Зміст
Введення
Біотехнологія на варті врожаю
Біотехнологічні аспекти боротьби зі збудниками хвороб рослин
Біотехнологічні аспекти боротьби з шкідливими комахами
Отримання рослин-регенерантів, стійких до абіотичних і біотичних стресових факторів методами клітинної інженерії
Отримання рослин-регенерантів, стійких до абіотичних і біотичних стресових факторів методами клітинної інженерії
Список літератури
Введення
Найважливіше місце біотехнології і біоінженерії належить в сучасній селекції рослин на стійкість і якість продукції, створення нового покоління сортових ресурсів країни та світу. Основні дослідження біотехнологів спрямовані на створення поліпшених і принципово нових генотипів сільськогосподарських рослин, які мають одиничної, груповий або комплексною стійкістю до біотичних або абіотичних стресових факторів середовища при збереженні і підвищенні продуктивності та якості. Епіфітотійний характер поширення найбільш небезпечних грибкових, вірусних та бактеріальних захворювань культурних рослин, що знищують до 30% (а іноді і більше) врожаю, створили в Росії та ряді інших країн світу ситуацію, при якій потреба в оновленні сортових ресурсів сільськогосподарських культур на основі поєднання традиційних методів селекції і нових методів біотехнології стала виключно гострою.
Біотехнологія на варті врожаю
В даний час значна частина врожаю сільськогосподарських рослин - близько 30% - гине від шкідників і хвороб. Зусилля фахівців в області захисту рослин - галузі сільськогосподарської науки, що розробляє методи і прийоми боротьби-з хворобами, шкідниками і бур'янами культурних рослин - поки не дають бажаних результатів. У зв'язку з цим необхідно шукати принципово нові підходи до вирішення надзвичайно актуальної проблеми захисту рослин. І тут на допомогу людині приходить біотехнологія. Так, наприклад, використання методу культури ізольованих органів і тканин рослин дозволяє отримувати у великій кількості оздоровлений (безвірусні) посадковий матеріал.
Розвиток біотехнології дозволило абсолютно по-новому оцінити методи, використовувані для захисту рослин. Так, наприклад, у світлі досягнень біотехнології стало очевидним, що ми явно недооцінюємо можливості біологічного методу боротьби з шкідниками та хворобами сільськогосподарських рослин і, навпаки, переоцінюємо роль хімічного методу. Саме завдяки розвитку біотехнології стало можливим створення промисловості інсектицидних вірусів, їх виробництво і культивування в клітинах тварин.
Як відомо, під біологічним методом захисту рослин розуміють використання живих організмів або продуктів їхньої життєдіяльності для запобігали я або зниження шкоди, завданої шкідливими організмами. Ідея біологічного методу боротьби с. шкідниками рослин була висунута ще в кінці минулого століття, але не отримала інтенсивного розвитку почасти тому, що в ті часи більш перспективним здавався хімічний метод. Створення в середині XX століття потужної промисловості з виробництва різноманітних пестицидів вселяло упевненість в тому, що проблема захисту рослин буде нарешті вирішена. Однак досить швидко стало зрозуміло, що ці надії ілюзорні. Справа в тому, що зі збільшенням масштабів застосування і "розширення спектра отрутохімікатів відбувається зростання кількості стійких до них комах. Крім того, хімічні препарати діють, як правило, не цілеспрямовано. Вони вбивають не тільки шкідливих, а й корисних комах, в тому числі тих, які, будучи природними ворогами шкідників, надійно допомагають людині в його боротьбі за порятунок врожаю. Таким чином, ці залишилися після хімічної атаки в живих шкідники і були до того нейтральними види комах отримують можливість для безперешкодного розмноження, причому нейтральні види нерідко стають шкідливими для людини. Слід відзначити також, що пестициди є токсичними речовинами для тварин і людини. Багато хто з них тривалий час зберігаються в природному середовищі, приводячи до істотного її забруднення. Найбільш небезпечними для людини є пестициди хлорорганічних природи, здатні тривало,-до. десяти років, зберігатиметься в грунті і накопичуватися в організмі тварин в жировій тканині. За даними Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я, щорічно в світі близько півмільйона людей захворює, а понад п'яти тисяч помирає в результаті отруєння пестицидами.
Завдяки зусиллям вчених різних країн токсичність пестицидів за останні роки істотно знижена. При відповідному підборі асортименту препаратів, при їх правильному чергуванні небажані концентрації пестицидів у навколишньому середовищі різко зменшуються. Створені препарати, які швидко і без освіти шкідливого залишку розкладаються в грунті.
І, тим не менш, виробництво та використання в сільському господарстві пестицидів має ряд серйозних недоліків. Згідно зі статистикою, тільки один з десяти тисяч синтезованих препаратів стає надбанням практики.
Недоліки хімічного методу боротьби з шкідниками і збудниками хвороб рослин змусили дослідників звернути більш пильну, увагу на біологічний метод. Інтерес до нього різко зріс у зв'язку з досягненнями в галузі біотехнології. Слід чітко розмежувати сфери інтересів фахівців у галузі біотехнології та біологічного захисту рослин. Біотехнологія займається розробкою технологічних процесів, які забезпечують виробництво вірусів, бактерій, грибів, найпростіших і комах, а також біологічно активних речовин живих організмів (антибіотиків, гормонів, феромонів і ін), призначених для боротьби зі збудниками хвороб, шкідниками сільського господарства та смітної рослинністю. Таким чином, якщо фахівця в області біологічного захисту рослин цікавить проблема використання відповідних коштів, то біотехнолога насамперед хвилююче питання організації їх виробництва, І тут доречно зазначити, що вирощування бактерій і грибів для цілей захисту рослин, принципово не відрізняється від культивування їх для отримання різних речовин, наприклад антибіотиків. Разом з тим біотехнологія і генетична інженерія істотно розширюють можливості ефективного використання біологічних засобів захисту рослин.
Біотехнологічні аспекти боротьби зі збудниками хвороб рослин
Віруси викликають близько 300 різних хвороб сільськогосподарських культур. У порівнянні з фітопатогенними грибами і бактеріями це не так вже й багато; кількість грибів та бактерій, що завдають шкоду рослинництву, приблизно в 100 разів більше. Проте шкодочинність вірусних хвороб в ряді випадків не тільки не поступається грибним або бактеріальним, а й перевершує їх. Хворі рослини змінюють свій зовнішній вигляд, дають низький і гіршої якості урожай.
Боротьба з вірусною інфекцією ускладнюється тим, що віруси є облігатними паразитами рослинної або тваринної клітини. Знищення їх супроводжується загибеллю самої клітини. Оскільки вилікувати рослини, уражені вірусами, практично неможливо, заходи по боротьбі з ними носять головним чином профілактичний характер, вони покликані перешкоджати виникненню хвороби та її поширенню.
Прекрасні перспективи оздоровлення посадкового матеріалу, звільнення його від вірусної інфекції відкриває метод культури ізольованих тканин і органів. Ще в 1934 р. засновник методу культури тканин рослин Ф. Уайт вказав на відсутність вірусів у кінчиках коренів рослин, заражених вірусом тютюнової мозаїки. Подібні результати були отримані також іншими авторами. Грунтуючись на цих фактах, вчені з Національного агрономічного інституту (Франція) запропонували метод отримання оздоровленого посадкового матеріалу жоржин з культивований на живильному середовищі меристеми. З апікальної меристеми цих рослин вони виростили дорослі особини, які були вільні від вірусної інфекції. Сорт картоплі Бель де Фонтене, який практично зник у результаті зараження вірусами, був відроджений з здорової меристеми, ізольованої з зараженої рослини і культивованих на штучному живильному середовищі. Дослідження французьких вчених з'явилися основоположними у проведенні робіт, метою яких було отримання здорового посадкового матеріалу.
Процес отримання вільних від інфекції рослин можна розділити на три етапи:
-Визначення зараженості оздоровлюємо зразка за допомогою рослин - індикаторів присутності вірусів;
-Термотерапія і культивування меристеми;
-Перевірка регенерованого з меристеми рослин на відсутність вірусів і розмноження рослин в умовах ізоляції.
Зазвичай для ефективного звільнення від вірусів використовуються експлантатів меристем розміром 0,1-0,2 мм. Проте, чим менше розмір експлантатів, тим важче він приживається і регенерує в цілу рослину. Для отримання меристеми картоплі використовують або утворилися на бульбах світлові паростки, чи верхівки пагонів цілих рослин. Перед взяттям експлантатів кінці втеч стерилізують в розчині гіпохлориту кальцію, а потім кілька разів промивають стерильною водою.
Звільненню від вірусів сприяє термічна обробка експлантатів. Встановлено, що при температурі близько 30-40 ° відбувається зниження концентрації вірусів, особливо у зростаючих частинах рослин. Цей прийом дозволяє використовувати більш великі експлантатів, які легше приживаються.
Ізольований шматочок тканини переноситься потім на поверхню агарового живильного середовища, налитої в кількості 3-4 мл у пробірку, яку відразу ж закривають ватним корком. Французьким ученим Ж. Морелем був запропонований склад живильного середовища для укорінення експлантатів картоплі. Ця живильне середовище відрізняється від інших живильних середовищ * призначених для тієї ж мети, тим, що містить більше іонів калію і амонію, а в якості стимулятора росту доданий гіберелін.
Пробірки з меристема поміщають в світле приміщення з температурою 25 ° С. Через кожні двадцять-тридцять днів в окремих пробірках меристеми дають пагони. Втеча довжиною 3-4 см ріжуть на фрагменти в 0,5-1,0 см, кожен з яких повинен мати листочок і пазушну нирку і пересідає на поживне середовище того ж складу для вкорінення. Потім рослини переносять у грунт.
Метод культури тканин як засіб радикального позбавлення від вірусів в даний час досить широко застосовується у світовій практиці картоплярства, оскільки саме картопля, будучи вегетативно розмножуваної культурою, значною мірою зазнає шкідливого впливу вірусної інфекції. Поширюючись по всій рослині, віруси потрапляють в бульби і стебла, заражають потомство і з року в рік знижують вихід продукції, погіршують її якість. Через ураження вірусами багато цінні сорти картоплі зняті з виробництва. Для відновлення сорти доводиться відшукувати поодинокі клони, вільні від вірусної інфекції. Однак досить часто цінні сорти бувають вражені вірусами на 100%. У цьому випадку тільки метод культури меристем може сприяти відновленню сорту.
Розроблений фізіологами рослин метод оздоровлення посадкового матеріалу впроваджується не тільки в картоплярстві, але і при обробленні суниці, малини, плодових культур, декоративних рослин. У Франції культура меристем знайшла широке застосування для оздоровлення жоржин, гвоздик, орхідей. У ряді країн оздоровлений методом культури меристем посадковий матеріал став предметом експорту. У ВНР з 1980 р. діє спеціальна агропромислове об'єднання, яка отримує методами клонального мікророзмноження безвірусні розсаду овочевих, плодових і ягідних культур. У 1983 р. вирощено 5 млн. штук стерильною розсади. Застосування її (за деякими оцінками-) дозволить Угорщині отримати сорти винограду, протягом, двадцяти років не схильні до захворювань, подвоїти врожай картоплі, в 20 разів підвищити врожайність ожини. Культура тканин - ефективний і самостійний метод оздоровлення. Він годиться для всіх вірусів і слабости ними культур.
Поряд з методом культури тканин в позбавленні рослин, від вірусів мають значення і методи генетичної інженерії. Так, наприклад, клонування нуклеїнових кислот дозволяє виявляти присутність в рослинній тканині вірусів і вибраковувати заражені рослини. Учені з дослідницької сільськогосподарської служби міністерства сільського господарства США виділили РНК віроіди веретеновидное бульб картоплі, синтезували за допомогою зворотної транскриптази відповідну їй ДНК-копію і клонували її. Позбутися від цього віроіди нелегко, а його ідентифікація в бульбах картоплі дозволяє вибраковувати заражений посадковий матеріал. Використання тільки здорових бульб веде до значного підвищення "урожаю. Таким чином, клонована ДНК дозволяє точно і надійно виявляти віруси і віроїди, вона здатна до гібридизації з вірусною РНК.
У природному обстановку зустрічається чимало випадків, коли на фітопатогенних грибах - збудників хвороб рослин - розвиваються і ведуть паразитичний спосіб життя інші гриби. Такі паразитичні гриби, що розвиваються на інших грибах-паразитів, отримали назву паразитів другого порядку (гіперпаразітов). Якщо первинний паразит є збудником якогось захворювання, то вторинний паразит може бути використаний для боротьби з цим захворюванням. Завданням біотехнології є розробка процесів виробництва мікробіологічних препаратів, призначених для боротьби з фітопатогенними грибами в умовах відкритого та закритого грунту.
Важливе місце в захисті рослин від збудників хвороб належить вироблюваним мікроорганізмами антибіотичним речовин які виникли в ході еволюції як могутній засіб боротьби мікроорганізмів один з одним. Використання деяких антибіотиків для боротьби з хворобами рослин ознаменувало собою початок ери біотехнологічного виробництва різних агрохімікатів, серед яких слід відзначити гербіциди мікробного походження, атрактанти, екдізоном, фітогормони та інші речовини, одержувані з живих організмів не призначені для використання в сільському господарстві.
Антибіотики як засіб боротьби з фітопатогенними мікроорганізмами мають ряд переваг в порівнянні з іншими використовуваними для тієї ж мети речовинами. Вони легко проникають в органи і тканини рослин, тому їх. дію у меншій мірі залежить від несприятливих факторів середовища. Особливо швидко проникають в рослини антибіотики нейтральній природи (хлорамфенікол, пеніцилін), повільніше - амфотерні (хлортетрациклин, окситетрациклін) і антибіотики-підстави (неоміцин, стрептоміцин). У порівнянні з тваринами тканинами рослинні тканини інактивують антибіотики значно повільніше. Таким чином, швидке проникнення антибіотиків у тканини рослин і інтенсивне переміщення їх по органами при порівняно повільному руйнуванні дозволяє створювати певні насичення антибіотиками, необхідні для придушення фітопатогенної мікрофлори. Дослідження вчених показують, що в тканинах рослин біологічна активність антибіотиків, проявляється значно сильніше, ніж в тваринних тканинах. Більшість фітопатогенних грибів і бактерій можна успішно придушити в рослинах з їх допомогою.
Крім того, антибіотики, використовувані для придушення фітопатогенних бактерій і грибів, нетоксичні для рослин і живляться ними тварин. У деяких випадках вони навіть стимулюють ріст і розвиток рослин, що сприяє підвищенню їх врожайності.
Потрапляючи в грунт або водойми, антибіотики досить швидко руйнуються. Цим вони істотно відрізняються від синтетичних препаратів, що застосовуються в сільському господарстві. Вчені пояснюють швидку "деградацію антибіотиків у навколишньому середовищі тим, що їх синтез здійснюється при участі ферментних систем. За допомогою ж ферментів відбувається і руйнування антибіотиків. З'єднання, синтезовані хімічним шляхом, часто повільно руйнуються в природному середовищі через відсутність мікроорганізмів відповідних ферментів. Інтерес до використання антибіотиків у рослинництві різко зріс після того, як стали очевидними несприятливі наслідки використання в цій же сфері отрутохімікатів, які поряд з придушенням фітопатогенних мікроорганізмів отруюють корисні види тварин, що харчуються обробленими рослинами. Потрапляючи з грунту у водойми, отрутохімікати викликають масове отруєння риби та інших представників водної фауни. Все це, в кінцевому рахунку, справляє негативний вплив на людину.
Вперше антибіотики в якості засобу боротьби з хворобами рослин були застосовані у деяких європейських країнах і в США. Стрептоміцин в комбінації з тетрацикліном був використаний проти бактеріальних захворювань овочевих і плодових культур. Пізніше з тією ж метою стали вживати циклогексимід і гризеофульвін. У зарубіжних країнах для захисту рослин від хвороб і зараз нерідко використовують антибіотики медичного призначення (стрептоміцин, тераміцин, тетрациклін та ін.) Так, наприклад, препарат агрістеп представляє собою 37%-ний сульфат стрептоміцину, фітоміцін - 20%-ний нітрат стрептоміцину, агріміцін-100 - 15%-ная суміш стрептоміцину з окситетрацикліном у співвідношенні 10:1 і т.д. Введення
Біотехнологія на варті врожаю
Біотехнологічні аспекти боротьби зі збудниками хвороб рослин
Біотехнологічні аспекти боротьби з шкідливими комахами
Отримання рослин-регенерантів, стійких до абіотичних і біотичних стресових факторів методами клітинної інженерії
Отримання рослин-регенерантів, стійких до абіотичних і біотичних стресових факторів методами клітинної інженерії
Список літератури
Введення
Найважливіше місце біотехнології і біоінженерії належить в сучасній селекції рослин на стійкість і якість продукції, створення нового покоління сортових ресурсів країни та світу. Основні дослідження біотехнологів спрямовані на створення поліпшених і принципово нових генотипів сільськогосподарських рослин, які мають одиничної, груповий або комплексною стійкістю до біотичних або абіотичних стресових факторів середовища при збереженні і підвищенні продуктивності та якості. Епіфітотійний характер поширення найбільш небезпечних грибкових, вірусних та бактеріальних захворювань культурних рослин, що знищують до 30% (а іноді і більше) врожаю, створили в Росії та ряді інших країн світу ситуацію, при якій потреба в оновленні сортових ресурсів сільськогосподарських культур на основі поєднання традиційних методів селекції і нових методів біотехнології стала виключно гострою.
Біотехнологія на варті врожаю
В даний час значна частина врожаю сільськогосподарських рослин - близько 30% - гине від шкідників і хвороб. Зусилля фахівців в області захисту рослин - галузі сільськогосподарської науки, що розробляє методи і прийоми боротьби-з хворобами, шкідниками і бур'янами культурних рослин - поки не дають бажаних результатів. У зв'язку з цим необхідно шукати принципово нові підходи до вирішення надзвичайно актуальної проблеми захисту рослин. І тут на допомогу людині приходить біотехнологія. Так, наприклад, використання методу культури ізольованих органів і тканин рослин дозволяє отримувати у великій кількості оздоровлений (безвірусні) посадковий матеріал.
Розвиток біотехнології дозволило абсолютно по-новому оцінити методи, використовувані для захисту рослин. Так, наприклад, у світлі досягнень біотехнології стало очевидним, що ми явно недооцінюємо можливості біологічного методу боротьби з шкідниками та хворобами сільськогосподарських рослин і, навпаки, переоцінюємо роль хімічного методу. Саме завдяки розвитку біотехнології стало можливим створення промисловості інсектицидних вірусів, їх виробництво і культивування в клітинах тварин.
Як відомо, під біологічним методом захисту рослин розуміють використання живих організмів або продуктів їхньої життєдіяльності для запобігали я або зниження шкоди, завданої шкідливими організмами. Ідея біологічного методу боротьби с. шкідниками рослин була висунута ще в кінці минулого століття, але не отримала інтенсивного розвитку почасти тому, що в ті часи більш перспективним здавався хімічний метод. Створення в середині XX століття потужної промисловості з виробництва різноманітних пестицидів вселяло упевненість в тому, що проблема захисту рослин буде нарешті вирішена. Однак досить швидко стало зрозуміло, що ці надії ілюзорні. Справа в тому, що зі збільшенням масштабів застосування і "розширення спектра отрутохімікатів відбувається зростання кількості стійких до них комах. Крім того, хімічні препарати діють, як правило, не цілеспрямовано. Вони вбивають не тільки шкідливих, а й корисних комах, в тому числі тих, які, будучи природними ворогами шкідників, надійно допомагають людині в його боротьбі за порятунок врожаю. Таким чином, ці залишилися після хімічної атаки в живих шкідники і були до того нейтральними види комах отримують можливість для безперешкодного розмноження, причому нейтральні види нерідко стають шкідливими для людини. Слід відзначити також, що пестициди є токсичними речовинами для тварин і людини. Багато хто з них тривалий час зберігаються в природному середовищі, приводячи до істотного її забруднення. Найбільш небезпечними для людини є пестициди хлорорганічних природи, здатні тривало,-до. десяти років, зберігатиметься в грунті і накопичуватися в організмі тварин в жировій тканині. За даними Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я, щорічно в світі близько півмільйона людей захворює, а понад п'яти тисяч помирає в результаті отруєння пестицидами.
Завдяки зусиллям вчених різних країн токсичність пестицидів за останні роки істотно знижена. При відповідному підборі асортименту препаратів, при їх правильному чергуванні небажані концентрації пестицидів у навколишньому середовищі різко зменшуються. Створені препарати, які швидко і без освіти шкідливого залишку розкладаються в грунті.
І, тим не менш, виробництво та використання в сільському господарстві пестицидів має ряд серйозних недоліків. Згідно зі статистикою, тільки один з десяти тисяч синтезованих препаратів стає надбанням практики.
Недоліки хімічного методу боротьби з шкідниками і збудниками хвороб рослин змусили дослідників звернути більш пильну, увагу на біологічний метод. Інтерес до нього різко зріс у зв'язку з досягненнями в галузі біотехнології. Слід чітко розмежувати сфери інтересів фахівців у галузі біотехнології та біологічного захисту рослин. Біотехнологія займається розробкою технологічних процесів, які забезпечують виробництво вірусів, бактерій, грибів, найпростіших і комах, а також біологічно активних речовин живих організмів (антибіотиків, гормонів, феромонів і ін), призначених для боротьби зі збудниками хвороб, шкідниками сільського господарства та смітної рослинністю. Таким чином, якщо фахівця в області біологічного захисту рослин цікавить проблема використання відповідних коштів, то біотехнолога насамперед хвилююче питання організації їх виробництва, І тут доречно зазначити, що вирощування бактерій і грибів для цілей захисту рослин, принципово не відрізняється від культивування їх для отримання різних речовин, наприклад антибіотиків. Разом з тим біотехнологія і генетична інженерія істотно розширюють можливості ефективного використання біологічних засобів захисту рослин.
Біотехнологічні аспекти боротьби зі збудниками хвороб рослин
Віруси викликають близько 300 різних хвороб сільськогосподарських культур. У порівнянні з фітопатогенними грибами і бактеріями це не так вже й багато; кількість грибів та бактерій, що завдають шкоду рослинництву, приблизно в 100 разів більше. Проте шкодочинність вірусних хвороб в ряді випадків не тільки не поступається грибним або бактеріальним, а й перевершує їх. Хворі рослини змінюють свій зовнішній вигляд, дають низький і гіршої якості урожай.
Боротьба з вірусною інфекцією ускладнюється тим, що віруси є облігатними паразитами рослинної або тваринної клітини. Знищення їх супроводжується загибеллю самої клітини. Оскільки вилікувати рослини, уражені вірусами, практично неможливо, заходи по боротьбі з ними носять головним чином профілактичний характер, вони покликані перешкоджати виникненню хвороби та її поширенню.
Прекрасні перспективи оздоровлення посадкового матеріалу, звільнення його від вірусної інфекції відкриває метод культури ізольованих тканин і органів. Ще в 1934 р. засновник методу культури тканин рослин Ф. Уайт вказав на відсутність вірусів у кінчиках коренів рослин, заражених вірусом тютюнової мозаїки. Подібні результати були отримані також іншими авторами. Грунтуючись на цих фактах, вчені з Національного агрономічного інституту (Франція) запропонували метод отримання оздоровленого посадкового матеріалу жоржин з культивований на живильному середовищі меристеми. З апікальної меристеми цих рослин вони виростили дорослі особини, які були вільні від вірусної інфекції. Сорт картоплі Бель де Фонтене, який практично зник у результаті зараження вірусами, був відроджений з здорової меристеми, ізольованої з зараженої рослини і культивованих на штучному живильному середовищі. Дослідження французьких вчених з'явилися основоположними у проведенні робіт, метою яких було отримання здорового посадкового матеріалу.
Процес отримання вільних від інфекції рослин можна розділити на три етапи:
-Визначення зараженості оздоровлюємо зразка за допомогою рослин - індикаторів присутності вірусів;
-Термотерапія і культивування меристеми;
-Перевірка регенерованого з меристеми рослин на відсутність вірусів і розмноження рослин в умовах ізоляції.
Зазвичай для ефективного звільнення від вірусів використовуються експлантатів меристем розміром 0,1-0,2 мм. Проте, чим менше розмір експлантатів, тим важче він приживається і регенерує в цілу рослину. Для отримання меристеми картоплі використовують або утворилися на бульбах світлові паростки, чи верхівки пагонів цілих рослин. Перед взяттям експлантатів кінці втеч стерилізують в розчині гіпохлориту кальцію, а потім кілька разів промивають стерильною водою.
Звільненню від вірусів сприяє термічна обробка експлантатів. Встановлено, що при температурі близько 30-40 ° відбувається зниження концентрації вірусів, особливо у зростаючих частинах рослин. Цей прийом дозволяє використовувати більш великі експлантатів, які легше приживаються.
Ізольований шматочок тканини переноситься потім на поверхню агарового живильного середовища, налитої в кількості 3-4 мл у пробірку, яку відразу ж закривають ватним корком. Французьким ученим Ж. Морелем був запропонований склад живильного середовища для укорінення експлантатів картоплі. Ця живильне середовище відрізняється від інших живильних середовищ * призначених для тієї ж мети, тим, що містить більше іонів калію і амонію, а в якості стимулятора росту доданий гіберелін.
Пробірки з меристема поміщають в світле приміщення з температурою 25 ° С. Через кожні двадцять-тридцять днів в окремих пробірках меристеми дають пагони. Втеча довжиною 3-4 см ріжуть на фрагменти в 0,5-1,0 см, кожен з яких повинен мати листочок і пазушну нирку і пересідає на поживне середовище того ж складу для вкорінення. Потім рослини переносять у грунт.
Метод культури тканин як засіб радикального позбавлення від вірусів в даний час досить широко застосовується у світовій практиці картоплярства, оскільки саме картопля, будучи вегетативно розмножуваної культурою, значною мірою зазнає шкідливого впливу вірусної інфекції. Поширюючись по всій рослині, віруси потрапляють в бульби і стебла, заражають потомство і з року в рік знижують вихід продукції, погіршують її якість. Через ураження вірусами багато цінні сорти картоплі зняті з виробництва. Для відновлення сорти доводиться відшукувати поодинокі клони, вільні від вірусної інфекції. Однак досить часто цінні сорти бувають вражені вірусами на 100%. У цьому випадку тільки метод культури меристем може сприяти відновленню сорту.
Розроблений фізіологами рослин метод оздоровлення посадкового матеріалу впроваджується не тільки в картоплярстві, але і при обробленні суниці, малини, плодових культур, декоративних рослин. У Франції культура меристем знайшла широке застосування для оздоровлення жоржин, гвоздик, орхідей. У ряді країн оздоровлений методом культури меристем посадковий матеріал став предметом експорту. У ВНР з 1980 р. діє спеціальна агропромислове об'єднання, яка отримує методами клонального мікророзмноження безвірусні розсаду овочевих, плодових і ягідних культур. У 1983 р. вирощено 5 млн. штук стерильною розсади. Застосування її (за деякими оцінками-) дозволить Угорщині отримати сорти винограду, протягом, двадцяти років не схильні до захворювань, подвоїти врожай картоплі, в 20 разів підвищити врожайність ожини. Культура тканин - ефективний і самостійний метод оздоровлення. Він годиться для всіх вірусів і слабости ними культур.
Поряд з методом культури тканин в позбавленні рослин, від вірусів мають значення і методи генетичної інженерії. Так, наприклад, клонування нуклеїнових кислот дозволяє виявляти присутність в рослинній тканині вірусів і вибраковувати заражені рослини. Учені з дослідницької сільськогосподарської служби міністерства сільського господарства США виділили РНК віроіди веретеновидное бульб картоплі, синтезували за допомогою зворотної транскриптази відповідну їй ДНК-копію і клонували її. Позбутися від цього віроіди нелегко, а його ідентифікація в бульбах картоплі дозволяє вибраковувати заражений посадковий матеріал. Використання тільки здорових бульб веде до значного підвищення "урожаю. Таким чином, клонована ДНК дозволяє точно і надійно виявляти віруси і віроїди, вона здатна до гібридизації з вірусною РНК.
У природному обстановку зустрічається чимало випадків, коли на фітопатогенних грибах - збудників хвороб рослин - розвиваються і ведуть паразитичний спосіб життя інші гриби. Такі паразитичні гриби, що розвиваються на інших грибах-паразитів, отримали назву паразитів другого порядку (гіперпаразітов). Якщо первинний паразит є збудником якогось захворювання, то вторинний паразит може бути використаний для боротьби з цим захворюванням. Завданням біотехнології є розробка процесів виробництва мікробіологічних препаратів, призначених для боротьби з фітопатогенними грибами в умовах відкритого та закритого грунту.
Важливе місце в захисті рослин від збудників хвороб належить вироблюваним мікроорганізмами антибіотичним речовин які виникли в ході еволюції як могутній засіб боротьби мікроорганізмів один з одним. Використання деяких антибіотиків для боротьби з хворобами рослин ознаменувало собою початок ери біотехнологічного виробництва різних агрохімікатів, серед яких слід відзначити гербіциди мікробного походження, атрактанти, екдізоном, фітогормони та інші речовини, одержувані з живих організмів не призначені для використання в сільському господарстві.
Антибіотики як засіб боротьби з фітопатогенними мікроорганізмами мають ряд переваг в порівнянні з іншими використовуваними для тієї ж мети речовинами. Вони легко проникають в органи і тканини рослин, тому їх. дію у меншій мірі залежить від несприятливих факторів середовища. Особливо швидко проникають в рослини антибіотики нейтральній природи (хлорамфенікол, пеніцилін), повільніше - амфотерні (хлортетрациклин, окситетрациклін) і антибіотики-підстави (неоміцин, стрептоміцин). У порівнянні з тваринами тканинами рослинні тканини інактивують антибіотики значно повільніше. Таким чином, швидке проникнення антибіотиків у тканини рослин і інтенсивне переміщення їх по органами при порівняно повільному руйнуванні дозволяє створювати певні насичення антибіотиками, необхідні для придушення фітопатогенної мікрофлори. Дослідження вчених показують, що в тканинах рослин біологічна активність антибіотиків, проявляється значно сильніше, ніж в тваринних тканинах. Більшість фітопатогенних грибів і бактерій можна успішно придушити в рослинах з їх допомогою.
Крім того, антибіотики, використовувані для придушення фітопатогенних бактерій і грибів, нетоксичні для рослин і живляться ними тварин. У деяких випадках вони навіть стимулюють ріст і розвиток рослин, що сприяє підвищенню їх врожайності.
Потрапляючи в грунт або водойми, антибіотики досить швидко руйнуються. Цим вони істотно відрізняються від синтетичних препаратів, що застосовуються в сільському господарстві. Вчені пояснюють швидку "деградацію антибіотиків у навколишньому середовищі тим, що їх синтез здійснюється при участі ферментних систем. За допомогою ж ферментів відбувається і руйнування антибіотиків. З'єднання, синтезовані хімічним шляхом, часто повільно руйнуються в природному середовищі через відсутність мікроорганізмів відповідних ферментів. Інтерес до використання антибіотиків у рослинництві різко зріс після того, як стали очевидними несприятливі наслідки використання в цій же сфері отрутохімікатів, які поряд з придушенням фітопатогенних мікроорганізмів отруюють корисні види тварин, що харчуються обробленими рослинами. Потрапляючи з грунту у водойми, отрутохімікати викликають масове отруєння риби та інших представників водної фауни. Все це, в кінцевому рахунку, справляє негативний вплив на людину.
Слід, однак, мати на увазі, що багато хвороботворних для людини мікроорганізми присутні у грунті або на поверхні рослин. Обробка рослин антибіотиками медичного призначення може сприяти відбору стійких до них хвороботворних для людини мікроорганізмів, що врешті-решт призведе до падіння ефективності медичних антибіотиків. Тому в останні роки посилилися пошуки антибіотиків, спеціально призначених для боротьби з хворобами рослин. Найбільш широко і успішно такі пошуки ведуться в Японії, де за останні 15 років створено великотоннажне виробництво більше десяти найменувань препаратів - бластіцідін, касугамін, поліоксіни, валідаміцін, целлоцідін, тетранактін.
Цікаво те обставина, що вивчення і освоєння препаратів промисловістю Японії здійснюється дуже швидко. Так, наприклад, перший антибіотик для сільського господарства бластіцідін-S, відібраний для боротьби з пірікуляріозом рису, був виділений в 1958 р., зареєстрований в 1961 р., а вже в 1962 р. виробництво його склала 3,7 тис. т. Через три роки випуск цього антибіотика збільшився в 5 разів. Загальний обсяг антибіотиків, призначених для захисту рослин, в 1977 р. перевищив 100 тис. т. Різні японські фірми почали випускати комбіновані препарати, що містять антибіотики і синтетичні фунгіциди. Такі препарати мають більш широкий спектр дії і застосовуються для боротьби з комплексом хвороб та шкідників. Антибіотики японського виробництва знайшли широке застосування в багатьох країнах світу: Канаді, Нідерландах, Австрії, Румунії, Польщі, Єгипті, Пакистані, на Філіппінах і ін
Пошуки антибіотиків для захисту рослин ведуться і в ряді інших країн. У США запатентовані антибіотики, ефективний проти борошнистої роси, в'янення томатів та інших хвороб. В Індії виготовляється і застосовується у виробничих масштабах антибіотичний препарат ауреофунгіі. У Бельгії запатентований нікоміцін, ефективний проти бактеріальних і грибних хвороб рослин.
У СРСР використання медичних антибіотиків для боротьби із захворюваннями рослин заборонено. У різних установах країни починаючи з 50-х років ведуться пошуки немедичних антибіотиків для захисту рослин від хвороб. У результаті проведених досліджень виділені, вивчені, випробувані та рекомендовані для застосування в сільському господарстві антибіотики фітобактеріоміцін і трихотецин.
Фітобактеріоміцін - антибіотик з групи стрептотріцин, що володіє широким спектром бактерицидної і фунгіцидної дії. Його отримують з допомогою актиномицета Actinomyces lavendulae, виділеного з грунтів Криму. На основі фітобактеріоміціна розроблено декілька товарних форм препарату: 2-5%-ний дуст фітобактеріоміціна, фітолавін-100, призначені для обробки насіння, 10%-ний порошок, що змочується - для обприскування рослин. Дуст фітобактеріоміціна пройшли державні випробування і рекомендовані для виробничого застосування в боротьбі з бактеріозом сої (2%-ний дуст), бактеріозом квасолі, кореневою гниллю пшениці та ячменю (5%-ний дуст), поляганням сіянців сосни та ялини (1%-ний дуст ). Препарати застосовують для передпосівної обробки насіння з розрахунку 2-3 кг / т. Передпосівні обробки насіння квасолі сприяють зниженню поражаемості рослин бактеріозом на 70% і дають надбавку врожаю в 1,5-3 ц / га.
Отримано дані, що свідчать про ефективність фітобактеріоміціна у боротьбі з гоммозом бавовнику, фузаріозним в'яненням бобових, вертіциллезному в'яненням перцю, антракнозом смородини, плямистістю люцерни. Це говорить про те, що спектр ефективного застосування препарату фітобактеріоміціна може бути розширений.
Поряд з вивченням ефективності застосування препаратів фітобактеріоміціна під ВНІІбакпрепарат розроблена технологія їх промислового виробництва. Освоєно дослідно-промислове виробництво дустов фітобактеріоміціна. Впровадження технологічних розробок дозволило значно знизити собівартість випускаються препаратів, підвищити ефективність їх застосування.
Фітолавін-100 являє собою активну речовину фітобактеріоміціна. Його використовують для передпосівного опудрювання насіння пшениці і ячменю з метою профілактики кореневої гнилі, а також проти бактеріозів сої.
Трихотецин - антибіотик, що має широкий спектр функціонального дії. Його отримують з гриба тріхотеціума рожевого (Trichothecium roseum). Цей некротрофних мікроорганізм живе нерідко як сапрофіт на рослинних рештках. Разом з тим він часто зустрічається як гіперпаразіт на багатьох фітопатогенних грибах. Здатність тріхотеціума паразитувати на грибах тісно пов'язана з утворенням їм протигрибкового антибіотика трихотецин. Цей антибіотик вбиває гіфи грибів, і тріхотеціум рожевий заселяє їх, отримуючи з убитих клітин поживні речовини.
Трихотецин випускається у вигляді 10%-ного змочується порошку і 10%-ного дусту. Він застосовується шляхом обприскування рослин при перших ознаках хвороби, замочування і опудрювання насіння. Трихотецин ефективний при борошнистої роси огірків у закритому і відкритому грунті, борошнистої роси тютюну, оїдіум винограду, моніальном опіку кісточкових плодових дерев, парші яблуні. Опудривание насіння пшениці та ячменю знижує ураженість рослин кореневими гнилями. Успішне впровадження в рослинництво перших вітчизняних антибіотиків спонукає більш енергійно вести пошуки нових препаратів немедичного профілю, активних у відношенні бактеріальних, грибних і вірусних хвороб рослин.
Явище антагонізму мікроорганізмів було відомо давно. У 20-х роках, задовго до відкриття антибіотиків, воно використовувалося для боротьби з фітопатогенної флорою. Позитивні результати були отримані при застосуванні деяких актиноміцетів і міколітіческіх бактерій у боротьбі з хворобами льону,, сіянців сосни, бавовнику, овочевих культур, садових кісточкових порід та інших Мікроби-антагоністи можуть бути використані для загального оздоровлення грунту.
Після відкриття антибіотиків для боротьби із захворюваннями рослин, як правило, стали використовувати не самі мікроорганізми, а віднайдені ними речовини. Проте і зараз у ряді країн випускаються препарати, що містять мікроорганізми, які надають згубну дію на збудників хвороб рослин, причому відбувся поділ сфери застосування антибіотиків і мікроорганізмів-антагоністів.
Для боротьби з насіннєвою інфекцією і для обробки уражених вегетуючих рослин використовують антибіотичні речовини, тоді як для боротьби з грунтовою інфекцією, що зберігається на рослинних залишках, застосовують мікроби-антагоністи у вигляді чистих культур або компостів для збагачення грунту. Справа в тому, що ефективність внесення антибіотиків у грунт, як уже зазначалося, невелика через швидке руйнування їх грунтовими мікроорганізмами. У ролі антагоністів можуть виступати бактерії, гриби, віруси.
З грибів-антагоністів широко використовуються представники роду Триходерма (Trichoderma). У Великобританії, Франції, Швеції, Австралії Триходерма застосовують для боротьби з молочним блиском плодових культур. У США розроблено способи вирощування та внесення в грунт Триходерма для боротьби зі склеротинія на арахісі і деякими іншими захворюваннями.
У Франції отримано позитивний ефект у боротьбі з сірою гниллю винограду при обприскуванні рослин препаратами Триходерма. В Ізраїлі створено препарат, який використовується проти ризоктоніозу картоплі та інших збудників хвороб.
Препарат триходермин отримують на основі культивування гриба на різних рослинних відходах й інших субстратів (хлібному м'якушці, солом'яному різанні, відходах зернового господарства, торфі).
Він використовується для придушення в грунті збудників хвороб льону, кореневих гнилей, вертіциллезному в'янення бавовнику та інших хвороб сільськогосподарських рослин
Триходерма зелена (Trichoderma viride), що вживається для виготовлення цього препарату, продукує два антибіотики: гліотоксин і вірідін, що володіють антибактеріальними і антигрибковими властивостями.
Триходермін отримують також методом глибинного культивування. Досліди показали, що передпосівна обробка насіння пшениці триходермин з розрахунку 4 г / кг знижує ураженість рослин протягом усього періоду вегетації на 54-71% і збільшує врожай на 2 ц / га. Внесення Триходерміну в торфоперегнійні горщики у кількості 50 мг знижує ураженість огірків кореневими гнилями на 60% і збільшує врожай на 31-74%.
Біотехнологія й генетична інженерія відкривають нові широкі можливості в справі створення форм мікроорганізмів, що згубно впливають на збудників хвороб рослин, що відрізняються високою ефективністю і не впливають на людину і корисних тварин.
Біотехнологічні аспекти боротьби з шкідливими комахами
В даний час все більшого поширення набуває мікробіологічний метод боротьби з шкідливими комахами. З цією метою використовуються віруси, бактерії, гриби і найпростіші тварини. З їх допомогою серед комах штучно викликають швидко поширюються захворювання.
Основоположником мікробіологічного методу боротьби з шкідливими комахами є великий французький мікробіолог Луї Пастер. У 1874 р. він запропонував використовувати ентомопатогенні бактерії для боротьби з небезпечним шкідником винограду філоксерою. Через п'ять років російський вчений І. І. Мечников застосував гриб - збудник зеленої мускардина для знищення хлібного жука. Великий внесок у розробку мікробіологічного методу боротьби з шкідливими комахами вніс канадський дослідник Ф. д'Еррель. Їм були виділені культури неспороносних бактерії і використані для боротьби з сараною в деяких країнах Південної Америки та Північної Африки. Велика кількість ентомопатогенних форм спороутворюючих бактерій було виявлено та вивчено в 1922-1942 рр.. радянськими вченими. Деякі з цих форм бактерій стали використовуватися у виробництві інсектицидних препаратів, що знищують шкідників кукурудзи, винограду і бавовнику. У 1959-1960 рр.. в СРСР, США, Франції було організовано промислове виробництво спеціальних бактеріальних інсектицидів, що містять спори Bacillus thuringiensis. В даний час мікробні препарати зайняли міцне місце серед засобів захисту рослин від шкідників.
Мікробіологічні препарати нерідко використовуються в комбінації з сублетальних дозуваннями хімічних інсектицидів. Сублетальні концентрації пестицидів не настільки небезпечні для
Слід підкреслити, що використання мікробних препаратів для боротьби з шкідливими комахами не представляє небезпеки для людини, оскільки збудники хвороб комах мають високий ступінь специфічності. Крім того, як правило, вони не накопичуються в навколишньому середовищі. Разом з тим мікробні інсектициди діють повільніше, ніж хімічні препарати та їх ефективність в значній мірі залежить від умов середовища. Крім того, їх слід вносити досить часто, щоб препарат діяв протягом тривалого часу. Причина цього недоліку - у високому ступені спеціалізації ентомопатогенних мікроорганізмів: загибель шкідливих комах тягне за собою відмирання самих мікроорганізмів. Останній недолік мікробних інсектицидів може бути усунений за допомогою методів генетичної інженерії. Можна, наприклад, ввести ген, що забезпечує синтез токсичних речовин в широко поширені сапрофітні, що мешкають на рослинах бактерії. У цьому випадку коливання в чисельності шкідливих комах не будуть відображатися на чисельності інсектицидних бактерій.
Вірусні хвороби дуже широко поширені серед комах. У зв'язку з цим вірусні інсектициди є ефективним засобом захисту лісових насаджень і сільськогосподарських культур від шкідливих комах. У Росії проводяться вірусні інсектициди, призначені для боротьби з найбільш небезпечними шкідниками сільського і лісового господарства: капустяної, озимої та бавовняної совкою, непарним і кільчастого шовкопряда, американським білим метеликом, рудим сосновим пилильщиком і яблуневої плодожеркою.
Основною перешкодою на шляху широкого впровадження в практику вірусних препаратів є труднощі культивування вірусів як облігатних паразитів. Характерною особливістю їх виробництва є розмноження вірусів в живих клітинах. Для отримання вірусних інсектицидів використовуються відповідні комахи-шкідники. Але комахи, призначені для розмноження вірусів, аж ніяк не є стерильними, вони населені різноманітною мікрофлорою, в тому числі і вірусами. У зв'язку з цим при виробництві вірусних інсектицидів необхідний суворий і постійний контроль їх, якості. Присутність у комах сторонньої мікрофлори призводить до зниження якості препаратів. Крім того, в процесі виробництва цих препаратів припадає заражати вірусом велика кількість комах, а потім витягати його з маси загиблих личинок. Все це позначається на вартості та якості препарату.
У зв'язку із зазначеними труднощами вчені задалися метою з'ясувати, чи не можна використовувати для виробництва вірусів метод культури клітин тварин. Адже переваги цього методу очевидні: клітини можуть бути позбавлені від сторонньої мікрофлори, вони однорідні, розмножуються стабільно.
Перші спроби культивування клітин комах були зроблені на початку XX ст. Однак тривалий час серед вчених була поширена думка, що вирощування клітин безхребетних в культурі не має практичного значення. З цієї причини дослідження в галузі культури клітин комах велися недостатньо активно. Інтенсивні дослідження проблеми почалися в 60-х роках, коли Т. Д. Грейс отримав перші чотири перещеплюваних лінії з тканин яєчників евкаліптової шовкопряда. У 1976 р. вже налічувалося понад 120 перещеплюваних ліній клітин комах, а до 1983 р. їх кількість перевищила 200.
Для отримання клітинних ліній використовують первинні культури ембріонів, гомоцітов, яєчників, імагінальних дисків, жирових тіл, мацерированной личинок, лялечок або імаго. Доведено, що личинки і лялечки комах - кращі джерела отримання культивованих клітин. Методика отримання первинних культур клітин комах достатньо відпрацьована. Вона включає наступні етапи:
-Стерилізація поверхні комах і підлягають культивування тканин;
-Дисоціація клітин;
-Пересадка їх на поживне середовище.
Термін життя первинних клітинних культур обмежений. Через певний час культура старіє, що проявляється в грануляції цитоплазми, сморщивании і округленні клітин, втрати зв'язків між клітинами і твердим субстратом. Зусилля вірусологів спрямовані на отримання стабільних клітинних ліній, тобто клітин, здатних культивуватися на штучних поживних середовищах до нескінченності. В даний час отримані стабільні (перещеплюваних) клітинні лінії таких важливих шкідників сільського і лісового господарства, як непарний шовкопряд, капустяна Совка, бавовняна і тютюнова совка і ін
Для потреб медицини і охорони здоров'я розроблено заводське обладнання для масового виробництва клітин хребетних тварин in vitro. Ця технологія, на думку фахівців, може бути використана з невеликими модифікаціями і для культивування клітин комах.
В даний час випускається кілька препаратів, що містять ентомопатогенні віруси. Це перш за все ряд вітчизняних препаратів типу вирин: вирин-ЕНШ проти непарного шовкопряда, вирин-АББ проти американського білого метелика, вирин-ЕКС проти капустяної совки, вирин-ЯМ проти яблуневої молі, вирин-КШ проти кільчастого шовкопряда, вирин-ГЯП - проти яблуневої плодожерки, вирин-ХС проти бавовняної совки і препарат елкар проти совок з роду. Heliothis.
Поряд із вірусами для боротьби з шкідливими комахами використовуються бактерії. Найбільше практичне значення у справі організації боротьби з комахами-шкідниками має бактерія В. fburingiensis, вона складає основу "сучасної промисловості по виробництву бактерійних, інсектицидів. В. thuringiensis об'єднує різновиди спороутворюючих бактерій, що виробляють особливі ентомоцидної токсини, що володіють високою активністю по відношенню до комах. Ці токсини можуть бути двох видів: кришталь і розчинна.
Кристали першого типу мають ромбоподібну (тетрагональную) форму. Вони виявляються в клітинах в процесі споруляції за допомогою звичайного світлового мікроскопа. Їх часто називають параспоральнимі включеннями або ендотоксинами. Після завершення спорообразования кристали потрапляють в живильне середовище, де виявляються у вільному вигляді. По хімічній природі кристали являють собою термолабільні білкові речовини, руйновані при температурі 60 °. Бактерії, що продукують кришталь токсин, мешкають серед мікрофлори кишечника різних комах. Виділений з них токсин, будучи введений в гусениць лускокрилих комах, викликає параліч кишечнику. Комахи гинуть при обробці їх розчинами дуже слабкої концентрації-1:10 6.
Деякі різновиди В. thuringiensis утворюють ентомоцидної низькомолекулярний токсин нуклеотидної природи, званий екзотоксин, який на відміну від кришталь токсину знаходиться в культуральній рідині в розчиненому стані і не руйнується при кип'ятінні. У складі його є два споріднених речовини, названі тюрінгіензінамі А і В. Екзотоксин відрізняється від кришталь токсину меншою специфічністю - він активний по відношенню до багатьох видів комах. Препарати обох токсинів нешкідливі для теплокровних тварин, риб і рослин.
У нашій країні і за кордоном з В. thuringiensis в промислових масштабах виготовляють ряд препаратів, призначених для боротьби зі шкідливими комахами. Із зарубіжних препаратів відомі біотрол, туріцід, агрітрол, бактан, діпел, бактоспейн та ін Світове виробництво препаратів з В. thuringiensis в 1979 р. становило понад 1200 т, що дозволяє обробити площа посівів у кілька мільйонів гектарів.
У США інсектициди на основі В. thuringiensis виробляються компанією «Сільськогосподарські продукти Монсанто» («Monsanto. Agricultural Products»). Фермери протягом двадцяти років використовують ці препарати для захисту таких культур, як капуста, бавовник, боби, картоплю.
У Росії створено, застосовуються або проходять випробування такі препарати: дендробаціллін, ентобактерін, інсектін, гомелін, бітоксибациллін (БТБ-202), бактеріальний інсектицидний препарат (БІП), алестін, туверін-2, лепідоцид, інсектін-2. Вони вражають понад 200 видів шкідливих комах. Промислове виготовлення бактеріального препарату ентобактеріна здійснюється в нашій країні ще з 1959 р.
Бактеріальні інсектициди зазвичай випускаються у вигляді порошку. Це зручна для транспортування, зберігання і використання форма. Проти ряду шкідників, застосовуються гранульовані й інкапсульовані форми бактеріальних препаратів. Так, наприклад, для боротьби з кукурудзяним метеликом успішно використовуються препарати, в гранулах з кукурудзяною мукою.
Для підвищення ефективності бактеріальних інсектицидів вживаються різні-добавки - растекателі, прилипача. або розпилювачі. Препарати містять спори бактерій і кристали ендотоксин, а в деяких випадках (препарат бітоксибациллін) і термостабільниі токсин за допомогою якого вдається розширити спектр дії препаратів. Ці препарати можна комбінувати з сублетальних дозами хімічних інсектицидів, а саме деяких карбаматів, фосфорорганічних препаратів, піретроїдів, з препаратами ентомопатогенних вірусів, про які говорилося вище. У нашій країні дендробаціллін, ентобактерін, інсектін, гомелін, бітоксибациллін використовують у суміші з хлорофосом, золон, фосфамід, севин, бензофосфатом, фозолоном, метатіоном, метафос, полідофеном, рогором, карбофосом проти непарного і кільчастого шовкопрядів, яблуневої і капустяної молей, плодожерок, глодовий і троянди листокруток, бавовняних і капустяних совок, жилкуватого, шовкопряда-монашки, комплексу п'ядунів, дубової листовійки, лучного метелика, красногрудая Пьявіца, бересклетовой та японської воскової ложнощітовок, Шишкова вогнівки. Хімічні добавки вряде випадків підвищують ефективність біопрепаратів на 20-30% або не змінюють її. Причини відсутності ефекту при додаванні до биопрепаратам отрутохімікатів ще не з'ясовані, проте в цілому ряді випадків відзначено негативний вплив хімічних добавок на життєздатність суперечку В. thuringiensis (у разі фосфорорганічних інсектицидів, алдрин, гепта-хлору). Разом з тим ряд препаратів виявився сумісним з бактеріями. Ці препарати можуть бути рекомендовані до використання при здійсненні інтегрованого захисту рослин від шкідливих комах (ортен, ділокс, ланнот, цетран, дімелін).
З метою підвищення ефективності бактеріальних препаратів намагаються використовувати особливі клеющие речовини. Виробничу перевірку успішно пройшов прилипач полівінілацетат ідрожжевая бражка в концентрації 1%. Додавання до препарату В. thuringiensis ферменту хітинази, прискорює гідроліз хітинового покриву комах, прискорює загибель ялинової листовійки. Крім хітинази хороший ефект дає дімелін, який подавляє "освіта хітину у гусениць і подовжує межліночний період. Поряд з В. thuringiensis для боротьби зі шкідливими комахами можуть бути використані і деякі інші бактерії. Так, наприклад, культури В. popilliae є ефективним засобом боротьби з японським жуком - небезпечним шкідником, вражаючим близько 300 видів рослин. Бактерія викликає так звану молочну хвороба шкідника. Для практичних потреб бактерії вирощують безпосередньо в організмі личинок японського жука. Загиблих личинок вносять у грунт, де суперечки бактерій протягом тривалого часу зберігають життєздатність і вірулентність. Детальне вивчення біологічних особливостей цих бактерій дозволить успішно культивувати їх на штучних поживних середовищах і виготовляти бактеріальні інсектициди у великих кількостях. Вони можуть бути використані для боротьби з шкідливими жуками та іншими комахами, проти яких нині використовуються засоби малоефективні.
Для виробництва інсектицидних препаратів застосовуються не тільки види ентомопатогенних бактерій, вилучені з природи, але і мікроорганізми, створені методами генетичної інженерії. Вчені, які співпрацюють з компанією «Сільськогосподарські продукти Монсанто» (США), розробляють проблему клонування гена, контролюючого синтез токсичних для комах речовин і передачі цього гена бактерії Pseudomonas fluorescens - нешкідливому неспороносних флуоресціює мікроорганізму, який широко зустрічається в грунті, воді, на різних рослинних і тварин субстратах. Створені методами генетичної інженерії ентомопатогенні бактерії можна використовувати шляхом зараження ними насіння чи грунту під час посіву. У цьому випадку інфекція може виявитися дієвої протягом тривалого часу. Адже мікроорганізми, створені методами генетичної інженерії, навіть у разі загибелі шкідливих комах будуть зберігатися в природному середовищі як звичайні сапрофіти.
Проведені дослідження показують, що клонування токсичних генів можливо. Мікроорганізми, створені методами генетичної інженерії, виявилися здатними вражати певні види шкідників рослин.
У 1835 р. італійський дослідник А. Бассі вперше описав гриб з роду Бовері, виявлений на гусеницях шовковичного шовкопряда. Гриб отримав видову назву, утворене від прізвища першовідкривача - Бовер Бассіана (Beauveria bassiana). Гусениці шовковичного шовкопряда, уражені цим грибом, були зморщеними, сухими, покритими білим нальотом, що робило їх схожими на зацукровані фрукти. З цієї причини захворювання шовковичного шовкопряда отримало назву біла мускардина (від французького слова, що означає «зацукрований фрукт»). Пізніше було виявлено, що гриб вражає не тільки корисних комах, до числа яких належить тутового шовкопряда, а й численних шкідників (колорадський жук, картопляна корівка, луговий і кукурудзяний метелик, соснова п'ядун, соснова совка, шкідлива черепашка, яблунева і персикова плодожерка, деякі види кліщів). Бовері Бассіана поширена дуже широко. Вона зустрічається всюди, де є комахи, і тому по праву вважається космополітом. Тільки в Північній Америці нею уражається понад 175 видів комах. У нашій країні збудник білої мускардина викликає захворювання більше 60 видів комах. Комахи та кліщі, стійкі до білої мускардина, сприяють поширенню її міцелію і спор. Інший представник роду Бовер - Бовер тонка (Б. tonella) вражає головним чином шкідливих жуків: західного та східного травневих хрущів.
Мускардіновие гриби здатні до сапротрофними харчуванню і порівняно легко культивуються на штучних поживних середовищах. Правда, Бовер тонка дещо гірше зростає в штучних умовах, вона вимагає присутності в живильному середовищі вітамінів. Бовері Бассіана успішно розмножується на скибочках картоплі. Результати порівняльного випробування гриба Бовер Бассіана в глибинній та поверхневої культурах показали, що в поверхневій культурі для його зростання створюються більш сприятливі умови. Склад живильного середовища впливає на вірулентність гриба.
Ще в 60-х роках в Українському інституті захисту рослин був виготовлений препарат боверин, що представляє собою порошок сірого кольору, у якому суперечки мускардінових грибів В. bassiana і В. globalifera, а також наповнювач (каолін). Препарат був рекомендований у поєднанні з сублетальних дозами отрутохімікатів для боротьби з колорадським жуком, дубової листовійки та іншими шкідниками сільського і лісового господарства.
В даний час для боротьби з шкідливими комахами залучаються і інші види грибів, зокрема з родів метаррізіум, вертіцілліум, гірзутелла, гіменостільбе, Ашерсон, коніотіріум, ентомофтора та ін
Важливе місце в арсеналі засобів боротьби з шкідниками займають біологічно активні речовини комах. До числа таких речовин відносяться феромони, ювенільний гормон, гормон линьки.
Феромони представляють собою біологічно активні речовини, що виділяються тваринами в навколишнє середовище і специфічно впливають на метаболізм, поведінка, фізіологічний та емоційний стан інших особин того ж виду. Як правило, феромони продукуються спеціалізованими залозами тварин. За характером дії розрізняють агрегаційні феромони (феромони скучіванія), феромони, що викликають реакцію тривоги чи оборони, слідові феромони, що відзначають шлях прямування комахи в пошуках їжі, феромони-соціального розпізнавання та регулювання, статеві феромони. Найбільш детально вивчені статеві феромони насекомихкоторие забезпечують зустріч і пізнавання особин різної статі і стимулюють статеву поведінку. Феромоіи, залучають осіб протилежної статі, називають аттрактактамі.
В 1959р. західнонімецький біохімік Адольф Бутенандт встановив будову статевого атрактанти самки шовковичного шовкопряда. Цей феромон був названий бомбікол. Він викликає, у самців поведінкову реакцію при концентрації всього близько, 10 12 мг / л повітря. До 1980р. феромони були виявлені y 700 видів комах, причому у 220 видів встановлено хімічну будову. По хімічній природі феромони не є представниками якогось певного класу хімічних сполук. Статеві феромони самок лускокрилих зазвичай ставляться до граничних спиртів, ацетату і альдегідів з 10-18 атомами вуглецю. Вони можуть бути представлені окремими хімічними сполуками, але частіше біологічну дію надає сукупність декількох компонентів. Як правило, для біологічної дії феромонів характерна видова специфічність: різні види комах використовують як феромонів певні хімічні речовини або суміші з певним поєднанням компонентів.
У зв'язку з відкриттям феромонів виникла думка використовувати їх для боротьби зі шкідливими комахами. Виробництво атрактантів із залоз комах малоефективно із-за високої трудомісткості і низького виходу продукту. У зв'язку з цим були зроблені зусилля по хімічному синтезу цих речовин. На жаль, хімічні феромони виявилися недостатньо специфічними, оскільки природні феромони у багатьох комах представляють собою суміш індивідуальних хімічних речовин, причому деякі компоненти ряду феромонів є загальними для декількох видів. Синтез високоспецифічних феромонів утруднений необхідністю отримання хімічно чистих речовин і комбінацій їх у певному співвідношенні, відсутністю відомостей про роль окремих складових в управлінні поведінкою комах при паруванні. Відомо, що у східній плодожерки спарювання відбувається у чотири етапи: залучення самця до самки, наближення його, орієнтація самки, копуляція. Кожен етап характеризується дією певного хімічного компоненту.
У зв'язку з недостатньою ефективністю синтетичних феромонів важливо відзначити роль рослин в освіті природних атрактантів. Так, наприклад, до складу агрегационной феромона жука великого ільмових заболонніка - переносника голландської хвороби в'язів, входить α-кубеба, що є метаболітом дерева-господаря. До складу феромонной комплексу жука-Лубоїди входить мірцен, також утворений рослинами. Насекрмие можуть використовувати деякі алкалоїди рослин як попередників при синтезі статевих феромонів. Міститься в рослинах-господарях речовина α-пінен служить вихідним з'єднанням для біосинтезу цис-вербенола жуками Ips paraconfusus. Цікаво у зв'язку з цим відзначити, що перетворення α-пинена в вербенол здійснює штам бактерій В. cereus, виділений з травного тракту цих жуків. Синтез попередників феромонів клітинами рослин, перетворення цих попередників у феромони комах за участю бактерій свідчить про те, що для практичних цілей можуть бути використані феромони, отримані не хімічним, а біотехнологічним шляхом використання методів біотехнології, у зокрема методу культури тканин рослин, а також прийомів генетичної інженерії, може виявитися вельми перспективним при організації виробництва високоефективних феромонів. Існують три основних шляхи використання феромонів для боротьби зі шкідливими комахами:
-Виявлення видів комах;
-Масовий вилов комах;
-Порушення системи орієнтації за запахом, що служить для просторового об'єднання особин різної статі.
Одним з найважливіших шляхів практичного застосування природних і хімічних феромонів для боротьби зі шкідливими комахами є моніторинг стану популяції, облік чисельності шкідників за допомогою пасток. Візуальні спостереження за посівами аж ніяк не завжди дозволяють виявити присутність шкідників або встановити справжню картину зараженості посівів. Потрапили в пастки окремі комахи свідчать про присутність певних видів на найближчій території, а кількість спійманих комах дозволяє судити про необхідність прийняття заходів по придушенню. Завдяки таким обстеженням вдається різко скоротити витрату інсектицидів на боротьбу зі шкідниками, запобігати поширенню комах на незаселеній території.
Широкі можливості відкриває застосування пасток з феромонами для виявлення карантинних шкідників. В даний час феромони широко використовуються для раннього виявлення об'єктів карантину (східна плодожерка, картопляна міль, американський білий метелик, середземноморська плодова муха, каліфорнійська щитівка і ін.) У 1976 р. фахівці з Міністерства сільського господарства США розмістили майже 17 тис. пасток з феромонами трімедлюром, кьюлюром і метілевгенолом на півдні країни з метою фіксації трьох небезпечних шкідників: середземноморської плодової мухи, динної мухи та східній фруктової "мухи. Вони дозволяють швидко виявити і знищити шкідників, перш ніж ті встигають влаштуватися на новій території. Таке раннє виявлення шкідників зберігає багато мільйонів доларів, які треба було б витратити на винищення небезпечних інтродуцентів. Для тієї ж мети кільцем пасток були оточені порти, через які здійснюється імпорт товарів. Якщо якомусь шкідливому комасі все-таки вдається влаштуватися, пастки з феромонами полегшують винищення комах, точно вказуючи місцезнаходження шкідника, а також, де і коли слід застосовувати хімічні інсектициди, які в. цьому випадку не забруднюють природне середовище марно. Так, наприклад, в 1956 р. під Флориді середземноморська плодова муха поширилася на площі близько 0,4 млн. га. Використання пасток з атрактантамі для з'ясування місця знаходження шкідника та інсектицидів для його знищення дозволило повністю винищити середземноморську плодову муху до кінця наступного року.
Американський бавовняний довгоносик, поширений від східного Техасу до Атлантичного океану, - один з найнебезпечніших шкідників бавовнику. На його частку припадає три чверті втрат бавовнику і майже третина інсектицидів, щорічно використовуються в сільському господарстві США. У 70-х роках у деяких штатах США була здійснена програма придушення популяції бавовняного довгоносика за допомогою сексоловушек з грандлуром.
На о-ві Рота, розташованому в Тихому океані, східну фруктову муху вдалося викорінити шляхом приманювання самців за допомогою атрактанти метілевгенола на поверхню, покриту інсектицидом.
Таких прикладів ефективного застосування сексоловушек можна навести чимало. Поряд з сексоловушкамі для створення «самцовая вакууму» застосовується розсіювання феромона. У цьому випадку відбувається дезорієнтація самців. Ефективність цього прийому підвищується в міру зниження чисельності популяції шкідника-мішені. При великій щільності популяції самці можуть знаходити самок випадково. Для дезорієнтації самців непарного шовкопряда - небезпечного шкідника лісових, декоративних і фруктових дерев - використовують препарат діспарлюр. Він зберігає свою активність в польових умовах протягом тривалого часу. У дозі 20 г / га діспарлюр істотно пригнічує чисельність непарного шовкопряда. Ця речовина не надає відчутного впливу на навколишнє середовище або інші будь-які організми, крім шкідника.
Застосування феромонів дозволяє не тільки дезорієнтувати комах і завдяки цьому знижувати чисельність шкідників, але й запобігати розселення їх з вогнищ зараження. Експерименти, проведені в Пермській області, показали, що внесення феромона безпосередньо у вже наявні осередки високої чисельності короеда-гіпографа припиняє розліт жуків з цих вогнищ в інші місця.
Перший вітчизняний феромон східної плодожерки був синтезований у середині 70-х років. У 1975-1980 рр.. в нашій країні були проведені випробування пасток і феромонів вітчизняного та американського виробництва. Виявилося, що уловлює здатність пасток, виготовлених у нашій країні, в 2 рази вище американських.
Розрахунки вчених показують, що для придушення популяції шкідника при високій її вихідної чисельності потрібно близько 4,5 тис. пасток на 1 га або 50 - на одне дерево. Але при невеликій чисельності для захисту саду досить використовувати 30-50 пасток на 1га.
Для розвитку нового напрямку боротьби з шкідниками полів і садів необхідно створити високоефективні препаративні форми феромонів. Вартість феромонів висока, тому вчені розробили такі методи їх використання, коли випаровування діючої речовини відбувається повільно, протягом тривалого часу. Так, наприклад, для боротьби з непарним шовкопрядом застосовуються мікрокапсули, що містять діспарлюр - статевий атрактанти цієї комахи. Він широко використовується в США як засоби прямої боротьби з цим надзвичайно небезпечним шкідником. Діспарлюр викликає дезорієнтацію самців, які стають статевозрілими раніше, ніж самки. Мікрокапсули атрактанти представляють соббй кульки з желатину або поліаміду діаметром від 3 до 40 мкм, всередині яких укладено повільно випаровується феромон. За допомогою таких мікрокапсул вдається знизити чисельність непарного шовкопряда за чотири тижні на 98%.
Вчені інтенсивно працюють над вдосконаленням полімерних диспенсерів (носіїв) і способів їх розкидання. У США використовуються два типи диспенсерів - фіброволокна фірми Конрел і тришарові полімерні пластинки фірми Геркон. Норма витрати феромона зазвичай становить кілька грамів на 1 га протягом сезону. На думку фахівців, у найближчі роки феромони будуть широко використовуватися для боротьби з шкідниками плодових культур, бавовнику, кукурудзи та деяких технічних культур. Застосування фізіологічно активних речовин для боротьби з шкідливими комахами видається надзвичайно перспективним.
Поряд з феромонами в цілях захисту рослин можуть бути використані інші фізіологічно активні речовини комах. Залози внутрішньої секреції продукують різні гормони. Найбільш вивченими є ювенільний (або личинковий) гормон і гормон линьки (екдізон). Вони грають важливу роль в гормональній регуляції розвитку комах. Разом з тим фахівці в галузі захисту рослини можуть використовувати ці гормони для порушення нормального ходу розвитку і розмноження комах.
Використання гормональних препаратів для боротьби з шкідливими комахами має специфічні особливості. Застосування їх не забезпечує миттєву загибель комах, тому шкідники в разі масового поширення можуть завдати істотної шкоди рослинам. Крім того, критичний період дії гормонів обмежений у часі, що також ускладнює їх використання. Однак певні переваги гормональних препаратів (вони не накопичуються в організмі, малотоксичні для хребетних тварин, до них неможливо звикання комах) спонукають учених вести подальші дослідження в напрямку практичного використання цих речовин у боротьбі зі шкідливими комахами. Ці дослідження виявляться ще більш продуктивними, якщо будуть "проводитися з використанням методів біотехнології та генетичної інженерії. Встановлено, що речовини, аналогічні гормонів комах, продукуються поруч рослин. Ці речовини, наприклад, фітозкдізони, можуть вироблятися в ферментерах методом культури рослинних тканин.
Важливий аспект захисту рослин - боротьба з смітної рослинністю. В даний час для боротьби з смітної рослинністю широко застосовується хімічний метод, заснований на використанні гербіцидів. Повсюдне використання гербіцидів у сучасному рослинництві обумовлено тим, що це рентабельний спосіб підвищення врожайності сільськогосподарських культур, високоефективний метод підвищення продуктивності праці в сільському господарстві. Істотним недоліком гербіцидів є їх більш-менш виражена токсичність для тварин і людини. Разом із зливовими водами, а також у результаті знесення аерозолів вони можуть потрапляти у водойми, отруюючи там все живе, що робить воду непридатною для споживання тваринами і людиною. Крім того, вони можуть накопичуватися в рослинних кормах і тваринницьких продуктах.
У зв'язку з цим вчені інтенсивно працюють над підвищенням, ролі так званого біологічного методу боротьби з смітної рослинністю, що включає використання для цієї мети живих організмів або продуктів їхньої життєдіяльності. І тут відкривається широке поле для застосування досягнень біотехнології генетичної інженерії. За допомогою біотехнологічних прийомів можна швидко розмножити організми, що знищують сміттєві рослини, виробляти придатні для тієї ж мети речовини.
До теперішнього часу отримані гербіциди нового покоління, більш перспективні як з точки зору ефективності, так і з позицій екотоксикології. Їх отримують, зокрема, з мікроорганізмів. Одна з переваг виробництва мікробних гербіцидів - універсальність обладнання (ферментерів), необхідних для культивування гербіцідсінтезірующіх мікроорганізмів. Друге істотну перевагу мікробіологічного виробництва пестицидів - значно менше негативний вплив за допомогою відходів та викидів на навколишнє середовище. По-третє, гербіциди мікробного походження, не є чужорідними для природного середовища. Актиноміцети, що живуть у грунті, постійно виробляють їх і виділяють у навколишнє середовище. Цілком природно, в грунтовому біоценозі в ході еволюції виникли системи, спрямовані на деградацію речовин, що виділяються актиноміцетами. Ці системи будуть функціонувати і в тому випадку, якщо ми опрацюємо рослини гербіцидами, отриманими за участю актиноміцетів в ферментере. Завдяки цьому в природному середовищі не буде відбуватися накопичення токсичних речовин. До речі, ця обставина має враховуватися при розробці методів використання мікробних гербіцидів: багато хто з них будуть мати низьку ефективність при внесенні в грунт.
В даний час відомий ряд мікроорганізмів, які вже є або можуть бути значущими продуцентами гербіцидів. Їх використання в практиці передбачає проведення більш глибоких досліджень в області головним чином генетичної інженерії, що забезпечить інтенсивне використання мікроорганізмів у великотоннажних біотехнологічних виробництвах.
У Японії для боротьби з смітної рослинністю передбачається використовувати гербіцид біалафос, що продукується актиноміцетами Streptomyces hygrosporicus і S. viridochromogenes. Цей гербіцид має широкий спектр дії на такі бур'яни, як плоскуха звичайний, лобода біла, сить кругла при послевсходовое його застосуванні на всуех фазах росту рослин. При внесенні в грунт біалафос практично неефективний з причини, зазначеної вище. Після обприскування рослин розчином гербіцид швидко, переміщається в коріння, потім рослина гине. У цьому відношенні біалафос подібний з гербіцидом гліфосатом (фосфоно-метілглй1діном), проте його дія на сміттєві рослини проявляється більш сильно. Рекомендована доза становить 1 кг / га. В даний час в Японії налагоджується, виробництво цього препарату. Передбачається, що він знайде широке застосування. Вчені не без підстав вважають його надзвичайно перспективним з точки зору механізму дії. Він, очевидно, опиниться в полі зору фізіологів рослин, біохіміків, фахівців у галузі генетичної інженерії.
Деякі штами актиноміцетів продукують речовину, зване анісоміціном, яке характеризується тим, що уповільнює зростання корінців у проростків таких рослин, як плоскуха, люцерна, томати, пальчатка та ін Це речовина стала вихідним в отриманні цілого ряду похідних. Результатом дослідження структури і біологічної активності цих похідних стало створення нового гербіциду під назвою «метоксіфенон». Ця речовина має високу ефективність проти багатьох однорічних видів бур'янів. Застосовують його перед появою сходів. З'являються сходи поглинають гербіцид, в результаті чого виникає хлороз, що приводить до відмирання бур'янів. Гербіцид призначений для використання в посівах рису.
Спочатку в фільтраті S. saganonensis 4075 були виявлені два метаболіти з гербіцидною активністю, так звані гербіцідіни А і В, а пізніше ще три - З, Д, Е. Вони надають виборче контактна гербіцидну дію на дводольні бур'яни, пригнічують проростання насіння. Питання про їх практичному використанні поки не вирішене.
Відомі й інші гербіцідоподобние речовини мікроорганізмів, такі; як нараміцін, тойокаміцін, піолютеріон, цітобаріцін, форміцін А і В. Перспективними продуцентами гербіцідоподобних речовин розглядаються S. toyocaensis, гриб ірпекс (Irpex pacyodon). Як ефективний гербіцид діє різобітоксін в дозі 0,2 кг / га, синтезується деякими штамами Rhizobium japonicum.
Результати практичного використання препаратів мікробного походження для захисту рослин від бур'янів поки незрівнянно більш скромні в порівнянні з масштабами застосування класичних гербіцидів. Проте мікробні препарати відкривають принципово нові можливості з точки зору охорони навколишнього середовища людини. Фахівці в галузі захисту рослин вважають, що в найближчі роки виробництво гербіцидів мікробного походження, що виробляються на біотехнологічних підприємствах, різко зросте. Очікується, що свій внесок у розвиток їх виробництва внесе генетична інженерія.
Джерелом отримання гербіцидів можуть бути не тільки мікроорганізми, а й вищі рослини. Справа в тому, що вони синтезують найрізноманітніші речовини, частина з яких через коріння виділяється в грунт. Серед кореневих виділень рослин є сполуки, згубно впливають на інші рослини. Дуже інтенсивним гербіцидним, бактерицидну і фунгіцидну дію має, наприклад, агропірен, що виділяється в середу бур'яном пирієм повзучим. Якщо з кореневищ пирію відігнати ефірну олію, то воно буде містити близько 95% агропірена. Встановлено, що агропірен проникає в коріння і листя рослин і викликає спочатку пошкодження кінчиків коренів, а потім відмирання кореневої системи. Проникаючи в судини, він переміщається по рослині і отруює наймолодші частини рослин.
В даний час вчені досліджують колекції сортів різних культур у відношенні виділення ними речовин, що пригнічують бур'янисту рослинність. Сорти, що володіють такою здатністю, при вирощуванні не вимагають внесення гербіцидів.
В даний час методи генетичної і клітинної інженерії все частіше починають застосовуватися для створення рослин, стійких до хвороб, шкідників і токсичних речовин. Так, наприклад, за допомогою плазмід пухлинотворні бактерії Agrobacterium tumefaciens були отримані стійкі до антибіотика канаміцину рослини тютюну і томатів. Шляхом перенесення в клітини тютюну, сої, бавовнику і томатів гена стійкості до гербіциду гліфосату вдалося підвищити їх резистентність до обробки гербіцидами. У рослини тютюну був перенесений ген, що контролює синтез токсичного для личинок комах білка В. thuringiensis. Ген, який контролює утворення токсичного для личинок білка, попередньо був клонований і введений в кишкову паличку. Завдяки підвищенню стійкості тютюну по відношенню до шкідливих комах вдалося знизити рівень хімічного захисту його від комах.
Отримання рослин-регенерантів, стійких до абіотичних і біотичних стресових факторів методами клітинної інженерії
Засуха. Нестача води у грунті завдає значно більшої шкоди рослинництву, ніж всі інші стресові фактори, разом узяті. Засуха призводить до виникнення водного дефіциту в грунті і відповідно в рослинах, викликаючи у них водний стрес. Хоча термін «посуха» відноситься головним чином до грунтового водного стресу, він включає також вплив спеки на рослини. Стрес, викликаний водним дефіцитом, може бути первинним у разі посухи, а також вторинним при низькотемпературному, тепловому або сольовому стресах. Стрес, викликаний посухою, веде до прямих або непрямих пошкоджень рослин, які обумовлені інактивацією ферментів, порушенням біохімічних шляхів, накопиченням токсичних речовин, витоком іонів, дефіцитом харчування та іншими причинами.
З метою імітації in vitro стресового ефекту засухи можуть застосовуватися живильні середовища, які доповнені осмотично активними речовинами, що знижують зовнішній водний потенціал. В якості такого селективного агента, для селекції на стійкість до посухи були використані поліетиленгліколь (ПЕГ), що представляє собою непроникаюче в клітку осмотично активна речовина. Перше повідомлення про виділення клітинних ліній тютюну, стійких до стресу, індукованому ПЕГ, з'явилося в 1979 р. (Heyser, Nabors, 1979). Пізніше для селекції на посухостійкість Р. Брессан з співавт. використовував клітинні лінії томата, які піддавалися водного стресу при культивуванні калюсних тканини в присутності ПЕГ 6000 в концентрації 15%. У результаті дослідів було відібрано стійкі калюсна лінії, однак стійкість швидко втрачалася при культивуванні калюсу на середовищі без осмотіка, що вказує на фізіологічну природу адаптації. Тестування калюсних ліній на зростання в присутності ПЕГ запропоновано для ідентифікації витривалих до посухи генотипів сої. Аналіз зростання калюсних тканин десяти сортів сої на середовищах з 0,15, 20% ПЕГ 8000 свідчив про кореляцію посухостійкості у рослин і толерантності до ПЕГ культивованих клітин. Для отримання адаптованих до водного стресу клітинних ліній також застосовувалися середовища, що містять як осмотіка 99-880 мМ манітол. Як і в попередньому випадку, осмотично адаптовані клітини мали підвищену витривалістю до сольового стресу.
Засолення. Одним з лімітуючих факторів сільськогосподарської продуктивності є засолення грунтів. Близько 900 млн. га всіх земель нашої планети мають підвищений вміст солей, а кількість засолених грунтів з кожним роком зростає. Особливу тривогу викликає збільшення в грунтах вмісту солей, що відбувається в результаті їх штучного зрошення. Рішення даної проблеми багато в чому залежить від розробки раціональних агротехнічних прийомів, правильної методології зрошення, використання для поливу частково або повністю знесоленої води. З розвитком біотехнології рослин потенційно можливим є отримання Солевитривала генотипів у важливих сільськогосподарських культур шляхом селекції на рівні соматичних клітин, злиття протопластів або переносу генів при використанні техніки рекомбінантних молекул ДНК.
Шкідлива дія засолення має комплексний характер і обумовлено як порушенням осмотичного балансу клітини, так і прямим токсичним впливом іонів натрію, хлору на фізіологічні та біохімічні процеси в клітині. Результатом такої дії може бути зменшення тургору клітини, інгібування функції мембран і активності ферментів, придушення фотосинтезу, нестачі окремих іонів через порушення селективного транспорту іонів, використання значної кількості енергії для підтримки толерантності. Основні типи реакцій рослин, що виникають у відповідь на підвищення концентрації солей у зовнішньому середовищі.
Експериментальні дані, отримані багатьма вченими, показують, що клітинні механізми витривалості до засолення є схожими для культивованих in vitro клітин і цілих рослин і що селекція на клітинному рівні представляє реальну перспективу отримання стійких до засолення форм рослин.
Більшість селекційних програм спрямовані на виділення in vitro клітинних ліній, толерантних до присутності в середовищі для культивування клітин хлориду натрію. Так, показано, що вирощуючи гаплоїдні калюсна клітини тютюну на середовищі з постійно збільшується концентрацією солей, отримані клітинні лінії, здатні до зростання в присутності 1% NaCl. M. Наборі з співав. попередньо обробивши суспензійну культуру тютюну мутагеном (0,15% ЕМС, 60 хв), шляхом одноступінчастої селекції виділили клітинні лінії, стійкі до 0,5% NaCl. Відзначено, що витривалість, отриманих регенерантів до засолення, проявлялася на рівні цілих рослин.
На кафедрі сільськогосподарської біотехнології Московської сільськогосподарської академії ім. К.А. Тімірязєва проводилися дослідження щодо отримання солестійких рослин на прикладі ярих твердих і м'яких пшениць. Первинним експлантів служили як ізольовані незрілі зародки, так і гаплоїдів. Клітинну селекцію проводили на калюсна тканини, культивованих на живильному середовищі, що містить 0,3% NaCI або Na2SO 4 протягом 5-6 пасажів. У результаті досліджень були отримані стійкі клітинні лінії, а також рослини-регенеранти. Тестування на солестійкість першого насіннєвого покоління рослині-регенерантів методом реєстрації сповільненою флоуроесценціі показало, що фотосинтетичний апарат деяких рослині-регенерантів по стійкості до засолення перевершує вихідний сорт (Нікіфорова І.Д., 1993, 1994).
Солевитривала рослин вдається також підвищити в результаті селекції до одного фактору засолення осмотичного стресу. Наприклад, клітини томата, адаптовані до водного стресу, індукованому поліетиленгліколем, мали підвищену стійкість до NaС1. Підвищена толерантність до солі виявлена у клітинних ліній моркви, відібраних на середовищі, що містить як осмотіка манітол у високій концентрації (99-870 мМ). З цих результатів випливає, що адаптація клітин до осмотичного стресу застосовна для відбору Солевитривала варіантів, а дослідження подібного роду представляють інтерес для вивчення як у взаємодії, так і незалежно один від одного.
Метали. Присутність в грунті у великій кількості іонів металів, токсично впливають на рослини, або недолік іонів, що використовуються рослинами як поживних речовин, можуть бути причиною іонного (мінерального) стресу у рослин. Особливу увагу вчених привертає вивчення стресів, обумовлених наявністю в грунті іонів важких металів, багато з яких токсично впливають як на рослинні, так і на тваринні організми. Стресовий стан у рослин може бути індуковано іонами таких важких металів, як цинк, кадмій, мідь, ртуть, вони також досить часто зустрічаються і в грунтах, механізми стійкості до токсичних іонів можуть виключати зменшення проникності плазмалеми, детоксикацію іонів в результаті зв'язування з органічними речовинами, компартментализацию у вакуолях, а також зміни структури ферментів, які є їх мішенями.
Роботи з клітинної селекції рослин на стійкість до іонних стресів розпочаті нещодавно, але вже мають позитивний результат. У всіх експериментах використовується метод прямої селекції, при якому в якості селективного агента застосовували токсичні концентрації солей. Проте створення стресових селективних умов in vitro, ідентичних таким в природі, вкрай важко. У природних умовах крім токсичної дії іонів накладаються інші чинники, зокрема наявність різних речовин, кислотність грунту і т. д. Для селекції на клітинному рівні використовують живильні середовища, які хоча не повністю відповідали природним стресових умов, все ж таки забезпечували експресію ознаки стійкості і давали можливість відбирати потрібні варіанти.
Шляхом прямої селекції in vitro відібрані клітинні лінії петунії, стійкі до ртуті, сорго-до алюмінію, моркви - до алюмінію і марганцю одночасно; суспензійні клітинні культури дурману - до кадмію. На кафедрі сільськогосподарської біотехнології МСХА також проводилися роботи з одержання клітинних ліній та рослин-регенерантів льону-довгунця, стійких до солі нітрату кадмію і вивчалася дія цієї солі на інтактні рослини. Експериментально показано, що присутність іонів кадмію в грунті призводить до гальмування росту стеблової і кореневої частин рослини, до скорочення на 7-9 днів онтогенетичних фаз розвитку, наступних за фазою «ялинки» у порівнянні з контролем, культурні види накопичують іони кадмію у вегетативній масі, в той час як дикі - ні. Мезо-та ультраструктурний аналіз стебел льону-довгунця показав, що присутність кадмію в субстраті призводило до зменшення кількості клітин елементарних волоконець в пучку, до некомпактного розташуванню клітин елементарних волоконець в луб'яних пучках, а також до формування клітин елементарних волоконець неоднакових розмірів у межах одного пучка і до різних термінів формування вторинної клітинної стінки. У результаті клітинної селекції були отримані рослини-регенеранти, що володіють стійкістю до солі кадмію (Гончарук Е.А., 2000).
Екстремальні температури. Причиною стресового чинника у рослин можуть бути відносно високі або низькі температури. Робіт з клітинної селекції на стійкість до цих стресів небагато. У вивченій нами літературі відомостей про клітинної селекції до теплового шоку не виявлено, хоча білки теплового шоку є предметом пильного вивчення біологів різного профілю. Що стосується робіт з клітинної селекції до низькотемпературних факторів, то вони мають місце.
Холодовий стрес у рослин може бути викликаний температурами великого діапазону: від 10-15 ° до 0 ° С. Такому стресу найбільш схильні рослини тропічних і субтропічних зон. Стійкість рослин до охолодження обумовлена здатністю ліпідів мембран залишатися в рідкому стані завдяки наявності великої пропорції ненасичених жирних кислот і / або підвищеного вмісту стеролів. Пошкодження, викликані промороження рослин (температура нижче 0 ° С) пов'язані насамперед із формуванням позаклітинного льоду. При цьому відтік води в позаклітинний простір призводить до вторинного ефекту, викликаного водним стресом. Порушення, викликані негативними температурами, можуть бути запобігти акумуляцією антифризного речовин, зменшенням кількості незв'язаної води при зневодненні і збільшенням здатності переохолоджуватися. Більшість авторів зазначають, що у рослин відбуваються глибокі перетворення запасних поживних речовин, зокрема, у морозостійких деревних рослин накопичення великої кількості жирів, а у менш стійких - Сахаров.
Перші експерименти, в яких описана можливість використання культивованих рослинних клітин для відбору витривалих до низьких температур клітинних ліній, опубліковані в 1976 р. (Dix, Street, 1976). Роботи проводилися на суспензійних культурах тютюну і перцю, які після висіву на агаризованому середовища піддавалися протягом 21 дня відповідно температур - 3 ° і 4 ° С. Серед відібраних клонів виявлені лінії, стабільно зберігають підвищену холодостійкість.
Грунтуючись на наявних у цій області досліджень даних, однозначну відповідь про можливість застосування прямої селекції in vitro рослин, витривалих до низької температури, давати поки рано. Безсумнівно, однак, що індукція in vitro генетичного різноманіття знайде застосування для відбору більш витривалих варіантів.
Список літератури
1. Біотехнологія - агропромисловому комплексу / / В. І. Артамонов. - М.: Наука, 1989. - 160 с.
2. Сільськогосподарська біотехнологія: Учеб / В.С.Шевелуха, Калашнікова О.О. та ін; Під ред. В. С. Шевелуха - 2-е вид. перераб. і доп. - М.: Вищ. шк., 2003. -496.
Таких прикладів ефективного застосування сексоловушек можна навести чимало. Поряд з сексоловушкамі для створення «самцовая вакууму» застосовується розсіювання феромона. У цьому випадку відбувається дезорієнтація самців. Ефективність цього прийому підвищується в міру зниження чисельності популяції шкідника-мішені. При великій щільності популяції самці можуть знаходити самок випадково. Для дезорієнтації самців непарного шовкопряда - небезпечного шкідника лісових, декоративних і фруктових дерев - використовують препарат діспарлюр. Він зберігає свою активність в польових умовах протягом тривалого часу. У дозі 20 г / га діспарлюр істотно пригнічує чисельність непарного шовкопряда. Ця речовина не надає відчутного впливу на навколишнє середовище або інші будь-які організми, крім шкідника.
Застосування феромонів дозволяє не тільки дезорієнтувати комах і завдяки цьому знижувати чисельність шкідників, але й запобігати розселення їх з вогнищ зараження. Експерименти, проведені в Пермській області, показали, що внесення феромона безпосередньо у вже наявні осередки високої чисельності короеда-гіпографа припиняє розліт жуків з цих вогнищ в інші місця.
Перший вітчизняний феромон східної плодожерки був синтезований у середині 70-х років. У 1975-1980 рр.. в нашій країні були проведені випробування пасток і феромонів вітчизняного та американського виробництва. Виявилося, що уловлює здатність пасток, виготовлених у нашій країні, в 2 рази вище американських.
Розрахунки вчених показують, що для придушення популяції шкідника при високій її вихідної чисельності потрібно близько 4,5 тис. пасток на 1 га або 50 - на одне дерево. Але при невеликій чисельності для захисту саду досить використовувати 30-50 пасток на 1га.
Для розвитку нового напрямку боротьби з шкідниками полів і садів необхідно створити високоефективні препаративні форми феромонів. Вартість феромонів висока, тому вчені розробили такі методи їх використання, коли випаровування діючої речовини відбувається повільно, протягом тривалого часу. Так, наприклад, для боротьби з непарним шовкопрядом застосовуються мікрокапсули, що містять діспарлюр - статевий атрактанти цієї комахи. Він широко використовується в США як засоби прямої боротьби з цим надзвичайно небезпечним шкідником. Діспарлюр викликає дезорієнтацію самців, які стають статевозрілими раніше, ніж самки. Мікрокапсули атрактанти представляють соббй кульки з желатину або поліаміду діаметром від 3 до 40 мкм, всередині яких укладено повільно випаровується феромон. За допомогою таких мікрокапсул вдається знизити чисельність непарного шовкопряда за чотири тижні на 98%.
Вчені інтенсивно працюють над вдосконаленням полімерних диспенсерів (носіїв) і способів їх розкидання. У США використовуються два типи диспенсерів - фіброволокна фірми Конрел і тришарові полімерні пластинки фірми Геркон. Норма витрати феромона зазвичай становить кілька грамів на 1 га протягом сезону. На думку фахівців, у найближчі роки феромони будуть широко використовуватися для боротьби з шкідниками плодових культур, бавовнику, кукурудзи та деяких технічних культур. Застосування фізіологічно активних речовин для боротьби з шкідливими комахами видається надзвичайно перспективним.
Поряд з феромонами в цілях захисту рослин можуть бути використані інші фізіологічно активні речовини комах. Залози внутрішньої секреції продукують різні гормони. Найбільш вивченими є ювенільний (або личинковий) гормон і гормон линьки (екдізон). Вони грають важливу роль в гормональній регуляції розвитку комах. Разом з тим фахівці в галузі захисту рослини можуть використовувати ці гормони для порушення нормального ходу розвитку і розмноження комах.
Використання гормональних препаратів для боротьби з шкідливими комахами має специфічні особливості. Застосування їх не забезпечує миттєву загибель комах, тому шкідники в разі масового поширення можуть завдати істотної шкоди рослинам. Крім того, критичний період дії гормонів обмежений у часі, що також ускладнює їх використання. Однак певні переваги гормональних препаратів (вони не накопичуються в організмі, малотоксичні для хребетних тварин, до них неможливо звикання комах) спонукають учених вести подальші дослідження в напрямку практичного використання цих речовин у боротьбі зі шкідливими комахами. Ці дослідження виявляться ще більш продуктивними, якщо будуть "проводитися з використанням методів біотехнології та генетичної інженерії. Встановлено, що речовини, аналогічні гормонів комах, продукуються поруч рослин. Ці речовини, наприклад, фітозкдізони, можуть вироблятися в ферментерах методом культури рослинних тканин.
Важливий аспект захисту рослин - боротьба з смітної рослинністю. В даний час для боротьби з смітної рослинністю широко застосовується хімічний метод, заснований на використанні гербіцидів. Повсюдне використання гербіцидів у сучасному рослинництві обумовлено тим, що це рентабельний спосіб підвищення врожайності сільськогосподарських культур, високоефективний метод підвищення продуктивності праці в сільському господарстві. Істотним недоліком гербіцидів є їх більш-менш виражена токсичність для тварин і людини. Разом із зливовими водами, а також у результаті знесення аерозолів вони можуть потрапляти у водойми, отруюючи там все живе, що робить воду непридатною для споживання тваринами і людиною. Крім того, вони можуть накопичуватися в рослинних кормах і тваринницьких продуктах.
У зв'язку з цим вчені інтенсивно працюють над підвищенням, ролі так званого біологічного методу боротьби з смітної рослинністю, що включає використання для цієї мети живих організмів або продуктів їхньої життєдіяльності. І тут відкривається широке поле для застосування досягнень біотехнології генетичної інженерії. За допомогою біотехнологічних прийомів можна швидко розмножити організми, що знищують сміттєві рослини, виробляти придатні для тієї ж мети речовини.
До теперішнього часу отримані гербіциди нового покоління, більш перспективні як з точки зору ефективності, так і з позицій екотоксикології. Їх отримують, зокрема, з мікроорганізмів. Одна з переваг виробництва мікробних гербіцидів - універсальність обладнання (ферментерів), необхідних для культивування гербіцідсінтезірующіх мікроорганізмів. Друге істотну перевагу мікробіологічного виробництва пестицидів - значно менше негативний вплив за допомогою відходів та викидів на навколишнє середовище. По-третє, гербіциди мікробного походження, не є чужорідними для природного середовища. Актиноміцети, що живуть у грунті, постійно виробляють їх і виділяють у навколишнє середовище. Цілком природно, в грунтовому біоценозі в ході еволюції виникли системи, спрямовані на деградацію речовин, що виділяються актиноміцетами. Ці системи будуть функціонувати і в тому випадку, якщо ми опрацюємо рослини гербіцидами, отриманими за участю актиноміцетів в ферментере. Завдяки цьому в природному середовищі не буде відбуватися накопичення токсичних речовин. До речі, ця обставина має враховуватися при розробці методів використання мікробних гербіцидів: багато хто з них будуть мати низьку ефективність при внесенні в грунт.
В даний час відомий ряд мікроорганізмів, які вже є або можуть бути значущими продуцентами гербіцидів. Їх використання в практиці передбачає проведення більш глибоких досліджень в області головним чином генетичної інженерії, що забезпечить інтенсивне використання мікроорганізмів у великотоннажних біотехнологічних виробництвах.
У Японії для боротьби з смітної рослинністю передбачається використовувати гербіцид біалафос, що продукується актиноміцетами Streptomyces hygrosporicus і S. viridochromogenes. Цей гербіцид має широкий спектр дії на такі бур'яни, як плоскуха звичайний, лобода біла, сить кругла при послевсходовое його застосуванні на всуех фазах росту рослин. При внесенні в грунт біалафос практично неефективний з причини, зазначеної вище. Після обприскування рослин розчином гербіцид швидко, переміщається в коріння, потім рослина гине. У цьому відношенні біалафос подібний з гербіцидом гліфосатом (фосфоно-метілглй1діном), проте його дія на сміттєві рослини проявляється більш сильно. Рекомендована доза становить 1 кг / га. В даний час в Японії налагоджується, виробництво цього препарату. Передбачається, що він знайде широке застосування. Вчені не без підстав вважають його надзвичайно перспективним з точки зору механізму дії. Він, очевидно, опиниться в полі зору фізіологів рослин, біохіміків, фахівців у галузі генетичної інженерії.
Деякі штами актиноміцетів продукують речовину, зване анісоміціном, яке характеризується тим, що уповільнює зростання корінців у проростків таких рослин, як плоскуха, люцерна, томати, пальчатка та ін Це речовина стала вихідним в отриманні цілого ряду похідних. Результатом дослідження структури і біологічної активності цих похідних стало створення нового гербіциду під назвою «метоксіфенон». Ця речовина має високу ефективність проти багатьох однорічних видів бур'янів. Застосовують його перед появою сходів. З'являються сходи поглинають гербіцид, в результаті чого виникає хлороз, що приводить до відмирання бур'янів. Гербіцид призначений для використання в посівах рису.
Спочатку в фільтраті S. saganonensis 4075 були виявлені два метаболіти з гербіцидною активністю, так звані гербіцідіни А і В, а пізніше ще три - З, Д, Е. Вони надають виборче контактна гербіцидну дію на дводольні бур'яни, пригнічують проростання насіння. Питання про їх практичному використанні поки не вирішене.
Відомі й інші гербіцідоподобние речовини мікроорганізмів, такі; як нараміцін, тойокаміцін, піолютеріон, цітобаріцін, форміцін А і В. Перспективними продуцентами гербіцідоподобних речовин розглядаються S. toyocaensis, гриб ірпекс (Irpex pacyodon). Як ефективний гербіцид діє різобітоксін в дозі 0,2 кг / га, синтезується деякими штамами Rhizobium japonicum.
Результати практичного використання препаратів мікробного походження для захисту рослин від бур'янів поки незрівнянно більш скромні в порівнянні з масштабами застосування класичних гербіцидів. Проте мікробні препарати відкривають принципово нові можливості з точки зору охорони навколишнього середовища людини. Фахівці в галузі захисту рослин вважають, що в найближчі роки виробництво гербіцидів мікробного походження, що виробляються на біотехнологічних підприємствах, різко зросте. Очікується, що свій внесок у розвиток їх виробництва внесе генетична інженерія.
Джерелом отримання гербіцидів можуть бути не тільки мікроорганізми, а й вищі рослини. Справа в тому, що вони синтезують найрізноманітніші речовини, частина з яких через коріння виділяється в грунт. Серед кореневих виділень рослин є сполуки, згубно впливають на інші рослини. Дуже інтенсивним гербіцидним, бактерицидну і фунгіцидну дію має, наприклад, агропірен, що виділяється в середу бур'яном пирієм повзучим. Якщо з кореневищ пирію відігнати ефірну олію, то воно буде містити близько 95% агропірена. Встановлено, що агропірен проникає в коріння і листя рослин і викликає спочатку пошкодження кінчиків коренів, а потім відмирання кореневої системи. Проникаючи в судини, він переміщається по рослині і отруює наймолодші частини рослин.
В даний час вчені досліджують колекції сортів різних культур у відношенні виділення ними речовин, що пригнічують бур'янисту рослинність. Сорти, що володіють такою здатністю, при вирощуванні не вимагають внесення гербіцидів.
В даний час методи генетичної і клітинної інженерії все частіше починають застосовуватися для створення рослин, стійких до хвороб, шкідників і токсичних речовин. Так, наприклад, за допомогою плазмід пухлинотворні бактерії Agrobacterium tumefaciens були отримані стійкі до антибіотика канаміцину рослини тютюну і томатів. Шляхом перенесення в клітини тютюну, сої, бавовнику і томатів гена стійкості до гербіциду гліфосату вдалося підвищити їх резистентність до обробки гербіцидами. У рослини тютюну був перенесений ген, що контролює синтез токсичного для личинок комах білка В. thuringiensis. Ген, який контролює утворення токсичного для личинок білка, попередньо був клонований і введений в кишкову паличку. Завдяки підвищенню стійкості тютюну по відношенню до шкідливих комах вдалося знизити рівень хімічного захисту його від комах.
Отримання рослин-регенерантів, стійких до абіотичних і біотичних стресових факторів методами клітинної інженерії
Засуха. Нестача води у грунті завдає значно більшої шкоди рослинництву, ніж всі інші стресові фактори, разом узяті. Засуха призводить до виникнення водного дефіциту в грунті і відповідно в рослинах, викликаючи у них водний стрес. Хоча термін «посуха» відноситься головним чином до грунтового водного стресу, він включає також вплив спеки на рослини. Стрес, викликаний водним дефіцитом, може бути первинним у разі посухи, а також вторинним при низькотемпературному, тепловому або сольовому стресах. Стрес, викликаний посухою, веде до прямих або непрямих пошкоджень рослин, які обумовлені інактивацією ферментів, порушенням біохімічних шляхів, накопиченням токсичних речовин, витоком іонів, дефіцитом харчування та іншими причинами.
З метою імітації in vitro стресового ефекту засухи можуть застосовуватися живильні середовища, які доповнені осмотично активними речовинами, що знижують зовнішній водний потенціал. В якості такого селективного агента, для селекції на стійкість до посухи були використані поліетиленгліколь (ПЕГ), що представляє собою непроникаюче в клітку осмотично активна речовина. Перше повідомлення про виділення клітинних ліній тютюну, стійких до стресу, індукованому ПЕГ, з'явилося в 1979 р. (Heyser, Nabors, 1979). Пізніше для селекції на посухостійкість Р. Брессан з співавт. використовував клітинні лінії томата, які піддавалися водного стресу при культивуванні калюсних тканини в присутності ПЕГ 6000 в концентрації 15%. У результаті дослідів було відібрано стійкі калюсна лінії, однак стійкість швидко втрачалася при культивуванні калюсу на середовищі без осмотіка, що вказує на фізіологічну природу адаптації. Тестування калюсних ліній на зростання в присутності ПЕГ запропоновано для ідентифікації витривалих до посухи генотипів сої. Аналіз зростання калюсних тканин десяти сортів сої на середовищах з 0,15, 20% ПЕГ 8000 свідчив про кореляцію посухостійкості у рослин і толерантності до ПЕГ культивованих клітин. Для отримання адаптованих до водного стресу клітинних ліній також застосовувалися середовища, що містять як осмотіка 99-880 мМ манітол. Як і в попередньому випадку, осмотично адаптовані клітини мали підвищену витривалістю до сольового стресу.
Засолення. Одним з лімітуючих факторів сільськогосподарської продуктивності є засолення грунтів. Близько 900 млн. га всіх земель нашої планети мають підвищений вміст солей, а кількість засолених грунтів з кожним роком зростає. Особливу тривогу викликає збільшення в грунтах вмісту солей, що відбувається в результаті їх штучного зрошення. Рішення даної проблеми багато в чому залежить від розробки раціональних агротехнічних прийомів, правильної методології зрошення, використання для поливу частково або повністю знесоленої води. З розвитком біотехнології рослин потенційно можливим є отримання Солевитривала генотипів у важливих сільськогосподарських культур шляхом селекції на рівні соматичних клітин, злиття протопластів або переносу генів при використанні техніки рекомбінантних молекул ДНК.
Шкідлива дія засолення має комплексний характер і обумовлено як порушенням осмотичного балансу клітини, так і прямим токсичним впливом іонів натрію, хлору на фізіологічні та біохімічні процеси в клітині. Результатом такої дії може бути зменшення тургору клітини, інгібування функції мембран і активності ферментів, придушення фотосинтезу, нестачі окремих іонів через порушення селективного транспорту іонів, використання значної кількості енергії для підтримки толерантності. Основні типи реакцій рослин, що виникають у відповідь на підвищення концентрації солей у зовнішньому середовищі.
Експериментальні дані, отримані багатьма вченими, показують, що клітинні механізми витривалості до засолення є схожими для культивованих in vitro клітин і цілих рослин і що селекція на клітинному рівні представляє реальну перспективу отримання стійких до засолення форм рослин.
Більшість селекційних програм спрямовані на виділення in vitro клітинних ліній, толерантних до присутності в середовищі для культивування клітин хлориду натрію. Так, показано, що вирощуючи гаплоїдні калюсна клітини тютюну на середовищі з постійно збільшується концентрацією солей, отримані клітинні лінії, здатні до зростання в присутності 1% NaCl. M. Наборі з співав. попередньо обробивши суспензійну культуру тютюну мутагеном (0,15% ЕМС, 60 хв), шляхом одноступінчастої селекції виділили клітинні лінії, стійкі до 0,5% NaCl. Відзначено, що витривалість, отриманих регенерантів до засолення, проявлялася на рівні цілих рослин.
На кафедрі сільськогосподарської біотехнології Московської сільськогосподарської академії ім. К.А. Тімірязєва проводилися дослідження щодо отримання солестійких рослин на прикладі ярих твердих і м'яких пшениць. Первинним експлантів служили як ізольовані незрілі зародки, так і гаплоїдів. Клітинну селекцію проводили на калюсна тканини, культивованих на живильному середовищі, що містить 0,3% NaCI або Na2SO 4 протягом 5-6 пасажів. У результаті досліджень були отримані стійкі клітинні лінії, а також рослини-регенеранти. Тестування на солестійкість першого насіннєвого покоління рослині-регенерантів методом реєстрації сповільненою флоуроесценціі показало, що фотосинтетичний апарат деяких рослині-регенерантів по стійкості до засолення перевершує вихідний сорт (Нікіфорова І.Д., 1993, 1994).
Солевитривала рослин вдається також підвищити в результаті селекції до одного фактору засолення осмотичного стресу. Наприклад, клітини томата, адаптовані до водного стресу, індукованому поліетиленгліколем, мали підвищену стійкість до NaС1. Підвищена толерантність до солі виявлена у клітинних ліній моркви, відібраних на середовищі, що містить як осмотіка манітол у високій концентрації (99-870 мМ). З цих результатів випливає, що адаптація клітин до осмотичного стресу застосовна для відбору Солевитривала варіантів, а дослідження подібного роду представляють інтерес для вивчення як у взаємодії, так і незалежно один від одного.
Метали. Присутність в грунті у великій кількості іонів металів, токсично впливають на рослини, або недолік іонів, що використовуються рослинами як поживних речовин, можуть бути причиною іонного (мінерального) стресу у рослин. Особливу увагу вчених привертає вивчення стресів, обумовлених наявністю в грунті іонів важких металів, багато з яких токсично впливають як на рослинні, так і на тваринні організми. Стресовий стан у рослин може бути індуковано іонами таких важких металів, як цинк, кадмій, мідь, ртуть, вони також досить часто зустрічаються і в грунтах, механізми стійкості до токсичних іонів можуть виключати зменшення проникності плазмалеми, детоксикацію іонів в результаті зв'язування з органічними речовинами, компартментализацию у вакуолях, а також зміни структури ферментів, які є їх мішенями.
Роботи з клітинної селекції рослин на стійкість до іонних стресів розпочаті нещодавно, але вже мають позитивний результат. У всіх експериментах використовується метод прямої селекції, при якому в якості селективного агента застосовували токсичні концентрації солей. Проте створення стресових селективних умов in vitro, ідентичних таким в природі, вкрай важко. У природних умовах крім токсичної дії іонів накладаються інші чинники, зокрема наявність різних речовин, кислотність грунту і т. д. Для селекції на клітинному рівні використовують живильні середовища, які хоча не повністю відповідали природним стресових умов, все ж таки забезпечували експресію ознаки стійкості і давали можливість відбирати потрібні варіанти.
Шляхом прямої селекції in vitro відібрані клітинні лінії петунії, стійкі до ртуті, сорго-до алюмінію, моркви - до алюмінію і марганцю одночасно; суспензійні клітинні культури дурману - до кадмію. На кафедрі сільськогосподарської біотехнології МСХА також проводилися роботи з одержання клітинних ліній та рослин-регенерантів льону-довгунця, стійких до солі нітрату кадмію і вивчалася дія цієї солі на інтактні рослини. Експериментально показано, що присутність іонів кадмію в грунті призводить до гальмування росту стеблової і кореневої частин рослини, до скорочення на 7-9 днів онтогенетичних фаз розвитку, наступних за фазою «ялинки» у порівнянні з контролем, культурні види накопичують іони кадмію у вегетативній масі, в той час як дикі - ні. Мезо-та ультраструктурний аналіз стебел льону-довгунця показав, що присутність кадмію в субстраті призводило до зменшення кількості клітин елементарних волоконець в пучку, до некомпактного розташуванню клітин елементарних волоконець в луб'яних пучках, а також до формування клітин елементарних волоконець неоднакових розмірів у межах одного пучка і до різних термінів формування вторинної клітинної стінки. У результаті клітинної селекції були отримані рослини-регенеранти, що володіють стійкістю до солі кадмію (Гончарук Е.А., 2000).
Екстремальні температури. Причиною стресового чинника у рослин можуть бути відносно високі або низькі температури. Робіт з клітинної селекції на стійкість до цих стресів небагато. У вивченій нами літературі відомостей про клітинної селекції до теплового шоку не виявлено, хоча білки теплового шоку є предметом пильного вивчення біологів різного профілю. Що стосується робіт з клітинної селекції до низькотемпературних факторів, то вони мають місце.
Холодовий стрес у рослин може бути викликаний температурами великого діапазону: від 10-15 ° до 0 ° С. Такому стресу найбільш схильні рослини тропічних і субтропічних зон. Стійкість рослин до охолодження обумовлена здатністю ліпідів мембран залишатися в рідкому стані завдяки наявності великої пропорції ненасичених жирних кислот і / або підвищеного вмісту стеролів. Пошкодження, викликані промороження рослин (температура нижче 0 ° С) пов'язані насамперед із формуванням позаклітинного льоду. При цьому відтік води в позаклітинний простір призводить до вторинного ефекту, викликаного водним стресом. Порушення, викликані негативними температурами, можуть бути запобігти акумуляцією антифризного речовин, зменшенням кількості незв'язаної води при зневодненні і збільшенням здатності переохолоджуватися. Більшість авторів зазначають, що у рослин відбуваються глибокі перетворення запасних поживних речовин, зокрема, у морозостійких деревних рослин накопичення великої кількості жирів, а у менш стійких - Сахаров.
Перші експерименти, в яких описана можливість використання культивованих рослинних клітин для відбору витривалих до низьких температур клітинних ліній, опубліковані в 1976 р. (Dix, Street, 1976). Роботи проводилися на суспензійних культурах тютюну і перцю, які після висіву на агаризованому середовища піддавалися протягом 21 дня відповідно температур - 3 ° і 4 ° С. Серед відібраних клонів виявлені лінії, стабільно зберігають підвищену холодостійкість.
Грунтуючись на наявних у цій області досліджень даних, однозначну відповідь про можливість застосування прямої селекції in vitro рослин, витривалих до низької температури, давати поки рано. Безсумнівно, однак, що індукція in vitro генетичного різноманіття знайде застосування для відбору більш витривалих варіантів.
Список літератури
1. Біотехнологія - агропромисловому комплексу / / В. І. Артамонов. - М.: Наука, 1989. - 160 с.
2. Сільськогосподарська біотехнологія: Учеб / В.С.Шевелуха, Калашнікова О.О. та ін; Під ред. В. С. Шевелуха - 2-е вид. перераб. і доп. - М.: Вищ. шк., 2003. -496.