Пептидні фактори стійкості до емоційного стресу: теоретичні та прикладні аспекти дослідження / / у зб. Матер. 1 Сов-інд. симпозіуму "Нейрофізіологія" .- М.-1983.-С.127.
Юматов Е.А., Гехт К., Скоцеляс Ю.Г. Субстанція Р як фактор стійкості до емоційного стресу / / Журн. вис. нервн. деятельности.-1984.-34.-4.-С.771-777.
Юматов Е.А., Кирилова О.І., Поппай М., Ратеак Р. Зміст субстанції Р в гіпоталамусі у стійких і схильних до емоційного стресу щурів / / Журн. вис. нервн. деятельности.-1987.-37 .- № 2.-с.371-372.
Юханом Р.Ю., Рожанец В.В., Михалева І.І., Травневий А.І. Аналіз механізму стрес-протективні дії пептиду, що індукує?-Фазу сну / / Бюл. Експер. Біол. і Мед .- 1990 .- № 1 .- С.46-47.
Якушев В.С., Давидов З.В., Бушева В.В. Білковий обмін у великих півкулях головного мозку при емоційно-больовому стресі / / Укр.біохім.журн. - 1985. - Вип.57. - № 2. - С.15-18.
Янг Х.-Ю.Т., Хонг Дж.С., Фратто В., Коста Є. Енкефаліни мозку щурів. Розподіл і біосинтез / / в кн. "Ендорфіни" під ред. Коста Е., Трабуккі М. - М.-1981.-С.155-164.
Ahmed MS, Cemerikis B., Agbas A. Propepties and functions of human placental opioid system / / Life Sci.-1992.-V.50, № 2.-P.83-97
Akil H. Opiate tolerance and dependence: recent findings and synthesis. New.-Biol.1991.Oct. 3 (10) :915-23.
Armstrong JD Esbeshade KL, Coffey MT, Heimer E. Opioid control of growth hormone in the suckled sow is primarily mediated through growth hormon releasing factor / / Domest-Anim-Endocrinol .- 1990.-Apr.-v.7, № 2. - P. 191-198
Arregui A., Iversen LL Beta-lipotropin potently inhibisa purified angiotensin-conwerting enzyme from human brain / / Biochem. Pharmacol.-1979.-v.28 .- P.2693-2696
Axelrod J. - In.: Stress: The role of catecholamines and other neurotransmitters / Eds. E. Usdin, R. Kvetnansky, J. Axelrod. - V.1. - P.3-13, Gordon and Breach Science Publishers. NY 1984.
Bado A., Roze C., Lewin MJ, Dubrasquet M. Endogenous opioid peptides in the control of food intake in cats / / Peptides. - 1989, Sep.-Oct. - V.10. - N.5. - P.967-971.
Barry N., Jones, Alvin S. Stern, et al. Structure of Two-Adrenal Polypeptides. Containing Multiple Enkephalin Sequences / / Arch. Biochemistry and Biophisics, 1980. - V.204, 1. - P.392-395.
Bauer AI, Szurszewski IH Effect of opioid peptides on circular muscle of canine duodenum / / J. Phisiol. - London. 1992. - Mar. 434: 409-22.
Belluzzi JD, Grant N., Garsky V., Sarantalus D., Wise CD, Stein L. Analgesia induced in vivo by central administration of enkephalin in rats / / Nature. - London. 260, 625. - 1976.
Benter IF, Hirsh EM, Tuchman AI, Ward PE N-terminal degradation of low molecular weight opioid peptides in human cerebrospinal fluid / / Biochem. Pharmacol. - 1990. Aug. 40 (3): 465-72.
Bhargava HN Opioid peptides, receptors, and immune function / NIDA. Res. Monogr. - 1990. - V.96. - P.220-233.
Bloom F., Segal D., Ling N., Guillemin R. Endorphins: profound behaviaral factors in mental illeness / / Science. - 1976. - V.194. - P.630-632.
Blum AI Interactions of ligands with the opiate receptors of brain membrans regulations by ions and nucleotids / / Proc. Nat. Acad. Sci. US. - 1978. - V.75. - P.1713-1717.
Bunning P., Riordan F. Sulfate potentiation of the chloride activation of angiotensin-converting enzyme / / Biochem. - 1987. - V.26. - P.3374-3377.
Camargo AC et.al. Brain endooligopeptidase A, a putative enkephalin converting enzyme / / J. Neurochem .- 1987.-48, № 4 .- P. 1258-1263
Carr DJ The role of endogenous opioids and their receptors in the immune system / / Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1991, Nov. - V.198. - N.2. - P.710-200.
Carr DJ, DeCosta BR, Kim CH, Jacobson AE, Guarcello V., Rice KC, Blalock IE Opioid receptors on cells of the immune system: evidence for delta and-kappa-classes / / J. Endocrinol. - 1989, Jul. - V.122. - N.1. - P.161-168.
Chevillard C., Duchene N., Pasguir R., Alexander IM Relation of the centrally evoked pressor effect of angiotensin II to central noradrenaline in the rabbit / / Europ. J. Pharmacol. 1979. - V.58. - P.202.
Cool DR, Normant E., Shen F., Chen HC, Pannell L., Zhang Y., Loh YP Carboxypeptidase E is a regulated secretory pathway sorting receptor: genetic obliteration leads to endocrine disorders in Cpe (fat) mice / / Cell. - 1997, Jan. 10. - V.88. - N.1. - P.73-83.
Cover PO, Buckingham JS Effects of selective opioid-receptor blockade on the hypothalamo-pituitary-adrenocortical responses to surgical trauma in the rat / / J. Endocrinol. - 1989, May. - V.121. - N.2. - P.213-220.
Covi G., Sheiban I., Gelmini G., Arcaro G., Tonni S., Bolner A., Piemonte G., Leãhi A. Left ventricular diastolic function during adrenergic stress in essential hypertension: acute and chronic effects of ACE inhibitiïn / / Cardi ovasc. Druggs. Ther. - 1996 .- Jul. - V.10. - N.3. - P.321-329.
Ãuóhman DW, Ondetti MA, Gordon EM et al. Rational design and bi o chemical utility of specific inhibitors of angiotensin-cïnverting enzyme / / J. Cardiovasc. Pharmacol. - 1987. - V.10. - Suppl.7. - P.17-30.
Cushman DW, Wang FL, Fung WC et al. Comparison in vitro, ex vivo, and in vivo of the actions of seven structurally diverse inhibitors of ACE / / Brit. I. Clin. Pharmacol. 1989. - V.28. - P.115-131.
Demmer W., Brand R. Processing and degradation of Met-enkephalin by peptidase associated with rat brain cortical synaptosomes / Proteasey potential role in health and disease. Prot. Int. Symp. Wirsburg. 17-20 Oct. - 1982. P.165-177.
Duggan AW Enkephalins as transmitters in the central nervous system / / Cire Res. - 1980. - V.46. - N.6. - Suppl.1. - P.149-1-153.
Ehlers MR, Riordan IE Angiotensin-converting enzyme: new concepts concerning its biological role / / Biochem. - 1989. - V.28. - N.3. - P.5311-5318.
Erdos EG, Skidgel RA The angiotensin-I-converting enzyme / / Lab. Invert. - 1987. - V.56. - P.345-348.
Ernst A., Schulz P., Schoenenberger GA Cirdadian variation of DSIP - like immunoreactivity in human plasma / Sleep research. Brain information service. Brain research institute University of California. Los Angeles. - 1987. - V.16. - P.609.
Evans C. et al. Opioid peptides in the adrenal pituitary axes / / Psychopharm. Bull. - 1985. - N.3. - P.446-471.
Fricker LD Activation and membrane binding of carboxypeptidase E / / J. Cell Biochem. - 1988. - V.38. - P.279-289.
Fricker LD Carboxypeptidase E / / Ann. Rev. Physiol. - 1988. - V.50. - P.309-321.
Fricker LD Neuropeptide biosynthesis: focus on the carboxypeptidase processing enzyme / / Trends Neurosci. - 1985. - V.8. - N.5. - P.210-214.
Fricker LD Peptide - processing exopeptidases: amino-and carboxypeptidases involved with peptide biosynthesis / Peptidal biosynthesis and processing. - Florida, 1991. - P.199-230.
Fricker LD, Berman YL, Leiter EH, Devi LA Carboxypeptidase E activity is deficient in mice with the fat mutation. Effect on peptide processing / / J. Biol. Chem. - 1996, Nov. 29. - V.271. - N.48. - P.30619-30624.
Fricker LD, Reaves BJ, Das D., Dannies PS Comparison of the regulation of carboxypeptidase E and prolactin in CH 4 G 1 cells, a rat pituitary cells line / / Neuroendocrin.-1990 .- 51, № 6 .- P. 658-663
Fricker LD, Snyder SH Enkephalin convertase: purification and characterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenal chromaffin granules / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1982. - 79. - P.3886-3890.
Fricker LD, Snyder SH Purification and characterization of enkephalin convertase, an enkephaline-synthesizing carboxypeptidase / / J. Biol. Chem. - 1983. - V.258. - N.18. - P.10950-10955.
Fricker LD, Supattapone S., Snyder SH Enkephalin convertase: a specific enkephalin synthesizing carboxypeptidase in adrenal chromaffin granules. Brain and pituitary gland / / Life Sci. - 1982. - V.31. - P.1841-1844.
Gainer H., Russel JT, Loh YP The enzymology and intracellular organization of peptide precursor processing: the secretory vesicle hypothesis / / Neuroendocrin. - 1985. - 40. - P.171-184.
Ganten D., Minnich JL, Grander P. Et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue / / Ibid. - 1971. - V.173. - P.64-65.
Gerendaei I. Modulation of testicular functions by testicular opioid peptides / / J. Physiol. Pharmacol. . - 1991, Dec. - 42. - N.4. - P.427-437.
Gibson A., Hart S., Shabib A. Leucinoenkephalin and methionine-enkephalin produce opposing effects on plasma corticosterone levels in ether-stressing mice / / Brit. J. Pharmacol. - 1989. - V.70. - P.509-511.
Gorelic DA, Larlin DH, George R., Li CH β-endorphin is behaviorally active in rats after chronic intravenous administration / / Pharmacol. Biochem. B ehav. - 1978. - V.9. - N.3. - P.385-386.
Graf M., Kastin AI Delta-Sleep-Induãing Peptide (DSIP): A review / / Ne urosci. and Biobehav. Rev. - 1984. - V.8. - N.12. - P.83-93.
Graf M., Schenenberger GA Delta-Sleep-Inducing Peptide Modulates the Stimulation of Rat-Pineal N-Ace tyltransferase Activity bi Ivolving the α 1-Adrenergetic Reception / / J. Neurochemistry. - 1987. - V.48. - N.4. - P.1252-1257.
Gregg D., Goedken E., Gaikin M., Wendell D., Gorski J. Decreased expression of carboxypeptidase E protein is correlated to estrogen-induction of rat pituitary tumors / / Mol. Cell. Endocrinol. - 1996, Mar., 25. - V.117. - N.2. - P.219-225.
Guest PC et.al. Molecular heterogeneity and cellular localization of carboxypeptidase H in the islets of Langerhans / / Endocrinology .- 1991.-129, № 2 .- P.734-740
Harmar AJ Neuropeptides / / Transm. Mol. In the brain. - 1987. - 2. - P.17-26.
Hook YJH, Eiden LE Two peptidases that convert 125 J-Lys-Arg-(Met)-enkephalin, 125 J-enkephalin-Arg 6 and respectively, to 125 J-(Met)-enkephalin in bïvine ad renal medullary chromaffin granules / / FEBS Lett. - 1984. - 172. - N.2. - P.212-218.
Hook VYH, Eiden LE, Pruss RM Selective regulation of carboxypeptidase peptide hormone-processing enzyme during enkephalin biosynthesis in cultured bovine anrenomedullary chromaffin cells / / J. Biol. Chem. - 1985. - 260. N.10. - P.5991-5997.
Hook VYH, LaGamma EF Product inhibit of carboxypeptidase H / / J. Biol. Chem .- 1987.-v.262 .- № 26.-P. 12583-12588
Hook VJH, Mezey E., Fricker LD, Pruss RM, Siegel RE, Brownstein MJ Immunochemical characterization of carboxypeptidase B-like peptide-hormone-processing enzyme / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1985. - 82. - P.4745-4749.
Hooper NM Ançiotensin converting enzyme implications from molecular biology for its physiological functions / / Int. J. Biochem. - 1991. - V.23. - N.7-8. - P.641-647.
Hooper NM, Turner AJ Isolation of two differentially glycosylated from of peptide-dipeptidases A (ACE) from pig brain: a reevaluation of teiner role in neuropeptide-metabolism / / Biochem. 1987.-241, № 15.-P.1455-1463
Hughes J., Smith TW, Kosterlitz H. Wetal Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate agonist activity / / Nature. - 1975. - V.258. - N.5536. - P.577-579.
Hui K.-S., Lajlha A. Neuropeptidases / Handbook of Neurochemistry. - New York and London, 1983. - V.4. - P.1-19.
I'Hereault S., Barden N. Regulation of proopiomelanocortin messenger RNA - concentrations by opioid peptides in primary all cultures of rat hypotalamus / / Mol. Brain. Res. 1991. - 10 (2). - P.115-121.
Jankovic BD, Radulovic I. Enkephalins, brain and immunity: modulation of immune responses by methionine-enkephalin injected into the cerebral cavity / / Int. J. Neurosci. - 1992, Nov-Dec. - V.67. - N.1-4. - P.241-270.
Jiang ZG, North RA Pre-and postsynaptic inhibition by opioids in rat striatum / / J. Neurosci. - 1992, Jan. - V.12. - N.1. - P.356-361.
Junkinz G. Changes of pain threshold aften stress-possible involvement of endogenous opiates / / Arzeneimittel Forscheeng Drug. Res. - 1980. - V.30-2. N.8. - P.1237-1238.
Kastin AY, Nissen C., Coy DH DSIP - like immunoreactivity in the developing rat brain / / Brain. Res. Bull. - 1981. - 7. - P.687-690.
Khanna AS, Waisman DM Metabolism and intracellular processing of protein hormones / Hormones and their actions. Part 1. / Eds. BACooke et al. - Amsterdam, 1988. - P.117-132.
Khawaja XZ, Green JC, Thorpe JR The occurence and receptor specificy of endogenous opioid peptides within the pancreas and liver of the rat / Comporison with brain / / J. Biochim.-1990.-Apr.1 .- 267, № 1.P. 233-240
Kramer TH, Toth G., Haaseth RC, Matsunage TO, Davis P., Hruby VI, Burks TF Influence of peptidase inhibitors on the apparent agonist potency of delta celective opioid peptides in vitro / / Life Sci. - 1991. - V.48. - N.9. - P.881-6.
Krieger DT Brain peptides: what, where and why? / / Science. - 1983. - V.222. - N.462. - P.975-985.
Lansillo JJ, Stevens J., Dazaratty Y., Yotsumoto H., Fanburg BL Angiotensin-converting enzyme from human tessues, physicochemical, catalitic and immunological properties / / J. Biol. Chem. - 1985. - V.260. - N.28. - P.14938-14944.
Lantz I., Thornwall M., Kihlstrom JE, Nyberg F. A comparison of human lung, brain, CSF and plasma angiotensin-converting enzyme with regard to neuropeptide metabolism / / Biochem. Int. - 1992, Mar. - V.26. - N.3. - P.415-426.
Lanzillo JJ, Stevens J., Dararatty Y. et.al. Angiotensin-converting enzyme from human tessues, physicochemical, catalic and immunological properties / / J. Biol. Chem.-1985.-260, № 28.-P.14938-14944
Ling N., Burdus R., Guillemin R. Isolation primary structure and synthesis of α-endorphin and γ-endorphin, two peptides of hypothalamic hypophysial or igin with morphinomimetic activity / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1976. - V.73. - P.3942-3943.
Loe KS, Frank S., Vanderklish P. Et al. Inhibitions of proteolisis protect hyppocampal neurons from ischemia / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1991. - V.88. - N.16. - P.7233-7237.
Loh YP, Birch NP, Castro MG Pro-opiomelanocortin and provasopressin converting enzyme in pituitary secretory vesicles / / Biochemie.-1988.-70, № 1.-P.11-16
Loh MH., Theng LF, Wei E., Li CH β-endorphin as a potent analgetic agent / Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1976. - V.73. - N.8. - P.2895-2898.
Lynch DR, Snyder SH Neuropeptides. Multiple molecular forms. Metabolic pathways and receptors / / Anme. Rev. Biochem.-55 .- Calif.Alto.-1986 .- P.773-799
Lynch DR, Vanable JC, Snyder SH Enkephalin convertase in the heart similar disposition to atrial natriuretic factor / / Endocrinology .- 122, № 6 .- P. 2683-2691
Mains RE, Eipper BA Secretion and regulation of two biosyntetic enzyme activities, peptidil-glycine α-amidating monooxygenase and a carboxypeptidase, by mouse pituitary corticotropic tumor cells / / Endocrinology .- 1984.-115, № 5.-P.1683-1690
Makara GB, Palrovits M., Szentagothai J. The endocrine hypothalamus and the hormonal response to stress / Selyes guide to stress research. / Selye H. (Eds.). - New York: Van Nostrand Reinhold Co. - 1980. - P.280-337.
McDomald JK, Schwabe C. Intracellular exopeptidases / Proteinases in Mammalian Cells and Tissues / Barrett AI (eds.). - Amsterdam: Elsevier / North Holland Biomedical Press. - 1977. - P.311-391.
Mentein R., Roos T. Proteases involved in the metabolism of angiotensin II, bradykinin, calcitonin gene-related peptide (CGRP), and neuropeptide Y by vascular smooth muscle cells / / Peptides. - 1996. - V.17. - N.4. - P.709-720.
Meunier JC The opiad peptides and their receptors / / Biochemie .- 1986.-68 .- P.1153-1158
Millan MJ, Emrich HM Endorphinegric system and the response to stress / / Psychother. Psychosomat. - 1981. - V.36. - N.1. - P.43-56.
Mulder AH, Wardeh G., Hogenbom F., Frankhuyzen AL Selectivity of various opioid peptides toward delta-kappa-and mu-opioid receptors mediating presinaptic inhibition of neurotransmitter release in the brain / / Neuropeptides .- 1989.-Aug-Sep .- 14, № 2 .- P.99-104
Nakamura M., Kamata R., Jnour H., Inaba M. Effects of opioid peptides administration in conscious rats on the changes in blood adrenaline levels caused by immobilization stress / / Jap. J. Pharmacol. - 1989. - V.50. - N.3. - P.354-382.
Nicolarakis KE, Almeida OF, Yassouridis A., Herz A. Presynaptic auto-and allelo-receptor regulation of hypothalamic opioid peptide release / / Neurosci. - 1989. - V.31. - N.73. - P.269-273.
North RA, Williams JT How do opiates inhibit neurotransmitter release / / Trends. Neurosci. - 1983. - V.6. - N.8. - P.337-339.
Oehme P. Substance P: Regulatory functions / / Wiss. Beitz. M.-luther Univ. Hall-Wittenberg P. - 1988 .- 32 .- P. 179-190
Olson GA, Olson RD, Kastin AJ Endogenous opiates 1985 / / Peptides. - 1986. - V.7. - N.5. P.907-933.
Patterson TA, Schulteins G., Alvarado MC, Martinez JL-JR, Bennet EL, Rossenzweig MR, Hruby VY Influence of opioid peptides on learningand memory process in the chick / / Behav.-Neurosci.-1989.-Apr.-103, № 2 .- P.429-437
Przewlocki R. et.al. Gene expression and lokalization of opioid peptides in immune cells of inflamed tissue: functional role in antinoception / / Neurosci.-1992.-48, № 2 .- P.491-500
Rakudi H., Yu H., Kamitani A., Nakamura Y., Ohishi M., Kamide K., Nakata Y., Takami S., Higaki J., Ogihara T. Links between hypertension and myocardial infarction / / Am. Heart. J. - 1996, Jul. - V.132. - N.1. - P.213-221.
Rodrigues C., Brayton KA, Brownstein M., Dixon JE Rat preprocarboxypeptidase H: cloning, characterisation and sequence of the cDNA and regulation of the mRNA by corticotropin-releasing factor / / J. Biol.Chem. -1989 .- V.264.-P.5988-5995
Rossier J., Battenberg E., Piffman Q. et al. Hypothalamic enkephalin neurons may regulate the neurohypophysis / / Nature. - 1979. - V.277. - P.653-655.
Roth WW, Mackin RB, Spiess J., Goodman RH, Noe BD Primary structure and tissue distribution of angelerfish carboxypeptidase H / / Mol. Cell Endocrinol. - 1991. - V.78. - N.3. - P.171-178.
Rothman RB, Bycov V., Xue BG, Xu H., De-Costa BR, Jacobson AE, Rice KC, Kleinman JE, Brady LS Interaction of opioid peptides and other drugs with miltiple kappa receptors in rat and human brain / Evidence for species differences / / Peptides. - 1992, Sep.-Oct. - V.13. - N.5. - P.977-987.
Ryoichi K., Reiko S., Takshi K. et.al. Hydrolysis of neo-kyotophin (Thr-Ser-Lys-Tyr-Arg) and [met] enkephalin - Arg 6-Phe 7 by ACE from moncey brain / / Biochem. Pharmakol.-1986.-35, № 24 .- P.4499-4503
Schmieder RE, Schobel HP, Gatzka CE, Hauser W., Dominik P., Mann JF, Luft FC Effects of angiotensin converting enzyme inhibitor on renal heamodynamics during mental stress / / J. Hypertens. - 1996, Oct. - V.14. - N.10. - P.1201-1207.
Seredenin SB, Blednov Y u A., Badysktov BA Pharmacogenetic analyses of mechanisms of emotional stress: effects of benzodiazepines / / Ann. Inst. Super. Sanitc. - 1990. - V.26. - P.81.
Simantov R., Showman AM, Synder SV A morphine - like factor enkephalin in rat brain subcellular localization / / Brain Res. - 1976. - V.107. - P.650-657.
Simon EJ Opioid receptors and Endogenous opioid peptides / / Med. Res. Rev. - 1991. - V.11. - N.4. - P.357-374.
Skeggs LT, Jr.Kahn JR, Shumway NP The preparatia and function of hypertensin cïnverting enzyme / / J. Exp. Med. - 1956. - V.103. - P.295.
Skidgel RA Basic carboxypeptidases: regulators of peptide hormone activity / / Trends Pharmacol. Sci. - 1988. - V.9. - N.8. - P.299-304.
Skidgel RA, Jonson AR, Evda EG Hydrolisys of opioid hexapeptides by carboxypeptidase N. Presenc of carboxypeptidase in cell membranes / / Biochem. Pharmacol. - 1984. - V.33. - N.21. - P.3471-3478.
Snyder SH Brain peptides as neurotransmitters / / Science. - 1980. - V.209. - P.976-983.
Soffer RL, Ei-Dorry HA Angiotensin-converting enzyme: immunological, structural and developmental aspects / / Federation Proc.-1983.-P.2735-2739
Stanisz AM, Scicchitano R., Payan D., Bienestock J. In vitro studies of immunoregulation by substance P and somatostatin / Second Intern. Workshop on NIM: Scientific Programme and Abstracts. - Dubrobnik, 1986. - P.37.
Stein EA, Hiller JM, Simon ER Effect of stress on opioid receptor binding in the rat central nervous system / / Neurosci. - 1992, Dec. - V.51. - N.3. - P.683-690.
Steiner DF The biosynthesis of biologically active peptides: a perspective / Peptide Biosynthesia and processing / Frisker LD (eds.). - CRC Press. - Boca Ration. - Florida, 191. - P.1-16.
Strittmater SM, Lynch DR, Snyder SH (3 H) guanidinoethyl merkaptosuccinic acid binding to tissue homogenates selective labeling of enkephalin convertase / / J. Biol. Chem .- 1984 .- 259, № 19 .- P.11812-11817
Supattapone S., Frisker LD, Snyder SH Purification and characterization of membranebound enkephalin-forming carboxypeptidase "enkephalin convertase" / / J. Neurochem. - 1984. - V.42. - N.4. - P.1017-1023.
Taub DD, Eisenstein TK, Geller EB, Adler MW, Rogers TJ Immunomodulatory activity of mu - and Rappa-selective opioid agonists / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991, Jan., 15. - V.88. - N.2.
Terenius L. Opioid peptides, pain and stress / / Prog. Brain Res. - 1992 .- 92.-P. 375-383
Tezapsidis N., Parish DC Characterizatoin and partial purificatoin of a novel prohormone processing enzyme from bovine adrenal medulla / / FEBS Lett.-1989.-246, № 1.-P. 44-48
Turner AI Neuropeptide processing enzymes / / Trends. Neurosci .- 1984.-7, № 7 .- P.258-260
Van-Giersbergen PL, Cox-Van-Put J., De-Jong W. Central and peripheral opiate receptors appear to be activated during controlled haemorrhagic hypotension / / J. Hypertens. Suppl. - 1989, Dec. - V.7. - N.6. - P.26-27.
Vernicos-Danellis J., Heyback JP Psychophysiologic mechanismus regulating the hypothalamic-pituitary-adrenortical response to stress / Selyes guide to stress research / Eds. Selye H. - New York: Van Nostrand Reinhold Co., 1980. - P.206-251.
Viel E., Lefrant JY, Aya G., Eledjam JJ Opioids by the perimedullary route: mechanisms of opioid analgesia / / Cah. Anesthesiol. - 1991. - V.39. - N.1.
White JD, Gall CM Proenkephalin is prozessed in a projectionspecific monner in the rat central nervous system / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Biol. Sci.-1986 .- 83, № 18 .- P. 7099-7103
Yukimura T., Under T., Rascher W. Central peptidergic stimulation in blood pressure control: role of enkephalins in rats / / Clin. Sci.-1981.-61, № 7.-P.3475-3505
ДОДАТОК
Таблиця 1. Активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ у інтактних тварин (нмоль продукту, що утворився за 1 хв інкубації на 1 мг білка, М ± m, n = 5-6, тут і в таблицях 2-7: Г - гіпофіз, СМ - середній мозок, ГТ - гіпоталамус, ГК - гіпокамп, СТ - стріатум, БП - великі півкулі, НП - надниркові залози, РЄ - насінники)
Відділи мозку, органи | ВПП | ФМСФ - інгібіруемая КП | АПФ |
M ± m | M ± m | M ± m | |
Г | 1,54 ± 0,01 | 1,36 ± 0,08 | 0,53 ± 0,06 |
СМ | 0,22 ± 0,02 | 0,31 ± 0,03 | 0,05 ± 0,02 |
ГТ | 0,24 ± 0,02 | 0,33 ± 0,03 | 0,06 ± 0,01 |
ДК | 0,28 ± 0,03 | 0,33 ± 0,03 | 0,01 ± 0,001 |
СТ | 0,18 ± 0,01 | 0,34 ± 0,03 | 0,19 ± 0,03 |
БП | 0,18 ± 0,01 | 0,35 ± 0,02 | 0,03 ± 0,01 |
НП | 0,1 ± 0,02 | 1,84 ± 0,1 | 0,01 ± 0,01 |
РЄ | 0,06 ± 0,01 | 0,3 ± 0,04 | 0,53 ± 0,03 |
Таблиця 2. Активність ВПП, ФМСФ-інгібіруемой КП та АПФ в мозку і тканинах щурів при дії гострого ЕБС (нМ продукту, що утворився за 1 хв інкубації на 1 мг білка, М ± m, n = 5, *- p <0,05, ** - p <0,01, ***- p <0,001 до норми, тут і в таблицях 3-7: I - відділ мозку, орган, II - час після початку впливу)
I | II | ВПП | ФМСФ-інг. кп | АПФ | |||
норма | ЕБС | норма | ЕБС | норма | ЕБС | ||
Г | 0,5 ч. 4 ч. 24 ч. 72 ч. 240 ч. | 1,54 ± 0,08 | 2,2 ± 0,23 ** 1,87 ± 0,1 * 2,02 ± 0,08 ** 2,37 ± 0,12 *** 1,39 ± 0,05 | 1,36 ± 0,07 | 1,18 ± 0,14 1,26 ± 0,06 1,46 ± 0,06 1,67 ± 0,05 ** 1,45 ± 0,07 | 0,53 ± 0,06 | 0,48 ± 0,03 0,38 ± 0,06 ** 0,53 ± 0,05 0,58 ± 0,04 0,46 ± 0,04 |
СМ | 0,5 ч. 4 ч. 24 ч. 72 ч. 240 ч. | 0,22 ± 0,01 | 0,23 ± 0,01 0,18 ± 0,01 * 0,22 ± 0,01 0,22 ± 0,01 0,21 ± 0,01 | 0,31 ± 0,02 | 0,27 ± 0,02 0,29 ± 0,01 0,3 ± 0,02 0,37 ± 0,01 * 0,34 ± 0,02 | 0,05 ± 0,02 | 0,05 ± 0,01 0,02 ± 0,01 0,02 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,02 ± 0,01 |
ГТ | 0,5 ч. 4 ч. 24 ч. 72 ч. 240 ч. | 0,24 ± 0,02 | 0,28 ± 0,02 0,20 ± 0,01 0,24 ± 0,01 0,27 ± 0,03 0,23 ± 0,02 | 0,33 ± 0,01 | 0,31 ± 0,02 0,31 ± 0,01 0,32 ± 0,02 0,4 ± 0,01 ** 0,34 ± 0,01 | 0,06 ± 0,01 | 0,01 ± 0,01 0,03 ± 0,0,1 |
0,02 ± 0,01
0,04 ± 0,01
0,04 ± 0,01
ДК
0,5 ч.
4 ч.
24 ч.
72 ч.
240 ч.
0,28 ± 0,03
0,26 ± 0,01
0,19 ± 0,01 **
0,27 ± 0,01
0,29 ± 0,02
0,25 ± 0,02
0,33 ± 0,02
0,29 ± 0,01
0,32 ± 0,01
0,35 ± 0,03
0,42 ± 0,02 **
0,34 ± 0,01
0,01 ± 0,01
0,04 ± 0,02
0,02 ± 0,01
0,01 ± 0,01
0,04 ± 0,01
0,03 ± 0,01
СТ
0,5 ч.
4 ч.
24 ч.
72 ч.
240 ч.
0,18 ± 0,01
0,18 ± 0,02
0,2 ± 0,01
0,26 ± 0,01 **
0,24 ± 0,03 *
0,18 ± 0,01
0,34 ± 0,03
0,31 ± 0,03
0,33 ± 0,02
0,32 ± 0,01
0,4 ± 0,02
0,34 ± 0,01
0,19 ± 0,02
0,13 ± 0,02
0,15 ± 0,01 **
0,15 ± 0,01
0,18 ± 0,02
0,19 ± 0,01
БП
0,5 ч.
4 ч.
24 ч.
72 ч.
240 ч.
0,18 ± 0,02
0,21 ± 0,01
0,18 ± 0,02
0,19 ± 0,01
0,24 ± 0,01 *
0,198 ± 0,01
0,35 ± 0,02
0,32 ± 0,01
0,35 ± 0,01
0,34 ± 0,01
0,55 ± 0,01 ***
0,37 ± 0,03
0,03 ± 0,01
0,02 ± 0,01
0,01 ± 0,00
0,01 ± 0,00
0,02 ± 0,01
0,01 ± 0,00
НП
0,5 год
4ч
24г
72ч
240ч
0,1 ± 0,02
0,08 ± 0,01
0,06 ±, 002
0,06 ± 0,02
0,09 ± 0,01
0,1±,02
1,84±0,05
1,72±0,09
1,62±0,05*
1,46±0,09**
2,88±0,04**
1,75±0,02
0,01±0,01
0,02±0,01
0,03±0,01
0,02±0,01
0,01±0,01
0,02±0,02
СЕ
0,5ч
4ч
24ч
72ч
240ч
0,06±0,01
0,07±0,01
0,07±0,02
0,07±0,02
0,05±0,01
0,06±0,01
0,3±0,02
0,45±0,01*
0,3±0,01
0,31±0,02
0,27±0,01
0,25±0,02
0,53±0,03
0,59±0,01*
0,45±0,03*
0,47±0,01***
0,41±0,01
0,51±0,02