Вивчення питань біотехнології в курсі хімії середньої школи

Вивчення питань біотехнології в курсі хімії середньої школи

Введення
Актуальність дослідження: в даний час російське хімічна освіта зазнає глибоких змін. Зросла необхідність у нових методичних розробках, що відображають сучасний стан науки. Особливої уваги заслуговує інформація, що стосується інтеграційних тенденцій між різними галузями знання. Конкретизувати викладені положення дозволяє цілий спектр тем, які зачіпають різні напрями біологічних наук. Одне з перших місць займають нові напрямки біотехнології, перш за все генетична інженерія, яка призвела до «біотехнологічному буму», свідками якого ми є.
Таким чином, для орієнтації людини у новій інформаційної та матеріально-технічному середовищі проживання, формування реалістичного погляду на навколишній світ необхідна постановка нових завдань навчання. Подолання абстрактності і відірваності навчального матеріалу від життя, які тягнуть до втрати пізнавального інтересу, - пріоритетне завдання навчання. Наявність пізнавального інтересу є важливою умовою формування високої якості знань.
Іншою стороною абстрактності при вивченні біології є недооцінка її ролі у виникненні та вирішенні глобальних продовольчих, сировинних, екологічних проблем сьогодення і майбутнього. Кому як не біотехнології, що вийшла з надр хімії та біології, займатися цими проблемами. Сьогодні нам ясно, що відкриття біохімії глибоко позначаться на долі людства.
Враховуючи роз'єднаність і поверховість питань біотехнології майже у всіх запропонованих програмах (див. розділ 2) метою роботи є розробка елективного курсу на тему «основи біотехнології» а також комплексу фрагментів включення даного матеріалу в загальноприйняті біологічні програми.
Об'єкт дослідження: місце і процес застосування досліджуваної теми в структурі біологічної освіти.
Предметом дослідження є розробка методичних рекомендацій до вивчення теми «основи біотехнології».
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
1. Проаналізувати методичну літературу, обгрунтувати актуальність теми.
2. Проаналізувати літературу, що дає огляд основних питань біотехнології.
3. Підібрати матеріал до проведення уроків з даної теми і розробити методичні рекомендації щодо його використання.
4. Підібрати лабораторні роботи, які слід включити у вивчення даної теми.
5. Провести педагогічний експеримент.
Поставлені завдання вирішувалися з використанням методів, які відповідають об'єкту і предмету дослідження
Теоретичні
· Аналіз літератури за темою, систематизація теоретичного матеріалу
· Теоретико-методичний аналіз проблеми
Емпіричні
· Общепедагогические: спостереження і самоспостереження, бесіда
· Хімічні: лабораторний експеримент
Також була висунута гіпотеза: при включенні матеріалу біотехнологічного ухилу в навчальний процес припускаємо підвищення пізнавального інтересу та мотивації до навчання в учнів.

1. Основи біотехнології (літературний огляд)
1.1 Основи генетичної інженерії
Історія розвитку генетичної інженерії
Генетична інженерія - розділ молекулярної генетики, який досліджує можливості та способи створення лабораторним шляхом (in vitro) генетичних структур і спадково змінених організмів, тобто створення штучних генетичних програм, за допомогою яких направлено конструюються молекулярні генетичні системи поза організмом з наступним їх введенням в живий організм (О. О. Баєв). Зазвичай вживаються дві назви даного наукового напряму - генетична інженерія та генна інженерія, що є як би синонімами [7]. Проте їх смисловий зміст неоднаково: генетичну інженерію пов'язують з генетикою, а генна має відношення тільки до генів. Крім того, генетична інженерія точніше розкриває зміст дисципліни - створення генетичних програм, основне завдання яких - створення in vitro молекул ДНК за допомогою з'єднання фрагментів ДНК, які в природних умовах частіше не поєднуються завдяки міжвидові бар'єри (рекомбінантні ДНК). Молекула рекомбінантної ДНК є з'єднані в безклітинних системі два компоненти: вектор (дивись нижче), що забезпечує механізм реплікації та експресії, і фрагмент клонованої («чужорідної») ДНК, що містить цікаві для дослідника генетичні елементи. Відповідно до визначення національних інститутів здоров'я США, «рекомбінантними ДНК називають молекули ДНК, отримані поза живої клітини шляхом з'єднання природних або синтетичних фрагментів ДНК з молекулами, здатними реплицироваться в клітці». Перша рекомбінантна ДНК отримана в 1972 р. (П. Бергом з спів.) І була складена з фрагмента ДНК мавпячого вірусу ОВ40 і бактеріофага λ dvgal з галактозним опероном E. Coli. Формально 1972 слід вважати датою народження генетичної інженерії.
Генетична інженерія має яскраву історію завдяки тому суспільному резонансу, який вона викликала з самих перших своїх кроків. Початок цим подіям поклало послання учасників Гордоновской конференції (1973) президії АН США, в якому йшлося про можливу небезпеку технологій рекомбінантних ДНК для здоров'я людини. Можливі блага генетичної інженерії визнавалися з самого початку, але розбіжності з даної проблеми не затихли і зараз. У таблиці 1 перераховані основні етапи становлення та розвитку генетичної інженерії.
Таблиця 1. Основні етапи розвитку генетичної інженерії

Рік	Автор	Зміст відкриття
1869	Ф. Мішер	Виділена ДНК з ядер клітин гною
1880	А. Коссель [5]	Виділення азотистих основ
1928	Гріффітс [3]	Явище бактеріальної трансформації
1929	П. Левін, Е. Лондон	Виділення 2-D-дезоксирибози
1930	Евері, Мак-Карті і Мак-Леод	Виділення речовини гена
1938	Беренс	Локалізація н.к.
1940	Браун і Тодд	Принципи хімічної будови полинуклеотидной ланцюга.
1950	Е. Чаргафф	Закономірності нуклеотидних відносин
1953	Д. Уотсон, Ф. Крик	Сконструйована модель подвійної спіралі ДНК на підставі результатів рентгеноструктурного аналізу ДНК
1956	Волкін, Астрахан і Херші	Відкриття і-РНК
1957	А. Корнберг	Синтез ДНК in vitro
1961	А. Мармур і П. Доті	Відкрито явище ренатурації ДНК і встановлені точність і специфічність реакції гібридизації нуклеїнових кислот
1962	В. Арбер	Вперше отримані відомості про ферменти рестрикції ДНК
1968	М. Мезельсон та Є. Юань	Виділена перший рестріктаза
1966	М. Ніренберг, С. Очоа, Г. Корану	Розшифровано генетичний код
1967	М. Геллерт	Відкрито ДНК-лігаза
1970	Г. Темін, С. Мізутані	Відкрито ревертаза
1972-1973	Г. Бойєр, С. Коен, П. Берг	Розроблено технологію клонування ДНК
1975-1977	Ф. Сенгер, Р. Баррел, А. Максам, В. Гілберт	Розроблено методи швидкого визначення нуклеотидної послідовності
1979	Г. Корану	Синтезовано ген тірзіновой супресорної РНК
1981-1982	Р. Пальмітер, Р. Брінстер, А. Спредлінг, Г. Рубін	Отримано трансгенна миша. Отримано трансгенні екземпляри дрозофіли
1993	Л.К. Ернст, Г. Брем, І.В. Прокоф'єв	Отримано трансгенні вівці з геном химозина

Біотехнологія рекомбінантних ДНК
Технологія рекомбінантних ДНК включає набір, як нових методів, так і запозичених з інших дисциплін, зокрема з генетики мікроорганізмів. Ці методи істотно розширюють можливості генетичних досліджень. До найбільш важливим методам біотехнології рекомбінантних ДНК слід віднести наступні:
1. Специфічне розщеплення ДНК рестрікцірующімі нуклеазами, що в значній мірі прискорює виділення різних генів і маніпуляції з ними.
2. Швидке секвенування всіх нуклеотидів в очищеному фрагменті ДНК, що дозволяє визначити точні межі гена і кодованих їм амінокислотну послідовність поліпептиду.
3. Гібридизація нуклеїнових кислот, що дозволяє з великою точністю виявити специфічні нуклеотидні послідовності на основі їх здатності зв'язувати комплементарні підстави.
4. Клонування ДНК, суть якого зводиться до введення ДНК-фрагмента в самореплицирующихся генетичний апарат (плазміди або вірус), який використовують для трансформації бактерій. Бактеріальна клітина після трансформації здатна відтворювати цей фрагмент в багатьох мільйонах ідентичних копій.
5. Генетична інженерія, що дозволяє отримувати модифіковані версії генів (сайт-спецефічні мутагенез і т.д.) і потім впроваджувати їх в клітини або організми.
Розщеплення ДНК у специфічних ділянках нуклеотидних послідовностей здійснюється особливими ферментами - рестрікцірующімі нуклеазами, здатними зруйнувати чужорідну ДНК. Кожен фермент, здатний зруйнувати чужорідну ДНК, пізнає в ній специфічну послідовність з 4-6 нуклеотидів (сайт впізнавання). Відповідні послідовності в геномі бактерій замасковані метилюванням залишків за допомогою метилаза.
Для успішного вирішення завдань генетичної інженерії дуже важливо швидко секвенувати (визначати послідовність нуклеотидів) будь-яких очищених фрагментів ДНК [8]. У середині 70-х р. у цій області відбувся рішучий перелом, пов'язаний з відкриттям рестриктаз і удосконаленням методу гель-електрофорезу, коли стало можливим розділяти досить протяжні фрагменти ДНК, що відрізняються розміром всього на один нуклеотид. За допомогою рестриктаз ДНК стали розрізати на певні блоки і визначати в них позиції нуклеотидів хімічними (А. Максам і У. Гілберт 1976) або ензиматичними (Сангер і Коулсон 1975) методами.
Найважливіший метод одержання рекомбінантних ДНК заснований на здатності нуклеїнових кислот швидко відновлювати свою структуру після нагрівання до 100 º С у сильно лужному середовищі (рН 13) [9]. При нагріванні до 100 º С комплементарні пари основ руйнуються, і ДНК дисоціює на два окремих ланцюги. Цей процес називається денатурацією ДНК («плавленням»). Витримка комплементарних ланцюгів при температурі 65 º С призводить до їх спаровування і відновлення структури подвійної спіралі (гібридизація, ренатурацією, або «отжиг»).
Обмін генами, а також введення в клітину гена іншого виду організму здійснюють за допомогою генетичної рекомбінації in vitro.
Для ефективного введення (трансформації) необхідно мати достатню кількість копій нуклеотидних послідовностей.
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це метод ампліфікації фрагментів нуклеїнових кислот in vitro, за допомогою якого можна досить швидко (протягом декількох годин) отримати мільйони копій певних нуклеотидних послідовностей (генів) [9]. Метод був запропонований в 1985 р. К. Мюллісом (біотехнологічна корпорація «Cetus», США) і отримав широке поширення в 1988 р., коли Р. Сайки з співавт. була опублікована основна робота з теорії ПЛР та її оптимізації. Метод ПЛР, названий «винаходом століття» і дуже скоро, в 1993 р., зазначений Нобелівською премією, прискорив реалізацію програми «Геном людини», а також сприяв впровадженню у практику клінічної діагностики багатьох захворювань високоефективних діагностичних наборів нового покоління.
У методі ПЛР для ампліфікації фрагментів ДНК використовують термостійкий ДНК-полімеразу з термофільною бактерії Thermus aquaticus (Taq-полімеразу), яка в присутності всіх 4 видів дезоксирибонуклеозидтрифосфатов і коротких 20-30-членних запалів (праймерів) здійснює синтез комплементарних послідовностей ДНК. ПЛР має циклічний, що включають нагрівання і охолоджування проб, і ланцюговий характер, так як синтезовані фрагменти ДНК надалі самі служать матрицею, на якій йде синтез. Повторюючи цикли ампліфікації 30-40 разів, за 1,5 - 3 год отримують мільйони копій фрагментів ДНК.
Лігазну ланцюгова реакція проводиться за принципом, аналогічним ПЛР, але замість Taq-полімерази і dNTP використовується термостабільна ДНК-лігаза і 4 специфічних олігонуклеотиду, що додаються в реакційну суміш у надлишку. Кожні 2 олігонуклеотиду комплементарні до ампліфікується фрагменту ДНК-матриці і безпосередньо примикають один до одного; одночасно вони комплементарні і іншій парі олігонуклеотидів.
NASBA-метод (Nucleic Acid Sequence - Base Amplification), розроблений в останні роки, є найбільш універсальним методом ампліфікації як ДНК, так і РНК. Цей метод, на відміну від ПЛР, є ізотермальним і здійснюється при 41 º С. Основними компонентами NASBA-системи є РНК-полімераза фага Т7, РНКаза Н (гідролізує РНК у складі гібриду РНК: ДНК, але не атакує вільну ДНК) і зворотна транскриптаза вірусу пташиного міелобластоза. У систему входять також нуклеозидтрифосфат і два специфічних праймера, один з яких містить ділянку, що представляє собою послідовність (промотор), розпізнавану РНК-полімеразою.
Один з важливих етапів конструювання молекули ДНК - лігування (або зшивання) генів за допомогою ферменту ДНК - лігази. Зшивання фрагментів ДНК, які містять потрібні гени, здійснюють двома основними методами: а) за «липким» кінцях; б) за допомогою штучно добудованих «липких» кінців.
Зшивання генів (фрагментів) (рис. 1) ДНК по «липким» кінців, тобто взаімнокомплементарним ділянкам, завдовжки з 4-6 пар нуклеотидів, досить легко здійснюється ферментом ДНК-лігази з утворенням ковалентного фосфодіефірних зв'язку між сусідніми нуклеотидами:
- - А Т Г Ц А А Т Т Ц А Г Т Ц - - - - - -
Т А Ц Г Т Т А А Г Т Ц А Г - - - - - -

Зшивання ДНК-лігаза
А Т Г Ц А А Т Т - Ц А Г Т Ц
Т А Ц Г - Т Т А А - Г Т Ц А Г
Рис. 1. Зшивання генів

При відсутності комплементарних «липких» решт у зшиваються фрагментів їх добудовують, тобто синтезують штучно ферментативним шляхом (коннекторний метод отримання гібридних молекул ДНК), використовуючи кінцеву (термінальну) дезоксинуклеотидилтрансферазу з тимусу теляти або полі (А) - полімеразу E.coli.
Також, для стикування фрагментів застосовують так звані лінкера (рис. 2) (або «перехідники») - короткі ділянки ДНК, що мають різні «липкі» кінці:
- А Т Г Ц А А Т Т Ц Т Г А Г А Т Ц Ц А Т А Ц Г
Т А Ц Г Т Т А А Г А Ц Т Ц Т А Г Г Т А Т Г Ц
Фрагмент 1 Лінкер Фрагмент 2
Рис. 2. Об'єднання фрагментів лінкерами

IV. Отримання антибіотиків
Згадайте, що таке антибіотики? Думаю, важливість отримання сполук даної групи немає необхідності доводити.
У 1940 році було відомо всього 6 антибіотиків, а в даний час описано понад 12 000 сполук, з яких у клініці використовується близько 200 (решта токсичні).
Біосинтез антибіотиків здійснюється:
1) додаванням в живильне середовище відповідного попередника (фенілоцтової кислота стимулює біосинтез пеніциліну);
2) використанням блокованих мутантів, у яких відсутній певна ланка в ланцюзі реакцій, що ведуть до синтезу антибіотика. Отже, можна отримати аналоги антибіотиків і модифікувати їх хімічно (бензилпеніцилін, ампіцилін).
4. Висновок
Поки людина лише наближається до моделювання природних біохімічних процесів, а поки вишукує нові шляхи використання існуючих.
УРОК № 6 по темі «Застосування ферментів»
Завдання:
1. Освітня: знайомство з іммобілізованими ферментами. Промислове застосування іммобілізованих ферментів.
2. Розвиваюча: а) розвиток пізнавального інтересу;
б) формування логічного мислення в ході знайомства з методами іммобілізації ферментів;
в) формування умінь і навичок розумового і практичного праці.
3. Виховна: а) з метою формування діалектичного світогляду показати використання каталізаторів білкової природи;
б) виховання мотивації до навчання при акцентуванні на сучасності та важливості даної методики роботи з ферментними препаратами.
Хід уроку:
1. Організація класу
Якими способами можна отримати білкові амінокислоти? Спробуйте написати реакцію гідролізу білка в загальному вигляді.
2. Актуалізація знань
Всім добре відомо, що в морській воді багато розчиненого кисню, але, тим не менш, його використання ускладнене, і при зануренні доводиться використовувати додаткові джерела кисню. А що, якщо гемоглобін, виділений із крові, використовувати в якості посередника між морською водою і газовим середовищем дихального апарату?! Більше того, модель «гемогубкі» вже запропонована і, можливо, в найближчому майбутньому будуть сконструйовані ефективні штучні зябра. Сьогодні на уроці ми спробуємо розібратися, яким чином можна «направити в потрібне русло» той чи інший фермент.
3. Вивчення нового матеріалу
Ферменти зберігають свої унікальні властивості (які?) І поза клітинами, тому їх традиційно широко застосовують у практиці.
Застосування ферментів

Фермент	Хіміко-біологічний процес	Область застосування
Амілази	Гідроліз крохмалю до мальтози і глюкози	Спиртова промисловість, хлібопечення, отримання глюкози
Глюкоізомераза	Глюкоза фруктоза	Кондитерська промисловість
Ліпази	Гідроліз жирів і масел	Харчова та медична промисловість
Пептідогідролази	Гідроліз білка	Отримання амінокислот, виробництво сиру, вироблення шкіри, медицина
Целюлази	Гідроліз целюлози до глюкози	Виробництво етанолу, глюкозо-фруктозного сиропів
Сахарази	Гідроліз сахарози	Сіропопроізводство

Але якщо змішати фермент з реагентами, то після закінчення реакції його буде дуже важко відокремити від продуктів. Ще в 1916 році Дж. Нельсон і Є. Гріффін показали, що сахарази, сорбированная на вугіллі, зберігала свою каталітичну активність, а вугілля можна відокремити від розчину продуктів без особливих труднощів, і, отже, фермент можна застосовувати багато разів.
В даний час (з 1971 року) застосовується термін «іммобілізація» - повне або часткове обмеження руху білкових молекул. Іммобілізованими ферментами називають ферменти, штучно пов'язані з нерозчинним носієм, але зберігають свої каталітичні властивості (під запис). Іммобілізований ферментний препарат включає в себе безпосередньо фермент і носій (природні полімери - целюлоза, хітин, желатин; синтетичні - полістирол, полівініловий спирт; неорганічні - кераміка, силікагель, графіт).
Методи іммобілізації ферментів

фізичні хімічні

(Ковалентное зв'язування з носієм)
· Міцне і необоротне зв'язування
адсорбція включення в гель
(Активоване (фермент вводять в
вугілля, глини) розчин мономера
і полімеризують,
або відразу в розчин
полімеру)
· Неруйнівна зв'язування і при зміні
умов - деградація ферментного препарату
Приклади хімічної іммобілізації:
1) утворення амідній зв'язку:
H - C (O) Cl + H ₂ N - Ф = H - C (O) NH Ф + HCl
2) утворення дисульфідного містка:
H - SH + 0,5 O ₂ + HS - Ф = H - S - S - Ф + Н ₂ О
3) утворення основ Шиффа:
H - C (O) H + H ₂ N - Ф = H - CH = N - Ф + Н ₂ О
Промислове застосування іммобілізованих ферментів:
1. Іммобілізована сахарази працює до 10 років, при цьому активність ферменту втрачається незначно:
З ₁₂ Н ₂₂ Про ₁₁ + Н ₂ О = С ₆ Н ₁₂ О ₆ + З ₆ Н ₁₂ О ₆
глюкоза фруктоза

інвертний цукор
2. Глюкоізомераза перетворює глюкозу на фруктозу і таким чином отримують глюкозо-фруктозний сироп (50 х 50).
3. Здійснено промисловий синтез амінокислот з їх аналогів на іммобілізованих ферментах:

Ноосі - СН = СН - СООNH ₄ HOOC - CH ₂ - CH (NH ₂₎ - COOH
фумарат амонію аспарагінова кислота

HOOC - CH ₂ - CH (NH ₂₎ - COOH H ₃ C - CH (NH ₂₎ - COOH + CO ₂
аспарагінова кислота аланін
4. Яблучну кислоту - замінник лимонної в продуктах харчування - отримують з хімічно синтезується фумарової:

Ноосі - СН = CH - СООН + Н ₂ О Ноосі - СН (ОН) - СН ₂ СООН
фумарова кислота яблучна кислота
4. Висновок
Отже, нам стало ясно, яке значення відіграють ферменти в сучасній хімічній промисловості. На наступному уроці ми спробуємо самі отримати іммобілізований ферментний препарат.
УРОК № 7 Практична робота «Приготування іммобілізованих ферментних препаратів»
Завдання:
1. Освітня: освоєння найпростіших методів отримання ферментних препаратів в розчиненому та іммобілізованих вигляді.
2. Розвиваюча: а) розвиток пізнавального інтересу учнів;
б) формування логічного мислення в ході виконання практичної роботи;
в) формування умінь і навичок розумового і практичного праці.
3. Виховна: а) з метою формування діалектичного світогляду проведенням якісних проб на ферменти показати реальність процесу іммобілізації;
б) виховання мотивації до навчання.
Хід уроку:
1. Організація класу
Які способи іммобілізації ферментів ви знаєте?
2. Постановка навчальних завдань
На сьогоднішньому занятті ви спробуєте самостійно виділити фермент з природного об'єкту і іммобілізувати його на полімерному носії.
Клас ділиться на 3 групи, і кожна працює зі своїм ферментом.
3. Проведення роботи (детальніше див [13].
I. Отримання ферментних препаратів:
10 г . природного об'єкта (пекарські дріжджі - сахарази; боби квасолі без шкірки - уреаза; проростки пшениці - комплекс амілаз) ретельно розтирається в ступці з кварцовим піском і заливається 20-30 мл води; перемішування - 10 хв. Фільтрування через складчастий фільтр.
II. Іммобілізація:
Після пояснення терміну «катионит» беруть 1 г його і в хімічному стакані перемішують з отриманим раніше фільтратом 40-60 хв. Після фільтрування (звичайний фільтр) масу промивають 2 рази водою.
III. Проведення якісних проб:
(Заздалегідь на дошці приготовлена таблиця)

Фермент	Субстрат	Реагент виявлення	Ознаки реакції
Сахарази	3 мл 5% сахарози	Фелінгова рідина (2 мл)	Освіта червоного Cu ₂ O при нагріванні
Уреаза	5 мл 1% сечовини	2 краплі спиртового фенолфталеїну	Малинова забарвлення
Амілази	5 мл 1% крохмалю	Фелінгова рідина (2 мл)	Освіта червоного Cu ₂ O при нагріванні

Контроль виконують 3 людини з класу зі змоченим водою катионитом.
Висновки
Отже, що ви можете сказати після проведення якісних реакцій? Чому катионит не дав позитивних результатів в контрольних дослідах? Оформіть будинку роботу, спробуйте написати хімічний процес, що каталізується «вашим» ферментом, і дайте відповідь на питання: який вид іммобілізації ми використовували в ході роботи?
УРОК № 8 по темі «Основи генної інженерії»
Завдання:
1. Освітня: знайомство з сучасною біотехнологією - генетичною інженерією, основні напрямки та завдання. Принципові методи створення штучних генетичних структур.
2. Розвиваюча: а) розвиток пізнавального інтересу учнів;
б) формування логічного мислення в процесі освоєння теоретичних прийомів конструювання генетичних структур;
в) формування умінь і навичок розумового і практичного праці.
3. Виховна: а) з метою формування діалектичного світогляду показати пізнаванність тонких механізмів реалізації генетичної програми організму і можливості впливу людини на геноми різних живих об'єктів;
б) виховання мотивації до навчання.
Хід уроку:
1. Організація класу
Обговорення питань, виникнувшими при оформленні практичної роботи.
2. Актуалізація знань
«... Там, де природа кінчає виробляти свої види, там людина починає з природних речей створювати, за допомогою цієї ж самої природи, незліченні види нових речей». (Л. Да Вінчі: розшифровані записні книжки)
З глибокої давнини людина мріяла створювати нові види тварин ... людей. Досить згадати безліч міфів про русалок, кентаврів, сиренах та інших казкових (?!) Персонажах. Хто знає, може в недалекому майбутньому вони стануть реальністю.
На сьогоднішньому уроці ми спробуємо розібратися, що служить підставою для таких суджень.
3. Вивчення нового матеріалу
Якщо ви згадаєте перше заняття, то самі скажете, в якій «біотехнологічної ері» ми зараз живемо (ера генетичної інженерії).
Спробуємо розібратися в цьому терміні:
генетична (генна) - зачіпає генетичні структури (які це структури?);
інженерія увазі конструювання, модифікацію в механічному сенсі.
Отже, запишіть визначення:
Генна інженерія - система експериментальних прийомів, що дозволяють конструювати лабораторним шляхом штучні генетичні структури, вводити їх у клітку і які у неї здійснювати роботу.
Можливо, у вас викликало подив словосполучення «здійснювати роботу». Згадаймо найпростішу схему реалізації генетичної інформації:

ділянка ДНК (ген) РНК білок (на дошці)
і саме білок реалізує генетичну інформацію сам по собі або, якщо він фермент, запускає перетворення якихось речовин. Наприклад, собаки не потребують надходження ззовні вітаміну С, а синтезують його з компонентів вуглеводної їжі. Отже, якщо гени, що кодують потрібні ферменти такого перетворення, «пересадити» від собаки організму, що відчуває нестачу вітаміну С (морській свинці, людині !?!), то проблема буде вирішена. Правда, даний перенесення генів на сучасному етапі утопічний, але я навів його як наочний приклад біотехнологічного використання.
Успіхи в генній інженерії стали можливі завдяки вивченню найпростіших живих істот (вірусів і бактерій) на генетичному рівні. Перш, ніж отримати потрібний ген з мікроорганізму, треба знати його місце розташування. Складені так звані генетичні карти багатьох штамів бактерій і вірусів методами класичної генетики. Потрібен «листоноша» - носій генів, призначених для перенесення («вектор»). Такі є в природі з незапам'ятних часів: плазміди і бактеріофаги. Плазміди - кільцеві молекули ДНК, відносно невеликих розмірів, самостійно існуючі незалежно від хромосоми бактерії. Вони обумовлюють поза хромосомну спадковість (до речі, у людини її обумовлюють мітохондрії). І звичайно потрібні «хірургічні скальпелі» молекулярних розмірів, що дозволяють різати ДНК в потрібних місцях. І такі інструменти завжди були поруч з нами і навіть у нас: ферменти специфічного розщеплення ДНК - рестріктази. Роль їх у клітці - руйнування вірусних ДНК. Кожна рестріктаза специфічна по-своєму, але всі вони мають одну загальну особливість - діють на послідовності, що читаються в одного ланцюга ДНК, ідентично іншої, але в протилежний бік:

5 'ГААТТЦ 3'

5 'ЦТТААГ 3'
«Перевертні»: «А роза упала на лапу Азора».
Зверніть увагу, що утворилися однотяжевие послідовності, комплементарні один одному, «липкі кінці». Вже відомо більше 500 рестриктаз, що дозволяють розщеплювати ДНК в 120 послідовностях. Вперше їх застосували в 1972 році в США.
Є ферменти, зшиваючі розриви ДНК (на дошці):

Аатте Аатте
______________________
____________________________________________

ТТАА ТТАА
рестріктаза =

Аатте
ТТАА
(Плазміда)

Аатте
___________________
___________________
ТТАА
(Потрібний ген) =
Аатте
___________________
___________________
ТТАА
(Розкрита плазміда)

Аатте
ТТАА
ТТАА
Аатте
гібридна ДНК
(Після зшивання)

Тепер оновлені плазміди, поглинені бактеріями з розчину, можна розмножити в мільйони разів - клонувати. А вбудований ген буде працювати і напрацьовувати потрібний білок, вітамін, амінокислоту ... Це ми розглянемо на наступному уроці.
УРОК № 9 по темі «Застосування генної інженерії»
Завдання:
1. Освітня: знайомство учнів із застосуванням досягнень генної інженерії у біотехнології: клонування генів у різних організмах. Проблеми та перспективи даного напрямку.
2. Розвиваюча: а) розвиток пізнавального інтересу учнів у зв'язку з цікавістю матеріалу;
б) формування логічного мислення в ході пізнання шляхів отримання сучасних лікарських препаратів і нових сортів рослин;
в) формування умінь і навичок розумового і практичного праці.
3. Виховна: а) з метою формування діалектичного світогляду показати крихкість стану природної рівноваги і все зростаючу роль людини у підтримці цієї рівноваги;
б) виховання мотивації до навчання.
Хід уроку:
1. Організація класу
Поясніть, як можна пересадити ген від одного мікроорганізму іншому?
2. Актуалізація знань
Отже, ми розібралися, як можна пересадити ген від одного організму іншому. Сьогодні подивимося, до чого це призводить або може призвести.
3. Вивчення нового матеріалу
В даний час основні роботи з генної модифікації організмів ведуться з бактеріями, так як вони найбільш вивчені і прості. Багато штамів мікроорганізмів також є сверхпродуцентов різних біологічно активних речовин.
Матеріал до уроку дивись клонування в клітинах різних організмів (глава I).
«Ми відчули себе нікчемними істотами, богозневажне який наважився торкнутися сили, що були до сих пір в недоторканності». (Генерал Фарелл, очевидець вибуху першої експериментальної атомної бомби 16.07.1945)
УРОК № 10 Підсумкова перевірочна робота
I варіант
1. Визначення біотехнології
2. Принцип роботи біофільтра, аеротенках
3. Напишіть рівняння реакцій мікробіологічного окислення піриту, вилуговування мідних відвалів
4. Визначення іммобілізованого ферменту. Методи іммобілізації.
5. Що таке генна інженерія?
II варіант
1. Етапи розвитку біотехнології
2. Рівняння процесів молочнокислого і спиртового бродіння, отримання оцту
3. Визначення біометаногенеза, етапи
4. Принцип відбору мутантів з порушеннями регуляторних систем
5. Як ви розумієте поняття: вектор, рестріктази
3.3 Приблизний план включення матеріалу елективного курсу в теми неспеціалізованою програми з хімії

Заняття елективного курсу	Матеріал «стандартних» уроків
Біотехнологічні процеси в харчовій промисловості.	Вуглеводи, процеси бродіння; Отримання етилового спирту
Біотехнологічна переробка відходів	Охорона гідросфери; отримання нижчих УВ (біометаногенез)
Бактеріальне вилуговування	Одержання металів; екологічні аспекти хімії - переробка промислових відходів
Основи одержання БАР. Виробництво кормового білка. Виробництво амінокислот, вітамінів і антибіотиків	Хімія і життя; біологічно активні речовини
Застосування ферментів	Білки, ферменти
Основи генної інженерії. Застосування генної інженерії	Нуклеїнові кислоти, перспективи вивчення

3.4 Педагогічний експеримент
Наведена практична робота була виконана на заняттях школи № 18 зі школярами 10 «А» і 10 «Б» і зі студентами 5 курсу біолого-хімічного факультету КДПУ ім. К.Е. Ціолковського.
Заняття на тему «Мікробіологічне вилуговування» було також проведено зі студентами (БХ-51) за неможливістю використання резервів школи.
Крім того, було вивчено та перероблений досвід вчителів середньої школи № 18 м. Калуги у викладанні теми «Біотехнологія». Дана тема зачіпається ними в 11 класі в модулі «Хімія в житті суспільства» (за програмою О. С. Габрієляна).
Висновок
Педагогічний експеримент виявив деякі технічні і тимчасові недоліки пропонованої практичної роботи. На нашу думку доцільніше її проводити у позаурочний час: на факультативних заняттях і гуртках.
У ході бесіди була виявлена зацікавленість студентів у запропонованому матеріалі. Безсумнівно, дане заняття розширило їх кругозір і мотивувало до подальшого навчання.
Вчитель хімії середньої школи № 5 м. Калуги також вважає за потрібне розширення запропонованого О.С. Габріеляном модуля за кордону лікарських препаратів.

Висновок
У процесі роботи для досягнення мети нами були виконані наступні завдання:
1. Проаналізовано методична література і обгрунтована актуальність теми.
2. Проаналізовано література, що дає огляд основних питань біотехнології.
3. Підібрано матеріал до проведення уроків з даної теми та розроблено методичні рекомендації щодо його використання.
4. Підібрано лабораторна робота, яку слід включити до вивчення даної теми.
5. Проведено педагогічний експеримент та освоєно досвід вчителів.
Таким чином, розроблена нами методика застосовна для навчання, оскільки підвищує пізнавальний інтерес в учнів, що є важливою умовою формування високої якості знань та ефективності їх засвоєння. Крім того, запропоновані досліди, які не потребують застосування складного обладнання.

Список літератури
1. Андрєєва Н.В., Левченко А.Л. Профільне навчання: вчора, сьогодні, завтра / / Біологія в школі, № 5, 2004-с. 21
2. Баранов В.С. Генна терапія - медицина XXI століття / / Соросівський освітній журнал, № 3, 1999-с. 63
3. Білозерський О.М. Молекулярна біологія - нова ступінь пізнання природи - М., «Радянська Росія», 1970
4. Біотехнологія. Принципи та застосування: Пер. з англ. / / За ред. І. Хіггінса, Д. Беста і Дж. Джонса. - М.: Мир, 1988. - 480 с.
5. Браун А.Д. Фаддеева М.Д. Молекулярні основи життя - М.: «Просвещение», 1976 - 206 с.
6. Геном, клонування, походження людини / / заг. ред. Корочкін Л.І. - Фрязіно, 2004
7. Єгорова Т.А., Клунова С.М., Жівухіна Є.А. Основи біотехнології - М.: «Академія», 2003 - 208 с.
8. Інгрем В. Біосинтез макромолекул Пер. з англ. - М.: Світ 1966 -273 с.
9. Конічев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярна біологія - М.: «Академія», 2003. - 400 с.
10. Концепція модернізації російської освіти на період до 2010 року
11. Ленінджер А. Основи біохімії: в 3-х томах Т.3. Пер. з англ.-М.: Світ, 1985. - 320 с.
12. Лутова Л.А. «Генетична інженерія рослин: звершення і надії» / / Соросівський освітній журнал, том 6, № 10, 2000 - с. 10
13. Миколаїв А.А. Основи біотехнології частина I Калуга, КДПІ ім. Ціолковського. 1989. - 43 с.
14. Овчинников Ю.А. Біоорганічна хімія. - М.: Просвещение, 1987. - 815 с.
15. Програми для загальноосвітніх установ: хімія 8-11 кл. / / Сост. Габрусева Н.І., Суматохіна С.В. - М.: Дрофа, 2001 - 288 с.
16. Садовникова Е.А., Шакір І.В. «Біотехнологія - що це таке?» / / Хімія в школі № лютого 1994
17. Пилипович Ю.Б. Основи біохімії Висш.шк., 1985. - 503 с.
18. Франк-Каменецький М.Д. Найголовніша молекула - М.: Наука 1988. - 176 с.
19. Чирков Ю.Г. «Час химер. Великі генні ігри ». - М.: ИКЦ «Академкнига» 2002.
20. http://www.pravda.ru/science/technologies/209660-egg-0
21. http://www.vz.ru/society/2006/10/17/53162.html

Лінкерние фрагменти не тільки забезпечують об'єднання генів, але і обумовлюють їх експресію, у зв'язку з чим, часто в середину лінкера поміщають якийсь регуляторний генетичний елемент, наприклад промотор, або ділянка зв'язування з рибосомою.
Після того як рекомбінантна ДНК зшита, її вводять в живі клітини. При цьому рекомбінантні ДНК стають складовою частиною генетичного апарату реципієнтного організму і, крім того, вони привносять в нього нові генетичні та фізіолого-біохімічні властивості, корисні для людини. Але оскільки вона не здатна до самовідтворення, її руйнують внутрішньоклітинні нуклеази. Для того щоб рекомбінантна ДНК стала складовою частиною генетичного апарату клітини, вона повинна або вбудуватися (інтегруватися) в її геном і репліцірваться за його рахунок, або бути здатною до автономної реплікації. Прийнято молекули ДНК, здатні акцептувати чужорідну ДНК і автономно реплицироваться, називати векторними молекулами. До числа векторів відносять плазміди, бактеріофаги, віруси тварин. Вектори повинні володіти наступними особливостями:
1. Мати субстратні ділянки для певних ендонуклеаз рестрикції.
2. Мати властивості реплікону.
3. Містити один або кілька маркерних генів, які після проникнення вектора в клітку надають їй фенотип, що свідчить про присутність вектора.
Таким чином, всі вектори забезпечують реплікацію вбудованих генів, їх експресію, інтеграцію в хромосому клітини і т.д. Частіше за інших в генетичній інженерії в якості векторів використовують плазміди. Плазмідами називають стабільно успадковані бактеріальні реплікону (позахромосомних елементи спадковості). Вони являють собою дволанцюгових кільцеві молекули ДНК з варіабельними молекулярними масами. Вони детермінують різні властивості: резистентність до антибіотиків (R-плазміди); біодеградацію (D-плазміди) та ін Наприклад, плазміди стафілококів несуть гени стійкості до пеніциліну, з'єднанням ртуті та ін Кількість плазмід у клітині може коливатися від однієї до більш ста.
Перший плазмідний вектор був отриманий С. Коеном (1973). Його джерелом була плазміда E. Coli R _6-5 c Mr 65 кДа. Плазміда стала родоначальником серії векторів і інших структур.
Плазміда pBR313 містить унікальні ділянки розщеплень декількох рестриктаз (рис. 3).

Рис. 3. Схема використання плазміди pBR322 для відбору клітин, що містять рекомбінантні плазміди [14].
Можливості плазмід для генетичної інженерії не безмежні, що пов'язано з їх невеликими розмірами. Коли потрібно клонувати великі фрагменти ДНК, зручніше використовувати вектори на основі бактеріофага λ. Геном фага λ досконально вивчений [9]. У центральній частині лінійного генома фага міститься область, необов'язкова для літичної інфекції, яку і використовують для вставки клонованої ДНК. ДНК фага λ розрізають за допомогою рестриктаз Eco RI, видаляють необов'язкову центральну область і на її місце вбудовують потрібний фрагмент ДНК, отримуючи, таким чином, конкамер - попередник для упаковки фагової ДНК у зрілі фаговой частки. Фаг λ дуже пластичний: без порушення розвитку фага з нього можна прибрати до 25% ДНК або прибудувати до 6% зайвої ДНК. У цей фагової вектор можна вбудовувати до 23 000 н.п.
У тих випадках, коли не вистачає можливостей фага, використовують ще більші вектори - косміди. До складу космід входять: ген (маркер) резистентності до антибіотиків, реплікону плазміди і фрагмент ДНК фага λ (так званий cos-ділянка). Цей фрагмент являє собою однониткових комплементарні ділянки на кінцях фагової ДНК, тобто «Липкі кінці».
Ще один вид векторів - фазміди, штучні гібриди між фагом і плазміди. Після вбудовування чужорідної ДНК вони в одних умовах можуть розмножуватися як фаги, а в інших - як плазміди.
Вектори на основі ниткоподібних фагів застосовують тоді, коли зручніше працювати з одним ланцюгом ДНК. Так, фага М13 і fd містять кільцеву одноцепопочечную ДНК з повністю вивченими послідовностями нуклеотидів.
Дріжджі Saccharomyces cerevisiae є перспективні моделі для експериментів з рекомбінантними ДНК. Їх гаплоїдний геном містить 1,4 х 10 ⁷ н.п. (В 3 рази більше, ніж у E. Coli), розподілених по 17 хромосомами. Дріжджі не інфікуються вірусами, але в їхніх клітинах виявлена плазміда, яка використовується як вектора - 2 мкм-плазмідна ДНК. Важливою особливістю дріжджових систем є та обставина, що клонованої фрагменти ДНК здатні до рекомбінації з гомологічними ділянками дріжджового геному, що веде до стабільної сайт-специфічної трансформації останнього (незалежно від збереження або втрати вектора).
Векторні плазміди і векторні віруси з вбудованими чужорідними генами часто називають гібридними (або химерними) плазмідами (або фагами). Після конструювання рекомбінантних ДНК їх за допомогою трансформації вводять в реципієнтного організм: бактеріальну, грибну, рослинну або тваринну клітку. Трансформація передбачає попередню обробку клітин сполуками (CaCl _2), які зумовлюють проникнення ДНК усередину клітин з наступним їх приміщенням в середу, в якій здатні існувати тільки клітини, які отримали векторну молекулу, наприклад у середу з певним антибіотиком.
Процес інфікування клітин за допомогою чужорідних ДНК, що приводить до утворення зрілого фагового потомства, названий трансфекції.
Проте ефективність проникнення екзогенної ДНК у клітину досить низька. Тому серед бактерій, зазнали трансформації, тільки невелика частина виявляється трансформованому. Відділення її від загальної маси можливо також в процесі клонування. Для клонування бактеріальну суспензію певної концентрації виливають на тверду живильне середовище, наприклад на агар з поживними добавками в чашці Петрі з розрахунку 5-10 бактерій на 1 см ² поверхні. Бактеріальна клітина на поверхні агару починає ділитися з утворенням у результаті маленької колонії, схожою на головку гриба. Ця колонія називається клоном, причому з кожної клітини утворюється свій клон, всі клітини якого мають властивості бактерії-родоначальника.
Рекомбінантні клони можуть бути ідентифіковані за синтезується ними продукту (імунологічний метод Брума-Джілберта) [4]. Але частіше доводиться ідентифікувати безпосередньо нуклеотидну вставку з використанням методів гібридизації (Грюнштейн - Хогнесс) [18]. (Рис. 4).

Рис. 4. Метод радіоавтографіі в застосуванні до пошуку рекомбінантних клонів [14].
З фрагментів вірусних та бактеріальних хромосом вже виділений цілий ряд генів. Що ж стосується виділення специфічних генів з фрагментованих еукаріотичних хромосом, то реалізація цієї процедури все ще залишається складною і трудомісткою задачею. Існує два основних підходи для отримання специфічних генів, що підлягають потім рекомбінації та клонування. В одному з них, який отримав назву «шотган» (від англ. Shotgun - дробовик), всю клітинну ДНК обробляють рестріктірующей ендонуклеаз, що утворює в місцях розриву виступаючі кінці. Отримані фрагменти ДНК вбудовують потім у плазміди E. Coli, «розкриті» (тобто переведені в лінійну форму) за допомогою тієї ж самої рестріктірующей ендонуклеази. У результаті утворюється надзвичайно складна суміш, що складається, ймовірно, з тисяч різних рекомбінантних плазмід, серед яких лише одна може містити потрібний ген. Для пошуку плазміди, що несе цей ген, розроблені спеціальні процедури, які називають скринінгом.
Інший підхід, який використовується для отримання потрібних генів, полягає в конструюванні на мРНК-матриці комплементарної по відношенню до неї ДНК (кДНК) [11]. Тепер специфічну мРНК, що кодує білок, ген якого треба отримати, можна використовувати в якості матриці для ферментативного синтезу кДНК за допомогою зворотної транскриптази (ревертази). (Рис. 5).
Після розщеплення гібрида ДНК-РНК, використовуючи видозмінену протеазами ДНК-полімеразу E.coli - фрагмент Кленова, синтезують двухцепочечную ДНК.
Після розщеплення «шпильки» залишається синтетична двуцепочечной кДНК, відповідна білку, гіпнотізіруемому цікавлять нас геном. Зауважимо, однак, що якщо цю синтетичну кДНК отримували з мРНК людини, то вона не ідентична природному гену цього білка, оскільки не містить ні інтронів, тобто вставних послідовностей, ні стартових і терминируются сигналів, властивих генам більшості еукаріотичних білків. І для експресії такого гена в клітинах прокаріотів необхідно, щоб він знаходився під контролем прокаріотичних регуляторних елементів. У зв'язку з цим для здійснення експресії відповідна кДНК приєднується до регуляторних елементів бактерії-промотора, оператору і рибосом-зв'язуючого ділянці.
На сучасному етапі також можливий хіміко-ферментативний синтез полінуклеотидних послідовностей. Синтез гена вперше був здійснений в 1970 році в лабораторії Х.Г. Корани.

Рис. 5. Схема підготовки кДНК для клонування [14].
Клонування та експресія генів у різних організмах
В даний час розроблені системи клонування в бактеріях, дріжджах, грибах, рослинах і ссавців. Особливий інтерес з економічної точки зору представляють системи клонування генів у грампозитивних бактеріях, багато з яких є сверхпродуцентов найважливіших хімічних сполук [7]. Значних успіхів у біоіндустрії вдалося досягти з клітинами Bacillus subtilis, стрептоміценамі і Sacchromyces cerevisiae.
Вектори для клонування в таких системах є подвійні реплікону, здатні існувати і в E. Coli, і в тій клітці господаря, для якої вони призначені. З цією метою створюють гібридні вектори, що містять реплікону який-небудь із плазмід E. Coli і необхідний реплікону (з бактерій, дріжджів та ін), і спочатку клонують з наступним відбором необхідних генів в добре вивченій системі. Потім виділені рекомбінантні плазміди вводять в новий організм.
Інсулін - гормон підшлункової залози, який регулює вуглеводний обмін і підтримує нормальний рівень цукру в крові. Недолік цього гормону в організмі приводить до одного з найважчих захворювань - цукрового діабету.
Зазвичай підшлункова залоза великої рогатої худоби і свиней не використовується в м'ясній та консервної промисловості і поставляється на фармацевтичні підприємства, де проводять екстракцію гормону. Для отримання 100 г . кристалічного інсуліну необхідно 800-1000 кг вихідної сировини. У 1978 р. з'явилося повідомлення про отримання штаму кишкової палички, яка продукує щурячий проінсулін (США). У цьому ж році були синтезовані окремі ланцюга людського інсуліну за допомогою експресії їх синтетичних генів у клітинах E. Coli (рис. 6).

Рис. 6. Експресія гена проінсуліну людини в складі гібридного білка з β-галактозидазою [14]

Був синтезований і ген соматостатину - гормону гіпоталамуса. Соматостатин пригнічує виділення інсуліну та гормону росту людини. У Національному медичному центрі «Хоуп» (Каліфорнія) було здійснено хіміко-ферментативний синтез гена довжиною в 42 нуклеотиду, здатного кодувати соматостатин. Синтетичний ген соматостатину був вбудований в плазміду pBR322 E. Coli поблизу кінця гена, що кодує фермент β-галактозидазу. Між двома генами був поміщений кодон метіоніну. Після введення рекомбінантної плазміди в бактеріальну клітину кишкова паличка стала синтезувати гібридний білок. Частина його (соматостатин) потім відщеплює від β-галактозидази BrCN. Перший синтез соматостатину генно-інженерним способом був здійснений в 1977 р. Бойером. Вихід гормону становив 10 000 молекул на одну клітку. З 100 г . біомаси E. coli, вирощеної в ферментере об'ємом 8 л, вдалося виділити 5 мг соматостатину, тобто стільки, скільки можна його виділити з 100 кг овечих мізків.
Соматотропін (або гормон росту людини ГРЧ) секретується передньою часткою гіпофіза. Його нестача призводить до захворювання - гіпофізарної карликовості (1 випадок на 5000 чоловік). Зазвичай його отримують з гіпофіза трупів, але в недостатній кількості. Гормону вистачає лише для лікування 1 / 3 випадків гіпофізарної карликовості в розвинених країнах. Препарат з трупного матеріалу представляє собою суміш з декількох форм. Це призводило до того, що у 30% хворих, які отримували препарат, проти гормону вироблялися антитіла, зводили нанівець його біологічну активність. Беручи до уваги цю обставину, в даний час ГРЧ синтезують методами генетичної інженерії в спеціально сконструйованих клітинах бактерій. Біосинтез ГРЧ був здійснений в 1979 р. Д. Гедделем зі співробітниками. Кінцевий вихід гормону склав 2,4 мкг на 1 мл культури, що становить 100 000 молекул гормону на клітину.
Проблема введення генів у клітини ссавців дуже важлива для дослідження функціонування генів вищих еукаріот [7].
Попередньо клоновані гени вводять в клітину тварин різними шляхами. Суть одного з них полягає у трансформації клітин потрібним геном, сполученим з одним з генів, для яких здійснюється селекція. Для ідентифікації і подальшого розмноження клітин, що містять інтегровану ДНК, був розроблений метод, який отримав назву методу маркера. Прикладом може служити метод отримання клітин, дефектних по синтезу ферменту тимідинкінази (ТК ^{--клітини).} Такі клітини трансформувалися фрагментами ДНК вірусу герпесу (HSV), що містить ген ферменту ТК, і після трансформації вони набували здатності до синтезу ферменту на селективної середовищі, тобто ставали ТК ^{+-клітинами.} Клітини ТК ⁺ легко відрізняються від клітин ТК ^-, оскільки здатні рости на середовищах з аміноптеріном (інгібітор, блокуючий певні стадії біосинтезу нуклеотидів). Отже, в даному випадку для трансформації клітин тварин були використані гібриди бактеріальних плазмід з геном ТК з вірусу герпесу. Для цього попередньо проводили клонування і ідентифікацію генів у клітинах E. Coli і потім отримана рекомбінантна плазміда вводилася в ТК ^- клітини.
Представляють важливий інтерес мікроін'єкції ДНК безпосередньо в ядро клітини. Її здійснюють за допомогою спеціальної піпетки (внутрішній діаметр її біля 1 мкм), а кількість ін'єкційованого розчину ДНК становить 1-2 ПКЛ. Так, плазміди, які містять фрагмент вірусу герпесу з геном тимідинкінази, і плазміди pBR322 були ін'єктовані в ТК-клітини, при цьому ТК-ген проник в ядра і нормально в них реплицироваться. Мікроін'єкції клонованих генів проводять в один або обидва пронуклеусів щойно заплідненої яйцеклітини миші. Після ін'єкції яйцеклітину негайно імплантують в яйцепровід названої матері або дають можливість розвиватися в культурі до стадії бластоцисти, після чого імплантують в матку. Таким чином, були ін'єктовані гени інтерферону та інсуліну людини, ген глобіну кролика, ген тімідінкіназного вірусу герпесу і кДНК вірусу лейкемії мишей. Незважаючи на певні успіхи в області інтеграції чужорідних генів у ембріональні клітини тварин, до цих пір не вдалося вбудувати чужорідну ДНК в заданий ділянку хромосоми, витіснити ген і замінити його новою нуклеотидної послідовність, підпорядкувати новий ген системі регуляції організму.
Застосування методів генетичної інженерії у тваринництві відкриває перспективу зміни ряду властивостей організму: підвищення продуктивності, резистентності до захворювань, збільшення швидкості росту, поліпшення якості продукції та ін Тварин, що несуть в своєму геномі рекомбінантний (чужорідний) ген, прийнято називати трансгенними, а ген, інтегрований в геном реципієнта, - трансгенна. Продукт цього гена (білок) є трансгенним. Завдяки переносу генів у трансгенних тварин виникають нові якості, а подальша селекція дозволяє закріпити їх у потомстві і створювати трансгенні лінії.
Генетичний аналіз народилися трансгенних тварин і отриманого від них потомства показав, що, незважаючи на ін'єкцію ДНК на ранніх стадіях, у трансгенних лініях можуть з'являтися так звані мозаїки. До мозаїк відносять тварин, що походять з однієї зиготи, але мають різні генотипи. Підраховано, що близько 30% первинних трансгенних тварин, отриманих методом мікроін'єкції ДНК, - мозаїки, що ускладнює створення чистих трансгенних ліній тварин.
Перші трансгенні миші з ГР були отримані в 1982 р. У них зазначалося підвищення швидкості росту і збільшення кінцевої живої маси. Однак у трансгенних свиней з геном ГР (1989) збільшення зростання не спостерігалося.
За даними Л.К. Ернста (1996), у трансгенних свиней з геном рилізинг-фактора гормону росту (РФ ГР) кінцева жива маса була на 15,7% вище в порівнянні з контрольними тваринами. Однак у трансгенних овець з генами Гр і РФ ГР, незважаючи на підвищений рівень ГР, швидкість зростання не збільшувалася.
Одна з найважливіших задач використання трансгенних тварин у медицині - отримання біологічно активних сполук за рахунок включення в клітини організму генів, що викликають у них синтез нових білків.
В Единбурзі в 1992 р. були виведені трансгенні вівці з геном α-1-антитрипсину людини і β-глобуліновий промотором. Зміст цього білка у різних трансгенних овець становила від 1 до 35 р. / л, що відповідає половині всіх білків у молоці. При такому рівні продукції білка може бути отримано близько 10 кг трансгенного білка від однієї тварини на рік, що достатньо для 50 пацієнтів при лікуванні емфіземи легенів. У Росії групою вчених під керівництвом Л.К. Ернста отримані трансгенні вівці з геном химозина, в 1 л молока яких міститься 200-300 мг химозина - основний компонент для виробництва сиру. Велике досягнення зроблене вченими наукового центру, в якому була створена перша клонована овечка - Доллі. Дослідники з інституту Росліна виробили п'ять поколінь птахів, в яєчному білку яких містяться людський інтерферон і miR24 антитіла для боротьби з меланомою [20].
Генно-інженерні методи, зокрема технологія рекомбінантних ДНК, дозволяють створювати нові генотипи і, отже, нові форми рослин набагато швидше, ніж класичні методи селекції. Крім того, з'являється можливість цілеспрямованої зміни генотипу - трансформації - завдяки введенню певних генів.
Формальним явищем генетичної інженерії рослин вважається отримання першого в світі химерного рослини - санбіна (sunbeen) як результат перенесення гена запасного білка бобових (фазеоліна) в геном соняшнику (sunflower + been) [12].
Отримання рослин з новими властивостями з трансформованих клітин (регенерація) можливе завдяки їх властивості тотипотентності, тобто здатності розвиватися в цілу рослину.
Перенесення генів у рослинні клітини, так само як і в клітини тварин, та їх вбудовування в геном рослин (трансформація) здійснюються головним чином завдяки специфічним структурам - векторах.
Деякі види агробактерій (Agrobacteria) можуть заражати дводольні рослини, викликаючи утворення пухлин - корончатих галлів (рис. 7).
Одним з найбільш сильних індукторів пухлин є грунтова бактерія A.tumefaciens [12]. Здатність цієї бактерії до утворення пухлини пов'язана з великою позахромосомних плазмидой, що отримала назву Ti-плазміда (від англ. Tumor inducing - індукують пухлина). Ti-плазміди - це природні вектори для генів, що володіють всіма функціями, необхідними для перенесення, стабільного включення і експресії генетичної інформації в рослинах. Вони мають широке коло господарів.

Рис.7. Agrobacterium tumefaciens викликає утворення корончатих галлів (пухлин).
Т-ДНК - трансформує ДНК, яка інтегрується в рослинний геном; vir - область, що включає гени, продукти яких забезпечують вирізування і перенесення Т-ДНК у рослинну клітину; tra - область, де локалізовані гени, які контролюють кон'югацію бактерій; ori - область, яка містить гени, продукти яких забезпечують реплікацію Ti-плазміди

Після зараження частина Ti-плазміди зустрічається в хромосомах клітин рослини-хазяїна (М. Монтес і Д. Шелл [6])
Недолік цих плазмід полягає в тому, що деякі гени, що знаходяться в Т-ДНК, змушують рости клітини рослин незалежно від гормонів, що вносяться в живильне середовище, на якому культивуються дані клітини. У зв'язку з цим дуже важко регенерувати нормальне рослина з клітин, що містять повну послідовність Т-ДНК. Інший недолік - великі розміри Ti-плазміди, через які ускладнені будь-які маніпуляції з нею, тому вставити ген в плазміду традиційними способами неможливо.
В даний час конструюються похідні Ti-плазміди, в яких залишають регуляторний ділянку Т-області, а замість її структурних генів вшивають структурну частину гена, який треба ввести в рослину. Такі гени з позиції їх регенерації нешкідливі для рослин (рис 8).
Існують і інші бактерії (A. Rhizogenes), що викликають посилене утворення корінців при зараженні рослин. За цей процес відповідальні містяться в них так звані Ri-плазміди (від англ. Root inducing - індукуючий коріння). Ri-плазміди вигідно відрізняються від Тi-плазмід тим, що вони служать природними нешкідливими векторами, так як трансформовані з їх допомогою рослинні клітини зберігають здатність до морфогенезу і до регенерації здорових рослин. У зв'язку з цим Ri-плазміди в даний момент розглядаються як більш перспективні вектори.

Тому фітовіруси представляють собою дуже ефективні засоби для отримання хорошої експресії чужорідного гена. Однак віруси в якості векторів володіють і істотними недоліками: мають невелику ємність, патогенні і нездатні вбудовуватися в хромосоми господаря.
Методи прямого перенесення генів в рослину виникли завдяки появі специфічного об'єкта - ізольованих протопластів, тобто клітин, позбавлених целюлозної стінки.
1) Трансформація рослинних протопластів здійснюється завдяки комбінації методик кальцієвої преципітації ДНК і злиття протопластів. Для трансформації може бути використаний практично будь-ДНК-вектор.
2) Культуру протопластів на початковій стадії її зростання заражають агробактерій, які використовують в якості векторів.
3) Мікроін'єкції ДНК. Аналогічний методу мікроін'єкцій тварин клітин. Цей метод можна розглядати як найбільш універсальний. Ефективність трансформації рослинних клітин - 10-20% незалежно від типу вектора. Трансформація видоспецифічність, можливе перенесення генів у будь-яку рослину.
4) електропорація. Метод заснований на підвищенні проникності біомембран за рахунок дії імпульсів високої напруги. У результаті молекули ДНК проникають в клітини через пори в клітинній мембрані.
5) Упаковка в ліпосоми. Це один з методів, що дозволяють захистити екзогенний генетичний матеріал від руйнування нуклеазами рослинної клітини. Ліпосоми - сферичні тільця, оболонки яких утворені фосфоліпідами.
6) Метод біологічної балістики [6]. Це один з найбільш ефективних методів трансформації однодольних рослин. Вихідний матеріал для трансформації - суспензійна культура, калюсна тканину або 4-5-денні культивовані незрілі зародки однодольних. Метод заснований на напиленні ДНК-вектора на найдрібніші частинки вольфраму, якими потім бомбардують клітини. Бомбардування здійснюється за допомогою біолістіческой гармати за рахунок перепаду тиску. Частина клітин гине, а ті, що вижили клітини трансформуються, потім їх культивують і використовують для регенерації рослин.
Вирішення проблеми створення нових форм рослин на увазі в першу чергу підвищення якості синтезованих рослиною продуктів, які визначають його харчову та технічну цінність. В основному це стосується запасних білків.
Починаючи з 1970 р. стали з'являтися серйозні роботи з вивчення генів азотфіксації та їх перенесення в клітини Klebsiella pneumoniae і E. coli. Конструювання плазмід, що несуть nif-гени, дозволяє передавати здатність до фіксації азоту організмам, що не володіє цією властивістю. Серед бактерій, крім E. Coli, таке перенесення здійснений для бактерій Salmonella typhimurium, Erwinia herbicola та інших. Однак подібні маніпуляції можуть призводити до небажаних ефектів. Так перенесення генів у штам Erwinia (бактерії, що викликають гниття рослин) може підсилити його патогенну дію.
В даний час увагу вчених привертають проблеми введення генів азотфіксації в клітини рослин; створення різоценозов між небобовимі рослинами (особливо злаками) і азотфіксуючими організмами. Найбільш цікава перша проблема - введення nif-генів в клітини рослин. Проте її рішення пов'язане з рядом труднощів. Основна - руйнування нітрогенази під впливом кисню. У азотфіксуючих мікроорганізмів існує ряд пристосувань, що захищають бактерії від вільного кисню. Таким чином, введення тільки nif-генів в якусь рослинну клітину не вирішує проблеми. Крім того, сама клітина, в яку переносять гени азотфіксації, може бути не пристосована до синтезу і витрачання великої кількості енергії, яка потрібна для фіксації азоту. Отже, більш перспективно підвищення ефективності фіксації азоту у вже існуючих природних системах за рахунок дії на гени, які контролюють цей процес, а також збільшення потужності кореневої системи бобових рослин і створення нових азотфіксуючих систем за допомогою методів клітинної інженерії.
Найбільших втрат рослинам приносять грибні, бактеріальні та вірусні патогенних. У рослині існують захисні механізми, які більшою чи меншою мірою (залежно від стійкості рослин) починають діяти у відповідь на проникнення фітопатогенів в клітку. По-перше, починається синтез сполук, що викликають загибель патогенів. Прикладом можуть служити специфічні білки PRP (pathogen related proteins). З них найбільш вивчені ферменти хітинази і β-1, 3 - глюконази, які пригнічують ріст грибів і деяких видів бактерій, руйнуючи їх клітинні стінки. По-друге, можуть створюватися структурні бар'єри, що перешкоджають поширенню інфекції. Це досягається завдяки лігніфікації клітинних стінок.
Так, гени хітинази і глюконази кодуються одиночними генами. Завдяки цьому були отримані трансгенні рослини тютюну та турнепсу, до складу геному яких ввели ген хітинази. Лабораторні та польові випробування виявили велику стійкість трансгенних рослин. У рослини томатів був введений ген захисних пептидів редьки (дефензінов) rs, що відповідають за стійкість до фітопатогенних грибів.
Інший підхід до отримання трансгенних рослин, стійких до вірусної інфекції, полягає у введенні в геном вихідних рослин гена оболонки вірусу. Це призводить до інгібування розмноження вірусу і зниженню інфікованості. Завдяки такому підходу був отриманий стійкий антивірусний ефект у рослин тютюну, трансформованих геном оболонки вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ).
Створення трансгенних рослин, стійких до комах, за допомогою методів генної інженерії стало можливим після того, як було виявлено, що бактерії Bacillus thurengiensis синтезують специфічний білок - прототоксін, високотоксичний для комах. Потрапляючи в кишечник комахи, цей білок розщеплюється, утворюючи активну форму токсину. У результаті комаха гине. Ген, відповідальний за експресію прототоксіна, вдалося виявити, виділити з генома B. Thurengiensis і за допомогою бінарного вектора ввести в геном рослин тютюну.
Аналогічним чином рослини томата були трансформовані генами іншого инсектицидного білка - ендотоксину. У результаті були отримані перші трансгенні рослини, які не пошкоджували комахи (рис. 9).

Сонечка, які харчувалися попелицями, що жили на ГМ - картоплі, ставали безплідними і т.д. Деякі автори пов'язують ці явища з «горизонтальними» потоками генетичної інформації [19].
Генну терапію на сучасному етапі можна визначити як лікування спадкових мультифакторної і неспадкових (інфекційних) захворювань шляхом введення генів у клітини пацієнтів з метою спрямованої зміни генних дефектів або додання клітинам нових функцій [2]. Перші клінічні випробування методів генної терапії були зроблені 22 травня 1989 з метою генетичного маркування пухлина-інфільтрують лімфоцитів у разі прогресуючої меланоми. Першим моногенних спадкових захворювань, щодо якого були застосовані методи генної терапії, виявився спадковий імунодефіцит, обумовлений мутацією в гені аденозіндезамінази (ADA). 14 вересня 1990 в Бетесде (США) чотирирічної дівчинки, яка страждає цим досить рідкісним захворюванням (1: 100 000), були пересаджені її власні лімфоцити, попередньо трансформовані поза організмом (ex vivo) геном ADA (ген ADA + ген neo + ретровірусний вектор). Лікувальний ефект спостерігався протягом декількох місяців, після чого процедура була повторена з інтервалом 3-5 місяців. У результаті лікування стан пацієнтки настільки поліпшився, що вона змогла вести нормальний спосіб життя і не боятися випадкових інфекцій.
У 1997 році число допущених до клінічних випробувань протоколів становило вже 175, більше 2000 пацієнтів взяли участь у їх реалізації.
До теперішнього часу інтеграція в геном досягалася тільки при використанні ретровірусних або аденоассоціірованних векторів. Останнім часом особлива увага приділяється створенню векторів на базі штучних хромосом ссавців (Mammalian Artificial Chromosomes). Завдяки наявності основних структурних елементів звичайних хромосом такі міні-хромосоми довгостроково утримуються в клітинах і здатні нести повнорозмірні (геномні) гени і їх природні регуляторні елементи.
Сучасний рівень знань не дозволяє проводити корекцію генних дефектів на рівні статевих клітин і клітин ранніх доімплантаційної зародків людини у зв'язку з реальною небезпекою засмічення генофонду небажаними штучними генними конструкціями або внесенням мутацій з непередбачуваними наслідками для майбутнього людства.
1.2 Біотехнологічні процеси в харчовій промисловості
Молочні продукти
У харчовій промисловості для отримання молочних продуктів застосовують, головним чином, ферментацію [4]. У сквашивании молока зазвичай беруть участь стрептококи та молочнокислі бактерії; лактоза при цьому перетворюється на молочну кислоту. Шляхом використання інших реакцій, які супроводжують головному процесу або йдуть при подальшій обробці, отримують і інші продукти переробки молока. Серед них пахта, сметана, йогурт і сир.
У молоці при ферментації можуть протікати шість основних реакцій, і в результаті утворюються молочна (СН ₃ СН (ОН) СООН), пропіонова (СН ₃ СН ₂ СООН) або лимонна кислота ((НООССН _{2) 2} С (ОН) СООН), спирт (С ₂ Н ₅ ОН), масляна кислота (С ₃ Н ₇ СООН) або ж відбувається коліформних газоутворення. Головна з цих реакцій - утворення молочної кислоти. На ній засновані всі способи ферментації (сквашування) молока. Лактоза молока гідролізується при цьому з утворенням галактози і глюкози. Зазвичай галактоза перетворюється на глюкозу ще до сквашування. Наявні в молоці бактерії перетворюють глюкозу в молочну кислоту (шлях Ембдена-Мейергофа-Парнаса). Освіта згустку казеїну відбувається в ізоелектричній точці цього білка (рН 4,6) під дією молочної кислоти. Цей процес лежить в основі сироваріння.
При виробництві швейцарського сиру ключову роль відіграє маслянокислое бродіння з утворенням вуглекислого газу.
З ₆ Н ₁₂ О ₆ = СН ₃ СН ₂ СН ₂ СООН +2 СО ₂ +2 Н ₂
Саме це зумовлює своєрідний смак (букет) цих сирів та освіта очок. Характерний смак сколотин, сметани і вершкового масла формується в результаті лимоннокислого бродіння. Він складається зі складових смаків диацетила (СН ₃ С (О) С (О) СН _3), пропіонової і оцтової кислот і близьких до них сполук. Різні процеси ферментації молока проводять сьогодні в контрольованих умовах. Протягом багатьох минулих тисячоліть вони здійснювалися за участю бактерій, початково присутніх у молоці. У наш час для цього використовують різноманітні закваски, що дозволяють отримувати молочні продукти потрібної якості та типу. Застосовуються при цьому культури живих бактерій можуть становити або один якийсь штам певного виду, або кілька штамів та / або видів.
Хоча властивості сирів надзвичайно різноманітні, в процесі вироблення всіх їх є багато спільного. Перший етап - це підготовка культури молочнокислих бактерій і засів нею молока. Потім молоко створаживается, для чого зазвичай застосовують фермент реннін. Після відділення водянистої рідини (сироватки) отриману сирнистий масу піддають термообробці і пресують у формах. Далі згусток солять і ставлять на дозрівання. На наступному етапі сири відправляють на дозрівання або витримку. Дозрівання відбувається в спеціальних приміщеннях з контрольованою температурою і триває до чотирьох років. Мікроорганізми і ферменти в ході цього процесу гідролізують жири, білки і деякі інші речовини молодого сиру. У результаті їх розпаду утворюються речовини, що додають сирам характерний смак.
З молочних продуктів найпростіше отримувати олію. У залежності від сорту вироблюваного масла використовують вершки з концентрацією від 30-32 до 30-40%. При їх збиванні емульсія олії у воді перетворюється на емульсію води в олії. При виробництві масла для поліпшення смаку і кращого збереження використовують особливі культури бактерій.
При виготовленні сметани до вершків додають 0,5-1% закваски, використовуваної при виробництві олії. Далі продукт витримують, поки концентрація кислоти не досягне 0,6%.
Відомо, що деякі люди не переносять лактозу. Для них можна випускати молоко, оброблене β-галактозидазою - ферментом, який зменшує вміст лактози. Для цієї мети потрібно розробити недорогий промисловий спосіб виробництва такого молока. β-галактозидазу отримують з дріжджів, пліснявих грибів і бактерій.
Хлібопродукти
Для виробництва хліба до цих пір застосовують в основному дріжджі Saccharomyces cerevisiae. Зазвичай їх вирощують у ферментерах періодичної дії на мелясі (бурякової або цукрового очерету). У найпростішому випадку готують тісто, змішуючи борошно, воду, дріжджі і сіль. При замісі шари тесту переміщуються, створюються умови для утворення бульбашок газу і підйому тесту. Замішаній тесту дають можливість «підійти», а потім ріжуть на шматки потрібної ваги, формують і витримують у вологій атмосфері. При витримці і на першій, наступного за нею стадії випічки утворилися при замісі і формуванню «зародки» газових бульбашок наповнюються вуглекислим газом. Він виділяється в ході анаеробного зброджування глюкози і мальтози борошна. Піднялося тісто випікають. У ході цього термічного процесу крохмаль желатинізується, дріжджі гинуть, і тісто частково зневоднюється. Крім вуглекислого газу при анаеробному бродінні утворюються органічні кислоти, спирти та ефіри. Всі вони помітно впливають на формування смаку хліба.
Крім хлібопечення, крохмаль використовують для отримання низькомолекулярних вуглеводів. Гідроліз крохмалю в промисловому масштабі здійснюється різними способами: тільки кислотою, кислотою і ферментами і тільки ферментами. У середині 60-х років на зміну кислотного і кислотно-ферментативного процесам прийшов ферментативний спосіб переробки крохмалю, заснований на послідовному застосуванні α-амілази B. Subtilis і амілоглюкозідази A. Oryzae або A. Niger. Крім виробництва глюкози, найбільш помітним успіхом в цій галузі промисловості був випуск сумішей глюкози і фруктози. Цей продукт відомий під назвою ізоглюкози або кукурудзяного сиропу з високим вмістом фруктози. Ізоглюкози може заміняти сахарозу в більшості видів їжі. Ізомеризація здійснюється ферментами з різних організмів. Вибір їх визначається тим, наскільки просто з ними працювати, чи потребують вони в кофактором і стабільні чи (дивися «Основи інженерної ензимології»).
Бродильні виробництва
Отримання напоїв шляхом спиртового бродіння - одне з найдавніших бродильних виробництв. Першими з таких напоїв були, мабуть, вино і пиво. До появи робіт Пастера в кінці ХІХ ст. про суть протікають при бродінні процесів та їх механізми було відомо дуже мало. Пастер показав, що бродіння без доступу повітря здійснюється живими клітинами дріжджів, при цьому цукор перетворюється на спирт і вуглекислий газ.
З ₆ Н ₁₂ О ₆ = 2С ₂ Н ₅ ОН +2 СО ₂
Тоді ж було показано, що бродіння здійснюється під дією якихось речовин, що знаходяться всередині дріжджових клітин. Одне з головних нововведень у галузі мікробіології бродіння було запропоновано Хансеном. Хансен виділив чисті культури дріжджів і використовував їх у пивоварінні, тим самим він став піонером застосування таких культур при виробництві пива. Зброджування здійснюється дріжджами роду Saccharomyces. В одних випадках використовується природний цукор (наприклад, що міститься у винограді, з якого роблять вино), в інших цукру отримують із крохмалю (наприклад, при переробці зернових культур в пивоварінні). Наявність вільних цукрів обов'язково для спиртового бродіння за участю Saccharomyces, так як ці види дріжджів не можуть гідролізувати полісахариди. Освіта етилового спирту відбувається за схемою Ембдена - Мейергофа - Парнасу.
Традиційним джерелом потрібних для цього полісахаридів в пивоварінні завжди був ячмінь. Ячмінний солод та інші компоненти подрібнюють і змішують з водою при температурі до 67 º С. У ході перемішування природні ферменти ячмінного солоду руйнують вуглеводи зерна. На заключній стадії розчин, званий суслом, відокремлюють від нерозчинних опадів. Додавши хміль, його кип'ятять в мідних казанах. Після додавання дріжджів всі поміщають в бродильний чан. Після закінчення певного часу бродіння закінчується, дріжджі відокремлюють від пива і витримують його деякий час для дозрівання.
У виробництві вина використовують цукор виноградного соку. Майже все вино в світі роблять з винограду одного виду, Vitis vinifera. Виноробство на відміну від пивоваріння до самого останнього часу було засноване на використанні диких місцевих дріжджів. Єдина обробка, якій піддавали виноград до віджимання, - обкурювання його сірчистим газом, щоб сік не темнів. Крім того, сірчистий газ пригнічує діяльність невинних дріжджів; це дозволяє винним дріжджів, які менш чутливі до нього, здійснювати бродіння без перешкод. При виготовленні червоного вина гребені, кісточки і шкірка до кінця бродіння знаходяться у виноградному суслі (мустьє), а біле вино роблять з чистого соку. Після завершення спиртового бродіння молоде вино зберігають в особливих умовах, щоб воно не зіпсувалося. Якщо вино не передбачається піддавати яблучно-молочнокислому доброджування, його обробляють сірчистим газом, що пригнічує окислювальні процеси, що викликають його потемніння. До цього з вина видаляють дріжджі, щоб припинити бродіння
Виробництво перегнанного спирту молодше, ніж неперегнанних спиртних напоїв, але і його коріння губляться у віках. Для отримання напою, що містить 40% (за об'ємом) спирту, потрібна перегонка. Її і сьогодні здійснюють в перегінних апаратах, що представляють собою модифікації пристрою, запропонованого в 1830 р. Коффі і носить його ім'я. У спиртовому виробництві використовуються придатні для цієї мети штами Saccharomyces.
Оцет - це продукт, що містить не менше 4% (вага / об 'єм) оцтової кислоти; його отримують за допомогою двостадійного процесу. Спочатку здійснюють спиртове бродіння, в ході якого цукор сировини перетворюється на спирт за участю S. Cerevisiae. Після завершення цього етапу дріжджів дають осісти і збирають надосадову рідину. Вміст спирту доводять до 10-13%. На наступному етапі етиловий спирт перетворюється в оцтову кислоту (проміжним продуктом є ацетальдегід). Всі процеси отримання оцту йдуть за участю змішаних культур Acetobacter. Бродіння відбувається а аеробних умовах з споживанням великої кількості кисню і виділенням тепла.
Виробництво кормового білка
Відповідно до норм харчування людина повинна щодня отримувати з їжею 60-120 р. повноцінного білка. Якщо рослини і більшість мікроорганізмів здатні синтезувати всі білкові амінокислоти з вуглекислоти, води, аміаку і мінеральних солей, то людина і тварини не можуть синтезувати деякі амінокислоти (валін, лейцин, ізолейцин, лізин, метіонін, треонін, триптофан і фенілаланін), які називають незамінними . Ці амінокислоти повинні надходити в організм у готовому вигляді з їжею; їх відсутність викликає важкі захворювання людини і зниження продуктивності сільськогосподарських тварин. Незамінні амінокислоти найбільш збалансовані в білках насіння сої. Відносно високу біологічну цінність мають також білки зерна рису і гороху. У білках зерна пшениці та ячменю дуже мало лізину, метіоніну і ізолейцин, а в білках кукурудзи ще і триптофану.
Особливий інтерес представляє використання мікроорганізмів в якості джерела білка і вітамінів при виробництві харчових продуктів. Перспектива і економічна доцільність вживання мікроорганізмів в технології виробництва харчових продуктів диктується рядом факторів:
1) можливістю використання найрізноманітніших хімічних сполук, у тому числі відходів виробництва, для культивування мікроорганізмів;
2) високою інтенсивністю синтезу білків;
3) відносно нескладною технологією культивування мікроорганізмів;
4) відносно високим вмістом білка і вітамінів;
5) підвищеним вмістом незамінних амінокислот в порівнянні з рослинними білками;
6) можливістю спрямованого генетичного впливу на хімічний склад мікроорганізмів з метою вдосконалення білкової і вітамінної цінності продукту (ГМО).
В даний час світовий дефіцит білка становить близько 15 млн. т. Найбільш перспективний мікробіологічний синтез, що випливає з представлених нижче даних. Якщо для великої рогатої худоби потрібно 5 років для подвоєння білкової маси, для свиней - 4 міс., Для курчат - 1 міс., То для бактерій і дріжджів - 1-6 ч. Світове виробництво харчових білкових продуктів за рахунок мікробного синтезу становить більше 15 тис. т на рік. В якості джерел кормового білка частіше використовують різні види дріжджів і бактерій, мікроскопічні гриби, одноклітинні водорості, білкові коагулянти трав'янистих рослин.

Дріжджові клітини в якості джерела вуглецю для зростання здатні використовувати нерозгалужені вуглеводні з кількістю від 10 до 30 вуглецевих атомів у молекулі. В основному вони представлені рідкими фракціями вуглеводнів нафти з температурою кипіння 200-320 º С. У Росії перший завод з виробництва кормових дріжджів з рідких парафінів нафти вступив в дію в 1971 р. Альтернативна ланцюжок розщеплення вуглеводнів: н-Алкани (З ₉ - З ₃₀₎ Аліфатичні спирти

Аліфатичні кислоти ацил-КоА Ацетил-КоА
При вирощуванні дріжджів на н-парафінів нафти в приготовану з них живильне середовище додають макро-і мікроелементи, необхідні вітаміни і амінокислоти [13]. Висушена дріжджова маса гранулюється і використовується як білково-вітамінний концентрат (БВК), що містить до 50-60% білкових речовин, для годівлі сільськогосподарських тварин.
Хорошим субстратом для вирощування кормових дріжджів є молочна сироватка - виробничий відхід при переробці молока. В якості джерел вуглецю дріжджові клітини можуть використовувати і нижчі спирти - метанол і етанол, одержувані в біотехнології з природного газу або рослинних відходів. Дріжджова маса, отримана після культивування дріжджів на спиртах, містить більше білків (56-62% від сухої маси) і менше шкідливих домішок, ніж кормові дріжджі, вирощені на н-парафінів нафти, такі, як похідні бензолу, D-амінокислоти, аномальні ліпіди , токсини і канцерогенні речовини. Разом з тим білки дріжджів частково не збалансовані за метіоніну, у них мало цистеїну і селенцістеіна.
Поряд з технологією використання дріжджових білків в якості кормової добавки до раціонів сільськогосподарських тварин розроблені технології одержання з них харчових білків. Важливий резерв харчового білка і вітамінів - залишкові пивні дріжджі Saccharomyces carlsbergensis. Організм людини засвоює понад 90% всіх поживних речовин, що містяться в них. Пивні дріжджі можуть з успіхом застосовуватися при виробництві ковбас як замінник казеїну. Білки дріжджів застосовують також при отриманні штучного м'яса. Для цього їх нагрівають з наступним швидким охолодженням або продавлюванням білкової пасти через отвори малого діаметру.
Відомо більше 30 видів бактерій, які можуть бути застосовані в якості джерел повноцінного кормового білка. Бактеріальні білкові концентрати з вмістом сирого білка 60-80% (від сухої маси) - цінні препарати в кормовиробництві. Слід зазначити, що бактерії значно швидше, ніж дріжджові клітини, нарощують біомасу і, крім того, білки бактерій містять більше цистеїну і метіоніну, що дозволяє віднести їх до розряду білків з високою біологічною цінністю. Джерелом вуглецю при культивуванні бактерій можуть служити природний і попутний гази, водень, а також спирти - метанол, етанол, пропанол. До числа бактерій з високою інтенсивністю синтезу білків слід віднести і водородокісляющіе бактерії, здатні накопичувати в клітинах до 80% сирого білка. Для їх культивування в складі газового середовища зазвичай міститься 70-80% водню, 20-30% кисню і 3-5% СО _2.
Для одержання кормового білка використовують одноклітинні водорості Chlorella і Scenedesmus, синьо-зелені водорості з роду Spirulina, здатні синтезувати білки з діоксиду вуглецю, води і мінеральних речовин за рахунок енергії сонячного світла. Водорості для свого розвитку потребують певних режимах освітлення і температури і у великих обсягах води. Зазвичай їх вирощують у природних умовах південних регіонів у басейнах відкритого типу. При вирощуванні водоростей в культиваторах відкритого типу з 1 га водної поверхні можна отримувати до 70 т сухої біомаси в рік, що перевищує вихід біомаси при обробітку пшениці, рису, сої, кукурудзи. Білки водоростей добре збалансовані за вмістом незамінних амінокислот, за винятком метіоніну. У клітинах водоростей, крім того, синтезується досить багато поліненасичених жирних кислот і β-каротину.
У біомасі багатьох мікроскопічних грибів добре збалансовані за амінокислотним складом білки, вони включають також вітаміни та ліпіди. За своїми поживними властивостями білки грибів наближаються до білків сої та м'яса, що дозволяє використовувати з не тільки для приготування кормових концентратів, але і як добавку в їжу людини. Джерелом вуглецю для промислового вирощування мікроскопічних грибів служать рослинні відходи, що містять клітковину, геміцелюлози, лігнін, а також торф і гній. У Великобританії створено харчовий продукт, основним компонентом якого є білок грибного походження - мікопротеін на дешевому глюкозного сиропу, отриманому шляхом гідролізу пшеничного або кукурудзяного крохмалю.
1.3 Основи інженерної ензимології
Застосування ферментів
Ферменти зберігають свої унікальні властивості (ефективність, специфічність дії) і поза клітинами, тому їх традиційно широко застосовують у практиці. Біологічні каталізатори нетоксичні, працюють в м'яких умовах, використовують доступне сировину (у тому числі і відходи), у зв'язку з чим, їх застосування в промисловості вигідно з економічної та екологічної точок зору. За обсягом виробництва ферменти посідають третє місце після амінокислот та антибіотиків. З більш ніж 2000 відомих в даний час ферментів в промисловості використовується близько 30.

Таблиця 2. Застосування ферментів

Назва ферменту	Джерела ферменту	Хімічний і біологічний процеси. Область використання.
Амілази	Bacillus sp., Aspergillus niger	Гідроліз крохмалю до декстринів, мальтози і глюкози. Спиртова, пивоварна промисловість, хлібопечення, отримання патоки, глюкози.
Глюкоізомераза	Більше 80 видів мікроорганізмів	Ізомеризація D-глюкози в D-фруктозу. Кондитерська, лікеро-горілчана, безалкогольна промисловість, хлібопечення.
Глюкооксідаза	Penecillium chrysogenum, Aspergillus niger	Видалення кисню і глюкози (з яєчного порошку, м'ясних і інших продуктів). Виноробство, пивоварна, консервна, сокова та безалкогольна промисловість.
Ліпази	Підшлункові залози тварин, насіння рослин, мікроорганізми	Гідроліз жирів і масел. Харчова, легка, медична промисловість, сільське господарство, комунальне господарство, побутова хімія.
Пектиназу	Багато мікроорганізмів (Aspergillus ssp., Fusarium ssp.)	Гідроліз галактуронана, освітлення вина та фруктових соків.
Пептідогідролази	Підшлункові залози і слизова шлунка тварин, плоди, пагони, відходи переробки деяких рослин (динне дерево, інжир, ананас)	Лізис білка. Отримання амінокислот, виробництво і отримання сиру, Мягчение м'ясних і рибних виробів, вироблення шкіри, активізація травлення. Пивоваріння, виноробство, хлібопечення, харчова промисловість, сільське господарство, медицина.
Целюлази	Clostridium ssp., Aspergillus oryzae, Fusarium culmorum	Гідроліз целюлози до глюкози. Виробництво харчових і кормових білкових препаратів, етанолу, глюкозо-фруктозного сиропів. Спиртова, пивоварна, харчоконцентратна промисловість, хлібопечення, кормовиробництво.
Фруктофуранозидаза	Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus mutans	Інверсія сахарози. Кондитерська, лікеро-горілчана, безалкогольна промисловість, сіропопроізводство.

Завдання інженерної ензимології полягають у розвитку прогресивних методів виділення ферментів, їх стабілізації та іммобілізації; конструюванні каталізаторів з потрібними властивостями і розробці наукових основ їх застосування. Зокрема, методами білкової інженерії, сутність яких полягає у зміні первинної структури природної молекули ферменту за допомогою хімічної модифікації самого ензиму або його гена, вдається принципово трансформувати структуру активного центру і його функцію, модулювати субстратне специфічність і фізико-хімічні властивості ферменту. Так, заміна залишку глутаміну-102 в молекулі лактатдегідрогенази на аргінін перетворила фермент у високоактивну малатдегідрогенази. Створено гібридні форми ферментної системи, цінною в імуноферментному аналізі, що поєднують в собі властивості β-галактозидази і β-галактокінази. Важливим етапом розвитку інженерної ензимології стала розробка способів одержання і використання іммобілізованих ферментів.
Іммобілізовані ферменти
Іммобілізованими ферментами називають ферменти, штучно пов'язані з нерозчинним носієм, але зберігають свої каталітичні властивості [7].
Ще в 1916 р. Дж. Нельсон і Є. Гріффін показали, що сахарази, сорбированная на вугіллі, зберігала свою каталітичну активність, але лише в 1953 р. Н. Грубхофер і Д. Шлейт вперше здійснили ковалентні зв'язування амілази, пепсину, РНКази і карбоксипептидази з нерозчинним носієм. У 1971 р. на першій конференції з інженерної ензимології був узаконений термін «іммобілізовані ферменти». Однак в поняття «іммобілізація» в даний час вкладають ширший зміст, ніж зв'язування на нерозчинному носії, а саме - повне або часткове обмеження руху білкових молекул.
Іммобілізовані ферменти мають ряд переваг у порівнянні з вільними молекулами. Перш за все, такі ферменти, представляючи собою гетерогенні каталізатори, легко відокремлюються від реакційного середовища, можуть використовуватися багаторазово і забезпечують безперервність каталітичного процесу. Іммобілізовані ферменти довговічні й у тисячі і десятки тисяч разів стабільніше вільних ензимів.
За Дж. Пората (1974), ідеальні матеріали, використовувані для іммобілізації ферментів, повинні володіти наступними основними властивостями: нерастворимостью; високою хімічною і біологічною стійкістю; значною гідрофільністю; достатньої проникністю, як для ферментів, так і для коферментів, субстратів та продуктів реакції; здатністю носія легко активуватися (переходити в реакційноздатні форму). У залежності від природи носії діляться на органічні і неорганічні матеріали.
Іммобілізація багатьох ферментів здійснюється на полімерних носіях органічної природи. Існуючі органічні полімерні носії можна розділити на два класи: природні та синтетичні полімерні носії. Серед природних полімерів виділяють білкові, полісахаридні і ліпідні носії, а серед синтетичних - поліметиленового, поліамідні і поліефірні.
До переваги природних носіїв слід віднести їх доступність, поліфункціональність і гідрофільність, а до недоліків - біодеградіруемость і досить високу вартість. З полісахаридів для іммобілізації найбільш часто використовують целюлозу, декстран, агарози та їх похідні. Для додання хімічної стійкості лінійні ланцюги целюлози та декстрану поперечно зшивають епіхлоргідрином. Хімічною модифікацією крохмалю зшиваючі агентами (формальдегід, гліоксаль, глутаровий альдегід) синтезований новий носій - губчастий крохмаль, що володіє підвищеною стійкістю до гликозидазу. З природних аміносахаридами в якості носіїв для іммобілізації застосовують хітин. Серед білків практичне застосування в якості носіїв знайшли структурні протеїни, такі, як кератин, фиброин, колаген і продукт переробки колагену - желатин.
До синтетичних полімерним носіям відносяться полімери на основі стиролу, акрилової кислоти, полівінілового спирту; поліамідні і поліуретанові полімери. Більшість синтетичних полімерних носіїв володіють механічною міцністю, а при утворенні забезпечують можливість варіювання в широких межах величини пір, введення різних функціональних груп.
В якості носіїв неорганічної природи найбільш часто застосовують матеріали зі скла, глини, кераміки, графітової сажі, силікагелю, а також сілохроми, оксиди металів. Їх можна піддавати хімічній модифікації, для чого носії покривають плівкою оксидів алюмінію, титану, гафнію, цирконію або обробляють органічними полімерами. Основна перевага неорганічних носіїв - легкість регенерації.
Існують два принципово різних методи іммобілізації ферментів: без виникнення ковалентних зв'язків між ферментом і носієм (фізичні методи іммобілізації) і з утворенням ковалентного зв'язку між ними (хімічні методи іммобілізації).
При адсорбційної іммобілізації білкова молекула утримується на поверхні носія за рахунок електростатичних, гідрофобних, дисперсійних взаємодій і водневих зв'язків. Адсорбція була першим методом іммобілізації ферментів (Дж. Нельсон, Е. Гріффін, 1916), але і зараз не втратила свого значення і стала найбільш широко поширеним способом отримання іммобілізованих ферментів в промисловості. Процес адсорбції ферментів досягається при контакті водного розчину ферменту з носієм (статистичним способом, при перемішуванні, динамічним способом з використанням колонок). До недоліків адсорбційного методу слід віднести невисоку міцність зв'язування ферменту з носієм. При зміні умов іммобілізації можуть відбуватися десорбція ферменту, його втрата і забруднення продуктів реакції.
Спосіб іммобілізації ферментів шляхом включення в тривимірну структуру полімерного гелю широко поширений завдяки своїй простоті та унікальності. Метод застосуємо для іммобілізації не лише індивідуальних ферментів, але і мультиензимних комплексів і навіть інтактних клітин. Іммобілізацію ферментів в гелі здійснюють двома способами. У першому випадку фермент вводять у водний розчин мономера, а потім проводять полімеризацію, в результаті якої виникає просторова структура полімерного гелю з включеними в його осередку молекулами ферменту. У другому випадку фермент вносять в розчин вже готового полімеру, який згодом переводять на гелеобразную стан. Для першого варіанта використовують гелі поліакриламіду, полівінілового спирту, полівінілпіролідону, силікагелю, для другого - гелі крохмалю, агар-агару, каррагінана, агарози, фосфату кальцію. Метод непридатний для іммобілізації ферментів, що діють на водонерозчинні субстрати.
Сутність способу іммобілізації ферментів у напівпроникні структури полягає у відділенні водного розчину ферменту від водного розчину субстрату за допомогою напівпроникною мембрани, проникної низькомолекулярні молекули субстратів і кофакторів, але затримує великі молекули ферменту. Розроблено кілька модифікацій цього методу, з яких інтерес представляє микрокапсулирование і включення ферментів у ліпосоми. Перший спосіб запропонований Т. Чангом в 1964 р. і полягає в тому, що водний розчин ферменту включається всередину замкнутої мікрокапсули, стінки якої утворені напівпроникні полімером. Один з механізмів виникнення мембрани на поверхні водних мікрокапсул ферменту полягає в реакції міжфазної поліконденсації двох з'єднань, одне з яких розчинено у водному, а інше - в органічній фазі. Прикладом може служити утворення на поверхні розділу фаз мікрокапсули, що одержується шляхом поліконденсації гексаметилендиамина - 1,6 (водна фаза) і галогенангідриди себаціновой кислоти (органічна фаза).
Nн ₂ N (CH _{2) 6} NH ₂ + nClC (O) (CH _{2) 8} C (O) Cl = (-NH (CH _{2) 6} NHC (O) (CH _{2) 8} C (O) -) _n +2 nHCl
До недоліків методу слід віднести неможливість інкапсульованих ферментів здійснювати перетворення високомолекулярних субстратів.
Близьким до инкапсулирование методом іммобілізації можна вважати включення водних розчинів ферментів в ліпосоми, що представляють собою сферичні або ламеллярной системи подвійних ліпідного бішару. Вперше цей спосіб був застосований для іммобілізації ферментів Дж. Вайсманом і Дж. Сессо в 1970 р. Для отримання ліпосом з розчинів ліпіду (найчастіше лецитину) упарюють органічний розчинник. Частину, що залишилася тонку плівку ліпідів диспергируют у водному розчині, що містить фермент. У процесі диспергування відбувається самозбирання біслойних ліпідних структур ліпосоми, що містять включений розчин ферменту. Ферменти, іммобілізовані шляхом включення в структуру ліпосом, використовують переважно у медичних та наукових цілях, бо значна частина ферментів у клітині локалізована в складі ліпідного матриксу біологічних мембран.
Іммобілізація ферментів шляхом утворення нових ковалентних зв'язків між ферментом і носієм - найбільш масовий спосіб отримання промислових біокаталізаторів. На відміну від фізичних методів цей спосіб іммобілізації забезпечує міцну і необоротну зв'язок ферменту з носієм і часто супроводжується стабілізацією молекули ензиму. Однак розташування ферменту щодо носія на відстані однієї ковалентного зв'язку створює стеричні труднощі у здійсненні каталітичного процесу. Фермент відокремлюють від носія за допомогою вставки (зшивання, спейсер), в ролі якої найчастіше виступають біфункціональність та поліфункціональні агенти (бромціан, гідразин, сульфурілхлорід, глутаровий діальдегід та ін.) Всі методи хімічної іммобілізації класифікують залежно від природи реакційної групи носія, яка вступає у взаємодію з молекулою ферменту.
1) Іммобілізація ферментів на носіях, які мають гидроксогрупп.
Найбільш поширеним методом утворення ковалентного зв'язку між ферментом і полісахаридних носієм або синтетичним діольним з'єднанням є бромціановий метод, який був запропонований Р. Аксьонов, Дж. Пората і С. Ернбаком в 1967 р. При обробці носія бромцианом виникають реакційноздатні ціанати та імідокарбонати, які при взаємодії з нуклеофільними аміногрупами ферменту утворюють похідні ізомочевіни і уретанів.
Н-OH + BrCN = H-OCN + H ₂ N-Ф = H-OC (NH) - NH-Ф
2) Іммобілізація ферментів на носіях, які мають аміногрупами.
Первинні аміногрупи носія, пов'язані з ароматичним кільцем, попередньо перетворюють на солі діазонію, які потім піддають різноманітним реакцій поєднання. У реакції поєднання вступають фенольні, імідазольного, амінні, гуаніновий, тіольних групи білків. Н-N ₂ ^{+ +} H ₂ N-Ф = H-N = N-NH-Ф + Н ⁺
3) Іммобілізація на носіях, які мають активованими похідними карбоксильної групи.
Найбільш часто для з'єднання аміногруп білка з ацильниє угрупованнями носія використовують ангідриди, галогенангідриди, активовані ефіри та інші похідні карбонових кислот.
Н-С (О) Cl + H ₂ N-Ф = H-C (O) NH-Ф + НCl
4) Іммобілізація на носіях, які мають сульфгідрильними групами.
Сульфгідрильні групи носія і ферменту легко окислюються з утворенням дисульфідних зв'язків під дією кисню повітря.
H-SH +0,5 О ₂ + HS-Ф = Н-SS-Ф + Н ₂ О
Поряд з іммобілізацією ферментів останнім часом все більша увага приділяється іммобілізації клітин і субклітинних структур. Це пояснюється тим, що при використанні іммобілізованих клітин відпадає необхідність виділення і очищення ферментних препаратів, застосування кофакторів; створюється можливість отримання Поліферментні систем, що здійснюють багатостадійні безперервно діючі процеси.
Промислові процеси з використанням іммобілізованих ферментів і клітин
Отримання глюкозофруктозних сиропів.
Перша промислова установка для перетворення глюкози у фруктозу за допомогою иммобилизованной глюкоізомерази була запущена лише в 1973 р. Вихідною сировиною для цього процесу служить глюкоза, яку отримують при гідролізі кукурудзяного або картопляного крохмалю в присутності мінеральних кислот. Для конструювання промислового біокаталізатора глюкоізомеразу сорбують на пористих неорганічних носіях або іонообмінних смолах. Виникає в результаті каталітичного процесу глюкозофруктозний сироп містить 42-45% фруктози, близько 51% глюкози, невелика кількість олігосахаридів і по солодощі відповідає інвертний цукор, одержуваному при гідролізі сахарози.
Отримання L-амінокислот з їх рацемічних сумішей.
Поряд з мікробіологічними способами важливе значення мають хімічні методи промислового одержання природних амінокислот, в тому числі незамінних. Проте в результаті хімічних реакцій, що використовуються для синтезу амінокислот, що містять асиметричні атоми вуглецю, з однаковою швидкістю утворюються як D-, так і L-стереоізомери, тобто завжди виникає рацемічна суміш. Поділ рацемічних сумішей на складові їх оптичні ізомери (представляє важку задачу) стало першим промисловим процесом з використанням іммобілізованих ферментів. Цей процес був здійснений у Японії в 1969 Г.С допомогою аміноацілази, іммобілізованої на ДЕАЕ-целюлозі. В якості вихідних сполук у даному перетворенні використовують N-ацілірованние похідні D-, L - амінокислот, одержувані за допомогою хімічного синтезу. Аміноацілаза гідролізує лише N-ацил-L-стереоізомер, отщепляя від нього ацильної радикал, у результаті чого розчинність утворюється L-амінокислоти різко зростає і її легко можна відокремити від свого антипода фізико-хімічними методами. При нагріванні залишилася N-ацил-D-амінокислота рацемізіруется, тобто перетворюється у вихідну суміш, яка знову піддається впливу ферменту.
АсNH-CHRCOOH + H ₂ O = H ₂ N-CHRCOOH + CH ₃ COOH + АсNH-CHRCOOH
N-Ас D / L амінокислоти L-амінокислоти N-Ac D-амінокислоти

нагрівання
Аміноацілаза строго специфічна до структури тільки ацильної частини субстрату, тому одна й та ж установка з іммобілізованим ферментом використовується для отримання різних амінокислот.
Отримання L-аспарагінової кислоти.
Аспарагінова кислота широко вживається в якості харчової добавки (підсолоджувач і підкислювач). Перша в світі промислова установка для синтезу L-аспарагінової кислоти з одержуваного хімічним шляхом фумарату амонію була запущена в 1973 р. в Японії. У ній використані іммобілізовані в поліакриламідному гелі клітини кишкової палички E.coli, що містять аспартат-аміак-ліази.
H ₄ NOOC-CH = CH-COOH = HOOC-CH _2-CH (NH ₂₎ - COOH
Отримання L-аланіну.
В даний час основний промисловий спосіб отримання L-аланіну - ферментативне декарбоксилювання L-аспарагінової кислоти. Процес перетворення L-аспартату в L-аланін каталізується аспартат-β-декарбоксилази ряду мікроорганізмів (Pseudomonas dacunhae, Alcaligenes faecalis, Achromobacter pestifier), іммобілізованих в поліакриламідному гелі.
HOOC-CH _2-CH (NH ₂₎ - COOH = CH _3-CH (NH ₂₎ - COOH + CO ₂
Удосконалення процесу пов'язане з використанням в якості сировини фумарату амонію. У даному випадку процес одержання L-аланіну стає двустадійность і реалізується у двох послідовно розташованих колонках. На першому етапі фумарат амонію перетворюється в L-аспарагінову кислоту, яка без виділення з реакційної середовища на другому етапі зазнає β-декарбоксилювання з утворенням аланіну.
Отримання L-лізину
Процес отримання лізину заснований на стереоспецефіческом ферментативному гідролізі (конверсії) D-, L-α-аміно-ε-капрлактама, який спочатку одержують хімічним шляхом з циклогексена. Рацемат використовують як субстрат, який під дією лактамази перетворюється в L-лізин, а непрореагіровавшіх D-форма переводиться в суміш антиподів рацемазой. Лактамаза знайдена у деяких дріжджів (Candida laurentil). Рацемаза виявлена у ряду бактерій (Alkaligenes obae).
Отримання триптофану
Хіміко-ферментативний спосіб отримання триптофану полягає в прямий конденсації індолу, аміаку і ПВК. Реакцію каталізує пірідоксальзавісімая тріптофаназа. Фермент знайдений у E.coli.
Отримання L-яблучної кислоти.
Яблучна кислота - замінник лимонної в продуктах харчування і лікарських препаратах. Яблучну кислоту отримують, використовуючи іммобілізовані в поліакриламідному гелі клітини, що містять фумаратгідратазу. У присутності цього ферменту відбувається приєднання води по подвійному зв'язку в молекулі фумарової кислоти.
HOOC-CH = CH-COOH + H ₂ O = HOOC-CH (OH) - CH _2-COOH
Перспективи технології іммобілізованих ферментів [4]
Сьогодні в промисловості реалізовано лише чотири великомасштабні технології на основі іммобілізованих ферментів (глюкоізомерази, аміноацілази, пеніціллази і лактази). У доступному для огляду майбутньому іммобілізовані ферменти можуть бути використані для наступних цілей.
1. Холінестераза може застосовуватися для визначення пестицидів. Ступінь інгібування цього ферменту в присутності пестицидів оцінюють електрохімічними або колориметричними методами.
2. Іммобілізована діізопропілфторфосфатаза нервових клітин кальмара може знайти застосування для знешкодження фосфорорганічних нервових газів.
3. Іммобілізована гепаріназа може застосовуватися для запобігання тромбоутворення в апаратах штучного кровообігу.
4. Запропоновано новий спосіб застосування іммобілізованого гемоглобіну. Включений в поліуретанову матрицю білок утворить «гемогубку», здатну поглинати кисень прямо з води з ефективністю 80%. Далі кисень вивільняється з полімеру під дією слабкого електричного розряду. Передбачається, що така система може забезпечувати киснем водолазів або працюючі під водою двигуни.
5. Можливо, незабаром вдасться створити системи з декількох іммобілізованих ферментів. Так, якщо укласти в мікрокапсули уреазу, глутаматдегідрогенази і глюкозодегідрогеназу, то їх можна буде використовувати для видалення сечовини із крові хворих з нирковою недостатністю.
6. Різноманітні іммобілізовані ферменти знаходять застосування в датчиках швидкого аналізу.
7. Останнім часом велика увага приділяється використанню різних мікробних оксігеназних систем в стереоспецефіческом епоксіокісленіі олефінів.
1.4 Основи одержання метаболітів
Процесами біотрансформації називають реакції перетворення вихідних органічних сполук (попередників) у цільовий продукт за допомогою клітин живих організмів або ферментів, виділених з них.
По відношенню до процесу зростання низькомолекулярні продукти метаболізму живих клітин діляться на первинні та вторинні метаболіти. Первинні метаболіти необхідні для росту клітин. До них належать структурні одиниці біополімерів - амінокислоти, нуклеотиди, моносахариди, а також вітаміни, коферменти, органічні кислоти та інші сполуки. Вторинні метаболіти (антибіотики, пігменти, токсини) - низькомолекулярні з'єднання, не є необхідною умовою для виживання клітин і утворюються по завершенні фази їх росту.
Механізми інтенсифікації процесів отримання продуктів клітинного метаболізму
У нормі обмін речовин в клітині здійснюється за принципами найсуворішої економії, що забезпечується складною системою регуляції обміну речовин. Завдання біотехнолога полягає в забезпеченні сверхсинтезу одного з продуктів метаболізму, що досягається як шляхом зміни генетичної програми організму, так і за допомогою порушення регуляторних систем метаболізму в ньому [7].
Для виділення з природних популяцій високопродуктивних штамів мікроорганізмів використовують методи селекції, тобто спрямованого відбору організмів із стрибкоподібним зміною геномів. Для виникнення мутацій цікавить ген повинен подвоїтися 10 ⁶ -10 ⁸ разів. Більш ефективний метод штучного пошкодження генома. Таким методом є індукований мутагенез, заснований на використанні мутагенної дії низки хімічних сполук, рентгенівських і ультрафіолетових променів.
Координація хімічних перетворень, що забезпечує економність метаболізму, здійснюється у мікроорганізмів трьома основними механізмами: регуляцією активності ферментів, у тому числі шляхом ретроінгібірованія; регулюванням обсягу синтезу ферментів (індукція і репресія біосинтезу ферментів); катаболітной репресією.
У процесі ретроінгібірованія (інгібування за принципом зворотного зв'язку) активність ферменту, що стоїть на початку багатоступеневого перетворення субстрату, гальмується кінцевим метаболітом, що детально розроблено при вивченні регуляції біосинтезу піримідинових нуклеотидів і новоутворення ряду амінокислот.
На обмін речовин, аналогічний кінцевим метаболітам, надають ефект їх аналоги. Для відбору об'єктів продуценти вирощують на селективної середовищі, що містить відповідний аналог або антиметаболіт, які не включаються в обмін речовин (зокрема, аналоги амінокислот не включаються до складу білків), що веде до пригнічення росту організму. Ті, що вижили мутанти мають дефектами в механізмі регуляції активності ферменту за принципом зворотного зв'язку і тому служать важливими об'єктами в забезпеченні сверхсинтезу цільового продукту.
Так, мутації по ділянках цистрона, детермінують структуру аллостеріческого центру ферменту, можуть призвести до змін у конформації білка, які роблять молекулу ензиму нечутливою до концентрації кінцевого продукту. Це забезпечує можливість утворення в клітині надлишкової кількості цільового продукту.
Мутації в гені-регуляторі проводять таким чином, щоб його продукт - білок-репрессор - втрачав здатність зв'язуватися або з індуктором, або з оператором. У результаті мутацій індуцибельних ферменти стають конститутивними. Мутантні організми, у яких змінені нуклеотидні послідовності в зоні гена-оператора, не можуть пов'язувати нормальний репрессор і також набувають здатність до конститутивний експресії структурних генів. Мутанти з дефектами регуляторної області оперона називаються регуляторними. Через відсутність або вимкнути ферменту, що каталізує проміжну стадію процесу, в середовищі накопичується не кінцевий продукт, а проміжний цільової метаболіт. Мутанти з обмеженою здатністю до утворення кінцевих продуктів називаються ауксотрофнимі.
Біотехнологія отримання первинних метаболітів
Виробництво амінокислот
Серед сполук, одержуваних біотехнологічними методами, амінокислоти займають перше місце за обсягом виробництва і друге місце за вартістю, поступаючись за останнім параметром лише антибіотиків. Обсяг світового виробництва амінокислот становить більше 500 тис. т на рік, з яких 300 тис. т припадає на глутамат натрію, 100 тис. т на лізин і 140 тис. т на метіонін.
У промислових масштабах білкові амінокислоти отримують:
1) гідролізом природного белоксодержащего сировини;
2) хімічним синтезом;
3) мікробіологічним синтезом;
4) біотрансформацією попередників амінокислот за допомогою мікроорганізмів або виділених з них ферментів (хіміко-мікробіологічний метод).
У ході кислотного гідролізу білків відбуваються рацемізації і руйнування деяких складових їх амінокислот. При кислотному гідролізі повністю руйнується триптофан і досить значні втрати цистеїну, метіоніну і тирозину (10-30%).
Істотний недолік методів хімічного синтезу амінокислот полягає в отриманні цільових препаратів у вигляді рацемической суміші D-і L-стереоізомерних форм. Переважна більшість природних амінокислот відноситься до L-ряду. Винятком у цьому відношенні є лише метіонін, метаболізм якого нестереоізбірателен, завдяки чому дана амінокислота виходить переважно шляхом хімічного синтезу.
Найбільш перспективний і економічно вигідний мікробіологічний синтез амінокислот. Більше 60% всіх вироблюваних в даний час промисловістю високоочищених препаратів білкових амінокислот отримують саме цим способом, головна перевага якого в порівнянні з методами хімічного синтезу полягає у можливості отримання L-амінокислот на основі поновлюваної сировини.
Промислове виробництво амінокислот стало можливим після відкриття здібності у деяких мікроорганізмів виділяти у культуральне середовище значні кількості якої-небудь однієї амінокислоти (С. Кіносіта, 1955). При цьому було помічено, що більшість із кількох тисяч проаналізованих диких штамів мікроорганізмів продукували амінокислоти в зовнішнє середовище, але в дуже незначних кількостях. І лише один з обстежених мікроорганізмів - Corynebacterium glutamicum був здатний до сверхсинтезу глутамату. Цей штам використовували при організації першого в світі великомасштабного виробництва глутамінової кислоти мікробіологічними способом у Токіо (1956). Поширені об'єкти селекції продуцентів - мікроорганізми, пов'язані з пологами Brevibacterium, Microcjccus, Corynebacterium, Arthrobacter.
Виробництво лізину. У клітинах мікроорганізмів лізин синтезується з аспарагінової кислоти і служить кінцевим продуктом розгалуженого метаболічного шляху біосинтезу, спільна для "трьох амінокислот - лізину, метіоніну і треоніну.
Аспартат

Аспартаткіназа
Фосфоаспартат

Полуальдегід аспартату

Гомосерін-
дегідрогеназа
Гомосерін

Гомоцистеїн Треонін Лізин

Метіонін
Рис. 11. Схема біосинтезу лізину, метіоніну і треоніну в клітинах Corynebacterium
Ефекту накопичення в середовищі всього однієї цільової амінокислоти домагаються шляхом блокування процесів, що ведуть до синтезу побічних амінокислот, що виникають у зв'язку з розгалуженням метаболічного шляху. У типових продуцентів L-лізину - Brevibacterium flavum і Corynebacterium glutamicum - фермент аспартаткіназа, що відкриває метаболічний шлях, є аллостеріческій білком, чутливим до інгібування за принципом зворотного зв'язку при спільній дії побічних продуктів L-треоніну і L-лізину.
Щоб добитися утворення лізину у великих кількостях, отримують мутанти двох типів. У мутантів першого типу не синтезується або не функціонує гомосеріндегідрогеназа, в результаті чого блокується синтез метіоніну і треоніну. Мутанти другого типу дефектні по структурному гену, що детермінують конформацію аспартаткінази. У результаті фермент втрачає чутливість до високих концентрацій аллостеріческого інгібітора - лізину.
Виробництво триптофану. Подібно лізину триптофан утворюється в ході розгалуженого метаболічного шляху, тому для його виробництва використовують ауксотрофних мутантів, у яких блоковані реакції, які ведуть до синтезу природних амінокислот. Однак при вирощуванні мутантних штамів у середовищі з мінімальною концентрацією цих амінокислот, що не викликає регуляторних ефектів, надмірне накопичення триптофану в середовищі не спостерігається, що пояснюється особливістю процесів регуляції біосинтезу триптофану у мікроорганізмів.
Триптофан інгібує антранілатсінтетазу, тому для обходу метаболічного контролю синтез ферменту індукують ступінчастим введенням попередника - антранілової кислоти:

Хорізмовая кислота

Антранілатсінтетаза

Антранілової кислоти
Фенілаланін Тирозин Триптофан
Рис. 12. Схема розгалуженого біосинтезу фен, тир, і три Candida
У зв'язку з цією особливістю промислове виробництво триптофану організовано переважно за двоступеневою схемою. На першому етапі хімічним способом синтезують антранілової кислоти, яку за допомогою ензиматичного системи мутантних штамів дріжджів Candida utilis переводять у триптофан.
Крім триптофану мікробіологічними способом з використанням попередників отримують гістидин, ізолейцин, метіонін, серин і треонін.
Для отримання амінокислот - кінцевих продуктів нерозгалужених метаболічних шляхів, наприклад аргініну, ауксотрофние мутанти не використовують. У цьому випадку застосовують мутанти з дефектами регуляції біосинтезу амінокислоти, тобто регуляторні мутанти.
Виробництво вітамінів
Завдяки вивченню фізіології та генетики мікроорганізмів - продуцентів вітамінів і з'ясуванню шляхів біосинтезу кожного з них створена теоретична основа для отримання мікробіологічними способом практично всіх відомих в даний час вітамінів. Однак за допомогою ензимів доцільніше проводити лише особливо складні за будовою вітаміни: В _2, В _12, β-каротин (провітамін А) і попередники вітаміну D. Інші вітаміни або виділяють з природних джерел, або синтезують хімічним шляхом.
Отримання вітаміну В ₂ (рибофлавін). Аж до 30-х років минулого століття рибофлавін виділяли з природної сировини. У найбільшої концентрації він присутній в моркві та печінки тріски. З 1 т моркви можна ізолювати лише 1 г рибофлавіну, а з 1 т печінки - 6 г . У 1935 р. виявлено активний продуцент рибофлавіну - гриб Eremothecium ashbyii, здатний при вирощуванні на 1 т живильної суміші синтезувати 25 кг вітаміну В _2. Сверхсинтезу рибофлавіну домагаються дією на дикі штами мутагенів, що порушують механізм ретроінгібірованія синтезу вітаміну В _2, флавінових нуклеотидами. Відбір мутантів ведуть по стійкості до аналогу вітаміну В ₂ - розеофлавіну.
У 1983 р. у ВНДІ генетики мікроорганізмів сконструйований рекомбінантний штам продуцента Bacillus subtilis, характеризується збільшеною дозою Оперон, які контролюють синтез рибофлавіну. Клонуванням генів рібофлавінового оперона в одній із створених плазмід був отриманий виробничий штам-продуцент вітаміну В _2, здатний синтезувати втричі більше в порівнянні з E. Ashbyii кількість рибофлавіну всього за 40 год ферментації.
Отримання вітаміну В ₁₂ (ціанокобамід). Спочатку вітамін В ₁₂ отримували виключно з природної сировини, але з 1 т печінки можна було виділити лише 15 мг вітаміну. Єдиний спосіб його отримання в даний час - мікробіологічний синтез. Виявлення вітаміну в якості побічного продукту при виробництві антибіотиків в значній мірі стимулювало пошук організмів-продуцентів вітаміну і вивчення шляхів його освіти. Проте механізми регуляції біосинтезу вітаміну В ₁₂ до теперішнього часу повністю не розшифровані. Відомо, що при високих концентраціях вітамін повністю репресує синтез ключових ферментів свого новоутворення.
Продуцентами вітаміну В ₁₂ при його промисловому отриманні служать актиноміцети, метанобразующие і фотосинтезуючі бактерії, одноклітинні водорості. У 70-х роках ХХ ст. інтерес вчених привернули пропіоновокислі бактерії, відомі ще з 1906 р. і широко використовуються при приготуванні препаратів тваринництва. Виділено 14 видів пропіоновокислих бактерій, які продукують вітамін В _12.
Отримання β-каротину і вітаміну D _2. Β-Каротин можна виділити з ряду рослинних об'єктів - моркви, гарбуза, обліпихи, люцерни. На початку 60-х років ХХ ст. розроблена схема мікробіологічного синтезу β-каротину, яка стала основою промислового способу його отримання. Встановлено, що багато мікроорганізмів - фототрофні бактерії, актиноміцети, цвілеві гриби, дріжджі - синтезують каротин. Характерно, що вміст β-каротину у мікроорганізмів у багато разів перевищує вміст цього провітаміну у рослин. Так, в 1 г моркви є всього 60 мкг β-каротину, у той час як у 1 г біомаси гриба Blaneslea trispora - 3-8 тис. мкг.
Мікробіологічними способом отримують і вітамін D ₂ (ергокальциферол), при виробництві якого освоєно дешеву сировину (вуглеводні) і встановлений стимулюючий ефект ультрафіолетових променів на синтез ергостерину культурою дріжджів.
Виробництво органічних кислот
Отримання лимонної кислоти. Лимонну кислоту широко використовують у харчовій, фармацевтичній та косметичній промисловості. Нею заміняють фосфати у складі детергентів, так як вона повністю метаболізується живими організмами. Лимонна кислота утворює хелати з металами, тому її застосовують для їх очищення. Обсяг світового виробництва цитрату становить 400 тис. т / рік. Виробництво лимонної кислоти належить до числа найстаріших промислових мікробіологічних процесів: воно було організовано в 1893 р.
Для промислового виробництва лимонної кислоти використовують головним чином культуру гриба Aspergillus niger. Метаболічним джерелом лимонної кислоти в організмі служить цикл трикарбонових кислот. Реакція утворення лимонної кислоти, що каталізується цітратсінтазой, відкриває цикл Кребса. Цітратсінтаза визначає швидкість реакцій, що становлять цикл Кребса. Активність ферменту залежить від концентрації щук, зміст якої може підтримуватися за рахунок функціонування конститутивний піруваткарбоксілази, що забезпечує перемикання в аеробних умовах процесів гліколізу і гліоксілевого циклу. Швидкість обороту циклу Кребса визначається підтриманням необхідного рівня окислених форм коферментів дегідрогеназ, тому високий вихід цитрату виходить лише за умови гарної аерації. Дефіцит фосфату веде до сверхпродукціі цитрату.
Одночасно з лимонною було налагоджено виробництво молочної кислоти за участю молочнокислих бактерій роду Lactobacillus.
З 20-х років налагоджено промислове виробництво D-глюконової кислоти з глюкози за участю A. Niger. Глюконат натрію, у вигляді якого зазвичай виділяють глюконова кислоту, використовують для добування металів, боротьби з іржею, як миючий засіб і як медичний препарат.
Виробництва, засновані на ацетон-бутанольном бродінні і мікробіологічна конверсія етанолу в ацетат в даний час не рентабельні з економічних міркувань.
Біотехнологія отримання вторинних метаболітів
Біосинтез вторинних метаболітів фазоспеціфічен і відбувається по завершенні стадії росту, в ідіофазе, завдяки чому їх ще називають ідіолітамі. Серед вторинних метаболітів провідне місце за обсягом виробництва займають антибіотики.
Отримання антибіотиків
Організація широкомасштабного виробництва антибіотиків зіграла вирішальну роль у становленні промислової біотехнології. До антибіотиків відносяться низькомолекулярні ефектори спочатку природного походження, що здатні пригнічувати ріст живих клітин. Здатність нитчатой гриба зеленої цвілі Penicillium notatum викликати загибель мікроорганізмів вперше була встановлена в 1928 р. англійським мікробіологом О. Флеммінгом. Проте лікувальні властивості цієї цвілі були описані ще в 1871 р. російським дерматологом А.Г. Полотебнова. Кількість відкритих антибіотиків постійно зростає. У 1940 р. було відомо всього 6 антибіотиків, а в даний час описано більше 12 000 аналогічних сполук, з яких у клініці застосовують близько 200 препаратів. 97% відомих антибіотиків токсичні, тому в практиці не використовуються. Вишукування нових антибіотиків обумовлено як потребами практики, так і накопиченням резистентних форм мікроорганізмів по відношенню до багатьох антибіотиків.
Головний напрямок отримання нових антибіотиків полягає в хімічній трансформації природних молекул для створення напівсинтетичних антибіотиків. Методи отримання антибіотиків шляхом хімічного синтезу надзвичайно складні і не можуть конкурувати з їх біосинтезом методами біотехнології. Спрямований біосинтез антибіотиків здійснюється шляхом прямої ферментації мікроорганізму - продуцента з відповідним попередником, що індукує синтез ферментів вторинного метаболізму в ідіофазе. Введений попередник повинен лімітувати швидкість біосинтезу антибіотика. Наприклад, виробництво бензилпеніциліну в значній мірі стимулюється добавками його метаболічного попередника - фенілоцтової кислоти; пропіонова кислота і пропіловий спирт ініціюють біосинтез макролідів через метілмалонілКоА; L-фенілаланін - попередник фенілаланіну - прискорює утворення граміцидину S. Аналогічний ефект викликає використання інгібіторів метаболізму. Так, при придушенні процесу введення хлору мікроорганізм S. Aureofaciens утворює тетрациклін, а не хлортетрациклин.
Інший спосіб отримання антибіотиків полягає у використанні для їх біосинтезу блокованих мутантів, у яких відсутній (блоковано) певну ланку в ланцюзі реакцій, що ведуть до синтезу антибіотика. Блоковані мутанти не здатні утворювати потрібний антибіотик. Використовуючи низьку субстратне специфічність ферментів вторинного метаболізму і вводячи аналоги попередників антибіотика, останні переводять в аналоги самого антибіотика в ході процесу, відомого як мутаційний біосинтез або мутасінтез. Так, мутанти Nocardia mtditerranei, у яких порушена здатність до ацилювання, утворюють аналог попередника рифаміцинів По-рифаміцин SV.
Особливо успішні розробки в області біосинтезу напівсинтетичних пеніцилінів і цефалоспоринів. Отримання нових більш ефективних аналогів пеніциліну засноване на зміні природи його ацильної угруповання при збереженні у незмінному вигляді ядра пеніциліну - 6-амінопеніциланової кислоти (6-АПК). У промисловості 6-АПК отримують шляхом гідролізу природних пеніцилінів за допомогою специфічного ферменту - пеніцилінацилазою. Деякі з ацілаз здатні каталізувати і зворотні реакції - процеси ацилювання аміногрупи 6-АПК з утворенням модифікованого пеніциліну. Таким шляхом було отримано більше 4000 напівсинтетичних пеніцилінів.
Отримання промислово важливих стероїдів
Здатність клітин мікроорганізмів до складним процесам біотрансформації найбільш повно реалізувалася при отриманні промислово важливих стероїдів. Біотрансформація стероїдів звичайно полягає в селективному впливі на одне з положень стероїдного скелета. Перший промисловий процес (1937 р.) мікробної біотрансформації стероїдів грунтувався на технології спрямованого гідроксилювання (11-α-гідроксилювання) прогестерону.
Найважливіше джерело стероїдних гормонів (ендострани і естрани) - культура клітин рослин. Так, культура клітин диоскореи дельтоподібного (Dioscorea deltoidea) кореневого походження продукує фітостерини діосгенін і його глікозидні похідні (сапоніни). Подальші успіхи у виробництві стероїдних препаратів пов'язують із застосуванням іммобілізованих клітин.
1.5 Основи біологічної переробки відходів
Специфічне застосування біотехнологічних методів для вирішення проблем навколишнього середовища, таких, як переробка відходів, очищення води, усунення забруднень, становить предмет екологічної біотехнології.
Отримання біогазу
Біогаз - це суміш з 65% метану, 30% СО _2, 1% сірководню. Енергія, укладена в 28м ³ біогазу, еквівалентна енергії: 16,8 м ³ природного газу; 20,8 л нафти. В основі отримання біогазу лежить процес метанового бродіння або біометаногенез.
Біометаногенез - складний мікробіологічний процес, в якому органічна речовина розкладається до діоксиду вуглецю і метану в анаеробних умовах [7]. Мікробіологічному анаеробного розкладання піддаються практично всі сполуки природного походження. У анаеробному процесі біометаногенеза виділяють три послідовні стадії, в яких беруть участь понад 190 різних мікроорганізмів. На першій стадії під впливом екстрацелюлярний ферментів ферментативному гідролізу піддаються складні многоуглеродние сполуки - білки, ліпіди і полісахариди. На другій стадії (ацідогенез) у процесі ферментації беруть участь дві групи мікроорганізмів: ацетогенние і гомоацетатние. Ацетогенние Н _{2-продукують} мікроорганізми ферментують моносахариди, спирти і органічні кислоти з утворенням Н _2, СО _2, нижчих жирних кислот, в основному ацетату, спиртів і деяких інших низькомолекулярних сполук. Гомоацетатние мікроорганізми засвоюють Н ₂ і СО _2, а також деякі одноуглеродние з'єднання через стадію утворення ацетил-КоА і перетворюють його в низькомолекулярні кислоти, в основному в ацетат. На заключній третій стадії анаеробного розкладання відходів утворюється метан. Він може синтезуватися через стадію відновлення СО ₂ молекулярним воднем, а також з метильної групи ацетату.
4Н ₂ + СО ₂ = СН ₄ + 2Н ₂ О
3Н ₂ + СО = СН ₄ + Н ₂ О
2Н ₂ О + 4СО = СН ₄ + 3СО ₂
4НСООН = СН ₄ + 3СО ₂ + 2Н ₂ О
4 СН ₃ ОН = 3СН ₄ + СО ₂ + 2Н ₂ О
СН ₃ СООН = СН ₄ + СО ₂
90-95% використовуваного вуглецю метанобразующие бактерії перетворюють на метан і лише 5-10% вуглецю перетворюються на біомасу. Процес ведеться при температурі 30-60 º С і рН 6-8. Цей спосіб отримання біогазу широко застосовують в Індії, Китаї, Японії. В даний час для виробництва біогазу частіше використовують вторинні відходи (відходи тваринництва і стічні води міст), ніж первинні (відходи зерноводства, рільництва), які мають порівняно низькою реакційною здатністю і потребують попередньої обробки. Основна перевага біогазу полягає в тому, що він є відновлюваним та екологічно чистим джерелом енергії.
Очищення стічних вод
Методи очищення стічних вод [4]:
1. Механічні методи. Сутність цих методів полягає в тому, що із стічних вод шляхом відстоювання і фільтрації видаляють механічні домішки. Механічне очищення дозволяє виділяти з побутових стічних вод до 60-75% нерозчинних домішок, а з промислових - до 95%.
2. Хімічний метод. У стічні води додають різні реагенти (AL ₂ (SO _{4) 3),} які вступають в реакцію із забруднювачами й облягають їх у вигляді нерозчинних опадів. Хімічне очищення зменшує кількість нерозчинних домішок до 95%, а розчинних - до 25%.
3. Фізико-хімічні методи використовують для видалення тонкодисперсних і розчинених неорганічних домішок, а також руйнування органічних і погано окислюються речовин. В арсенал цих методів входять електроліз, окислення, сорбція, екстракція, іонообмінна хроматографія, ультразвук, високий тиск і ін
4. Біологічний метод заснований на використанні закономірностей біохімічного і фізіологічного самоочищення річок та інших водойм. Для очищення стічних вод використовують біофільтри, біологічні ставки і аеротенки.
У біофільтрах (перколяційні фільтри відомі с1890г.) Стічні води пропускають через шар грубозернистого матеріалу, покритого тонкою бактеріальною плівкою, завдяки якій інтенсивно протікають процеси біологічного окислення. З 1970 р. на зміну клінкеру та гравію, які в якості пористого матеріалу, прийшли пластмаси.
Аеротенки - величезні резервуари із залізобетону, у яких очищення відбувається за допомогою активного мулу (відомий з 1914 р.) з бактерій і мікроскопічних тварин, які бурхливо розвиваються в цих спорудах, чому сприяють органічні речовини стічних вод і надлишок кисню, що надходить з потоком повітря, що подається . Процес більш ефективний, ніж фільтрація, але характеризується високими експлуатаційними витратами (аерація).
З 1980 р. і до цього дня в технології очищення стічних вод застосовується принцип «псевдоожиженного шару» - поєднання перших двох систем. Реалізується цей принцип у вловлювачі Саймона-Хартлі (періодичне нарощування біомаси проводять у пустотах пористого поліефіру) і оксигенатори Доррі - Олівера (підкладкою служить пісок).
Після біоочищення проводять хлорування рідким хлором або хлорним вапном. Для дезінфекції використовують також ультразвук, озонування, електроліз.
Мікробне вилуговування
Методи вилучення міді з порід, що містять мінерали, шляхом обробки їх кислими розчинами використовуються вже багато століть. Проте лише в 50-і і 60-і роки ХХ століття з'ясувалося, що в отриманні металів з мінералів вирішальну роль відіграють бактерії [4]. У 1947 р. Колмер і Хінклі виділили з шахтних дренажних вод бактерію Tiobacillus ferrooxydans. Цей організм окислю двовалентне залізо і відновлював сірковмісні сполуки, а також, можливо, і деякі метали. Незабаром виявилося, що він бере участь у перекладі міді з рудних мінералів у розчин.
Окислювальним процесом, каталізуються бактеріями, є окислення заліза,
4FeSO ₂ + O ₂ + 2H ₂ SO ₄ = 2Fe ₂ (SO _{4) 3} + 2H ₂ O, (1)
і окислення сірки,
S ₈ + 12O ₂ + 8H ₂ O = 8H ₂ SO _4. (2)
Ряд мінералів безпосередньо окислюється деякими витравлюють організмами. Прикладами такого роду можуть бути окислення піриту,
2FeS ₂ + 15O ₂ + 2H ₂ O = 2Fe ₂ (SO _{4) 3} + 2H ₂ SO _4, (3)

і сфалериту,
ZnS + 2O ₂ = ZnSO _4. (4)
Іон тривалентного заліза служить сильним окислюючими агентом, що переводять в розчин багато мінералів, наприклад халькоціт,
Cu ₂ S + 2Fe ₂ (SO _{4) 3} = 2CuSO ₄ + 2Fe ₂ SO ₄ + S º, (5)
і уранініт,
UO ₂ + Fe ₂ (SO _{4) 3} = UO ₂ SO ₄ + 2FeSO _4. (6)
Вилуговування, що відбувається за участю іона тривалентного заліза, який утворюється в результаті життєдіяльності бактерій, називають «непрямий» екстракцією. В даний час бактеріальне вилуговування, відоме також як біогідрометаллургія або біоекстрактівная металургія, застосовується в промислових масштабах для перекладу в розчинну форму міді і урану.
Вилуговування мідних відвалів. Для початку процесу вилуговування відвал змочують водою, підкисленою сірчаною кислотою до рН 1,5-3,0. Цей кислий розчин, або «вищелачіватель», просочується крізь бідну руду або відвальні матеріали. Він містить кисень і вуглекислий газ і створює сприятливе середовище для розмноження ацидофільних гіобацілл, широко поширених в сульфідних рудах. У деяких випадках зміст Tiobacillus ferrooxydans перевищує 10 ⁶ клітин на 1 кг породи і на 1 мл витравлюють розчину. Цей організм активно окисляє розчинні іони двовалентного заліза (1) і впливає на сірку - і залізовмісні мінерали (2) (3). При окисленні мідно-сульфідних мінералів нерідко утворюється елементарна сірка (5). Ця сірка маскує частинки мінералів, обмежуючи вплив на них з боку тривалентного заліза. T. Ferrooxydans, присутня в кількості 10 ³ -10 ⁵ клітин на 1 г породи і на 1 мл розчину витравлюють, окисляє деякі розчинні сполуки сірки та елементарну сірку (2). Руйнування сірки цим організмом призводить до видалення маскуючого шару сірки, навколишнього деякі частинки мінералів, і підсилює процес вилуговування. З вилуговується відвалів випливають розчини, що містять 0,75-2,2 г міді в 1 л. Ці розчини направляють у відстійники; мідь з них отримують шляхом осадження з використанням заліза або екстракцією розчинниками. «Відпрацьовані» витравлюють розчини знову надходять у відвал.
Вилуговування урану. Бактеріальне вилуговування урану застосовували в східних районах Канади для вилучення залишкового урану на вже вироблених площах, а також з відвалів. Для зростання бактерій достатньо 3-4 місяців, за цей час T. Ferrooxydans окисляє залізо до тривалентного стану. Потім тривалентне залізо окисляє відновлений уран до розчинної окисленого стану відповідно до реакцією (6). Промивні води, що містять уран, збирають і беруть із них уран за допомогою іонного обміну або екстрагують розчинниками. Бактеріальне вилуговування застосовувалося в Канаді і в якості первинного засобу для отримання урану. Рудне тіло руйнували вибухом і здійснювали вилуговування in situ.
Практичне застосування бактеріального вилуговування стримується через низку причин. Головна перешкода полягає в тому, що процес ще погано досліджено як на досвідчених установках, так і в польових умовах. Процеси бактеріального вилуговування нерідко протікають повільніше, ніж хімічні процеси. Для бактерій, що окислюють залізо і сірку, потрібно кисле середовище. Тому для переробки непридатні руди і відходи, що поглинають кислоти у великій кількості. При підземному вилуговуванні за допомогою розчинів слід брати до уваги такі чинники, як вплив на активність бактерій підвищеного гідростатичного тиску і гіпербаричної оксигенації.
Біотехнологія багатолика і за своїм історичним корінням, і за своєю сучасній структурі, що об'єднує елементи фундаментальних наук і прикладних досліджень. Її розвиток дозволяє істотно підвищувати ефективність використання природних ресурсів, вирішувати екологічні проблеми, створювати нові джерела енергії. Очевидно, що нові «стрибки» біотехнології глибоко позначаться на долі людства.
Саме тому ми вважаємо за необхідне більш докладне вивчення даного розділу в шкільному курсі хімії і пропонуємо розробку методичних рекомендацій, що дозволяють зробити дане вивчення найбільш ефективним.

2. Зміст питань біотехнології в шкільному курсі хімії
2.1 Аналіз шкільних програм і підручників [15]
Основними ідеями сучасної концепції шкільної хімічної освіти є ідеї гуманізації і демократизації освіти, згідно з якими «слід подолати відчуження науки і виробництва від людини. У процесі навчання хімії необхідно розкривати зв'язок між хімічними знаннями і повсякденним життям людини ... [10] »
Програма В.В. Пасічника для 11 класу в курсі загальної біології містить тему «основи селекції та біотехнології». Зачіпаються наступні питання: мікробіологічне виробництво харчових продуктів, вітамінів, ферментів і ліків, проблеми та перспективи біотехнології, генна інженерія її досягнення та перспективи.
В.Б. Захаров в програмі, рекомендованої для 10-11 класів з поглибленим вивченням біологічних дисциплін в курсі загальної біології в темі «основи генетики і селекції» також зачіпає біотехнологію і генетичну інженерію.
Необхідно відзначити, що якщо базовий стандарт з хімії не передбачає вивчення питань біотехнології, то такою з біології містить найбільш загальні її аспекти: досягнення генної інженерії та перспективи біотехнології.
2.2 Міжпредметні зв'язки з вивчення аспектів біотехнології в середній школі
За програмою Р.Г. Іванової та Л.А. Цвєткова в 10 класі передбачено вивчення теми «промислове отримання найважливіших неорганічних речовин» (15 годин), при цьому порушується питання охорони навколишнього середовища від забруднення. Вважаю доречним зачіпання теми переробки відвалів металургійних підприємств біологічними методами (мікробне вилуговування).
О.С. Габрієлян пропонує в 9 класі тему-модуль «хімічні речовини в сільському господарстві» (5 ч.). При розгляді проблеми захисту навколишнього середовища від пестицидів можливо акцентування уваги учнів на сучасних розробках в цій області (ГМ рослини, резистентні до пестицидів і шкідників). У модулі «хімія і екологія» (9 кл. 5 ч.) розглядаються основні джерела забруднень гідросфери і сучасні способи очищення стічних вод.
У підручнику О.С. Габрієляна, Ф.Н. Маскаєва, С.Ю. Пономарьова, В.М. Теренін для 10 класу розглядається тема «біологіческіактівние з'єднання» зачіпає застосування ферментів в промисловості, а також гормональні препарати, вітаміни і антибіотики. Т.ч. тут доречно розгляд основних біотехнологічних прийомів отримання даних БАР.
У 11 класі програмою передбачається розгляд теми «хімія і суспільство» (8 год). Необхідно відзначити наявність в ній наступних питань: біотехнології та генна інженерія, а також хімія і їжа. У підручнику О.С. Габрієляна Г.Г. Лисової, що реалізують цю програму, тема містить об'ємний матеріал, але методів очищення стічних вод і біохімічних основах харчової промисловості практично нічого не відводиться.
Н.С. Ахметов у 9 класі при вивченні «металургії» зачіпає проблеми безвідходного виробництва та охорони навколишнього середовища. При цьому можливе включення основ біометаллургіі. Також автор пропонує розгляд теми «хімія та охорона навколишнього середовища», зокрема питань охорони гідросфери.
У підручнику 10-11 класів у розділі «хімія і хімічна технологія» розглядається виробництво етанолу з деревини, а також «охорона гідросфери» і «біогеохімічні процеси».
Г.І. Шелінскій передбачає тему «роль хімії у прогресивному розвитку людського суспільства» в 11 класі.
Програма Н.Є. Кузнєцової, І.П. Титової, О.Ю. Жегіна, М.М. Гара призначена для загальноосвітніх установ природничого профілю, тому в ній простежується екологізація курсу хімії. Автори розкривають роль хімії у забезпеченні життя та прогресивному розвитку суспільства. І в 10 класі пропонуються теми: «речовини живих клітин» - поліпептиди в природі (гормони, антибіотики), а також «особливості процесів біотехнології» - мікробіологічний синтез, застосування генної інженерії та білкової інженерії, бактеріальне вилуговування, проблеми екологічного та гуманітарного характеру.
У 11 класі автори рекомендують теми «гідросфера», де розглядаються біологічні методи очищення води і «біосфера», де порушується проблема мікробіологічного білка.
Л.С. Гузей, Р.П. Суровцева і Л.М. Кузнєцова у своїх програмах не зачіпають, в явній формі, питання біотехнології.
2.3 Оптимізація вивчення основних напрямів біотехнології в середній школі
Проаналізувавши шкільні підручники і програми щодо вмісту в них матеріалу з питань біотехнології, можна зробити висновок про те, що далеко не всі програми передбачають розгляд останніх, а якщо і розглядають, то в неповному обсязі. Таким чином, крім розробки єдиного комплексу уроків (елективний курсу) за темою «особливості процесів біотехнології» ми пропонуємо приблизний план включення матеріалу з біотехнологічним ухилом в «стандартні» теми шкільного курсу хімії.
Функція включення матеріалу, у формі елективного курсу - внутрішньопрофільна спеціалізація навчання, у формі комплексу фрагментів - розширення знань учнів, подолання відірваності навчального матеріалу від життя [1].

3. Розробка елективного курсу та педагогічний експеримент
3.1 Тематичне планування елективного курсу «Основи біотехнології»
1. Біотехнологія. Біотехнологічні процеси в харчовій промисловості.
2. Біотехнологічна переробка відходів.
3. Бактеріальне вилуговування.
4. Основи одержання БАР. Виробництво кормового білка.
5. Виробництво амінокислот, вітамінів і антибіотиків.
6. Застосування ферментів.
7. Практична робота «Приготування іммобілізованих ферментних препаратів.
8. Основи генної інженерії.
9. Застосування генної інженерії.
10.Ітоговая перевірочна робота.
3.2 Поурочне планування елективного курсу
УРОК № 1 по темі «Біотехнологія. Біотехнологічні процеси в харчовій промисловості »
Завдання:
1. Освітня: знайомство з біотехнологією як яскравим прикладом інтеграційних взаємодій наукових дисциплін. Хронологія розвитку біотехнології. Основні біотехнологічні процеси в харчовій промисловості допастеровской ери.
2. Розвиваюча а) розвиток пізнавального інтересу учнів при знайомстві з даним напрямком людської діяльності;
б) формування логічного мислення в ході вивчення нового матеріалу;
в) формування умінь і навичок розумового і практичного праці.
3. Виховна: а) з метою формування діалектичного світогляду показати пізнаванність природи, на прикладі впливу людини на біотехнологічні процеси харчової промисловості;
б) виховання такту і дисципліни на заняттях у загальноосвітній школі.
Хід уроку:
1. Організація класу
2. Актуалізація знань
Біотехнологія - що це таке? (Думки учнів)
Біотехнологія - використання в промисловості біологічних систем або процесів (під запис).
Важливо те, що людина змогла створити літак за принципом птиці, многоотсечние підводні човни за принципом кільчастих хробаків (біоніка - наслідування природі), але навіть не зміг наблизитися до унікальності біологічних систем щодо впізнавання і каталізу (згадайте специфічність та активність ферментів).
Людина використовував біотехнологію багато тисяч років: люди займалися пивоварінням, пекли хліб. Вони придумали способи збереження і переробки продуктів шляхом ферментації (сир, оцет), виготовляли найпростіші ліки і т.д. Однак тільки розробка методів генетичної інженерії призвела до «біотехнологічному буму», свідками якого ми є.
3. Вивчення нового матеріалу
Але підемо по порядку.
У своєму сучасному варіанті біотехнологія, мабуть, наука синтетична:

біохімія
мікробіологія генетика
електроніка
хімічна технологія харчової
технологія промисловості
інженерна
технологія

біотехнологія

Але у вас не має бути думка про неї як про прикладну дисципліни: «Ні і ще тисячу разів ні: я не знаю такої науки, яку можна було б назвати прикладною. Є наука і є області її застосування, і вони пов'язані один з одним, як плід з виростив його деревом »(Луї Пастер, 1871 р.)
З'їзд європейської асоціації біотехнологів розділив розвиток біотехнології на п'ять етапів: (під запис) [16]
1) допастеровская ера (до 1865 року) - самобутні виробництва пива, вина, хліба, сиру;
2) послепастеровская (1866-1940) - виробництво органічних кислот, розчинників, кормових дріжджів, вакцин, очищення стічних вод.
У кінці 19 століття Луї Пастер встановив, що мікроби відіграють ключову роль у процесах бродіння, і показав, що в утворенні окремих продуктів беруть участь різні їх види;
3) ера антибіотиків (1941-1960) - початком якої послужило відкриття Олександром Флемінгом здібності Penicillium викликати загибель мікроорганізмів;
4) ера керованого біосинтезу (1961-1975) - виробництво амінокислот, вітамінів, ферментів. Досягнення, головним чином, селекції та біохімії мікроорганізмів;
5) ера генетичної інженерії (70-ті роки) - технологія гібридних ДНК.
Сьогодні ми розберемо основні процеси допастеровской ери - виробництво деяких продуктів харчування (таблиця виконується на дошці).

Харчовий продукт	Зброджують організми	Основний процес
Молочнокислі продукти	Стрептококи, молочнокислі бактерії	Молочнокисле бродіння: C ₆ H ₁₂ O ₆ 2CH ₃ CH (OH) COOH глюкоза молочна кислота
Сир	Молочнокислі бактерії, Ренін з сичуга	Маслянокислое бродіння: C ₆ H ₁₂ O ₆ CH ₃ CH ₂ CH ₂ COOH + глюкоза масляна кислота + 2CO ₂ + 2H ₂ + утворення згустку казеїну
Сметана, вершкове масло	Особливі молочнокислі бактерії	Лимоннокислий бродіння: C ₆ H ₁₂ O ₆ + H ₂ O = C ₆ H ₈ O ₇ + 3Н ₂ лимонна кислота
Хлібопродукти	Дріжджі Saccharomyces	Анаеробне зброджування глюкози: C ₆ H ₁₂ O ₆ = 2C ₂ H ₅ OН + 2СО ₂
Ізоглюкози («кукурудзяний сироп»)	Гідролази і ізомерази різних мікроорганізмів	Гідроліз крохмалю: (C ₆ H ₁₀ O _{5) n} + n H ₂ O = n C ₆ H ₁₂ O ₆ глюкоза Ізомеризація глюкози: 2n C ₆ H ₁₂ O ₆ = n C ₆ H ₁₂ O ₆ + n C ₆ H ₁₂ O ₆ глюкоза глюкоза фруктоза
Пиво, вино	Дріжджі Saccharomyces	Анаеробне зброджування глюкози: C ₆ H ₁₂ O ₆ = 2C ₂ H ₅ OН + 2СО ₂
Оцет (≥ 4 º)	Acetobacter	Аеробне окислення спирту: (1) C ₂ H ₅ OН + 1/2О ₂ = [CH ₃ C (O) H] + Н ₂ О ацетальдегід (2) CH ₃ C (O) H + 1/2О ₂ = CH ₃ CОOH оцтова кислота

Висновок
Отже, чи змінилося ваше уявлення про біотехнології, виробництві продуктів харчування?
УРОК № 2 по темі «Біологічна переробка відходів»
Завдання:
1. Освітня: вивчення основ одержання біогазу і очищення стічних вод. Знайомство з екологічної біотехнологією.
2. Розвиваюча: а) розвиток пізнавального інтересу при знайомстві з новим напрямком біотехнології;
б) формування логічного мислення в ході систематизації матеріалу;
в) формування умінь і навичок розумового і практичного праці.
3. Виховна: а) з метою формування діалектичного світогляду показати використання людиною процесів і об'єктів живої природи для потреб суспільства;
б) виховання мотивації до навчання у зв'язку актуальності екологічних проблем у сучасному світі.
Хід уроку:
1. Організація класу
Згадайте, який етап розвитку біотехнології ми розібрали на попередньому уроці?
Який хімічний процес лежить в основі всіх бродильних (спиртових) виробництв?
2. Актуалізація знань
Ні для кого з вас не секрет, що людина в ході своєї діяльності створює велику екологічне навантаження навколишнього середовища (приклади учнів). І тут біотехнологія внесла і вносить свій вклад. Під запис: специфічне застосування біотехнологічних методів для вирішення проблем навколишнього середовища, таких як переробка відходів, очищення води, усунення забруднень, становить предмет екологічної біотехнології.
3. Вивчення нового матеріалу
(Основна частина уроку проходить у формі лекції, що дозволяє компактно передати учням укрупнену дидактичну одиницю)

відходи
побутові (Стічні води міст, с / г відходи дрібних господарств тощо)	промислові (Відвали металургійних підприємств, стоки хімічних комбінатів і т.д.)

На сьогоднішньому уроці ми «займемося» побутовими відходами.
Необхідно зазначити, що проблемою очищення стічних вод зайнялися тільки в 1890 році, коли був запропонований перший біофільтр. Взагалі, всі біологічні методи очищення стічних вод засновані на використанні закономірностей самоочищення водойм.
Для очищення використовують:
а) біофільтри - стічні води пропускають через шар грубозернистого матеріалу, покритого тонкою бактеріальною плівкою, завдяки якій інтенсивно протікають процеси біологічного окислення. З 1970 року на зміну клінкеру і гравію в якості пористого матеріалу прийшли пластмаси. Таким чином, бачимо поєднання механічної (пористий носій) і біологічного (біодеградація органічних залишків) очищення стічних вод. Недолік - надмірний ріст мікроорганізмів і, як наслідок, засмічення фільтра.
б) біологічні ставки - відстійні квітучі водойми. Характеризуються малою ефективністю і великим часом самоочищення.
в) аеротенки - відомі з 1914 року. Саме 1914 вважається роком народження біоочищення стічних вод. Аеротенки - це величезні резервуари із залізобетону, у яких очищення відбувається за допомогою активного мулу з бактерій (Zoogloea) і мікроскопічних тварин. Процес очищення безперервний, аеробний, тобто потребує активної аерації повітрям (звідси високі експлуатаційні витрати) і високо ефективний.
г) «псевдозрідженим шар» - застосовується з 1980 року до цього дня. «Псевдозрідженим шар» - це поєднання біофільтра і активного мулу. Підкладка - полімерний носій або пісок. Процес періодичний і не вимагає аерації. Після біоочищення проводять дезінфекцію рідким хлором, хлорним вапном, УЗ, озоном або електролізом.
Яким би способом не проводилася біоочищення стічних вод, в кінці маємо надлишкову біомасу. Найбільш ефективний спосіб утилізації - анаеробне бродіння з отриманням біогазу.
Біогаз - суміш 65% СН _4; 30% СО _2; 1% Н ₂ S ... NH ₃ ...
Енергія 1,7 м ³ біогазу еквівалентна енергії 1м ³ природного газу. В основі отримання біогазу лежить процес метанового бродіння або біометаногенез. Біометаногенез - складний мікробіологічний процес розкладання органічної речовини до СО ₂ і СН ₄ в анаеробних умовах (під запис).
Беруть участь понад 190 мікроорганізмів.
Стадії:

I. Білки амінокислоти Ліпіди ВШК і гліцерин Полісахариди моносахара	II. H ₂ + СО ₂ + НЖК (СН ₃ СООН) + нижчі спирти (В основному)
III. Освіта метану: (1) 4H ₂ + СО ₂ = СН ₄ + 2Н ₂ О ... (2) 4СН ₃ ОН = 3СН ₄ + СО ₂ + 2Н ₂ О (3) СН ₃ СООН = СН ₄ + СО ₂

90-95% використовуваного вуглецю перетворюється на метан, решта в біомасу. Температура процесу 30-60 º С; рН ~ 7. Основна перевага біогазу - поновлюваний і екологічно чисте джерело енергії.
Висновок
Отже, що ж ми сьогодні вивчили? Яку роль, на вашу думку, може зіграти технологія біометаногенеза в найближчому майбутньому в світлі дефіциту енергоносіїв?
УРОК № 3 по темі «Бактеріальне вилуговування»
Завдання:
1. Освітня: розширити відомості учнів про переробку відходів на прикладі використання промислових відвалів. Розгляд основних процесів мікробного вилуговування. Промислове використання на прикладі переробки мідних відвалів.
2. Розвиваюча: а) розвиток пізнавального інтересу в процесі знайомства з матеріалом;
б) формування логічного мислення в ході дедуктивного викладу матеріалу;
в) формування умінь і навичок розумового і практичного праці.
3. Виховна: а) з метою формування діалектичного світогляду показати, що, при всій незвичайності процесів мікробного вилуговування, вони закономірно вписуються в загальну біотрансформацію неорганічних речовин;
б) «прищеплення» екологічного світогляду.
Хід уроку:
1. Організація класу
Які види очищення стічних вод ви можете назвати? Як ви розумієте поняття біометаногенез?
2. Актуалізація знань
Ще за 1000 років до н.е. фінікійці витягували мідь з рудничних вод. Валлійці (Британські острови) в 17 столітті описали аналогічний процес. Сьогодні ми спробуємо розібратися в секреті стародавніх металургів. Тема уроку: «Бактеріальне вилуговування».
3. Вивчення нового матеріалу
1947 р. - Колмер і Хінклі виділили з шахтних вод бактерію Thiobacillus ferrooxydans. Спробуйте перекласти назву на російську мову («Серобацілла железоокіслітельная»).
І справді цей вид здійснює процес:

Fe ^{2 +} Fe ^{3 +,} що відповідає окисленню заліза.
Даний вид бактерій ставитися до групи хемосинтезирующих автотрофів (згадайте, що це таке), відкритих Виноградским в 1920-і роки. Пізніше були виявлені Thiobacillus thiooxydans - організми, що живуть у середовищі при рН = 0,65, і Sulfolobus, «що зазнають» до 85 º С. Ці бактерії існують за рахунок окислення сірки.
T.ferrooxydans

4Fe ^{2 + +} O ₂ + 4H ⁺ 4Fe ^{3 + +} 2H ₂ O
Sulfolobus

S ₈ + 12O ₂ = 8 H ₂ O 8H ₂ SO ₄
T.thiooxydans

ZuS + 2O ₂ ZuSO ₄
T. ferro-/thiooxydans

4FeS ₂ + 15O ₂ + 2H ₂ O 2Fe ₂ (SO _{4) 3} + 2H ₂ SO ₄
Зверніть на останні два процеси особливу увагу, тому що дані процеси «розчинення» мінералів сфалериту (ZuS) і піриту (FeS ₂₎ йдуть в земній корі і можуть бути використані людиною як альтернатива
t
2ZuS + 3O ₂ = 2ZuO +2 SO _4, що дає багато забруднювачів атмосфери.
Особливий інтерес для промисловості презентує переклад в розчин напівдорогоцінного міді:

Cu ₂ S + 4Fe ^{3 +} = 2 Cu ^{2 + +} 4Fe ^{2 + +} S

T.ferrooxydans Sulfolobus H ₂ SO ₄
Даний процес дозволяє переробляти бідні руди і відвали з вмістом міді 0,4% (w).
Можливі схеми проведення:

I. р-р H ₂ SO ₄

(РН = 2)

збір продукту

II. р-р H ₂ SO ₄ відкачка

О ₂ продукту

III. Чанов вилуговування (менше втрат)

Продукт: р-р, містить 0,75 - 2,2 г / л міді:

Cu ^{2 + +} Fe = Cu + Fe ^{2 +} (можна показати меднение цвяха в розчині мідного купоросу)
Утворений розчин Fe ^{2 +} знову направляють у відвал.
· Проблеми:
1) Бактерії живуть тільки в кислому середовищі. Що буде відбуватися при контакті витравлюють розчину з вапняними породами?
2) Втрати розчину і можливе змішування з грунтовими водами.
3) Розігрівання породи при «роботі» бактерій (зафіксовано до 80 º С) і як наслідок стерилізація.
4) Інженерні проблеми введення кислоти і повітря в породу.
· Перспективи:
1) Видалення сірки з кам'яного вугілля. Подумайте, як це можна зробити.
2) Витяг металів з морської води (Au) - залучення ГМО.
4. Висновок
Отже, за бажання людина може застосовувати природозберігаючі технології навіть при розробці мідних, і не тільки, руд.
УРОК № 4 по темі «Основи одержання БАР. Виробництво кормового білка »
Завдання:
1. Освітня: вивчення основних механізмів інтенсифікації процесів отримання продуктів клітинного метаболізму. Виробництво кормового білка як попередник керованого біосинтезу БАР.
2. Розвиваюча: а) розвиток пізнавального інтересу учнів;
б) формування логічного мислення в ході вивчення механізмів інтенсифікації процесів отримання продуктів клітинного метаболізму;
в) формування умінь і навичок розумового і практичного праці.
3. Виховна: а) з метою формування діалектичного світогляду показати можливість впливу людини на процеси клітинного метаболізму;
б) виховання мотивації до навчання.
Хід уроку:
1. Організація класу
Напишіть рівняння хімічних процесів лежать в основі мікробіологічного вилуговування мідних відвалів, руд, що містять пірит.
2. Актуалізація знань
Усім вам добре відомі вітамінні препарати, що продаються повсюдно в аптеках. Антибіотики як засіб від багатьох збудників захворювань міцно увійшли в наше життя. Постає питання, якими методами отримують в промисловості все ці сполуки. Перш, ніж говорити про отримання, згадаємо, що з себе представляє предмет нашої розмови.
3. Вивчення нового матеріалу
Вітаміни - група низькомолекулярних природних органічних сполук, абсолютно необхідних для гетеротрофних організмів (що це за організми?). Автотрофні організми мають здатність до синтезу вітамінів. (Під запис)
Антибіотики - низькомолекулярні регулятори зазвичай природного походження, що здатні пригнічувати ріст живих клітин.
Отже, в процесі росту організми виробляють різні низькомолекулярні (які ще ви знаєте?) Продукти (метаболіти). Вони поділяються на первинні (абсолютно необхідні) і вторинні (не потрібні для виживання).

низькомолекулярні метаболіти
первинні (Структурні одиниці біополімерів, вітаміни, органічні кислоти)	вторинні (Антибіотики, пігменти, токсини)

Таким чином, вторинні метаболіти підвищують адаптаційні можливості організмів.

маса організму I - первинні метаболіти
II - вторинні (синтезуються
на завершальній стадії росту)

час росту
До яких метаболітам ви віднесете амінокислоти, вуглеводи? Чому?
У нормі обмін речовин в клітині здійснюється за принципом найсуворішої економії. Завдання біотехнолога полягає в забезпеченні сверхсинтезу одного з продуктів метаболізму, що забезпечується такими методами:
1) Зміна генетичної програми організму:
а) селекція - спрямований відбір організмів із стрибкоподібним зміною геному. Але для виникнення мутації цікавить нас ген повинен подвоїтися ~ 10 ⁷ разів.
б) штучний мутагенез - хімічний, УФ, радіаційний.
2) Порушення регуляторних систем організму: (на дошці)

Ф Ф '

А Б З

блокування ферменту кінцевим метаболітом

Якщо Д (теж блокує Ф) - антиметаболіт С, тобто Д не включається в обмін, то на середовищі з Д виживають організми з дефектами регуляції.

Сьогодні ми розглянемо також виробництво кормового білка як прообраз сучасного керованого біосинтезу амінокислот, вітамінів і антибіотиків.
Відповідно до норм харчування людина повинна щодня отримувати з їжею 60-120 р. повноцінного білка (що містить всі незамінні амінокислоти). Незамінні амінокислоти найбільш збалансовані в білках насіння сої, також рису і гороху. У білках зерна пшениці мало лізину, метіоніну і ізолейцин.
Особливий інтерес представляє використання мікроорганізмів в якості джерела білка і вітамінів:
1) використання різноманітних середовищ для культивації (аж до відходів виробництва);
2) висока інтенсивність росту
подвоєння білкової маси: велика рогата худоба - 5 років,
свині - 4 місяці,
дріжджі - 1-6 годин;
3) підвищений вміст незамінних амінокислот;
4) відносна простота впливу на процеси синтезу.
Дріжджові клітини здатні використовувати рідкі фракції вуглеводнів нафти (10-30 º С). У Росії перший завод з виробництва кормових дріжджів з рідких парафінів нафти вступив в дію в 1971 році. При вирощуванні в середу додають також мінеральні солі, вітаміни і воду. Отримана висушена дріжджова маса гранулюється і використовується як білково-вітамінний концентрат (БВК), що містить до 60% білкових речовин.
Хорошим субстратом для вирощування кормових дріжджів є молочна сироватка - відхід при переробці молока, а також нижчі спирти. Хороший резерв харчового білка і вітамінів - залишкові пивні дріжджі. Організм людини засвоює понад 90% поживних речовин, що містяться в них.
Відомо також більше 30 видів бактерій, які можуть бути застосовані в якості джерела повноцінного білка. Наприклад, водородоокісляющіе бактерії здатні накопичувати в клітинах до 80% сирого протеїну (середа 75% Н _2, 20% О _2, 5% СО _2).
Використовуються також одноклітинні водорості (Chlorella, Seenedesmus). Зазвичай їх вирощують у природних умовах південних регіонів у басейнах відкритого типу (70 т / га в рік).
Мікопротеін - білок грибного походження. Середа культивації - глюкозний сироп (гідролізат кукурудзяного крохмалю).
4. Висновок
Отже, гострота проблеми глобального перенаселення, скорочення с / г площ у результаті зростання міст і деградації земель виводить нас на новий виток розвитку біотехнології, а саме, великомасштабне використання мікроорганізмів для напрацювання білково-вітамінної продукції.
УРОК № 5 по темі «Виробництво амінокислот, вітамінів і антибіотиків»
Завдання:
1. Освітня: вивчити приклади деяких виробництв амінокислот, вітамінів і антибіотиків. Інші промислово важливі процеси ери керованого біосинтезу: виробництво лимонної і молочної кислот.
2. Розвиваюча: а) розвиток пізнавального інтересу учнів у процесі ознайомлення з матеріалом;
б) формування логічного мислення;
в) формування умінь і навичок розумового і практичного праці.
3. Виховна: а) з метою формування діалектичного світогляду показати використання людиною природних систем для одержання деяких БАР;
б) виховання мотивації до навчання у зв'язку з важливістю біотехнологічних методів у сучасній хімічної промисловості.
Хід уроку:
1. Організація класу
Які компоненти використовуються при отриманні БВК?
2. Актуалізація знань
На попередньому уроці ми познайомилися з можливими шляхами забезпечення сверхсинтезу одного їх продуктів метаболізму (якими?), А сьогодні спробуємо розглянути конкретні виробництва.
3. Вивчення нового матеріалу
I. Виробництво амінокислот
Серед сполук, отриманих біотехнологічними методами, амінокислоти займають перше місце за обсягом виробництва (500 тис. т / рік).
Білкові амінокислоти можна отримати:
1) гідролізом природного белоксодержащего сировини, але кислотне вплив руйнує деякі амінокислоти;
2) хімічним синтезом, в ході якого виходить трудноразделімая суміш цільового продукту і його аналогів;
3) мікробіологічним синтезом, який забезпечується поновлюваних сировиною і характеризується строгістю чистоти одержуваного продукту. Понад 60% вироблених амінокислот отримують саме цим методом.
Промислове виробництво амінокислот стало можливим після відкриття здатності деяких мікроорганізмів виділяти у культурне середовище значні кількості будь-якої амінокислоти (1955). Corynebacterium glutamicum був здатний, крім того, до сверхсинтезу глутаміну, і в 1956 році цей мікроорганізм був використаний при організації першого в світі виробництва глутамінової кислоти (Ноосі-СН _{2-СН 2-СН} (NH ₂₎ COOH). Зараз на глутамат натрію припадає 300 тис. т / рік, тобто 60% виробництва амінокислот. Японці називають глутамат натрію «сіллю смаку», тобто він значно продовжує смакові відчуття.
Лізина проводиться 100 тис. т / рік. Дана амінокислота H ₂ N (CH _{2) 4} CH (NH ₂₎ COOH - незамінний компонент харчування с / г тварин. У клітинах мікроорганізмів лізин служить кінцевим продуктом розгалуженого метаболічного шляху, і ефекту накопичення в середовищі цільової амінокислоти домагаються шляхом блокування процесів, що ведуть до синтезу побічних продуктів. Отримувані мутанти дефектні по ферменту розгалуження метаболічного шляху, в результаті чого накопичується тільки лізин. В якості поживного середовища використовують молочну сироватку або гідролізати крохмалю.
Деякі амінокислоти синтезують з попередників, отриманих хімічно і модифікованих ферментної системою організму (триптофан отримують з антранілової кислоти).
II. Виробництво вітамінів
В даний час мікробіологічно синтезують лише особливо складні за будовою вітаміни (В _2, В _12, β-каротин, D). Інші або синтезують хімічним шляхом, або виділяють з природних джерел.
Вітамін В ₂ (рибофлавін) аж до 30-х років 20 століття виділяли з природної сировини (1г з 1т моркви і 6г з 1т печінки тріски). У 1935 році був виявлений активний продуцент рибофлавіну - гриб Eremothecium, здатний давати з 1т живильного середовища 25 кг вітаміну. Відбір мутантів ведуть по стійкості до аналогу вітаміну В _2.
Вітаміну В ₁₂ з 1т печінки тріски можна було виділити лише 15 мг. В даний час вітамін В ₁₂ синтезується тільки мікробіологічними шляхом з використанням актиноміцетів і одноклітинних водоростей.
β-каротин можна виділити з ряду рослинних об'єктів: 1т моркви містить 0,06 мг вітаміну, в той час як біомаса гриба Blaneslea накопичує β-каротин у кількості 8 мг / м.
III. Отримання органічних кислот
Обсяг світового виробництва лимонної кислоти НООССН ₂ С (ОН) (СООН) СН ₂ СООН - 400 тис. т / рік. Дане виробництво відноситься до найстаріших мікробіологічних процесів: 1893 р. - рік заснування. Використовують культуру гриба Aspergillus niger. Умовами високого виходу лимонної кислоти є хороша аерація і дефіцит фосфату в середовищі.
Одночасно з лимонною було налагоджено аналогічне виробництво молочної кислоти за участю молочнокислих бактерій Lactobacillus.