Визначення рівня природної резистентності та оцінці імунного статусу риб

Х = К (y / ly) 17 "
де: Х - кількість комплементу (мл) в реакції; у - ступінь лізису, виражена в
частках одиниці; К-константа, відповідна ichso при у = 0,5; 1/п-константа
(Визначає нахил кривої, залежить від умов досвіду).
При логарифмування цього рівняння виходить функція, зручна для
оцінки результатів:
igx = lgk + l / n [lg (y / ly)]
Залежність величини lg Х від величини lg (y / ly) графічно буде
представляти пряму лінію, за якою можна визначити шукану величину К.
Знаючи величину К, легко розрахувати кількість chsn, що містяться в 1 мл
нерозведеною сироватки.

2.2.2.1. Визначення гемолітичної активності комплементу за
класичним шляхом активації (метод Мейєра в модифікації yano Т.,
1992).
- Принцип методу заснований на здатності комплементу приєдналась до програми
няться до комплексу антиген - антитіло (еритроцити барана - гемолізин) і
вьвивать специфічний гемоліе сенсибілізованих еритроцитів.
За одиницю активності (за Мейеру) комплементу теплокровних
беруть таку кількість нерозведеною сироватки, яке викликає
50% лізис 5х108 оптимально сенсибілізованих еритроцитів барана в
желатин - вероналовом буфері (рН 7,4), що містить 0,15 mm Са2 * і 0,5
mm mg24 ", протягом 60 хв інкубації при 37 ° С в обсязі 7,5 мл. За
yano Т., в залежності від виду риб, інкубацію здійснюють при 20 - 25 °
С протягом 60-120 хв в желатин-вероналовом буфері (рН 7,3 -7,4),
містить 0,5 mm Са2 ^ і 1 mm mg ^ в обсязі 1,5 мл. Для сенс-
зації еритроцитів використовують гемолізин того ж (або близького)
виду риб, що і випробуваний комплемент.
- Обладнання і реактиви: спектрофотометр та кювети з довжиною
оптичного шляху 1 см (при використанні приладів з іншою довжиною опти-
тичного шляху необхідно визначити і використовувати в розрахунках величину
оптичної щільності (od) для заданої концентрації еритроцитів);
рН - метр; водяна лазня; дозуючі мікропіпетки на 0,2; 1, 2 мл; про-
бирки (5-10 мл), що витримують центрифугування; рефрижераторних
центрифуга; стерильні шприци; глюкоза; naci; дистильована вода;
na-5, 5, - діетілбарбітурат (мединал); cacl2; mgcl2, желатин, in hc1;
крижана оцтова кислота; ацетат натрію; edta; 10% маж) з; еритроцити
барана в розчині Олсвера (1:1); гемолізини; сироватка крові риб (джерело комплементу); 0.85% naci; матковий розчин солей (СаСЬ х 2НгО - 7.35 г, mgcl-i x 6h20 - 20.33 г, дистильована вода до 100 мл) .
- Приготування буферних розчинів:
- Вероналовий буфер, концентрат, рН 7,3-7.4 (5vb): naci - 41,5 г,
Ма-5 ,5-діетілбарбітурат - 5,1 г, in hc1 - 17.5 мл, дистильована вода -1 л. Желатин-вероналовий буфер (gvb ^): желатин - 0,1 г, 5vb - 20 мл,
матковий розчин солей - 0,1 мл, дистильована вода до 100 мл
(Зберігати при +4 ° С не більше 1 тижня) Глюкозо-желатин-вероналовий буфер (ggvb24): желатин - 0.1 г, 5vb - 10 мл, глюкоза - 2,5 г, матковий розчин солей - 0,1 мл, 10%
nanos - 0,2 мл, дистильована вода до 100 мл (зберігати при +4 ° С не
більше 1 тижня). - 0,1 М edta буфер, рН 7 <5: 2Д2 г edta розчинити в 90 мл дистильованої води, додаючи концентрований розчин naoh, довести рН до
7.5, долити дистильованої води до 100 мл. - 0,01 М edta-желатин-вероналовий буфер (edta - gvb): желатин - 0,1 г, 5 vb - 20 мл, 0,1 М edta (рН 7,5) - 10 мл, дистилированная вода до 100 мл (зберігати при +4 ° С не більше 1 тижня). 0,001 М ацетатний буфер, рН 5,0: змішати 3 частини 0,1 М оцтової кислоти
з 7 частинами 0,1 М ацетату натрію, розвести в 100 разів, довести рН до 5,0.
- Отримання гемолизина.
- Риба. Для імунізації використовують статевонезрілих рибу з благополучного господарства. Рибу попередньо адаптують і утримують в умовах
найбільш оптимальних для кожного виду (температура води, проточність,
аерація, повноцінне годування).
- Приготування строми еритроцитів барана. 100 мл крові барана в розчині
Олсвера (1:1) центрифугують при 500-1000 g 10 хв (+ 4 ° С) і двічі відмивають
200 мл фізрозчину. Осад еритроцитів лізують в 1 л дистильованої води,
містить 0,4 мл крижаної оцтової кислоти, протягом ночі при +4 ° С.
Центрифугують, потім осад строми промивають б раз 0,0 б1 М ацетатних
буфером (рН 5,0) і 1 раз фізраство-ром, центріфугіруя 20 хв. при 500-1000 g.
Осад ретельно ресус-певдіруют в 30 мл фізрозчину. У суспензії визначають
вміст азоту мікромстодом К'єльдаля і доводять концентрацію до 1 мг / мл.
- Імунізація риб. Рибу ін'еціруют в / б суспензією строми еритроцитів
з розрахунку 0,3-0,5 мг n / кг маси риби. Ін'єкцій повторюють багаторазово (6-8 разів)
з інтервалом 5 днів. Перед кожною ін'єкцією (починаючи з 4-5) відбирають
сироватки і визначають титр гемодізіна. Кількість ін'єкцій залежить від титрів
отриманих гемолйзінов (визначення тетрагемолізіна див. нижче).
- Відбір антисироваток та умови зберігання. Через 5 днів після останньої
ін'єкції стерильно відбирають максимальну кількість крові. Після
освіти і ретракції згустку центрифугують 5 хв при 1500 g. Відбирають
сироватки і розводять 1:1 gvb2 ^ інактивують прогріванням (коропові-20 хв
при 50 ° С, лососеві - 20 хв при 42-45 ° С), розфасовують і зберігають при -20 ° С і
нижче.
- Визначення титру гемолизина. Готують серійні 2-х кратні розведення
антисироваток gvb2 ^ До 0,5 мл кожного розведення антисироватки додають по
0,1 мл еритроцитів барана (1х109 кл / мл, див. нижче), по 0,4 мл gvb 2 + та по 0,5 мл
комплементу, розведеного gvb2 ^ 1:20-1:40 (як комплементу використовують
свіжу сироватку, отриману від інтактних риб того ж виду). Суміш
інкубують при 20 - 25 ° С в залежності від виду риб (коропові - 25 ° С - 60 хвилин,
лососеві - 20 ° -120 хвилин), центрифугують 5 хвилин при 1600 g, визначають
оптичну щільність (od541) супернатанту і розраховують ступінь гемолізу. За
титр гемолизина беруть розведення, що дає 50% гемоліз.
- Отримання та умови зберігання комплементу. Комплемент риб дуже
термолабілен і швидко інактивується навіть при 0 ° С (кілька годин), не
переносить заморожування при мінус 20 ° С, при мінус 35 ° С активність
зберігається протягом місяця. Кров після відбору залишають на 30 хв при кімнатній температурі, потім на 1 годину при 0 ° С (лід з водою) для ретракції згустку, центрифугують 5 хв при 1500 g (0 ° ... +4 ° С) і відбирають сироватки. Сироватки як джерело комплементу використовують негайно, а при необхідності зберігають при -80 ° С або
ліофілізіруют.
- Приготування суспензії еритроцитів. Еритроцити барана в розчині
Олсвера (1:1) тричі відмивають edta-gvb і готують 5% суспензію в gvb2 ^ До
0,1 мл 5% суспензії еритроцитів додають 1,4 мл дистильованої води,
після лізису еритроцитів вимірюють ods4i проти дистильованої води.
Необхідної концентрації еритроцитів барана 1х109 кл / мл відповідає 0d541
0,680 при довжині оптичного шляху 1 см. Якщо 5% суспензія не дає необхідного
значення od541, значить її необхідно розвести (якщо od541 <0,680) або
сконцентрувати (якщо od541> 0,680) у стільки разів, у скільки отримане
ods4i відрізняється від 0,680.
- Підбір розведення гемолизина для оптимальної сенсибілізації
еритроцитів. Готують серійні дворазові розведення гемолизина (використовують
гемолізин з титром 1:1500 і вище) на gvb2 '. Беруть 2-4 ряди пробірок. У кожен
ряд вносять по 0,1 мл / пробірку приготовані розведення гемолизина. У всі
пробірки додають по 0,1 мл суспензії еритроцитів. Струшують і
інкубують при 25 ° С 20 хв. Готують кілька розведенні комплементу на
gvb24 - на кожен ряд своє розведення. Величина розведення залежить від виду риб
і активності комплементу (1:15 - 1:80). У кожну пробірку ряду вносять по 1,3 мл
комплементу одного і того ж розведення. Інкубують 60 хв при 25 ° С (для кар-
па), 120 хв при 20 ° С (для лососевих), 120 хв при 25 ° С (для тіляпіі),
періодично струшуючи. Центрифугують 5 хв при 16ДО g, визначають od541
і розраховують відсоток гемолізу супернатанту для кожної пробірки. Для
кожного розведення комплементу будують графік залежності відсотка гемолізу від
розведення гемолизина. Вибирають криву з таким розведенням комплементу, при якому максимальний гемоліз становить 50-70% (тобто крива виходить на плато при
гемолізі 50-70%). За оптимальне розведення гемолізнна беруть
максимальне розведення, що викликає максимальний% гемолізу (вихід кривої
на плато) і для надійності це розведення зменшують в 2 рази (наприклад, крива
виходить на плато при розведенні гемолизина 1:800, а за краще беруть
розведення 1:400).
- Приготування сенсибілізованих еритроцитів. Готують оптимальне
розведення гемолизина в edta-gvb. Це розведення повільно додають (при
постійному помішуванні) до рівного об'єму суспензії еритроцитів (1х109 кл / мл
в edta-gvb) і інкубують 30 хв при 25 ° С. Сенсибілізовані еритроцити
відмивають в ggvb2 ^, центрифугують 5-10 хв при 500g і готують суспензію
еритроцитів у ggvb ^ з концентрацією 5х108 кл / мл. Концентрацію еритроцитів
контролюють, вимірюючи ods4i лу клітин (0,2 мл суспензії
сенсибілізованих еритроцитів + ​​1,3 мл дистильованої води дають ods4i,
рівну 0,680). Сенсибілізовані еритроцити зберігають при +4 ° С протягом 1
тижня.
- Техніка постановки реакції і розрахунок активності комплементу. Всі
компоненти реакції змішують при 0 ° С (лід з водою). Випробуваний комплемент
розводять gvb24 в залежності від передбачуваної його активності, щоб потрапити в
область 50% лізису (для коропа зазвичай 1 / 40 - 1 / 60, для лососевих - 1 / 60 - 1 / 80).
Беруть ряд з 8 пробірок. У 5 пробірок вносять різні обсяги розведеного
випробуваного комплементу (0,4; 0.5; 0.6; 0.8; 1.0 мл), gvb21 доводять об'єм до 1,3
мл, в кожну пробірку додають по 0.2 мл сенсибілізованих еритроцитів.
Три пробірки використовують для контролів: 1-контроль еритроцитів на спонтанний
лізис (0.2 мл сенсибілізованих еритроцитів + ​​1.3 мл gvb ^); 2 - 100% лізис
еритроцитів (0.2 мл суспензії сенсибілізованих еритроцитів + ​​1.3 мл
дистильованої води); 3 - контроль od.541 комплементу (1.0 мл розведеного
комплементу + 0.5 мл gvb ^).
Пробірки інкубують, періодично струшуючи (час і температура -
оптимальні для кожного виду риб). Центрифугують 5 хв при 1600g. Вимірюють
od541 супернатанту. Обчислюють ступінь гемолізу (у) з урахуванням поправок на
контролі. Тобто від отриманого значення od., 41 супернатанту кожної дослідної
пробірки віднімають od.s4i контролю еритроцитів і ods4i контролю комплементу
(Значення ods ^ i контролю комплементу вимірюють тільки для першої пробірки, в
якої максимальний обсяг комплементу, а для решти пробірок ця
величина зменшується пропорційно зменшенню обсягу комплементу).
У логарифмічному масштабі будують графік залежності у / (1 - у) від обсягу
комплементу. При 50% гемолізі у / (1 - у) = 1. Графічно знаходять обсяг
комплементу (К), що викликає 50% гемоліз, що відповідає 1 гемолітичної
одиниці chso Кількість СН5о в 1 мл (М) розраховують за формулою:

М = 0.2 n: К,
де: n - величина, зворотна розведення комплементу; 0.2 - коеф. корекції, тому що у використовуваному варіанті об'єм реакційної суміші в 5 разів менше (1.5 мл), ніж в оригінальному по Мейсру (7.5 мл). Гемолітична активність комплементу коропа дорівнює 20.0 ± 9.1, радужнойфорелі - 28.0 ± 13.5, тіляпіі - 205.1 ± 76.6. (T.yano, 1992).
2.2.2.2. Визначення гемолітичної активності комплементу за
альтернативного шляху активації (по yano Т., 1992).
Для визначення активності комплементу по альтернативному шляху зазвичай
використовують еритроцити кролика, як активатор і тест-об'єкт. Реакцію ведуть у
присутності egta (хелатньш агент для Са2 ^ щоб блокувати класичний
шлях активації) і mg2 +.
Гемолітична активність коропа (на відміну від райдужної форелі, тіляпіі,
аю, Поргі, 'желтохвоста, людини, свині) зростає в кілька десятків разів
при додаванні в реакційну суміш 0.1 mm ca2 ^
- Принцип методу заснований на здатності комплементу активуватися
еритроцитами кролика і лизировать їх.
За одиницю активності комплементу (АСН5о) приймають таку кількість
нерозведеною сироватки, яке викликає 50% лізис 4х10 еритроцитів при
20 ° С в желатин-вероналовом буфері, що містить 10mМ egta і 10mm mg ^ в
обсязі 0.7 мл, рН і час інкубації різняться в залежності від виду риб
(Райдужна форель - рН 7.0, 1.5 години; короп - рН 7.5, 1.5 години).
- Обладнання і реактиви; обладнання див. п. 2.2.2.1.; Глюкоза;
дистилированная вода; Ма-5 ,5-діетілбарбітурат; mgcl2 +2; in hc1;
egta, желатин, naoh; еритроцити кролика; сироватка крові риб (джерело
комплементу).

- Приготування буферних розчинів:
- Всроналовий буфер, концентрат (5 vb), см.п, 2.2.2.1.
- 0,1 М egta - mg буфер,: egta - 38 r, mgc12 x 6 Н20 - 20,3 г, naoh - 7
r, дистилированная вода - 1л, доводять рН до 7,5 in naoh.
- 0,01 М egta - mg желатин-вероналовий буфер (egta-mg-gvb):
жедатін-0, 1 г, 5 vb-20 мл; 0,1 М egta-mg-10 мл; дистилированная вода до 100
мл, доводять рН до 7,5 (для коропа), до 7,0 (для райдужної форелі). Зберігають при +4 ° С
протягом 1 тижня.
- Приготування суспензії еритроцитів кролика. Еритроцити кролика в
розчині Олсвера (1:1) відмивають тричі на egta-mg-gvb і готують суспензію з
концентрацією 2х108 кл / мл в цьому ж буфері. Концентрацію еритроцитів
контролюють, вимірюючи odw лу клітин (до 0,1 мл суспензії
еритроцитів додають 3,4 мл дистильованої води і вимірюють od4i4 лізата;
якщо отримана величина od4i4 відрізняється від 0,740, то суспензію еритроцитів
необхідно розвести або сконцентрувати у стільки разів у скільки отримане
00414 відрізняється від 0,740).
-Отримання та умови зберігання комплементу см.п.2.2.2.1.
-Техніка постановки реакції і розрахунок активності комплементу. Всі
компоненти реакції змішують при 0 ° С (лід з водою). Випробуваний комплемент
розводять в egta-mg-gvb в залежності від виду риб і передбачуваної
активності (для коропа 1 / 15 - 1 / 20, райдужної форелі 1 / 100 -1/170).
Беруть ряд з 8 пробірок. У 5 пробірок вносять різні-обсяги розведеного
комплементу (0,1; 0,125; 0,160; 0,20; 0,25 мл), доводять загальний обсяг до 0,25 мл
egta-mg-gvb і додають у кожну пробірку по 0,1 мл суспензії еритроцитів.
Три пробірки використовують для контролів: 1-контроль еритроцитів на спонтанний
лізис (0,25 мл egta-mg-gvb + 0,1 мл суспензії еритроцитів); 2 - 100% лізис
(0,1 мл суспензії еритроцитів + ​​3,4 мл дистильованої води); 3 - контроль
комплементу (0,25 мл розведеного комплементу + 0,1 мл egta-mg-gvb).
Пробірки інкубують 90 хв при 20 ° С (для коропа, райдужної форелі),
періодично струшують.
У кожну пробірку (крім 2-го контролю) додають по 3,15 мл egta-mg-
gvb і центрифугують 5 хв. при 1600g. Вимірюють od4i4. Обчислюють ступінь
гемолізу (у) з урахуванням поправок на контроль еритроцитів і комплементу
(См.п.2.2.2.1.). У логарифмічному масштабі будують графік залежності у/1-у від
обсягу комплементу. При 50% гемолізі у / (1-у) = 1. Графічно знаходять обсяг
комплементу (К), що викликає 50%-ньш гсмоліз, що відповідає одній
гемолітичної одиниці АСН5і.
Кількість АСН5о в 1 мл (М) розраховують за формулою:
М = 0,5 n: К,
де: n-величина зворотна розведення комплементу, 0,5 - коеф. корекції, тому що в
використовуваному варіанті об'єм реакційної суміші в 2 рази менше, ніж у
оригінальному. За даними yano Т., 1992, гемолітична активність комплементу
коропа дорівнює 58,9 j: 13,5, райдужної форелі - 345 + _ 108, тідяпіі-574 j: 250, барана
- 15,4, морської свинки - 11,9, собаки -14,4, людини -18,4.
2.2.3. Визначення активності іптерферона спектрофотометрії-ного
методом (t.renault et al. 1991, з доповненням)
Розроблено кілька методів визначення активності интерфе-рона,
заснованих на його здатності інгібувати ЦПД вірусу в культурі клітин,
знижувати число бляшок в ній, придушувати титр вірусу і синтез РНК. Титром
інтерферону вважають найбільше розведення випробуваного матеріалу,
зменшує на 50% показник активності вірусу в контролі. При
дослідженні великої кількості зразків часто використовують мікрометод
титрування інтерферону в культурі клітин. При цьому дуже важливо вибрати
відповідну систему "культура клітин - вірус". Вірус повинен мати
високу чутливість до інтерферону і викликати в культурі клітин чіткі
зміни, що призводять до руйнування моношару. Використовують культуру клітин
гомологичную інтерферону і високо чутливу до його захисній дії.
Для титрування інтерферону лососевих риб найбільш поширеною є
система: rtg-2-ipnv; ддя коропа - ЕРС-svcv. Як джерело інтерферону
використовують сироватки риб, у випадку дослідження мальків - го-могенат тушок
риб.
2.2.3.1. Принцип методу. Спектрофотометричний мікрометод титрування
інтерферону заснований на відмінності оптичної щільності ін-тактного клітинного
моношару і монослоя з ознаками ЦПД після фарбування відповідними
барвниками. За одиницю активності інтерферону приймають таке розведення
зразка, яке захищає 50% клітинного моношару, тобто оптична
щільність клітинного моношару, обробленого цим розведенням, дорівнює 50%
оптичної щільності контрольного неінфікованого монослоя.
2.2.3.2. Обладнання і реактиви: фотометр для роботи з 96-ямковим
мікропанелямі (рідер); дозуючі мікропіпетки (1 - і 8-канальні на 0,2 мл);
96-ямковий культуральні мікропанелі; СС> 2 - інкубатор або термостат з
ексикаторі і зі свічкою; інвертований мікроскоп; стерильна фільтрувальний папір; вірус; культура клітин; ростова і підтримуюча
середовища, необхідні для обраної культури клітин (ростова середовище містить
10% сироватки, підтримуюча - 2%); 1%-ний розчин крісталлвіолет в 20%
етанояе.
2.2.3.3. Підготовка зразків інтерферону до дослідження. Сироватки
отримують загальноприйнятим способом. Гомогенат готують на підтримуючої середовищі
у співвідношенні 1:4. Центрифугують 15 хв при 3500g і збирають супернатант.
Сироватки або супернатант звільняють від вірусу (якщо його використовували в
як індуктора інтерферону) одним із "способів: прогріванням (час і
температура залежать від використаного вірусу; vhsv - 30 хв при 45 ° С);
ультрацентрифугирование - 4 години при looooog; низьким рН (додають НС1
до рН 2,0, витримують 24-48 годин при +4 ° С, відновлюють рН до 7.0 добав-
ленням naoh).
Якщо в якості індуктора використовували дсРНК або інші препарати (але не
віруси), ця процедура виключається. Містять интерфе-рон зразки можна
зберігати при -20 ° С і нижче.
2.2.3.4. Підготовка робочої дози вірусу. Вірус накопичують у найбільш
чутливої ​​культурі клітин і титрують методом серійних 10-кратних
розведенні. Готують віруссодержащую суспензію в підтримуючої середовищі з
титром 4х103 БОЕ/0.2 мл для системи rtg-2 - ipnv і 100 ТЦД5о / 0,2 мл для
системи epc-svcv.
2.2.3.5. Підготовка суспензії клітин. Суспензію клітин готують в ростовий
середовищі з такою концентрацією клітин, щоб через добу утворився моношар
(Rtg-2 - 95х103 клітин / О. 1 мл; ЕРС - 80-85х103 клітин / О. 1 мл).
2.2.3.6. Техніка титрування інгерферона. Восьмиканальний мікропіпеткою
готують 2-кратні розведення зразків інтерферону на ростової середовищі в 96 -
ямкової мікропанелі (для кожного розведення використовують 3-4 лунки) по 0,1
мл / лунка. Щоб виключити неспецифічне і токсичну дію зразків,
титрування починають з розведення 1:8, а кількість розведенні залежить від
передбачуваного титру інтерферону. Зазвичай достатньо кінцевого розведення
1:1024.
В якості контролів використовують: 1 - контроль клітин (в 3-4 лунки вносять по
0.1 мл ростової середовища), 2 - контроль на токсичність зразка (в 3-4 лунки вносять
по 0.1 мл зразка, розведеного 1:8), 3 - контроль робочої дози вірусу (в 6-8
лунок вносять по 0.1 мл ростової середовища).
У всі лунки (дослідні і контрольні) вносять по 0,1 мл суспензії клітин.
Мікропанелі закривають кришкою і розміщують у СОГ-інкубатор при температурі,
оптимальною для росту культури клітин (20 ° С для rtg-2, 25 ° С для ЕРС). При
відсутності СО; - інкубатора можна використовувати ексикатор, в який поміщають
мікропанелі, запалюють свічку, закривають кришку і ставлять в термостат з
зазначеної температурою. Для герметизації краю кришки ексикатора обмазують
вазеліном. Через 18-20 год інкубації мікропанслі відкривають, перевертають і
акуратно струшують, щоб видалити середу. Краї панелі промокають стерильною
фільтрувальним папером. У всі піддослідні лунки і лунки контролю робочої дози вірусу вносять по 0.2 мл робочої дози вірусу. У лунки контролів 1 і 2 вносять по 0,2 мл
підтримуючого середовища. Мікропанелі закривають і вміщують у СВ-г - інкубатор при температурі, оптимальної для репродукції вірусу. Інкубують до розвитку ЦПД на 100% у лунках з контролем робочої дози вірусу.
2.2.3.7. Облік результатів та розрахунок активності інтерферону.
Середу з мікропанслсй видаляють струшуванням, клітини фарбують у
протягом 10 хв 1%-нь1м розчином крісталлвіолет в 20%-ном етанолі.
Барвник видаляють, а клітини промивають 3 рази водою і висушують.
Барвник елюіруют 70%-ним етанолом (0.1 мл / лунку) і визначають od595.
Можна визначати оптичну щільність клітин без елюіро-вання, відразу після
висушування. Розраховують середнє значення od595, для лунок з контрольними
клітинами (odmax), з робочою дозою вірусу, тобто при 100% ураженні монослоя
(Odmin), а також середнє значення od595 для кожного розведення інтерферону.
Оптичну щільність зразків при 50% захист клітин визначають за
формулою:
od5o = (odmax - odmin): 2
Кількість одиниць активності інтерферону в 1 мл зразка (АіФ) розраховують за формулою:
АіФ = 1/vtn + [(Т n +1 - tn) x (odn - odmin - od5o): (odn - odn +1 v - об'єм зразка, 0.1 мл;
t, i-величина, зворотна розведення зразка, що дає більше 50% захисту
клітин від інфекції; Т пн - величина, зворотна розведення зразка, що дає менше 50% захисту клітин; odn - оптична щільність зразка, що захищає більше 50% клітин; od, n +1 - оптична щільність зразка, що захищає менше 50% клітин.
При відсутності фотометра частку неуражених клітин в кожній лунці (у
відсотках) визначають приблизно, досліджуючи мікропанель під
інвертованим мікроскопом. Активність інтерферону розраховують по цій
ж формулою, підставляв замість величини оптичної щільності частку
неуражених клітин (у відсотках). Специфічна імунна система
Специфічна імунна система складається з клітинних і гуморальних
компонентів. Від неспецифічних факторів вони відрізняються специфічністю
взаємодії з чужорідними агентами. Специфічність імунних реакції
визначається лімфоцитами і іммуноглобулі-нами.
Стан специфічного ланки імунної системи риб важливо знати при
оцінці імунного статусу, визначенні потенційних можливостей організму
риб протистояти дії агресивних факторів середовища та встановленні
характеру впливу іммуномоду бенкетуючих до вакцинних коштів. Воно оцінюється
за даними аналізу клітинних і гуморальних факторів імунітету.
3.1. Клітинні фактори
Основну роль у формуванні специфічного клітинного імунного
відповіді риб на чужорідні агенти грають лімфоцити.
3.1.1. Лімфоцити
3.1.1.1. Метод визначення абсолютного і відносного вмісту
лімфоцитів заснований на встановленні відносного числа лімфоцитів у
відсотках за лейкоцитарній формулі та проведенні розрахунку вмісту клітин,
припадають на частку лімфоцитів із загальної кількості лейкоцитів,
виявлених в 1 мл крові при прямому підрахунку.
3.1.1.2. Визначення Т-і В-лімфоцитів.
Існують різноманітні способи визначення Т-і В-лімфоцитів у
організмі риб. Вони засновані на обліку характеру реагування лімфоцитів з
маркерами або зі специфічними антисироватки проти окремих
клітинних популяцій. В якості маркерів використовують еритроцити барана,
мишей, зімозан, Т і В-залежні мітоген-ни (конкавалін А, фітогсмагглютінін,
ліпополісахариди, пташиний туберкулін) і т.д. Для оцінки якісного складу і
кількості окремих типів клітин застосовуються методи розеткоутворення або
реакція бластрансформаціі.
Визначення вмісту Т-лімфоцитів методом Е-
розеткоутворення.
Принцип методу. Т-лімфоцити в організмі хребетних, в т.ч. риб,
виконують різноманітні функції, пов'язані з розпізнаванням "свого" і
"Чужого" і підтриманням генетичного сталості внутрішнього середовища. Даний
показник використовується при оцінці стану Т-клітинного імунітету. Т-
лімфоцити несуть на своїй поверхні рецептори для еритроцитів барана (ЕБ).
Завдяки наявності таких рсцепторов Т-лімфоцити здатні вступати в реакцію
з еритроцитами барана і утворювати так звані розетки. Підрахувавши
кількість Е-розеткообразующіх клітин, судять про кількісний вміст
(Відносному і абсолютному) Т-лімфоцитів в досліджуваному зразку.
Обладнання, реагенти і реактиви: 0,5%-ва суспензія еритроцитів
барана; розчин Олсвера; фосфатний буфер (рН-7, 4); розчин ХСН-КСА (або середовище
199); 3%-ний розчин глутарового альдегіду; метиловий зелений; піронін;
хлороформ; лімфоцити; фікол-верографина (щільністю -1,007 г / мл);
силіконізовані або пластикові пробірки; центрифуга настільна;
піпетки, пробірки центрифужні; гспарін; кров риб; мікроскоп; камера
Горяєва.
Матеріали для дослідження, хід визначення та врахування результатів.
З крові риб виділяють лімфоцити шляхом центрифугування в градієнті
фікол-верографина. У силіконізований пробірку, змочену розчином
гепарину (або цитрату натрію), набирають 1 -2 мл крові риб, розводять 1:1
розчином Хснкса; на дно сухої пробірки акуратно наливають 1,5-2 мл градієнта
щільності; нахиливши пробірку під кутом 45 °; пробірки цснтрі4) угіруют при i500
об / хв протягом 40 хвилин; після центрифугування піпеткою збирають кільце
лімфоцитів, що знаходиться між шарами плазми і градієнтом щільності; клітини
двічі відмивають розчином Хенкса при 1500 об / хв протягом 10 хвилин; під-
зчитують концентрацію лімфоцитів в камері Горяєва і доводять розчином
Хенкса (або середовищем 199) до 2 млн. кл / мл. - Тричі відмиті еритроцити барана
розводять середовищем 199 до 0,5% концентрації. У силіконізований пробірку
об'ємом 1-2 мл вносять 0,1 мл 0,5% розчину еритроцитів барана, до еритроцитів
барана додають 0,1 мл суспензії лімфоцитів (2 млн. кл / мл), суміш інкубують
5 хв при 26 ° С, після інкубації суміш центрифугують протягом 5 хв при 750
об / хв і інкубують при 26 ° С протягом 1 години. Після закінчення інкубації клітини
фіксують глутаровий альдегідом (0,05 мл 3% розчину) і після отми-вання від
глутарового альдегіду роблять мазки. Мазки фіксують в метанолі. фарбують метил-
Грюн-піроніном по Брашс і мікроскопіруют. Число Н-розеткообразующіх
клітин у відсотках обчислюють у результаті підрахунку 200-300 лімфоцитів в
препараті. За розеткообразуюшую клітину (РОК) приймають лімфоцит,
приєднав нс менш 3 еритроцитів барана. Абсолютні цифри Е-
розеткообразующіх клітин в 1 мкл виводять на підставі кількості лімфоцитів
в 1 мкл крові. Лімфоцити можна виділити з суспензії клітин селезінки,
лімфоїдної тканини про-і мезонефроса і тимуса.
• Визначення Т-, В-, Д-І 0-лімфоцитів (за Мендес, 1973).
Принцип методу. При змішуванні лімфоїдних клітин риб з еритроцитами
барана (ЕБ), частинками зімозана, сенсибілізованими макроглобуліновимі
антитілами з комплементом, відбувається їхня виборча адсорбція
лімфоїдними клітинами: на Т-лімфоцитах адсорбуються еритроцити барана, на
В-лімфоцитах - частки зімозана, на Д-лімфоцитах - частки зімозана і
еритроцити барана; 0-лімфоцити залишаються вільними від еритроцитів і
частинок зімозана. Даний метод застосовується для ідентифікації
популяційної структури лімфоцитів.
Компоненти, матеріали та обладнання. ЛФ - суспензія лім-({юцітов риб,
концентрацією 2 млн. клітин / мл, в середовищі 199 (або Хснкса). Спосіб отримання ЛФ
(Див. вище). ЕБ - 0,5%-ва суспензія еритроцитів барана - індикатори для Т-
лімфоцитів; частки зімозана кон'юговані-ньге з комплементом (індикатори
для В-лімфоцитів). Розріджувачі: фіз-розчин, середа 199. Матеріали та
обладнання: гепарин, хлористий амоній, 0,2%-ний розчин трипанової сині,
глутаральдсгід, що розділяє розчин з густиною 1,077 г / мл,
сіліконізірованнис цснтріфужние та інші пробірки, піпетки, лічильні камери
Горяєва або Бюркера, холодильник, фазовоконтрастний мікроскоп.
Техніка постановки реакції. У силіконізований пробірку доливають
по 0,1 мл суспензії лімфоцитів, 0,5%-ної суспензії еритроцитів барана і частинки
зімозана з комплементом. Суміш клітин інкубують 5 хв при 26 ° С,
центрифугують 5 хв при 800-1000 об / хв і знову інкубують при 12 ° С - 60
хв. Осад обережно ресуспендіруют, наносять краплю суспензії клітин на
предметне скло, накривають покривним склом і мікроскопіруют. З краплі
суспензії можна готувати мазки на предметних стеклах і пофарбувати їх але
Романовським-Гімза.
Облік і оцінка результатів реакції здійснюються одночасно і
паралельно у світловому та фазово-контрастному мікроскопах. Переглядають 200
лімфоцитів і визначають відсоток РОК. Т-лімфоцит утворює розетку з 3 і
більше ЕБ, В-лімфоцит - з 3 і більше частинок зімозана;
Д-лімфоцит утворює змішану розетку - 2 ЕБ + 2 і більше частинок зімозана; 0 -
лімфоцит розеток не утворює.
3.2. Гуморальні фактори
3.2.1. Імуноглобуліни. Вони є основою біохімічної
специфічного гуморального імунітету, виконують функцію специфічних
антитіл до конкретних антигенів, синтезуються плазматичними клітинами (В-
лімфоцитами) і секретуються в кров або тканинні рідини. Основна їх
частина відноситься до гамма - глобулінової фракції сироватки крові.
Методи визначення вмісту в організмі риб іммуноглобулі-нів
засновані на оцінці вмісту гамма-глобулінів у сироватці крові або інших
біологічних рідинах. Простими і доступними прийомами дослідження
гамма-глобулінів у сироватці крові й інших рідинах є методи
електрофорезу, хроматографії на Анио-нообменніках, осадження насиченими
розчинами фосфатів або сульфатів. Існують також імунологічні
методи визначення вмісту гамма-глобулінів у риб за допомогою
антисироваток.
Визначення імуноглобулінів у сироватці крові риб по гамма-
глобуліну методом осадження.
Принцип методу. При взаємодії з насиченими розчинами
фосфатів, певної концентрації гама - глобуліни осаджуються. змінюючи
тим самим оптичну щільність досліджуваного зразка. Визначення
проводиться паралельно з іншими фракціями сироватки крові (альбумінами,
альфа і бета-глобулінами), по зміні оптичної густини (ОГ) на ФЕКе.
Обладнання та реактиви. ФЕК, хімічні пробірки, піпетки на!. 2, 5, 10
мл, бюретка на 100 мл, мірні колби на 100 і 500 мл, холодильник, сироватка
крові, фосфатні розчини (основний і робочий), штативи для пробірок.
Матеріал для дослідження, хід визначення та врахування результатів. Спочатку
готують основний фосфатний розчин: 335 г гідроокису натрію розчиняють в 400
мл дистильованої води, додають 226,8 г фосфорнокислого калію
однозамещснното. Після розчинення охолоджують до кімнатної температури і
додають дистильовану воду до об'єму 500 мл, потім готують робочі
фосфатні розчини для осадження кожній (фракції білків. Беруть 4 мірних
колби на 100 мл, які нумерують відповідно n 1, 2, 3 і 4. У кожну колбу
вносять суворо певну кількість основного фос4) атного розчину: 92,4 мл -
n 1, 74,9 мл - n 2. 58,8 мл - n 3, 48,7 мл - n 4 і до мітки 100 мл доливають
дистильовану воду. Після цього робочі розчини в колбах ретельно розмі-
жують шляхом струшування (при зберіганні додають i краплю хлороформу на 100
мл розчину). Після приготування (фосфатних розчинів приступають до
визначення білкових фракцій у досліджуваних зразках. На кожну пробу
сироватки крові беруть 6 пробірок і нумерують: 0. 1, 2, 3, 4, 5. У пробірку під
цифрою 0 вносяться 10 мл дистильованої води, в пробірки під номерами 1, 2, 3
і 4 - по 5 мл відповідних цим цифрам робочих фосфатних розчинів. У
пробірку n5 вносять 0.5 мл досліджуваної сироватки крові, 0.75 мл
дистильованої води і 3.75 мл основного фосфатного розчину, пробірку
закривають пробкою і перемішують шляхом перевертання її 5-6 разів, після чого
з цієї пробірки переносять по 0.5 мл суміші в пробірки ni, 2, 3, 4 і 1 мл в
пробірку під номером 0 (контроль). Вміст пробірок ретельно і обережно перемішують, уникаючи утворення піни і бульбашок повітря і витримують 15 хв при кімнатній температурі. Після закінчення зазначеного терміну здійснюють вимірювання ОГГ розчинів в пробірках n 1, 2, 3, 4 проти контролю (n 0) на ФЕКС при червоному
світлофільтрі в кюветі з довгою оптичного шляху 1 см. Визначення оптичної щільності проводиться спочатку в пробірці n4, потім в пробірках n 3, 2 і 1.
Розрахунок результатів здійснюється за схемою: ВП пробірки n1 - ВП пробірки n2 = ВП альбумінів; ВП пробірки n2 - ВП пробірки n3 = ВП альфа-глобулінів;
ВП пробірки n3 - ВП пробірки n4 = ВП бета-глобулінів;
ВП пробірки n4 = ОПгамма-глобулінів.
Приймаючи суму ВП альбумінів і всіх глобуліновий 4> РАКЦ за 100%
(ВП пробірки n1), обчислюють частку змісту кожної фракції у відсотках.
Процентний вміст гама-глобулінів визначають за (формулою:
Відносний вміст гама-глобуліну,% = ОПкк х 1 ()(). де:
ЮП
ongg - гамма-глобуліну (ОП - пробірки n 4),? 0n - сума ВП всіх білкових
фракцій (ВП пробірки n 1), 100 - коефіцієнт переведення змісту гамма-
глобуліну в%. Знаючи концентрацію загального білка в одиниці об'єму можна
провести перерахунок в абсолютні величини. Помилка методу складає + 4%.
3.2.2. Антитіла
Антитіла представляють собою сироваткові білки, синтезовані В-
лімфоцитами при попаданні в організм антигену або чужорідних тіл і
вступають з ними у взаємодію. Головними властивостями антитіл є
специфічність і гетерогенність. Специфічність антитіл визначається
антигеном, що викликають їх синтез. Риби, як і вищі хребетні,
синтезують різноманітні за структурою і функції антитіла: аглютиніни,
преціпітіни, антитоксини, Комплементзв'язуючі і віруснейтралізующіе
антитіла, гемолізини, повні і неповні. Антитіла за походженням
поділяються на природні та індуковані (що утворюються після
парентерального і ентерального введення антигену). Вони є однією з
інформаційних структур імунної системи, що виконують функцію
імунологічної пам'яті про антигене. Завдяки високій специфічності
антитіла використовуються при визначенні природи антигенів, що викликають їх
синтез, напруженості активно набутого імунітету, характеру перебігу
процесу імуногенезу і характеру впливу сприятливих і несприятливих
факторів на імунну систему риб. Існують численні методи визначення вмісту антитіл в організмі риб: серологічні, іммуноелектрофоретіческіе, радіоімунного, імуноферментні, іммунодіффузнис, лазерні.
Найбільш простими і загальноприйнятими методами визначення антитіл в
організмі риб є: реакція аглютинації, реакція аглютинації датою кс-
антигену (або антитіл).