Федеральне агентство з освіти РФ
Кафедра біохімії
Сметанін В.А.
Зміст
Стор.
Список скорочень
Введення
1. Огляд літератури
1.1. Фізико-хімічні властивості ферментів
1.1.1. Карбоксипептидаза Н
1.1.2. Карбоксипептидаза М
1.1.3. Фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемая карбоксипептидаза
1.2. Адреноблокатори
1.3. Адренергічна і пептідергіческая системи
2. Матеріали та методи дослідження
2.1. Матеріал дослідження
2.2. Методи визначення карбоксипептидази-В-подібної активності
2.2.1. Визначення активності карбоксипептидази Н
2.3. Методика визначення білка
2.4. Статистична обробка результатів дослідження
3. Результати та обговорення
Висновки
Бібліографічний список
СПИСОК СКОРОЧЕНЬ
АКТГ - адренокортикотропний гормон
ГПЯК - гуанідінопропілянтарная кислота
ГЕМЯК - гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота
ДОФА - діоксіфенілаланін
КОМТ - катехолортометилтрансферазой
КПА - карбоксипептидаза А
КПВ - карбоксипептидаза У
ВПП - карбоксипептидаза Н
КПM - карбоксипептидаза M
КПN - карбоксипептидаза N
ЛКПВ - лізосомальних карбоксипептидаза У
МАО - моноамінооксидазу
ПХМБ - п-хлормеркурійбензоат
ПХМФС - п-хлормеркурийфенилсульфонат
ФМСФ - фенілметілсульфонілфторід
ФМСФ-КП - фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемая
карбоксипептидаза
цАМФ - циклічний аденозинмонофосфату
ЦНС - центральна нервова система
ЕДТА - етилендіамінтетраацетат натрію
ВСТУП
Сучасна медицина володіє значним поруч "екзогенних" синтетичних адренопозітівних і адреноблокирующим препаратів, дія яких пов'язана з впливом на адренергічні процеси. За хімічною структурою ці кошти споріднені адреналіну і норадреналіну, і їх основні фармакологічні властивості пов'язані в першу чергу з взаємодією зі специфічними адренергічними рецепторами ефекторних клітин. Зокрема α-адреноблокатори, до числа яких ставитися пирроксан.
α-адреноблокатори надають прессорное дія, що пов'язана з дією речовини на рецептори, але наявність побічних ефектів, таких як, артеріальна гіпотонія, брадикардія, важко пояснити тільки впливом цього препарату на рецептори. Можливо, частина ефектів опосередковується пептідергіческой системою, тому що зміна адренергічної системи викликає зміна рівня регулярних пептидів: вазопресину, ангеотензіна і саматотропіна.
В освіті активних форм регуляторних пептидів беруть участь карбоксипептидази, зокрема карбоксипептидаза Н і ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза.
Метою цієї роботи є дослідження механізмів взаємодії адренергічної і пептідергіческой системами в нервовій тканині щурів.
У відповідності з поставленою метою вирішували такі завдання:
а) дослідити активність карбоксипептидази Н і ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази в нервовій тканині щурів;
б) вивчити вплив піроксену на активність основних карбоксипептидази.
1. Огляд літератури
1.1. Фізико-хімічні властивості ферментів
У нервовій тканині, як і в більшості органів і тканин тварин, є складна система протеолізу, що включає різні за внутрішньоклітинної локалізації і специфічності дії протеолітичні ферменти. В даний час внутрішньоклітинні ферменти поділяють на дві групи відповідно до локалізації в клітині та їх функціональною роллю [2].
Однією з функцій пептідгідролаз є участь у внутрішньоклітинному процессингу білків і пептидів - у перетворенні неактивних попередників у відповідні активні продукти. Пептідгідролази (пептидази) - ферменти, що каталізують гідроліз пептидних (амідних) зв'язків. Їх поділяють на екзопептидаза: амінопептидази, карбоксипептидази, діпептідаз, відщеплюють дипептид з N-або С-кінця поліпептидного ланцюга; і ендопептидаз [2].
В даний час в тканинах людини і тварин виявлено більше десяти КП нелізосомальной локалізації, щонайменше чотири з них присутні в мозку.
1.1.1. Карбоксипептидаза Н (КФ 3.4.17.10)
КПH (КПE, енкефалінконвертаза) вперше виділена і охарактеризована Fricker і Snyder з хромафінних гранул надниркових залоз бика, як фермент, який утворює енкефаліни з їх попередників [20]. Пізніше фермент був виділений і очищений з мозку [9], гіпофіза, острівців Лангерганса підшлункової залози. Фермент, виділений з різних тканин різних видів тварин, має дуже близькі фізико-хімічні та каталітичні властивості.
КПH є одноланцюговим глікопротеїном і існує як у розчинній, так і в зв'язаній з мембранами формах [9]. Існують дві форми мембранозв'язаних КПH, що відрізняються за міцністю зв'язування з мембранами. Одна з цих форм екстрагується з мембран при pH 5,6 1M розчином NaCl, друга - тільки за спільної дії 1M NaCl і 1% Тритона X-100.
Фермент синтезується у вигляді неактивного зимогена з Mr 75000, який перетворюється на активну форму під дією ферментів тріпсіноподобних в ході дозрівання секреторних везикул. Спочатку утворюється неактивна форма з Mr 65000, яка перетворюється в активні форми з Mr 52000 - 53000 і 55000 - 57000 [19]. Відмінності в Mr цих форм не пов'язані з відмінностями в ступені глікозилювання. Форма з Mr 55000 - 57000 відрізняється від форми з Mr 52000 - 53000 присутністю N-кінцевого сигнального пептиду. Обидві форми існують і в розчинній, і в зв'язаному з мембранами вигляді [19]. Активність розчинної форми ферменту в розрахунку на молекулу ферменту вище, ніж мембранозв'язаних. Співвідношення між розчинної і мембранозв'язаних формами змінюється в міру дозрівання секреторних везикул. За зв'язування ферменту з мембранами відповідає C-кінцева амфіфільних послідовність, яка присутня тільки у мембранозв'язаних форми. Вона складається з 21 залишку чергуються гідрофобних і гідрофільних амінокислот. У амінокислотної послідовності КПH виявлений також Ca 2 +-зв'язуючий ділянку, але іони Ca 2 + впливають не на активність, а на стабільність, агрегацію та здатність до зв'язування з мембранами.
ВПП проявляє максимальну активність при рН 5,5-6,0, що відповідає рН всередині секреторних везикул і є тіолзавісімим металоферментів, в активному центрі якого знаходиться іон Zn 2 +. Даний фермент сильно (приблизно в 5-10 разів) активується іонами Со 2 +, у меншій мірі (у 2-3 рази) - іонами Ni 2 +, інгібується іонами Сd 2 + і Cu 2 +, хелатирующими агентами: ЕДТА, о- фенантроліном, при застосуванні яких активність ферменту відновлюється додаванням іонів Zn 2 +. Фермент також інгібується реагентами на сульфгідрильні групи: ПХМФС, N-етілмалеімідом і органічними кислотами. Найбільш ефективними інгібіторами є ГЕМЯК і ГПЯК з К i 8,8 і 7,5 нМ відповідно.
ФМСФ, 2-меркаптоетанол, а також іони Мg 2 + та Mn 2 + не впливають на активність ВПП [20].
КПH відщеплює залишки аргініну і лізину з C-кінця синтетичних і природних пептидів. Швидкість відщеплення залишків аргініну в кілька разів більше, ніж залишків лізину. Залишки гістидину відщеплюються з дуже маленькою швидкістю, порівняно із залишками лізину. Залишки ароматичних амінокислот не відщеплюються. Швидкість розщеплення субстратів залежить від попереднього амінокислотного залишку. Швидкість розщеплення данс-фен-ала-арг на порядок вище, ніж швидкість розщеплення данс-фен-гли-арг, данс-фен-лей-арг і данс-фен-мулі-арг.
Локалізація ферменту в цілому відповідає розподілу біологічно активних пептидів і їх попередників [14]. Найбільш висока активність КПH виявлена в аденогипофизе, хромафінних гранулах надниркових залоз [20] і острівцях Лангерганса підшлункової залози. Більш низька (приблизно на порядок) активність ферменту виявляється в задній частині гіпофізу, гіпоталамусі, стріатумі, гіпокампі, середньому мозку, корі великих півкуль [17]. Найнижча активність КПH виявлена в стовбурної частини головного мозку, спинному мозку, легенях, серці, шлунково-кишковому тракті, печінці та нирках. Встановлено, що КПH асоційована зі структурними елементами ЕПР, комплексу Гольджі і секреторними везикулами, де протікає процесинг попередників різних біологічно активних пептидів. Фермент виявлений у секреторних везикулах, що містять енкефаліни, атріальний натрійуретичний фактор, глюкагон, інсулін, АКТГ, пролактин, речовина P, вазопресин і окситоцин і інші регуляторні пептиди. Різні інгібітори та активатори секреції координовано регулюють виділення КПH та енкефалінів, АКТГ, пролактину, вазопресину та інсуліну [21].
Фізико-хімічні властивості, субстратна специфічність, тканинна, клітинному і субклітинному локалізація, особливості зміни активності ферменту при різних фармакологічних впливах на культури клітин, порушення синтезу нейропептидів у мишей з дефектною ВПП свідчать про те, що досліджуваний фермент залучається до процесинг багатьох біологічно активних пептидів, таких як енкефаліни, АКТГ, b-ендорфін, вазопресин, окситоцин, нейротензин, меланоцітстімулірующій гормон, речовина Р та ін
Показано, що ВПП залучається до визначення агресивності [15], схильності до споживання етанолу, у розвиток фізичної залежності від етанолу [15], у відповідь на різні стрессірующіе впливу [15], введення стероїдних гормонів in vivo, є дані про наявність статевих відмінностей у активності ферменту.
1.1.2. Карбоксипептидаза М (КФ 3.4.17.2)
Карбоксипептидаза M (КПМ) представляє собою мембранозв'язаних одноланцюговий глікопротеїн з молекулярною масою 62 кДа, заякорені в плазматичній мембрані за допомогою залишку глікозил-фосфатидилінозитолу. Обробка трипсином і фосфоліпазою C призводить до видалення гідрофобного хвоста і вивільнення ферменту з клітинної мембрани [18].
Вивільнення КПM з плазматичної мембрани відбувається і in vivo, оскільки фермент виявлений в різних біологічних рідинах, зокрема в сечі та амніотичній рідині.
При хімічному деглікозілірованіі утворюється поліпептид з Mr 48000, який складається з 439 амінокислотних залишків. Амінокислотна послідовність ферменту на 41% ідентична КПN і КПH, на 15% - КПB і кПa. Багато залишки активного центру ідентичні таким кПa і КПB, але перехресної реакції з антисироватки до інших КП фермент не дає.
Фермент відщеплює залишки тільки основних амінокислот, при відсутності іонів Co 2 + краще відщеплює аргінін, а в присутності Co 2 + - лізин. Естеразная активність ферменту значно вище, ніж пептідазная. КПM проявляє максимальну активність при pH 7,0, іони Co 2 + підвищують активність ферменту в 1,5-2 рази, причому ступінь активації зростає при зниженні pH. Активність КПM пригнічується іонами Cd 2 +, о-фенантроліном, МГТК і ГЕМЯК.
ПХМФС, HgCl 2, дітіотреїтолу, ФМСФ, апротинін, каптоприл і фосфорамідон не впливають на активність ферменту.
Фермент локалізована переважно в плаценті, нирках, ендотеліальних клітинах кровоносних судин, виявлений у периферичній нервовій системі і головному мозку.
КПМ in vitro відщеплює С-кінцеві залишки основних амінокислот від динорфінів А 1-13, мет-енкефалінів-арг 6, мет-енкефалінів-ліз 6, лей-енкефалінів-арг 6, брадикініну [1], фактору росту епідермісу, утворює інтактні кініни і анафілотоксинів С3а, С4а, С5а. Припускають, що фермент може інактивувати або модулювати пептидні гормони перед або після взаємодії останніх з рецепторами.
Варто відзначити, що якщо фізико-хімічні властивості ВПП, ФМСФ-КП і КПМ вивчені досить добре, то біологічна роль даних ферментів, у тому числі їх участь у різних фізіологічних і патологічних процесах досліджені значно гірше. Тому представляється досить цікавим вивчення їх активності при різних процесах в організмі, у тому числі при гострої алкогольної інтоксикації.
1.1.3. Фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемая карбоксипептидаза
У 1995р. Вернигора і співавт. виявили в розчинній фракції сірої речовини головного мозку кішки основну КП, активність якої повністю пригнічується ФМСФ [13].
Фермент, за результатами гель-фільтрації, має Мr 100000; проявляє максимальну активність при рН 6,0-6,5, але зберігає 40-45% активності при рН 5,5. Фермент повністю ингибировал ФМСФ і ПХМБ, приблизно на 40% ингибировал іодацетамідом. ЕДТА, 2-меркаптоетанол, N-етілмалеімід, іони Co 2 + та ГЕМЯК не впливали на його активність. Фермент майже в 2 рази активувався 50мм NaCl, дещо слабше - NaBr, KCl і KJ. Підвищення концентрації NaCl не призводило до збільшення ступеня активації ферменту [13].
Згідно з даними тонкошарової хроматографії частково очищений фермент відщеплює аргінін від лей 5-енкефалінів-арг 6 і данс-фен-лей-арг з утворенням лей 5-енкефалінів і данс-фен-лей відповідно. Більш глибокого гідролізу субстратів не спостерігалося. Фермент також не розщеплював субстрат кПa - карбобензоксі-гли-лей [13]. Таким чином, за субстратної специфічності ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза схожа з ЛКПB. Разом з тим фізико-хімічні властивості ферменту (інгібування ФМСФ, нечутливість до ЕДТА, ГЕМЯК і іонів Co 2 +) відрізняють його від ЛКПB [1]. Інгібування ферменту ФМСФ дозволяє припустити, що він є серинових карбоксипептидази. У тканинах ссавців виявлені дві серинові карбоксипептидази - ЛКПА (КФ 3.4.16.1, катепсин A, лізосомальних карбоксипептидаза L) і карбоксипептидаза C (КФ 3.4.12.4, ангіотензіназа C, пролілкарбоксіпептідаза). Але ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза відрізняться від карбоксипептидази C за молекулярною масою і субстратної специфічності.
У той же час, ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза має схожі з ЛКПA молекулярну масу, оптимум pH, інгібіторний профіль, але відрізняється від останньої за субстратної специфічності і тканинної локалізації.
Активність ФМСФ-інгібіруемой КП виявлена у всіх відділах мозку і в більшості тканин, за винятком нирок, в яких присутні лише сліди її активності. Найбільша активність ферменту наголошується в наднирниках, приблизно на 40% нижче - у гіпофізі, в печінці і селезінці його активність становить приблизно 30-35% від активності в гіпофізі. У сім'яниках активність ФМСФ-інгібіруемой КП приблизно в 2,5 рази нижче, ніж в наднирниках. У відділах мозку активність ферменту приблизно в 2-3 рази нижче, ніж у гіпофізі. Найбільш висока активність ФМСФ-інгібіруемой КП в мозку виявляється у нюхових цибулинах, найбільш низька - у четверохолміе і гіпокампі [10].
Звертає на себе увагу той факт, що спорідненість виявленого ферменту до данс-фен-лей-арг (До m гідролізу - 48 мкМ), вище, ніж спорідненість ВПП (До m гідролізу - 96 мкМ). Це дозволяє припустити, що енкефалінів-лей 5-арг 6 може бути кращим субстратом для ФМСФ-інгібіруемой КП, ніж для ВПП. ФМСФ-КП виявляє істотну активність при значеннях рН, відповідних такому всередині секреторних везикул. Таким чином, можливо, що виявлений фермент залучається до процесинг нейропептидів, зокрема енкефалінів-лей 5-арг 6, тим більше, що в літературі є дані про те, що регіональний розподіл ВПП та енкефалінів не завжди відповідає один одному [16].
1.2. Адреноблокатори
Лікарські засоби, що впливають на функції різних адренорецепторів, мають в даний час широке застосування в різних областях медицини.
Адренергічні рецептори, для яких природними, тобто ендогенними, лігандами є норадреналін і адреналін, спочатку позначали в загальному вигляді як адренорецептори. Проте вивчення особливостей дії цих ендогенних сполук та їх синтетичних аналогів і похідних призвело до висновку про неоднорідність адренорецепторів, наявності їх підгруп, різних по локалізації та функціональної значущості. Ідентифікація цих підгруп має важливе фармакологічне і клінічне значення. Вплив на різні адренорецептори визначає не тільки особливості фармакологічної дії різних адренергічних і антиадренергическим речовин, але також показання та протипоказання до їх практичного використання. Так, наприклад, з β-адреноблокаторів анаприлін (пропранолол) характеризується антиішемічний, антиаритмічну і антигіпертензивну дію може супроводжуватися побічними ефектами (бронхоконстрикторними; підвищенням опору периферичних судин).
Пензенський державний педагогічний університет
ім. В.Г. Бєлінського
Факультет Природничо-географічнийКафедра біохімії
КУРСОВА РОБОТА НА ТЕМУ:
«ВПЛИВ пирроксан НА АКТИВНІСТЬ карбоксипептидази Н І ФМФС-ІНГІБІРУЕМОЙ карбоксипептидази В НЕРВОВОЇ ТКАНИНИ ЩУРІВ»
Виконавець: студентка групи
БХ-41 спеціальності «Біохімія» Даркін Ю.Ф.
Керівник: доцент к.б.н.Сметанін В.А.
Пенза - 2007
Зміст
Стор.
Список скорочень
Введення
1. Огляд літератури
1.1. Фізико-хімічні властивості ферментів
1.1.1. Карбоксипептидаза Н
1.1.2. Карбоксипептидаза М
1.1.3. Фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемая карбоксипептидаза
1.2. Адреноблокатори
1.3. Адренергічна і пептідергіческая системи
2. Матеріали та методи дослідження
2.1. Матеріал дослідження
2.2. Методи визначення карбоксипептидази-В-подібної активності
2.2.1. Визначення активності карбоксипептидази Н
2.3. Методика визначення білка
2.4. Статистична обробка результатів дослідження
3. Результати та обговорення
Висновки
Бібліографічний список
СПИСОК СКОРОЧЕНЬ
АКТГ - адренокортикотропний гормон
ГПЯК - гуанідінопропілянтарная кислота
ГЕМЯК - гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота
ДОФА - діоксіфенілаланін
КОМТ - катехолортометилтрансферазой
КПА - карбоксипептидаза А
КПВ - карбоксипептидаза У
ВПП - карбоксипептидаза Н
КПM - карбоксипептидаза M
КПN - карбоксипептидаза N
ЛКПВ - лізосомальних карбоксипептидаза У
МАО - моноамінооксидазу
ПХМБ - п-хлормеркурійбензоат
ПХМФС - п-хлормеркурийфенилсульфонат
ФМСФ - фенілметілсульфонілфторід
ФМСФ-КП - фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемая
карбоксипептидаза
цАМФ - циклічний аденозинмонофосфату
ЦНС - центральна нервова система
ЕДТА - етилендіамінтетраацетат натрію
ВСТУП
Сучасна медицина володіє значним поруч "екзогенних" синтетичних адренопозітівних і адреноблокирующим препаратів, дія яких пов'язана з впливом на адренергічні процеси. За хімічною структурою ці кошти споріднені адреналіну і норадреналіну, і їх основні фармакологічні властивості пов'язані в першу чергу з взаємодією зі специфічними адренергічними рецепторами ефекторних клітин. Зокрема α-адреноблокатори, до числа яких ставитися пирроксан.
α-адреноблокатори надають прессорное дія, що пов'язана з дією речовини на рецептори, але наявність побічних ефектів, таких як, артеріальна гіпотонія, брадикардія, важко пояснити тільки впливом цього препарату на рецептори. Можливо, частина ефектів опосередковується пептідергіческой системою, тому що зміна адренергічної системи викликає зміна рівня регулярних пептидів: вазопресину, ангеотензіна і саматотропіна.
В освіті активних форм регуляторних пептидів беруть участь карбоксипептидази, зокрема карбоксипептидаза Н і ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза.
Метою цієї роботи є дослідження механізмів взаємодії адренергічної і пептідергіческой системами в нервовій тканині щурів.
У відповідності з поставленою метою вирішували такі завдання:
а) дослідити активність карбоксипептидази Н і ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази в нервовій тканині щурів;
б) вивчити вплив піроксену на активність основних карбоксипептидази.
1. Огляд літератури
1.1. Фізико-хімічні властивості ферментів
У нервовій тканині, як і в більшості органів і тканин тварин, є складна система протеолізу, що включає різні за внутрішньоклітинної локалізації і специфічності дії протеолітичні ферменти. В даний час внутрішньоклітинні ферменти поділяють на дві групи відповідно до локалізації в клітині та їх функціональною роллю [2].
Однією з функцій пептідгідролаз є участь у внутрішньоклітинному процессингу білків і пептидів - у перетворенні неактивних попередників у відповідні активні продукти. Пептідгідролази (пептидази) - ферменти, що каталізують гідроліз пептидних (амідних) зв'язків. Їх поділяють на екзопептидаза: амінопептидази, карбоксипептидази, діпептідаз, відщеплюють дипептид з N-або С-кінця поліпептидного ланцюга; і ендопептидаз [2].
В даний час в тканинах людини і тварин виявлено більше десяти КП нелізосомальной локалізації, щонайменше чотири з них присутні в мозку.
1.1.1. Карбоксипептидаза Н (КФ 3.4.17.10)
КПH (КПE, енкефалінконвертаза) вперше виділена і охарактеризована Fricker і Snyder з хромафінних гранул надниркових залоз бика, як фермент, який утворює енкефаліни з їх попередників [20]. Пізніше фермент був виділений і очищений з мозку [9], гіпофіза, острівців Лангерганса підшлункової залози. Фермент, виділений з різних тканин різних видів тварин, має дуже близькі фізико-хімічні та каталітичні властивості.
КПH є одноланцюговим глікопротеїном і існує як у розчинній, так і в зв'язаній з мембранами формах [9]. Існують дві форми мембранозв'язаних КПH, що відрізняються за міцністю зв'язування з мембранами. Одна з цих форм екстрагується з мембран при pH 5,6 1M розчином NaCl, друга - тільки за спільної дії 1M NaCl і 1% Тритона X-100.
Фермент синтезується у вигляді неактивного зимогена з Mr 75000, який перетворюється на активну форму під дією ферментів тріпсіноподобних в ході дозрівання секреторних везикул. Спочатку утворюється неактивна форма з Mr 65000, яка перетворюється в активні форми з Mr 52000 - 53000 і 55000 - 57000 [19]. Відмінності в Mr цих форм не пов'язані з відмінностями в ступені глікозилювання. Форма з Mr 55000 - 57000 відрізняється від форми з Mr 52000 - 53000 присутністю N-кінцевого сигнального пептиду. Обидві форми існують і в розчинній, і в зв'язаному з мембранами вигляді [19]. Активність розчинної форми ферменту в розрахунку на молекулу ферменту вище, ніж мембранозв'язаних. Співвідношення між розчинної і мембранозв'язаних формами змінюється в міру дозрівання секреторних везикул. За зв'язування ферменту з мембранами відповідає C-кінцева амфіфільних послідовність, яка присутня тільки у мембранозв'язаних форми. Вона складається з 21 залишку чергуються гідрофобних і гідрофільних амінокислот. У амінокислотної послідовності КПH виявлений також Ca 2 +-зв'язуючий ділянку, але іони Ca 2 + впливають не на активність, а на стабільність, агрегацію та здатність до зв'язування з мембранами.
ВПП проявляє максимальну активність при рН 5,5-6,0, що відповідає рН всередині секреторних везикул і є тіолзавісімим металоферментів, в активному центрі якого знаходиться іон Zn 2 +. Даний фермент сильно (приблизно в 5-10 разів) активується іонами Со 2 +, у меншій мірі (у 2-3 рази) - іонами Ni 2 +, інгібується іонами Сd 2 + і Cu 2 +, хелатирующими агентами: ЕДТА, о- фенантроліном, при застосуванні яких активність ферменту відновлюється додаванням іонів Zn 2 +. Фермент також інгібується реагентами на сульфгідрильні групи: ПХМФС, N-етілмалеімідом і органічними кислотами. Найбільш ефективними інгібіторами є ГЕМЯК і ГПЯК з К i 8,8 і 7,5 нМ відповідно.
ФМСФ, 2-меркаптоетанол, а також іони Мg 2 + та Mn 2 + не впливають на активність ВПП [20].
КПH відщеплює залишки аргініну і лізину з C-кінця синтетичних і природних пептидів. Швидкість відщеплення залишків аргініну в кілька разів більше, ніж залишків лізину. Залишки гістидину відщеплюються з дуже маленькою швидкістю, порівняно із залишками лізину. Залишки ароматичних амінокислот не відщеплюються. Швидкість розщеплення субстратів залежить від попереднього амінокислотного залишку. Швидкість розщеплення данс-фен-ала-арг на порядок вище, ніж швидкість розщеплення данс-фен-гли-арг, данс-фен-лей-арг і данс-фен-мулі-арг.
Локалізація ферменту в цілому відповідає розподілу біологічно активних пептидів і їх попередників [14]. Найбільш висока активність КПH виявлена в аденогипофизе, хромафінних гранулах надниркових залоз [20] і острівцях Лангерганса підшлункової залози. Більш низька (приблизно на порядок) активність ферменту виявляється в задній частині гіпофізу, гіпоталамусі, стріатумі, гіпокампі, середньому мозку, корі великих півкуль [17]. Найнижча активність КПH виявлена в стовбурної частини головного мозку, спинному мозку, легенях, серці, шлунково-кишковому тракті, печінці та нирках. Встановлено, що КПH асоційована зі структурними елементами ЕПР, комплексу Гольджі і секреторними везикулами, де протікає процесинг попередників різних біологічно активних пептидів. Фермент виявлений у секреторних везикулах, що містять енкефаліни, атріальний натрійуретичний фактор, глюкагон, інсулін, АКТГ, пролактин, речовина P, вазопресин і окситоцин і інші регуляторні пептиди. Різні інгібітори та активатори секреції координовано регулюють виділення КПH та енкефалінів, АКТГ, пролактину, вазопресину та інсуліну [21].
Фізико-хімічні властивості, субстратна специфічність, тканинна, клітинному і субклітинному локалізація, особливості зміни активності ферменту при різних фармакологічних впливах на культури клітин, порушення синтезу нейропептидів у мишей з дефектною ВПП свідчать про те, що досліджуваний фермент залучається до процесинг багатьох біологічно активних пептидів, таких як енкефаліни, АКТГ, b-ендорфін, вазопресин, окситоцин, нейротензин, меланоцітстімулірующій гормон, речовина Р та ін
Показано, що ВПП залучається до визначення агресивності [15], схильності до споживання етанолу, у розвиток фізичної залежності від етанолу [15], у відповідь на різні стрессірующіе впливу [15], введення стероїдних гормонів in vivo, є дані про наявність статевих відмінностей у активності ферменту.
1.1.2. Карбоксипептидаза М (КФ 3.4.17.2)
Карбоксипептидаза M (КПМ) представляє собою мембранозв'язаних одноланцюговий глікопротеїн з молекулярною масою 62 кДа, заякорені в плазматичній мембрані за допомогою залишку глікозил-фосфатидилінозитолу. Обробка трипсином і фосфоліпазою C призводить до видалення гідрофобного хвоста і вивільнення ферменту з клітинної мембрани [18].
Вивільнення КПM з плазматичної мембрани відбувається і in vivo, оскільки фермент виявлений в різних біологічних рідинах, зокрема в сечі та амніотичній рідині.
При хімічному деглікозілірованіі утворюється поліпептид з Mr 48000, який складається з 439 амінокислотних залишків. Амінокислотна послідовність ферменту на 41% ідентична КПN і КПH, на 15% - КПB і кПa. Багато залишки активного центру ідентичні таким кПa і КПB, але перехресної реакції з антисироватки до інших КП фермент не дає.
Фермент відщеплює залишки тільки основних амінокислот, при відсутності іонів Co 2 + краще відщеплює аргінін, а в присутності Co 2 + - лізин. Естеразная активність ферменту значно вище, ніж пептідазная. КПM проявляє максимальну активність при pH 7,0, іони Co 2 + підвищують активність ферменту в 1,5-2 рази, причому ступінь активації зростає при зниженні pH. Активність КПM пригнічується іонами Cd 2 +, о-фенантроліном, МГТК і ГЕМЯК.
ПХМФС, HgCl 2, дітіотреїтолу, ФМСФ, апротинін, каптоприл і фосфорамідон не впливають на активність ферменту.
Фермент локалізована переважно в плаценті, нирках, ендотеліальних клітинах кровоносних судин, виявлений у периферичній нервовій системі і головному мозку.
КПМ in vitro відщеплює С-кінцеві залишки основних амінокислот від динорфінів А 1-13, мет-енкефалінів-арг 6, мет-енкефалінів-ліз 6, лей-енкефалінів-арг 6, брадикініну [1], фактору росту епідермісу, утворює інтактні кініни і анафілотоксинів С3а, С4а, С5а. Припускають, що фермент може інактивувати або модулювати пептидні гормони перед або після взаємодії останніх з рецепторами.
Варто відзначити, що якщо фізико-хімічні властивості ВПП, ФМСФ-КП і КПМ вивчені досить добре, то біологічна роль даних ферментів, у тому числі їх участь у різних фізіологічних і патологічних процесах досліджені значно гірше. Тому представляється досить цікавим вивчення їх активності при різних процесах в організмі, у тому числі при гострої алкогольної інтоксикації.
1.1.3. Фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемая карбоксипептидаза
У 1995р. Вернигора і співавт. виявили в розчинній фракції сірої речовини головного мозку кішки основну КП, активність якої повністю пригнічується ФМСФ [13].
Фермент, за результатами гель-фільтрації, має Мr 100000; проявляє максимальну активність при рН 6,0-6,5, але зберігає 40-45% активності при рН 5,5. Фермент повністю ингибировал ФМСФ і ПХМБ, приблизно на 40% ингибировал іодацетамідом. ЕДТА, 2-меркаптоетанол, N-етілмалеімід, іони Co 2 + та ГЕМЯК не впливали на його активність. Фермент майже в 2 рази активувався 50мм NaCl, дещо слабше - NaBr, KCl і KJ. Підвищення концентрації NaCl не призводило до збільшення ступеня активації ферменту [13].
Згідно з даними тонкошарової хроматографії частково очищений фермент відщеплює аргінін від лей 5-енкефалінів-арг 6 і данс-фен-лей-арг з утворенням лей 5-енкефалінів і данс-фен-лей відповідно. Більш глибокого гідролізу субстратів не спостерігалося. Фермент також не розщеплював субстрат кПa - карбобензоксі-гли-лей [13]. Таким чином, за субстратної специфічності ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза схожа з ЛКПB. Разом з тим фізико-хімічні властивості ферменту (інгібування ФМСФ, нечутливість до ЕДТА, ГЕМЯК і іонів Co 2 +) відрізняють його від ЛКПB [1]. Інгібування ферменту ФМСФ дозволяє припустити, що він є серинових карбоксипептидази. У тканинах ссавців виявлені дві серинові карбоксипептидази - ЛКПА (КФ 3.4.16.1, катепсин A, лізосомальних карбоксипептидаза L) і карбоксипептидаза C (КФ 3.4.12.4, ангіотензіназа C, пролілкарбоксіпептідаза). Але ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза відрізняться від карбоксипептидази C за молекулярною масою і субстратної специфічності.
У той же час, ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза має схожі з ЛКПA молекулярну масу, оптимум pH, інгібіторний профіль, але відрізняється від останньої за субстратної специфічності і тканинної локалізації.
Активність ФМСФ-інгібіруемой КП виявлена у всіх відділах мозку і в більшості тканин, за винятком нирок, в яких присутні лише сліди її активності. Найбільша активність ферменту наголошується в наднирниках, приблизно на 40% нижче - у гіпофізі, в печінці і селезінці його активність становить приблизно 30-35% від активності в гіпофізі. У сім'яниках активність ФМСФ-інгібіруемой КП приблизно в 2,5 рази нижче, ніж в наднирниках. У відділах мозку активність ферменту приблизно в 2-3 рази нижче, ніж у гіпофізі. Найбільш висока активність ФМСФ-інгібіруемой КП в мозку виявляється у нюхових цибулинах, найбільш низька - у четверохолміе і гіпокампі [10].
Звертає на себе увагу той факт, що спорідненість виявленого ферменту до данс-фен-лей-арг (До m гідролізу - 48 мкМ), вище, ніж спорідненість ВПП (До m гідролізу - 96 мкМ). Це дозволяє припустити, що енкефалінів-лей 5-арг 6 може бути кращим субстратом для ФМСФ-інгібіруемой КП, ніж для ВПП. ФМСФ-КП виявляє істотну активність при значеннях рН, відповідних такому всередині секреторних везикул. Таким чином, можливо, що виявлений фермент залучається до процесинг нейропептидів, зокрема енкефалінів-лей 5-арг 6, тим більше, що в літературі є дані про те, що регіональний розподіл ВПП та енкефалінів не завжди відповідає один одному [16].
1.2. Адреноблокатори
Лікарські засоби, що впливають на функції різних адренорецепторів, мають в даний час широке застосування в різних областях медицини.
Адренергічні рецептори, для яких природними, тобто ендогенними, лігандами є норадреналін і адреналін, спочатку позначали в загальному вигляді як адренорецептори. Проте вивчення особливостей дії цих ендогенних сполук та їх синтетичних аналогів і похідних призвело до висновку про неоднорідність адренорецепторів, наявності їх підгруп, різних по локалізації та функціональної значущості. Ідентифікація цих підгруп має важливе фармакологічне і клінічне значення. Вплив на різні адренорецептори визначає не тільки особливості фармакологічної дії різних адренергічних і антиадренергическим речовин, але також показання та протипоказання до їх практичного використання. Так, наприклад, з β-адреноблокаторів анаприлін (пропранолол) характеризується антиішемічний, антиаритмічну і антигіпертензивну дію може супроводжуватися побічними ефектами (бронхоконстрикторними; підвищенням опору периферичних судин).
Адренорецептори бувають чотирьох видів: альфа-адренорецептори (2 типу - α1 і α2) і бета-адренорецептори (β1 і β2). Сенс поділу: α - рецептори блокуються введенням алкалоїдів ріжків, а β-рецептори - не блокуються. Рецептори поділяються також на пресинаптические і постсинаптичні. Постсинаптические α-адренорецептори, як правило, викликають активацію (але для гладких м'язів кишечнику - навпаки, розслаблення). Через постсинаптичні β-рецептори виявляється в основному гальмівний вплив (але для серця - виняток - збудливий ефект). Пресинаптические α2-адренорецептори зменшують синтез і викид медіаторів, а пресинаптичні β2-адренорецептори збільшують і те й інше.
У результаті було створено велику кількість лікарських засобів, як адренопозітівних, тобто стимулюючих адренергічні процеси, так і адренонегатівних - антиадренергическим речовин.
1. Посилюють адренергіческіх передачу нервових імпульсів.
1.1. Адреноміметики прямої дії.
1.1.1. α, β-адреноміметики: адреналін (всі адренорецептори).
1.1.2. α-адреноміметики: норадреналін (α1, α2, частково - і β), мезатон (α1-рецептори), нафтизин (α2-рецептори на периферії), галазолін (α2-рецептори на периферії), клонідин (клофелін) (α2-рецептори ЦНС ), гуанфацин (α2-рецептори ЦНС).
1.1.3. β-адреноміметики: ізадрин (β1 і β2-рецептори), добутамін (β1-рецептори), дофамін (β1, частково - α), орципреналін, фенотерол (β2-рецептори), салбутамол.
1.2. Симпатоміметики непрямої дії: ефедрин, фенамін, тирамін, кокаїн, а також деякі трициклічні антидепресанти.
2. Ослабляють адренергіческіх ефекти.
2.1. Адренолітики прямої дії.
2.1.1. α, β-адренолитики: лабеталол.
2.1.2. α-адренолитики: фентоламін, пирроксан, дигідроерготамін, Дигідроерготоксину: α1 і α2, празозин (тільки α1).
2.1.3. β-блокатори: пропранолол, окспреналол, піндолол - β1 і β2, талинолол - кардіоселективні β1, метопролол і атенолол - β1.
2.2. Адренолітики непрямої дії (симпатолітики): резерпін, октадін, ормід, метил-ДОФА.
α1 ,2-адреноблокатори представляють собою дигидрированную алкалоїди ріжків. Сюди відносять фентоламін, пирроксан, дигідроерготамін, Дигідроерготоксину.
Дані лікарські засоби застосовують: а) для лікування розладів переферического кровообігу; б) лікування трофічних виразок, ран, відморожень, в) купірування гіпертонічних кризів (фентоламін внутрішньовенно); г) діагностика та лікування феохромоцитом (пухлина мозкового шару надниркових залоз, адреналін виходить у кров і стан подібно гіпертонічним кризам); д) лікування мігреней (сильний головний біль з блювотою, що з підвищенням амплітуди пульсації судин головного мозку; е) для лікування артеріальної гіпертензії використовуються речовини, які вибірково блокують постсинаптичні альфа1-адренорецептори (вони знімають вплив симпатичних нервів на судини і судини розширюються).
Механізм антидепресивної дії цих препаратів неясний. Спочатку було припущено, що воно обумовлено периферичним адренонегатівним ефектом, в результаті якого за механізмами зворотного зв'язку підвищується вміст норадреналіну в мозку [Бару А. М., 1970; Нуллер Ю. Л., 1970]. За останні роки з'явилися дані про вплив антидепресантів на чутливість норадренергічну рецепторів. Так, антидепресивну дію Миансерин частково пов'язують з гальмуванням а2-адренорецепторів.
1.3. Адренергічна і пептідергіческая системи
Адреналін був вперше виявлений в екстрактах надниркових залоз у 1895р. У 1901р, було здійснено синтез кристалічного адреналіну. Незабаром адреналін знайшов застосування в медицині для підвищення артеріального тиску при колапсі, для звуження кровоносних судин при місцевій анестезії, а потім і для купірування нападів бронхіальної астми. У 1905р. було виявлено важливе фізіологічне значення адреналіну. Виходячи з подібності дії адреналіну з ефектами, що спостерігаються при подразненні симпатичних нервових волокон, було висловлено припущення, що передача нервового збудження з симпатичних нервових закінчень на ефекторні клітини здійснюється за участю хімічного передавача (медіатора), яким є адреналін чи адреноліноподобние речовини. Цим було покладено початок вчення про хімічну передачі нервового збудження. В подальшому було розкрито процес біосинтезу адреналіну, починаючи від амінокислоти тирозину, через діоксіфенілаланін (L-ДОФА), дофамін, норадреналін до адреналіну. У 1946р. було встановленi, що основним медіатором адренергічної (симпатичної) передачі є не сам адреналін, а норадреналін. Утворюється в організмі ендогенний адреналін частково бере участь у процесах проведення нервового збудження, але головним чином грає роль гормонального речовини, що впливає на метаболічні процеси. Норадреналін здійснює медіаторну функцію в периферичних нервових закінченнях і в синапсах ЦНС. Біохімічні системи тканин, що взаємодіють з норадреналіном, називають адренореактівних (адренергічними) системами, або адренорецепторами ("Адреноцептори"). За сучасними уявленнями, норадреналін, що виділяється в процесі нервового імпульсу з пресинаптичних нервових закінчень, впливає на норадреналін-чутливу аденілатциклазу клітинної мембрани адренорецепторного системи, що призводить до посиленого утворення внутрішньоклітинного 3'-5'-циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ), що грає роль "вторинного" передавача (медіатора), до активації біосинтезу макроергічних з'єднань і далі до здійснення адренер-ня фізіологічних ефектів. Важливу роль у передачі імпульсів у ЦНС грає також дофамін, який є хімічним попередником норадреналіну, але виконує самостійну нейромедиаторную роль.
Освіта медіатора передбачається за наступною схемою: фенілаланін -> тирозин -> діоксіфенілаланін (ДОФА) -> дофамін (1-й медіатор, катехоламін) -> норадреналін (головна роль у передачі збудження в синапсах адренергіческіх). Норадреналін в синапсах і наднирниках може переходити в адреналін і навпаки).
Починаючи з третього реакції відбуваються в нервових клітин (перші реакції - в печінці). Медіатори спускаються по аксону у везикулах в пресімпатіческіе закінчення. У процес транспота везикул беруть участь іони магнію. Медіатори можуть руйнуватися МАО тип А (руйнує норадреналін, адренолин і серотонін). Норадреналін і адреналін для захисту від МАО з'єднуються зі спеціальними білками і АТФ (утворюється депо). Це - стабільні гранули (стабільна фракція). Лабільна фракція представлена непов'язаним медіатором у везикулах. Крім того є небагато вільного адреналіну в цитоплазмі, але він легко руйнується ферментами.
Після виходу медіатора в синаптичну щілину його надлишки можуть руйнуватися КОМТ. Може також здійснюватися зворотне захоплення частини медіатора пресинаптической мембраною.
Вплив адреналіну на артеріальний тиск передбачає кілька фаз: в першу фазу відбувається активація β1-адренорецепторів міокарда, що веде до збільшення серцевого викиду, по другою - затримка підняття тиску (вагодепрессорний рефлекторний ефект); третя фаза супроводжується впливом адреналіну на α (підйом) і β (спад) рецептори судин і четверта - слідова гіпотензія, швидкий нейрональний захоплення адреналіну, інактивація його надлишку ферментом КОМТ.
У регуляції функцій організму, поряд з класичними медіаторами, важлива роль належить регуляторним факторів пептидної природи. Регуляторні пептиди широко поширені в різних тканинах, у тому числі й у нервовій. Вони беруть участь у нейрохімічних механізмах, які підтримують основні гомеостатичні константи організму, формують і здійснюють цілеспрямоване поведінка, а також у процесах, контролюючих емоційну сферу, мотивацію, пам'ять [3]. Ймовірно, саме біологічно активним пептидів належить важлива роль в інтеграції функціональних систем організму, забезпеченні їх злагодженої роботи в умовах, що змінюються навколишнього середовища. Вони грають ключову роль в регуляції імунологічної захисту, у запуску адаптивних захисних реакцій при інфекції, пошкодженні тканин, стресі, а також у формуванні патологічних станів організму, в тому числі і алклоголізма. Багато нейропептиди залучаються до регуляцію вікових змін, в т. ч. і процесів статевого дозрівання [4].
Одним з етапів метаболізму пептидів є обмежений протеоліз, який грає головну роль як у процесах їх біосинтезу, так і в процесах інактивації. Пептідгідролази, здійснюють процесинг і деградацію пептидних регуляторів, забезпечують функціонування і певне співвідношення їх в організмі.
Більшість попередників нейропептидів включають послідовності пептидів, що володіють різною біологічною активністю. Те, які саме пептиди будуть утворюватися з попередника, залежить від набору протеїназ, що діють на молекулу попередника, і від співвідношення їх активностей.
При паракрінной дії пептиду активність позаклітинних пептидаз визначає час життя пептиду, відстань, на яку він може продіффундіровать, а, отже, і спектр мішеней, на які він діє. Таким чином, за допомогою протеїназ здійснюється регуляція фізіологічних ефектів пептидів на етапі біосинтезу і на етапі інактивації пептидів.
Особливість пептидної регуляції функціонального стану організму полягає в тому, що в кожній ділянці в кожний момент часу повинна підтримуватися необхідна концентрація певних пептидів. Це може бути досягнуто точної і узгодженої роботою протеїназ, що здійснюють синтез і деградацію пептидів, тобто підтриманням у головному мозку певної просторово-часової мозаїки протеолітичної активності. При зміні зовнішніх умов, або якому-небудь дії (наприклад, алкоголізації) ця мозаїка певним чином змінюється, щоб забезпечити роботу функціональних систем організму в нових умовах.
У кінцевій стадії утворення активних пептидів з неактивних попередників і в початкових стадіях їх деградації беруть участь основні карбоксипептидази - ферменти, відщеплюють залишки основних амінокислот (аргініну і лізину) з С-кінця пептидів. До них, зокрема, відносяться карбоксипептидаза Н, і нещодавно відкрита ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза. Їм належить важлива роль в регуляції рівнів активних нейропептидів в організмі [8], чим зумовлений інтерес до вивчення цих ферментів, у тому числі і при різних фізіологічних і патологічних процесах, що протікають в організмі [6].
Дії адреноблокирующим препаратів у першу чергу направлено на α, β-адренорецептори. При дії на α1-адренорецептори в клітину починають надходити іони кальцію, надаючи пряму збудливу дію. Крім того, активується фосфоліпаза С. Вона розщеплює мембранний фосфолипид на два активних речовини: інозит-3-фосфат, який стимулює викид кальцію з внутрішньоклітинних депо в цитоплазмі, і диацилглицерол, який активує протеїнкінази. Протеїнкінази активують фосфорілази, які фосфорилируют білки. При дії на β-рецептори через регуляторний білок Gs активується аденилатциклаза, а продукт її роботи - цАМФ активує протеїнкінази. При дії на α2-рецептои через білок Gi аденилатциклаза інгібується. І Gs і Gi для своєї роботи вимагають ГТФ.
Зокрема, α-адреноблокатори надаючи прессорное дію, характеризуються наявністю побоченних ефектів, таких як, артеріальна гіпотонія, брадикардія та інші, які важко пояснити тільки впливом цього препарату на рецептори. Можливо, частина ефектів опосередковується пептідергіческой системою, тому що зміна адренергічної системи викликає зміна рівня регуляторних пептидів: вазопресину, ангеотенізіна і саматотропіна.
2. Матеріали та методи дослідження
2.1. Матеріал дослідження
Дослідження проводили на самцях білих безпородних щурів масою 350-400г. У роботі використовували дві групи тварин: дослідну і контрольну. Тварини дослідної групи отримували протягом двох тижнів в якості єдиного джерела рідини водний розчин пирроксан, що містить 5% р-р сахарози, при цьому середня доза препарату становила 150мкг/кг/сут. Тварини контрольної групи - 5% р-р сахарози.
Щурів декапітованих, витягували гіпофіз, гіпоталамус, стріатум, великі півкулі, четверохолміе і надниркові залози.
Навіски тканин гомогенізували в 50мм натрій-ацетатному буфері при рН = 5,6.
2.2. Методи визначення карбоксипептидази-В-подібної активності
Карбоксипептидази-В-подібну активність визначали флюоріметріческім методом Фрікер і Снайдер з модифікаціями. В основу методу покладена різна розчинність в хлороформно і водної фазах субстрату і продукту реакції.
2.2.1. Визначення активності карбоксипептидази Н
50мкл 1% гомогенату змішували з 150мкл 50мм натрій-ацетатного буфера, рН 5.6, в разі контрольної проби; у разі дослідної проби 50мкл 1% гомогенату змішували з 140мкл 50мм натрій-ацетатного буфера, рН 5.6 з додаванням 10мкл ГЕМЯК.
Суміш інкубували 8 хв при 37 ° C. Реакцію починали додатком 50мкл субстрату (DNS-фен-лей-арг, приготованого на 50мм натрій-ацетатному буфері при рН 5.6). Проби перемішували і инкубировали 60 хв при 37 ° C.
Реакцію зупиняли додаванням 50мкл 1н розчину HCl.
Для екстракції продукту DNS-фен-лей до проб додавали 1,5 мл хлороформу, інтенсивно струшували протягом 60с і центрифугували 10хв при 1000об/мін для поділу фаз.
Вимірювання флуоресценції проводили на флюоріметре ФМЦ-2 (λ ex = 360нм, λ ex = 530нм) у кюветі товщиною 1см.
Активність ВПП визначали як різниця в флюоресценції проб і висловлювали DNS-фен-лей, що утворився за 1хв інкубації в розрахунку на 1 мг білка.
2.3. Методика визначення білка
Кількість білка в пробах визначали за методом Лоурі. Цей метод поєднує в собі біуретову реакцію (реакцію на пептидні зв'язки) та реакцію Фоліна (на тирозин і триптофан). Метод Лоурі є досить чутливим (10-100мкг білка в пробі) і найбільш точним з усіх існуючих методів кількісного визначення білка.
Калібрувальну криву будували за розчином бичачого сироваткового альбуміну (БСА). Для цього з вихідного розчину БСА (100мкг/мл) готували розведення з концентрацією БСА 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90мкг/мл і визначали в них концентрацію білка за звичайною схемою. Графік залежності оптичної щільності від концентрації білка наведено на рис.1.
Для проведення кольорової реакції відбирали 0,5 мл розчину білка, доливали по 1 мл реактиву С, приготованого наступним чином: р-р А (21,6 г Na 2 CO 3 × 10H 2 O і 4г NaOH розчинили в 1л води) і р- р У (0,5 г CuSO 4 × 5H 2 O і 1г цитрату натрію розчиняли в 10 мл води) змішували у відношенні 50:1. Проби ретельно перемішували і витримували 10хв при кімнатній температурі. Потім додавали 0,1 мл 1н реактиву Фоліна, ретельно перемішували і витримували 40хв при кімнатній температурі. Проби фотоколоріметріровалі на КФК-2 при λ = 750нм проти холостої проби.
2.4. Статистична обробка результатів дослідження
Для оцінки достовірності відмінностей між контрольною та дослідною групою використовували t-критерій Стьюдента. Це параметричний критерій, який використовується для перевірки гіпотез про достовірність різниці середніх при аналізі кількісних даних про популяціях з нормальним розподілом і однакові варіанти.
Метод Стьюдента різний для незалежних і залежних вибірок. Незалежні вибірки виходять при дослідженні двох різних груп піддослідних (у нашому експерименті це досвідчена і контрольна групи).
Далі у таблиці значень t знаходять величину, відповідну n-2 ступенями свободи, де n - загальне число випробовуваних в обох вибірках, і порівнюють цю величину з результатом розрахунку за формулою.
Якщо отриманий результат більше, ніж значення для рівня достовірності 0,05, знайдене в таблиці, то можна відкинути нульову гіпотезу, тобто рахувати різницю середніх достовірною. Якщо ж отриманий при обчисленні результат менше, ніж табличний, то нульову гіпотезу можна відкинути, і отже, різниця середніх не достовірна [5].
3. Результати та обговорення
Результати дослідження активності ВПП і ФМСФ-КП в гіпофізі, гіпоталамусі, стріатумі, великих півкулях, четверохолміе і наднирниках під впливом пирроксан представлені на двох діаграмах.
У ході проведення експерименту було встановлено, що отримання тваринами пирроксан призводить до істотного зниження активності ферментів обміну регуляторних пептидів:
а) активність ФМСФ-КП падає в стреатуме, великих півкулях і наднирниках в 7раз, а в гіпоталамусі і четверохолміе в 3раза. Лише в гіпофізі спостерігається невелике збільшення активності ферменту в 2раза;
б) активність ВПП зменшується у всіх пробах: у гіпоталамусі у 4.5 рази, а у великих півкулях і четверохолміе в 1.5раза.
Можна намагатися тлумачити ці дані так, що активність ферментів обміну регуляторних пептидів може регулюватися станом адренергічної системою, з використанням декількох шляхів.
Отже, можлива регуляція через Ca 2 +-систему: при дії на α-адренорецептори спостерігається зміна концентрації іонів Ca 2 +, але самі іони не впливають на активність ферментів, а змінюють стабілізацію, агрегацію та здатність до зв'язування з мембраною. У складі ферменту, а саме ВПП, виявлена ділянка зв'язування з даними іоном. Можливо, що біологічна роль розчинної і мембранозв'язаних ВПП відрізняється. Припускають, що обидві форми беруть участь у процессингу нейропептидів, але мембранозв'язаних форма, поряд з цим, бере участь у сортуванні пептидів. Отже, різна концентрації Ca 2 + може призводити до зниження рівня активності ВПП, тому що, ймовірно, відбувається зміна співвідношення розчинної і мембранозв'язаних форм. Результатом служить вплив на процесинг і сортування біологічно активних пептидів. Аналогічний механізм буде діяти і щодо ФМСФ-КП, тому що для неї також виявлена мембранозв'язаних форма.
Можливий шлях за рахунок зміни стану мембрани, що веде до зміни стану ліпідного шару і, отже, зменшується активність мембаносвязанних форм досліджуваних ферментів.
Найбільш важливим є механізм аденілатціклазного шляху, в якому увага приділяється не цАМФ, а G-білків. Відомо, що при дії на α-адренорецептори відбувається інактивація G i-білка і синтезуватися цАМФ не буде, тому що не буде працювати аденилатциклаза. Що призводить до зменшення частини обмінних процесів, след-но, зменшується швидкість синтезу мРНК і трансляції, і результат - уповільнення синтезу досліджуваних ферментів, у зв'язку з тим, що зчитування відбувається в меншому ступені.
Різноспрямована зміна активності ФМСФ-КП може бути викликано з ті, що в гіпофізі і в гіпоталамусі беруть участь в утворенні активних форм різних пептидів.
У цілому отримані дані узгоджуються з літературними про зміну рівня регуляторних пептидів при введенні α-адреноблокаторів.
Отже, зміна активності карбоксипептидази через адренергическую систему може впливати на рівень регуляторних пептидів, а через пептиди - на функціонування інших систем організму і, відповідно, на стан серцево-судинної системи, а також на емоційний статус, поведінка та інші функції вищої нервової діяльності.
ВИСНОВКИ
Вивчення впливу пирроксан на активність основних карбоксипептидази в нервовій тканині щурів дозволило зробити наступні висновки:
Ø при введенні а-адреноблокатора активність досліджуваних ферментів мала тенденцію до зниження у більшості вивчених відділів;
Ø у зв'язку з тим, що при дії активність ВПП і ФМСФ-КП змінюється однонаправлені, то швидше за все, обидва ферменту мають подібну біологічною функцією;
Ø зміна активності ферментів під впливом пирроксан вказує на те, що взаємозв'язок між пептідергіческой і адренергічної системою може здійснюватися за допомогою досліджуваних карбоксипептидази.
Бібліографічний список
1. Азарян А.В. Пептідгідролази нервової системи та їх біологічні функції. - Єреван: Айастан, 1989. - 208 с
2. Азарян А.В. Пептідгідролази нервової системи та їх біологічні функції / / Єреван - Айастан, 1989. - 208 с.
3. Ашмарин І.П., Каменська М.А. Нейропептиди у симпатичної передачі / / Підсумки Н. і Т. (ВІНІТІ. Сер. Фізіологія людини і тварин). - 1988. - 34, 184 с.
4. Бабічев В.М. Нейроендокринний контроль процесів пубертации / / Усп. сучас. біол. - 1994. - 114, № 3. - С. 330-344.
5. Бєляєв Н.А., Колесанова Є.Ф. Динаміка вмісту мет-енкефаліну у надниркових і плазмі крові щурів при гострої алкогольної інтоксикації / / Питання мед. хімії. - 1990. - Т. 36, № 3. - С.86-87.
6. Вернигора А. Н., Генгін М., Макарова В. В. Вплив стресових чинників на активність карбоксипептидази Н у відділах головного мозку щурів / / Укр. биохим. журн. - 1992. - 64. № 2. - С. 45-49. Н124.
7. Вернигора О.М., Генгін М.Т. Вплив етанолу на активність карбоксипептидази Н в гіпофізі і некотрих відділах головного мозку щурів при різних стрессірующіх впливах / / Фізіологічний журнал ім. І.М. Сєченова, 1993. - Т. 79, № 3. - 34-38с.
8. Вернигора О.М., Генгін М.Т. Протеолітичні ферменти: субклітинних локалізація, властивості та участь в обміні нейропептидів / / Біохімія - 1996. - 61, № 5. - С. 771-785.
9. Вернигора О.М., Генгін М.Т., Нікішин М.М. Очищення і фізико-хімічні властивості розчинної карбоксипептидази Н із сірої речовини головного мозку кішки / / Біохімія. - 1992. - Т. 57, № 11. - С. 1712-1719.
10. Вернигора О.М., Генгін М.Т., Салдан Д.А., Щетиніна Н.В. Розподіл активності фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази в нервовій тканині котів / / Нейрохімія. - 1997. - Т. 14, № 4. - С. 423 - 425.
11. Вернигора О.М., Михайлова О.Е., Генгін М.Т., Рижкова Ю.О., Мухіна Є.С. Вплив хронічного споживання етанолу на активність основних карбоксипептидази у відділах мозку щурів / / Укр. биохим. журн., 2002. - Т. 74, № 6. - 128-130с.
12. Вернигора О.М., Нікішин М.М., Генгін М.Т. Вплив внутрішньочеревно введення фізіологічного розчину на поведінку щурів у тесті "відкрите поле" і активність ферментів обміну нейропептидів / / фізіолого. журн, 1995. - Т. 81, № 12. - 121-125с.
13. Вернигора О.М., Нікішин М.М., Генгін М.Т. Часткова характеристика основної фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази з головного мозку кішки / / Біохімія. - 1995. - Т. 60, № 11. - С. 1860-1866.
14. Генгін М.Т., Вернигора О.М. Ферменти процесингу опіоїдних пептидів і методи визначення їх активності / / Укр. биохим. журн. - 1994. - Т. 66, № 2. - С. 3-17.
15. Гомазков О.А. Функціональна біохімія регуляторних пептидів. -М: Наука. 1993. - 160 с.
16. Оболенська Н.Є. Деякі особливості утворення нейропептидів / / Успіхи сучас. біол. - 1989. - Т. 108, № 3 (5). - С. 337-341.
17. Щетиніна Н.В. Активність основних карбоксипептидази в тканинах і відділах мозку щурів в онтогенезі / / дис. на соіск. наукового ступеня кандидата біол. наук. - Спб., 1997.
18. Daud AI, Bumpus FM, Husain A. Characterization of angiotensin I-converting enzyme (ACE)-containing follicles in the rat ovary during the estrous cycle and effects of ACE inhibitor on ovulation / / Endocrinology. - 1990. - 126, № 6. - Р. 2927-2935.
19. Fiedorek FTJr., Parkinson D. Carboxypeptidase H processing and secretion in rat clonal beta-cell lines / / Endocrinology. - 1992. - V. 131, № 3. - P. 1054-1062.
20. Fricker LD, Snyder SH Enkephalin convertase: purification and charasterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenall chromaffin granules / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1982. - № 79. - P. 3886-3890.
21. Guest PC, Pipeleers D., Rossier J., Rhodes CJ, Hutton JC Co-secretion of carboxypeptidase H and insulin from isolated rat islets of Langerhans / / J. Biochem. - 1989. - V. 264, № 2. - P. 503-508.
У результаті було створено велику кількість лікарських засобів, як адренопозітівних, тобто стимулюючих адренергічні процеси, так і адренонегатівних - антиадренергическим речовин.
1. Посилюють адренергіческіх передачу нервових імпульсів.
1.1. Адреноміметики прямої дії.
1.1.1. α, β-адреноміметики: адреналін (всі адренорецептори).
1.1.2. α-адреноміметики: норадреналін (α1, α2, частково - і β), мезатон (α1-рецептори), нафтизин (α2-рецептори на периферії), галазолін (α2-рецептори на периферії), клонідин (клофелін) (α2-рецептори ЦНС ), гуанфацин (α2-рецептори ЦНС).
1.1.3. β-адреноміметики: ізадрин (β1 і β2-рецептори), добутамін (β1-рецептори), дофамін (β1, частково - α), орципреналін, фенотерол (β2-рецептори), салбутамол.
1.2. Симпатоміметики непрямої дії: ефедрин, фенамін, тирамін, кокаїн, а також деякі трициклічні антидепресанти.
2. Ослабляють адренергіческіх ефекти.
2.1. Адренолітики прямої дії.
2.1.1. α, β-адренолитики: лабеталол.
2.1.2. α-адренолитики: фентоламін, пирроксан, дигідроерготамін, Дигідроерготоксину: α1 і α2, празозин (тільки α1).
2.1.3. β-блокатори: пропранолол, окспреналол, піндолол - β1 і β2, талинолол - кардіоселективні β1, метопролол і атенолол - β1.
2.2. Адренолітики непрямої дії (симпатолітики): резерпін, октадін, ормід, метил-ДОФА.
α1 ,2-адреноблокатори представляють собою дигидрированную алкалоїди ріжків. Сюди відносять фентоламін, пирроксан, дигідроерготамін, Дигідроерготоксину.
Дані лікарські засоби застосовують: а) для лікування розладів переферического кровообігу; б) лікування трофічних виразок, ран, відморожень, в) купірування гіпертонічних кризів (фентоламін внутрішньовенно); г) діагностика та лікування феохромоцитом (пухлина мозкового шару надниркових залоз, адреналін виходить у кров і стан подібно гіпертонічним кризам); д) лікування мігреней (сильний головний біль з блювотою, що з підвищенням амплітуди пульсації судин головного мозку; е) для лікування артеріальної гіпертензії використовуються речовини, які вибірково блокують постсинаптичні альфа1-адренорецептори (вони знімають вплив симпатичних нервів на судини і судини розширюються).
Механізм антидепресивної дії цих препаратів неясний. Спочатку було припущено, що воно обумовлено периферичним адренонегатівним ефектом, в результаті якого за механізмами зворотного зв'язку підвищується вміст норадреналіну в мозку [Бару А. М., 1970; Нуллер Ю. Л., 1970]. За останні роки з'явилися дані про вплив антидепресантів на чутливість норадренергічну рецепторів. Так, антидепресивну дію Миансерин частково пов'язують з гальмуванням а2-адренорецепторів.
1.3. Адренергічна і пептідергіческая системи
Адреналін був вперше виявлений в екстрактах надниркових залоз у 1895р. У 1901р, було здійснено синтез кристалічного адреналіну. Незабаром адреналін знайшов застосування в медицині для підвищення артеріального тиску при колапсі, для звуження кровоносних судин при місцевій анестезії, а потім і для купірування нападів бронхіальної астми. У 1905р. було виявлено важливе фізіологічне значення адреналіну. Виходячи з подібності дії адреналіну з ефектами, що спостерігаються при подразненні симпатичних нервових волокон, було висловлено припущення, що передача нервового збудження з симпатичних нервових закінчень на ефекторні клітини здійснюється за участю хімічного передавача (медіатора), яким є адреналін чи адреноліноподобние речовини. Цим було покладено початок вчення про хімічну передачі нервового збудження. В подальшому було розкрито процес біосинтезу адреналіну, починаючи від амінокислоти тирозину, через діоксіфенілаланін (L-ДОФА), дофамін, норадреналін до адреналіну. У 1946р. було встановленi, що основним медіатором адренергічної (симпатичної) передачі є не сам адреналін, а норадреналін. Утворюється в організмі ендогенний адреналін частково бере участь у процесах проведення нервового збудження, але головним чином грає роль гормонального речовини, що впливає на метаболічні процеси. Норадреналін здійснює медіаторну функцію в периферичних нервових закінченнях і в синапсах ЦНС. Біохімічні системи тканин, що взаємодіють з норадреналіном, називають адренореактівних (адренергічними) системами, або адренорецепторами ("Адреноцептори"). За сучасними уявленнями, норадреналін, що виділяється в процесі нервового імпульсу з пресинаптичних нервових закінчень, впливає на норадреналін-чутливу аденілатциклазу клітинної мембрани адренорецепторного системи, що призводить до посиленого утворення внутрішньоклітинного 3'-5'-циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ), що грає роль "вторинного" передавача (медіатора), до активації біосинтезу макроергічних з'єднань і далі до здійснення адренер-ня фізіологічних ефектів. Важливу роль у передачі імпульсів у ЦНС грає також дофамін, який є хімічним попередником норадреналіну, але виконує самостійну нейромедиаторную роль.
Освіта медіатора передбачається за наступною схемою: фенілаланін -> тирозин -> діоксіфенілаланін (ДОФА) -> дофамін (1-й медіатор, катехоламін) -> норадреналін (головна роль у передачі збудження в синапсах адренергіческіх). Норадреналін в синапсах і наднирниках може переходити в адреналін і навпаки).
Починаючи з третього реакції відбуваються в нервових клітин (перші реакції - в печінці). Медіатори спускаються по аксону у везикулах в пресімпатіческіе закінчення. У процес транспота везикул беруть участь іони магнію. Медіатори можуть руйнуватися МАО тип А (руйнує норадреналін, адренолин і серотонін). Норадреналін і адреналін для захисту від МАО з'єднуються зі спеціальними білками і АТФ (утворюється депо). Це - стабільні гранули (стабільна фракція). Лабільна фракція представлена непов'язаним медіатором у везикулах. Крім того є небагато вільного адреналіну в цитоплазмі, але він легко руйнується ферментами.
Після виходу медіатора в синаптичну щілину його надлишки можуть руйнуватися КОМТ. Може також здійснюватися зворотне захоплення частини медіатора пресинаптической мембраною.
Вплив адреналіну на артеріальний тиск передбачає кілька фаз: в першу фазу відбувається активація β1-адренорецепторів міокарда, що веде до збільшення серцевого викиду, по другою - затримка підняття тиску (вагодепрессорний рефлекторний ефект); третя фаза супроводжується впливом адреналіну на α (підйом) і β (спад) рецептори судин і четверта - слідова гіпотензія, швидкий нейрональний захоплення адреналіну, інактивація його надлишку ферментом КОМТ.
У регуляції функцій організму, поряд з класичними медіаторами, важлива роль належить регуляторним факторів пептидної природи. Регуляторні пептиди широко поширені в різних тканинах, у тому числі й у нервовій. Вони беруть участь у нейрохімічних механізмах, які підтримують основні гомеостатичні константи організму, формують і здійснюють цілеспрямоване поведінка, а також у процесах, контролюючих емоційну сферу, мотивацію, пам'ять [3]. Ймовірно, саме біологічно активним пептидів належить важлива роль в інтеграції функціональних систем організму, забезпеченні їх злагодженої роботи в умовах, що змінюються навколишнього середовища. Вони грають ключову роль в регуляції імунологічної захисту, у запуску адаптивних захисних реакцій при інфекції, пошкодженні тканин, стресі, а також у формуванні патологічних станів організму, в тому числі і алклоголізма. Багато нейропептиди залучаються до регуляцію вікових змін, в т. ч. і процесів статевого дозрівання [4].
Одним з етапів метаболізму пептидів є обмежений протеоліз, який грає головну роль як у процесах їх біосинтезу, так і в процесах інактивації. Пептідгідролази, здійснюють процесинг і деградацію пептидних регуляторів, забезпечують функціонування і певне співвідношення їх в організмі.
Більшість попередників нейропептидів включають послідовності пептидів, що володіють різною біологічною активністю. Те, які саме пептиди будуть утворюватися з попередника, залежить від набору протеїназ, що діють на молекулу попередника, і від співвідношення їх активностей.
При паракрінной дії пептиду активність позаклітинних пептидаз визначає час життя пептиду, відстань, на яку він може продіффундіровать, а, отже, і спектр мішеней, на які він діє. Таким чином, за допомогою протеїназ здійснюється регуляція фізіологічних ефектів пептидів на етапі біосинтезу і на етапі інактивації пептидів.
Особливість пептидної регуляції функціонального стану організму полягає в тому, що в кожній ділянці в кожний момент часу повинна підтримуватися необхідна концентрація певних пептидів. Це може бути досягнуто точної і узгодженої роботою протеїназ, що здійснюють синтез і деградацію пептидів, тобто підтриманням у головному мозку певної просторово-часової мозаїки протеолітичної активності. При зміні зовнішніх умов, або якому-небудь дії (наприклад, алкоголізації) ця мозаїка певним чином змінюється, щоб забезпечити роботу функціональних систем організму в нових умовах.
У кінцевій стадії утворення активних пептидів з неактивних попередників і в початкових стадіях їх деградації беруть участь основні карбоксипептидази - ферменти, відщеплюють залишки основних амінокислот (аргініну і лізину) з С-кінця пептидів. До них, зокрема, відносяться карбоксипептидаза Н, і нещодавно відкрита ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза. Їм належить важлива роль в регуляції рівнів активних нейропептидів в організмі [8], чим зумовлений інтерес до вивчення цих ферментів, у тому числі і при різних фізіологічних і патологічних процесах, що протікають в організмі [6].
Дії адреноблокирующим препаратів у першу чергу направлено на α, β-адренорецептори. При дії на α1-адренорецептори в клітину починають надходити іони кальцію, надаючи пряму збудливу дію. Крім того, активується фосфоліпаза С. Вона розщеплює мембранний фосфолипид на два активних речовини: інозит-3-фосфат, який стимулює викид кальцію з внутрішньоклітинних депо в цитоплазмі, і диацилглицерол, який активує протеїнкінази. Протеїнкінази активують фосфорілази, які фосфорилируют білки. При дії на β-рецептори через регуляторний білок Gs активується аденилатциклаза, а продукт її роботи - цАМФ активує протеїнкінази. При дії на α2-рецептои через білок Gi аденилатциклаза інгібується. І Gs і Gi для своєї роботи вимагають ГТФ.
Зокрема, α-адреноблокатори надаючи прессорное дію, характеризуються наявністю побоченних ефектів, таких як, артеріальна гіпотонія, брадикардія та інші, які важко пояснити тільки впливом цього препарату на рецептори. Можливо, частина ефектів опосередковується пептідергіческой системою, тому що зміна адренергічної системи викликає зміна рівня регуляторних пептидів: вазопресину, ангеотенізіна і саматотропіна.
2. Матеріали та методи дослідження
2.1. Матеріал дослідження
Дослідження проводили на самцях білих безпородних щурів масою 350-400г. У роботі використовували дві групи тварин: дослідну і контрольну. Тварини дослідної групи отримували протягом двох тижнів в якості єдиного джерела рідини водний розчин пирроксан, що містить 5% р-р сахарози, при цьому середня доза препарату становила 150мкг/кг/сут. Тварини контрольної групи - 5% р-р сахарози.
Щурів декапітованих, витягували гіпофіз, гіпоталамус, стріатум, великі півкулі, четверохолміе і надниркові залози.
Навіски тканин гомогенізували в 50мм натрій-ацетатному буфері при рН = 5,6.
2.2. Методи визначення карбоксипептидази-В-подібної активності
Карбоксипептидази-В-подібну активність визначали флюоріметріческім методом Фрікер і Снайдер з модифікаціями. В основу методу покладена різна розчинність в хлороформно і водної фазах субстрату і продукту реакції.
2.2.1. Визначення активності карбоксипептидази Н
50мкл 1% гомогенату змішували з 150мкл 50мм натрій-ацетатного буфера, рН 5.6, в разі контрольної проби; у разі дослідної проби 50мкл 1% гомогенату змішували з 140мкл 50мм натрій-ацетатного буфера, рН 5.6 з додаванням 10мкл ГЕМЯК.
Суміш інкубували 8 хв при 37 ° C. Реакцію починали додатком 50мкл субстрату (DNS-фен-лей-арг, приготованого на 50мм натрій-ацетатному буфері при рН 5.6). Проби перемішували і инкубировали 60 хв при 37 ° C.
Реакцію зупиняли додаванням 50мкл 1н розчину HCl.
Для екстракції продукту DNS-фен-лей до проб додавали 1,5 мл хлороформу, інтенсивно струшували протягом 60с і центрифугували 10хв при 1000об/мін для поділу фаз.
Вимірювання флуоресценції проводили на флюоріметре ФМЦ-2 (λ ex = 360нм, λ ex = 530нм) у кюветі товщиною 1см.
Активність ВПП визначали як різниця в флюоресценції проб і висловлювали DNS-фен-лей, що утворився за 1хв інкубації в розрахунку на 1 мг білка.
2.3. Методика визначення білка
Кількість білка в пробах визначали за методом Лоурі. Цей метод поєднує в собі біуретову реакцію (реакцію на пептидні зв'язки) та реакцію Фоліна (на тирозин і триптофан). Метод Лоурі є досить чутливим (10-100мкг білка в пробі) і найбільш точним з усіх існуючих методів кількісного визначення білка.
Калібрувальну криву будували за розчином бичачого сироваткового альбуміну (БСА). Для цього з вихідного розчину БСА (100мкг/мл) готували розведення з концентрацією БСА 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90мкг/мл і визначали в них концентрацію білка за звичайною схемою. Графік залежності оптичної щільності від концентрації білка наведено на рис.1.
Для проведення кольорової реакції відбирали 0,5 мл розчину білка, доливали по 1 мл реактиву С, приготованого наступним чином: р-р А (21,6 г Na 2 CO 3 × 10H 2 O і 4г NaOH розчинили в 1л води) і р- р У (0,5 г CuSO 4 × 5H 2 O і 1г цитрату натрію розчиняли в 10 мл води) змішували у відношенні 50:1. Проби ретельно перемішували і витримували 10хв при кімнатній температурі. Потім додавали 0,1 мл 1н реактиву Фоліна, ретельно перемішували і витримували 40хв при кімнатній температурі. Проби фотоколоріметріровалі на КФК-2 при λ = 750нм проти холостої проби.
2.4. Статистична обробка результатів дослідження
Для оцінки достовірності відмінностей між контрольною та дослідною групою використовували t-критерій Стьюдента. Це параметричний критерій, який використовується для перевірки гіпотез про достовірність різниці середніх при аналізі кількісних даних про популяціях з нормальним розподілом і однакові варіанти.
Метод Стьюдента різний для незалежних і залежних вибірок. Незалежні вибірки виходять при дослідженні двох різних груп піддослідних (у нашому експерименті це досвідчена і контрольна групи).
Далі у таблиці значень t знаходять величину, відповідну n-2 ступенями свободи, де n - загальне число випробовуваних в обох вибірках, і порівнюють цю величину з результатом розрахунку за формулою.
Якщо отриманий результат більше, ніж значення для рівня достовірності 0,05, знайдене в таблиці, то можна відкинути нульову гіпотезу, тобто рахувати різницю середніх достовірною. Якщо ж отриманий при обчисленні результат менше, ніж табличний, то нульову гіпотезу можна відкинути, і отже, різниця середніх не достовірна [5].
3. Результати та обговорення
Результати дослідження активності ВПП і ФМСФ-КП в гіпофізі, гіпоталамусі, стріатумі, великих півкулях, четверохолміе і наднирниках під впливом пирроксан представлені на двох діаграмах.
У ході проведення експерименту було встановлено, що отримання тваринами пирроксан призводить до істотного зниження активності ферментів обміну регуляторних пептидів:
а) активність ФМСФ-КП падає в стреатуме, великих півкулях і наднирниках в 7раз, а в гіпоталамусі і четверохолміе в 3раза. Лише в гіпофізі спостерігається невелике збільшення активності ферменту в 2раза;
б) активність ВПП зменшується у всіх пробах: у гіпоталамусі у 4.5 рази, а у великих півкулях і четверохолміе в 1.5раза.
Можна намагатися тлумачити ці дані так, що активність ферментів обміну регуляторних пептидів може регулюватися станом адренергічної системою, з використанням декількох шляхів.
Отже, можлива регуляція через Ca 2 +-систему: при дії на α-адренорецептори спостерігається зміна концентрації іонів Ca 2 +, але самі іони не впливають на активність ферментів, а змінюють стабілізацію, агрегацію та здатність до зв'язування з мембраною. У складі ферменту, а саме ВПП, виявлена ділянка зв'язування з даними іоном. Можливо, що біологічна роль розчинної і мембранозв'язаних ВПП відрізняється. Припускають, що обидві форми беруть участь у процессингу нейропептидів, але мембранозв'язаних форма, поряд з цим, бере участь у сортуванні пептидів. Отже, різна концентрації Ca 2 + може призводити до зниження рівня активності ВПП, тому що, ймовірно, відбувається зміна співвідношення розчинної і мембранозв'язаних форм. Результатом служить вплив на процесинг і сортування біологічно активних пептидів. Аналогічний механізм буде діяти і щодо ФМСФ-КП, тому що для неї також виявлена мембранозв'язаних форма.
Можливий шлях за рахунок зміни стану мембрани, що веде до зміни стану ліпідного шару і, отже, зменшується активність мембаносвязанних форм досліджуваних ферментів.
Найбільш важливим є механізм аденілатціклазного шляху, в якому увага приділяється не цАМФ, а G-білків. Відомо, що при дії на α-адренорецептори відбувається інактивація G i-білка і синтезуватися цАМФ не буде, тому що не буде працювати аденилатциклаза. Що призводить до зменшення частини обмінних процесів, след-но, зменшується швидкість синтезу мРНК і трансляції, і результат - уповільнення синтезу досліджуваних ферментів, у зв'язку з тим, що зчитування відбувається в меншому ступені.
Різноспрямована зміна активності ФМСФ-КП може бути викликано з ті, що в гіпофізі і в гіпоталамусі беруть участь в утворенні активних форм різних пептидів.
У цілому отримані дані узгоджуються з літературними про зміну рівня регуляторних пептидів при введенні α-адреноблокаторів.
Отже, зміна активності карбоксипептидази через адренергическую систему може впливати на рівень регуляторних пептидів, а через пептиди - на функціонування інших систем організму і, відповідно, на стан серцево-судинної системи, а також на емоційний статус, поведінка та інші функції вищої нервової діяльності.
ВИСНОВКИ
Вивчення впливу пирроксан на активність основних карбоксипептидази в нервовій тканині щурів дозволило зробити наступні висновки:
Ø при введенні а-адреноблокатора активність досліджуваних ферментів мала тенденцію до зниження у більшості вивчених відділів;
Ø у зв'язку з тим, що при дії активність ВПП і ФМСФ-КП змінюється однонаправлені, то швидше за все, обидва ферменту мають подібну біологічною функцією;
Ø зміна активності ферментів під впливом пирроксан вказує на те, що взаємозв'язок між пептідергіческой і адренергічної системою може здійснюватися за допомогою досліджуваних карбоксипептидази.
Бібліографічний список
1. Азарян А.В. Пептідгідролази нервової системи та їх біологічні функції. - Єреван: Айастан, 1989. - 208 с
2. Азарян А.В. Пептідгідролази нервової системи та їх біологічні функції / / Єреван - Айастан, 1989. - 208 с.
3. Ашмарин І.П., Каменська М.А. Нейропептиди у симпатичної передачі / / Підсумки Н. і Т. (ВІНІТІ. Сер. Фізіологія людини і тварин). - 1988. - 34, 184 с.
4. Бабічев В.М. Нейроендокринний контроль процесів пубертации / / Усп. сучас. біол. - 1994. - 114, № 3. - С. 330-344.
5. Бєляєв Н.А., Колесанова Є.Ф. Динаміка вмісту мет-енкефаліну у надниркових і плазмі крові щурів при гострої алкогольної інтоксикації / / Питання мед. хімії. - 1990. - Т. 36, № 3. - С.86-87.
6. Вернигора А. Н., Генгін М., Макарова В. В. Вплив стресових чинників на активність карбоксипептидази Н у відділах головного мозку щурів / / Укр. биохим. журн. - 1992. - 64. № 2. - С. 45-49. Н124.
7. Вернигора О.М., Генгін М.Т. Вплив етанолу на активність карбоксипептидази Н в гіпофізі і некотрих відділах головного мозку щурів при різних стрессірующіх впливах / / Фізіологічний журнал ім. І.М. Сєченова, 1993. - Т. 79, № 3. - 34-38с.
8. Вернигора О.М., Генгін М.Т. Протеолітичні ферменти: субклітинних локалізація, властивості та участь в обміні нейропептидів / / Біохімія - 1996. - 61, № 5. - С. 771-785.
9. Вернигора О.М., Генгін М.Т., Нікішин М.М. Очищення і фізико-хімічні властивості розчинної карбоксипептидази Н із сірої речовини головного мозку кішки / / Біохімія. - 1992. - Т. 57, № 11. - С. 1712-1719.
10. Вернигора О.М., Генгін М.Т., Салдан Д.А., Щетиніна Н.В. Розподіл активності фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази в нервовій тканині котів / / Нейрохімія. - 1997. - Т. 14, № 4. - С. 423 - 425.
11. Вернигора О.М., Михайлова О.Е., Генгін М.Т., Рижкова Ю.О., Мухіна Є.С. Вплив хронічного споживання етанолу на активність основних карбоксипептидази у відділах мозку щурів / / Укр. биохим. журн., 2002. - Т. 74, № 6. - 128-130с.
12. Вернигора О.М., Нікішин М.М., Генгін М.Т. Вплив внутрішньочеревно введення фізіологічного розчину на поведінку щурів у тесті "відкрите поле" і активність ферментів обміну нейропептидів / / фізіолого. журн, 1995. - Т. 81, № 12. - 121-125с.
13. Вернигора О.М., Нікішин М.М., Генгін М.Т. Часткова характеристика основної фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази з головного мозку кішки / / Біохімія. - 1995. - Т. 60, № 11. - С. 1860-1866.
14. Генгін М.Т., Вернигора О.М. Ферменти процесингу опіоїдних пептидів і методи визначення їх активності / / Укр. биохим. журн. - 1994. - Т. 66, № 2. - С. 3-17.
15. Гомазков О.А. Функціональна біохімія регуляторних пептидів. -М: Наука. 1993. - 160 с.
16. Оболенська Н.Є. Деякі особливості утворення нейропептидів / / Успіхи сучас. біол. - 1989. - Т. 108, № 3 (5). - С. 337-341.
17. Щетиніна Н.В. Активність основних карбоксипептидази в тканинах і відділах мозку щурів в онтогенезі / / дис. на соіск. наукового ступеня кандидата біол. наук. - Спб., 1997.
18. Daud AI, Bumpus FM, Husain A. Characterization of angiotensin I-converting enzyme (ACE)-containing follicles in the rat ovary during the estrous cycle and effects of ACE inhibitor on ovulation / / Endocrinology. - 1990. - 126, № 6. - Р. 2927-2935.
19. Fiedorek FTJr., Parkinson D. Carboxypeptidase H processing and secretion in rat clonal beta-cell lines / / Endocrinology. - 1992. - V. 131, № 3. - P. 1054-1062.
20. Fricker LD, Snyder SH Enkephalin convertase: purification and charasterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenall chromaffin granules / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1982. - № 79. - P. 3886-3890.
21. Guest PC, Pipeleers D., Rossier J., Rhodes CJ, Hutton JC Co-secretion of carboxypeptidase H and insulin from isolated rat islets of Langerhans / / J. Biochem. - 1989. - V. 264, № 2. - P. 503-508.