Будова і принцип дії переносників

1. Переносники: різноманітність функцій

2. Переносники як ферменти: застосування теорії швидкостей

3. Застосування теорії перехідного стану при вивченні роботи переносників

4. Аналіз стаціонарного стану

5. Деякі сімпортери, антіпортери і уніпортери

5.1 Білок смуги 3 - аніонний переносник з мембрани еритроцитів

5.2 Група мітохондріальних переносників.

5.3 Переносник глюкози з мембрани еритроцита

5.4 Лактозопермеаза з е. Соli

6. Кілька прикладів активних переносників, що використовують енергію атр і фосфоенолпіруват

6.1 Переносники катіонів плазматичної мембрани (е1e2-типу): атр-залежні іонні насоси

6.2 АТР-ази F1F0-типу з мітохондрій, хлоропластів і бактерії

6.3 Три інших класу переносників

Висновок

Введення

ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ.

Фосфоліпідний біослой є дуже ефективним бар'єром для безлічі невеликих розчинних молекул. Тим не менш через плазматичну мембрану, а також через мембрани, що обмежують різні органели (наприклад, мітохондрії), постійно транспортуються полярні речовини та іони. Цей транспорт цілком опосередкований білками, і для пояснення механізму перенесення розчинних речовин через мембрану було запропоновано багато моделей. Буде корисно ввести кілька термінів, які використовуються для характеристики білків або структур, що беруть участь у трансмембранному транспорті. У табл.1 дається класифікація транспортних білків. Перш за все їх підрозділяють на канали (або пори) і переносники. Пори та канали часто зображують у вигляді тунелів через мембрану, в яких місця зв'язування транспортуються розчинних речовин доступні з обох сторін мембрани одночасно. Канальні білки не зазнають жодних конформаційних змін у процесі перенесення розчинних речовин з одного боку мембрани на іншу. Навпаки, конформація переносників в процесі транспорту різних речовин змінюється. Переносний речовина зв'язується з одного боку мембрани, і для вивільнення його з іншого боку в переносника має відбутися певне конформационное зміна. При цьому в будь-який момент часу місце зв'язування речовини є тільки з одного боку мембрани.

Таблиця 1. Класифікація деяких транспортних білків, заснована на механізмі їх дії та енергетиці.

Переносники можна розділити на дві групи: пасивні та активні. Ми будемо використовувати термін пасивний переносник в тому випадку, коли за його участю здійснюється перенесення через мембрану єдиного типу речовин. Переносники-уніпортери тільки збільшують потік речовини, що йде без споживання енергії, тобто по градієнту електрохімічного потенціалу. Такий процес називається полегшеної дифузією. Найбільш повно вивченим пасивним переносником є ​​переносник глюкози в еритроцитах.

Активні переносники здійснюють перенос речовин через мембрану з витратами енергії, в результаті ці речовини накопичуються з одного боку мембрани. При цьому транспорт речовини повинен бути пов'язаний з іншим, запасающих вільну енергію процесом. Майже всі первинні активні переносники є іонними насосами, в яких переміщення іона прямо пов'язане з поставляє енергію хімічного або фотохімічної реакцією. Прикладом іонного насосу є бактеріородопсин, який для перенесення протонів через мембрану використовує енергію фотонів видимого світла. У більшості випадків іонні насоси є електрогеннимі: при роботі первинного насоса здійснюється переміщення заряду, у результаті чого відбувається поділ електричних зарядів і на мембрані створюється напруга.

Первинні активні переносники генерують напруга і створюють трансмембранні іонні градієнти. Вторинні активні переносники використовують такі градієнти в якості рушійної сили для транспорту розчинних речовин. Найбільш повно охарактеризованих прикладом такого роду є білок - переносник лактози (лактозопермеаза) з Escherichia colt. Цей переносник використовує протонний електрохімічний градієнт, генерований дихальної електронтранспортной ланцюгом, в якості рушійної сили для накопичення лактози в клітині. Це приклад сімпорта, коли через мембрану одночасно переносяться два різних речовини (наприклад, протони і лактоза). Антіпортери здійснюють транспорт речовин в протилежних напрямках. Так, наприклад, білок смуги 3 еритроцитів здійснює пов'язаний транспорт Cl - і НСО3 - в протилежних напрямках через еритроцитарну мембрану.

Терміни пермеаз, транслоказа і переносник, що є синонімами, їх часто використовують по відношенню до транспортних білків, відмінним від первинних активних переносників. Зазвичай термін "пермеаз" застосовують при описі бактеріальних транспортних білків. Термін "переносник", мабуть, краще використовувати по відношенню до іонофорам або схожим з ними структурам, які зв'язуються з іонами і переносять їх через біослой у складі комплексу.

Деякі групи переносників:

1. Мітохондріальні переносники:

переносник ADP / ATP; - переносник Н + - фосфатаза;

роз'єднувальний білок (переносник Н + / ОН -)

2. Переносники цукрів:

переносник глюкози (клітини ссавців);

переносник Н +-арабінози (Є. coli);

переносник Н + - ксилози (Є. coli);

3. АТРази E1E2-типу, пов'язані з трансмембранним переносом іонів:

Н + / К +-АТРази (слизова шлунка ссавців);

Na + / К + - АТРази (плазматична мембрана);

Са2 +-АТРази (саркоплазматический ретикулум);

Н + - АТРази (плазматична мембрана);

К +-АТРази (S. faecalis).

1. Переносники: різноманітність функцій

Функції переносників вельми різноманітні; проілюструємо їх на кількох прикладах.

Таблиця 2. Порівняння швидкостей транспорту для деяких систем.

У табл.2 наведено значення числа обертів для декількох переносників. Для лактозопермеази Є. coli максимальне число оборотів складає всього лише 30 с-1. Її роль полягає в транспорті лактози - вуглеводу, який потім бере участь у клітинному метаболізмі.

Для іонних насосів, що використовують для роботи енергію гідролізу АТР або переносу електронів, характерні максимальні числа оборотів, що досить типово для ферментів.

Однак не всі переносники працюють так повільно. Аніонний переносник білок смуги 3 з еритроцитарної мембрани відіграє важливу фізіологічну роль у посиленні швидкого трансмембранного обміну С1 - на НСО3-. Одна з функцій еритроцитів полягає в посиленні транспорту СО2 від різних тканин до легень. У венозних капілярах СО2 швидко дифундує через еритроцитарну мембрану. У клітці під дією карбоангідрази СО2 перетворюється на Н2СО3, потім швидко встановлюється рівновага Н2СО3 ↔ Н + + НСО3 -, і аніон бікарбонату переноситься через мембрану в плазму крові білком смуги 3. У результаті в міру того, як еритроцит проходить по капілярах, концентрація НСО3 - в плазмі збільшується, причому цей процес займає менше 1 с. Коли кров досягає легенів, починається дифузія СО2 в атмосферу. При цьому під дією карбоангідрази в еритроцитах відбувається масове перетворення Н2СО3 в СО2 і Н2О. Цей процес у свою чергу є рушійною силою для перенесення аніону бікарбонату всередину еритроцита, де він швидко перетворюється в СО2 і Н2О.

Транспортна система повинна функціонувати дуже швидко, але на відміну від іонних каналів в аксонах тут немає потреби в електрогенних реакціях, які тільки забарилися б швидкий масовий транспорт. Але транспорт катіона, наприклад Na +, разом з НСО3 - був би небажаний, оскільки зміна концентрації солі в еритроциті призвело б до осмотичного дисбалансу. Ця проблема вирішується за допомогою антіпортера, який в обмін на кожен транспортується іон НСО3 - переносить у зворотному напрямку аніон Сl-. Така човникова система працює дуже швидко.

2. Переносники як ферменти: застосування теорії швидкостей

Кінетичну теорію перехідного стану Ейрінг, використовувану ензимології, успішно застосовують і в разі різних транспортних систем. В основі цього підходу лежить припущення про те, що система може перебувати в декількох дискретних станах, кожному з яких відповідає стандартне значення електрохімічного потенціалу. При цьому взаємні переходи між двома станами пов'язані з переходом системи через проміжні стадії з більш високою свобод ної енергією, і константи швидкостей переходів залежать від висоти відповідних енергетичних бар'єрів. Мінімуми на кривих зміни вільної енергії (рис.1) відповідають місць зв'язування речовин, що транспортуються. Можна припустити, що переносник має одне або кілька місць зв'язування переносимих речовин. При досить високих концентраціях стерпного речовини всі ці місця опиняються зайнятими і швидкість переносу досягає свого максимального значення К mах, рівного максимальної швидкості роботи ферменту. Експериментальні підтвердження цьому отримані всім переносників.

Рис.1

3. Застосування теорії перехідного стану при вивченні роботи переносників

Розглянемо простий переносник з одним місцем зв'язування, що транспортує молекули через мембрану. Рис.2 ілюструє основні властивості як первинного активного переносника, так і пермеаз.

Рис.2

Розглянемо чотири стану білка-переносника:

1) білок звернений усередину / пов'язаний з субстратом;

2) звернений усередину / не пов'язана;

3) звернений назовні / пов'язаний з субстратом;

4) звернений назовні / не пов'язаний.

Тоді транспорт можна представити у вигляді такої послідовності елементарних оборотних стадій. Субстрат зв'язується з ділянкою, зверненим до однієї сторони мембрани (яка визначається як цис-сторона). Відбувається конформационное зміна, істотно зменшує кінетичний бар'єр для переміщення іона до виходу з каналу і збільшує енергетичний бар'єр для руху в зворотному напрямку. Це конформационное зміна може бути спонтанним або може відбуватися зі споживанням енергії (наприклад, енергії гідролізу АТР). Ділянка переносника із зв'язаним субстратом виявляється тепер зверненим до протилежної сторони мембрани (яка визначається як транс-сторона). Субстрат вивільняється з комплексу з переносником і виходить на протилежній стороні мембрани. Для активних переносників спорідненість субстрату до білка нижче, коли місце зв'язування звернено до транс-стороні мембрани. Відбувається конформационное зміна, повертає білок-переносник до вихідної конформації, в якій місце зв'язування знову звернена до цис-стороні.

Ключовим моментом у роботі всіх переносників є наявність високого енергетичного бар'єру, для подолання якого відповідні білки повинні зазнати конформаційні зміни. Якщо для цього необхідна енергія, то система може працювати як активний переносник (приклад - Са2 + - насос, що транспортує іони Са2 + за рахунок енергії гідролізу АТР). Якщо для конформаційного переходу необхідно, щоб молекула стерпного речовини була пов'язана з білком, тобто стадія 4 відсутня, то білок буде каталізувати лише обмін речовини через біослой, оскільки він не може изомеризоваться в "незавантаженою" формі (приклад - білок смуги 3 еритроцитів). Кінетична теорія перехідного стану має певні обмеження, але її застосування спрощує розв'язання багатьох складних завдань і дозволяє єдиним чином підходити до розгляду різних транспортних механізмів.

4. Аналіз стаціонарного стану

Для кінетичної характеристики транспортних систем, які каталізують полегшену дифузію або активний транспорт, можуть використовуватися різні підходи до аналізу стаціонарного стану. Всі ці підходи засновані на вимірюванні швидкості перенесення розчинних речовин через мембрану, але за різних умов. Як приклад ми розглянемо експерименти, які проводилися на пермеаз і мембранних везикулах. Зазвичай для такого роду вимірів використовують радіоактивні мітки. Ключовим моментом є те, що пермеаз повинна не тільки переносити речовину через бішар (цис → транс), то також і повертатися назад (транс → цис). Швидкість транспорту може залежати від будь-якої з цих стадій. Опишемо коротко деякі підходи до аналізу.

1. Субстрат присутній тільки з одного боку мембрани (цис). Початкова швидкість транспорту вимірюється для односпрямованого потоку. Зверніть увагу, що для забезпечення постійного потоку речовини, що транспортується переносник (пермеаз) повинен повернутися вільним. ] цис для процесса, протекающего в любом направлении (например, для переноса вещества внутрь везикул или для выведения его из везикул). Вимірюють потік як функцію [S] цис для процесу, що протікає в будь-якому напрямку (наприклад, для перенесення речовини всередину везикул або для виведення його з везикул).

Рівноважний обмін. Субстрат присутній в однаковій концентрації з обох сторін мембрани, але радіоактивна мітка - тільки з одного боку (цис). У цьому випадку пермеаз може повертатися, будучи пов'язаною з немічених речовиною. ]. З міряють потік як функцію [S].

Мічений субстрат перебуває з цис-боку мембрани, а в насичує концентрації він присутній на протилежній (транс) стороні. ] ц uc . Вимірюють потік як функцію [S] ц uc. Як і в першому випадку, при цьому реєструють односпрямований потік (цис → транс). Такий потік називають також зустрічним, оскільки мічених речовин переноситься проти свого хімічного градієнта.

Питома радіоактивність субстрату з обох сторін мембрани однакова. [ S ] цис изменяется. У насичує концентрації субстрат знаходиться на транс-стороні, a [S] цис змінюється. У цьому випадку вимірюють сумарний перенесення, оскільки радіоактивну речовину перетинає мембрану в обох напрямках. За таких умов вимірювання стан системи близько до рівноважного.

и Км которые при этом не обязательно совпадают для разных подходов. У всіх випадках визначають V max і Км які при цьому не обов'язково збігаються для різних підходів. Для різних моделей можна отримати кінетичні рівняння для стаціонарного стану та перевірити їх. Як і в класичних працях з ензимології, дуже корисним може виявитися використання інгібіторів. При цьому інгібітори можна вводити з будь-якої сторони мембрани, що дозволяє отримати додаткову інформацію.

Такого роду підходи можна застосовувати при роботі з клітинами, субклітинні мембрани везикулами або штучними реконструйованими системами. Для дослідження роботи іонних каналів зазвичай застосовують електричні методи, які дають величезні переваги. Їх ми розглянемо в наступному розділі.

5. Деякі сімпортери, антіпортери і уніпортери

До теперішнього часу досить добре охарактеризовано кілька систем, що каталізують транспорт одного або більше розчинних речовин. При цьому швидкість переносу за допомогою цих білкових комплексів набагато нижче, ніж навіть через найбільш "повільні" канали. У даному розділі ми розглянемо переносник глюкози і аніонний переносник (білок смуги 3) з мембрани еритроцита, лактозопермеазу з Е coli і групу мітохондріальних переносників. Транспортні функції цих білків дуже різноманітні: вони каталізують полегшену дифузію одного якоїсь речовини, сімпорт Н + і цукру, в результаті чого відбувається накопичення цукру в клітці, і антіпорт розчиненої речовини.

Відзначимо деякі загальні властивості цих процесів:

1. У деяких випадках ці транспортні білки є олігомерами, зазвичай димерами. Проте, мабуть, тільки у мітохондріальних переносників (наприклад, у системи обміну ATP / ADP) канал утворюється із структурних елементів різних мо номерів. У всіх інших випадках, цілком ймовірно, кожна субодиниця функціонує незалежно, навіть якщо вона є частиною олігомеру.

2. Дуже висока ступінь гомології транспортних білків вказує на їх близьке структурний спорідненість, хоча вони істотно розрізняються як за субстратної специфічності, так і по функціях. Це дозволяє припустити, що для широкої групи функціонально різних переносників характерні загальні транспортні механізми.

3. Для аналізу роботи у більшості випадків транспортних білків можна з успіхом використовувати моделі з чергуванням кон-формаційних станів, аналогічні моделі, схематично представленої на рис.2. При цьому лімітуючою стадією є конформационное зміна з тією стороною мембрани, де знаходиться місце зв'язування.

4. У більшості випадків спорідненість переносника до транспортованого речовини не залежить від того, до якої сторони мембрани звернено місце зв'язування. Однак для первинних активних транспортних систем спостерігається інша картина.

5. Всі розглянуті тут переносники зазвичай чутливі до реагентів, дія яких спрямована на сульфгідрильні групи. Однак це не обов'язково має означати, що між переносниками є значна структурна подібність або вони використовують однаковий механізм транспорту. Наприклад, встановлено, що жоден з восьми залишків цистеїну лактозопермеази не бере участь безпосередньо в транспорті. Висловлювалося також припущення, що занурені в мембрану залишки проліну розподілені в транспортних білках непропорційно, однак значення цього факту залишається неясним.

5.1 Білок смуги 3 - аніонний переносник з мембрани еритроцитів

На частку білка смуги 3 припадає близько 25% загальної кількості мембранних білків еритроцита людини; подібні білки присутні також у неерітроідних клітинах. Цей білок виконує кілька функцій, причому їх можна співвіднести з двома основними доменами білкової молекули. N-кінцева частина (41000 Да) є гідрофільної і локалізована з цитоплазматичною боку еритроцитарної мембрани. Вона містить місця зв'язування для компонентів цитоскелету (анкирина), а також для ферментів гліколізу і гемоглобіну. Цей домен можна видалити шляхом протеолізу, не торкнувшись С-кінцевого домену (52000 Да), який залишається зв'язаним з мембраною та опосередковує Сl - / НСО3 - обмін, а також утворює канал в мембрані, через який може проникати вода. Внецітоплазматіческій компонент цієї частини білка містить також вуглеводні антигенні детермінанти кількох систем груп крові. У мембрані білок смуги 3 знаходиться у формі димеру або тетрамера.

Було проведено клонування і секвенування ділянки ДНК, що кодує білок смуги 3 з еритроцитів миші. Ці дані послужили основою для побудови моделі білка смуги 3. Було висловлено припущення, що він має 12 трансмембранних α-спіралей, при цьому деякі з них є амфіфільних. Експериментальні дані, що підтверджують цю гіпотезу, отримані тільки для декількох ділянок поліпептиду і грунтуються головним чином на результатах протеолізу та локалізації пов'язаних вуглеводів.

Великі кінетичні дослідження узгоджуються з моделлю з чергуванням конформацій і одним місцем зв'язування (див. рис.2). Однак швидкість рівноважного аніонного обміну за допомогою переносника щонайменше в 104 разів перевищує швидкість транспорту як такого. Отже, незавантажений переносник не зазнає швидких конформаційних перетворень, необхідних для того, щоб аніон міг зв'язатися з мембраною. За даними ЯМР з використанням 35С1, у переносника є єдине місце зв'язування, і воно може бути звернено як всередину, так і назовні. Результати дослідів з використанням інгібіторів транспорту теж свідчать про те, що в каналі є єдине місце зв'язування аніону, локалізоване десь в середині каналу. При цьому передбачається, що перехід цього місця зв'язування з одного боку мембрани на іншу блокується якимось "ковзним бар'єром", який переміщається уздовж каналу в результаті конформаційних змін. Лімітуючою стадією є конформаційний перехід навантаженого переносника, але відбувається він досить швидко, з частотою 105 з-1 при 37 ° С. Мабуть, така висока швидкість запобігає значні конформаційні зміни в білку. Природа цього конформаційного переходу і точна структура каналу експериментально не визначені.

Конформаційний перехід завантаженого переносника, лімітуючий весь транспортний процес, лише в дуже малому ступені залежить від мембранного потенціалу. Це узгоджується з таким конформаційним переходом, в результаті якого через мембрану переміщається 0,1 пов'язаного з білком заряду. Якщо цей перехід пов'язаний з переміщенням аніонного субстрату, то він повинен супроводжуватися перенесенням протівоіона, наприклад зарядженої амінокислотної групи. На відміну від цього потенціалзалежне конформационное зміна, індукуюча відкривання натрієвого каналу, призводить до результуючою переміщення через мембрану шести пов'язаних з білком зарядів.

5.2 Група мітохондріальних переносників.

Гомологічною деяких транспортних білків внутрішньої мітохондріальної мембрани свідчить про їх близьку спорідненість: цілком ймовірно, вони походять від спільного предка в результаті дивергентной еволюції. Є щонайменше три представники цієї групи:

1) ADP / ATP-транслоказа;

2) переносник фосфату;

3) роз'єднувальний білок.

У структурі цих білків є багато спільного, і тим не менш вони істотно розрізняються за субстратної специфічності. ADP / ATP-транслоказа каталізує транспорт ADP і АТР через бішар. При фізіологічних умовах АТР транспортується з мітохондрій, a ADP переноситься в матрикс. Механізм цього процесу, мабуть, аналогічний такому для білка смуги 3, за винятком того, що АТР несе на один негативний заряд більше, ніж ADP, і тому обмін залежить від трансмембранного електричного потенціалу на мітохондріальній мембрані. Переносник фосфату здійснює одночасно і сімпорт Н +, і, мабуть, механізм його роботи схожий з описаним раніше механізмом для Н + - лактозопермеази з Є. coli. Цей білок каталізує транспорт фосфату всередину мітохондрій. Завдяки сімпорту Н + процес в цілому є електронейтральний і не залежить від трансмембранного потенціалу. Роз'єднувальний білок був виявлений в мітохондріях з клітин бурого жиру ссавців; його функція полягає в дисипації протонного електрохімічного градієнта, створюваного при функціонуванні дихальної ланцюга, у результаті чого генерується тепло. Роз'єднувальний білок може також каталізувати транспорт аніонів, наприклад С1 -, так що, може бути, насправді він каталізує транспорт ОН-, який неможливо експериментально відрізнити від транспорту Н +. Цей переносник зв'язується з нуклеотидами, які інгібують транспорт, і його робота може регулюватися жирними кислотами.

Всі три переносника, а можливо, ще й α-кетоглутарат / малат-транслоказа, мають подібну будову; цей висновок був зроблений на основі даних про їх амінокислотної послідовності. Всі вони мають мовляв. масу близько 33000 Та й складаються з трьох гомологічних доменів, кожен з яких містить 100 амінокислот. По всій імовірності, ці три домени утворилися в результаті потроєння єдиного гена. Була побудована модель, згідно з якою кожен з гомологічних доменів двічі перетинає мембрану, а вся субодиниця містить шість трансмембранних α-спіралей. З цією моделлю узгоджуються дані по хімічній модифікації. Відзначимо, що така структура має багато спільного з Na + - каналом, що складається з чотирьох споріднених гомологічних доменів. ADP / ATP-транслоказа є димером і, мабуть, містить єдиний канал, по якому здійснюється транспорт. Такий висновок грунтується на результатах досліджень щодо зв'язування інгібіторів з високою спорідненістю (наприклад, карбоксіатрактілозіда).

5.3 Переносник глюкози з мембрани еритроцита

Цей переносник охарактеризований найбільш повно з усіх білків, що каталізують дифузію єдиного речовини через мембрану. Він переносить через еритроцитарну мембрану D-глюкозу, яка потім використовується при гліколізі. Такі ж або аналогічні переносники глюкози присутні і в інших типах клітин тварин. Великий прогрес у цій галузі досліджень був досягнутий завдяки секвенированию ДНК, що кодує переносник глюкози з клітин гепатоми людини і з клітин мозку щура. Очищений переносник з еритроцитів являє собою глікопротеїн з здавалося мовляв. масою 55 000. Мабуть, в мембрані він перебуває у вигляді димеру. Якщо судити за даними про амінокислотної послідовності, то переносник повинен містити 12 трансмембранних α-спіральних ділянок, однак експериментальні дані не дають остаточної відповіді на це питання. Очищений переносник вдалося вбудувати в фосфоліпідних везикули, при цьому виявилося, що він орієнтований асиметрично.

Як і при дослідженні канальних білків, дуже важливу роль зіграли досліди з використанням специфічних інгібіторів, що володіють високою спорідненістю до переносники. У число цих інгібіторів входять цітохалазін В і флоретін, які зв'язуються з переносником зі стехіометрією 1:

1. Одні інгібітори (цітохалазін В) зв'язуються з переносником тільки в тому випадку, якщо вони перебувають з цитоплазматичної сторони мембрани, інші специфічно зв'язуються з зовнішнього боку мембрани (флоретін). Місця скріплення двох зазначених інгібіторів знаходяться поблизу С-кінця поліпептиду.

Більшість кінетичних даних і даних щодо зв'язування узгоджуються з простою моделлю чотирьох станів (рис.2), в якій передбачається, що існує єдине місце зв'язування D-глюкози, яка була всередині каналу. Для вимірювання індивідуальних констант швидкостей використовували ЯМР і метод зупиненої струменя. Конформація завантаженого каналу змінюється з константою швидкості 2000 с-1, яка приблизно в сім разів вище аналогічною константи для незавантаженого каналу (300с-1 при 23 ° С). Отже, обмін глюкози відбувається з більшою швидкістю, ніж транспорт як такої, для здійснення якого незавантажений переносник повинен повернутися через мембрану. Природа конформаційного зміни невідома, хоча воно було зареєстровано за допомогою інфрачервоної спектроскопії з перетворенням Фур'є і, як припускають, включає ковзання α-спіралей один щодо одного.

Між переносником глюкози з клітин ссавців і деякими транспортними системами бактерій спостерігається значна гомологія. Дивно, що така гомологія спостерігається також між переносником глюкози і білками, що здійснюють сімпорт Н + - арабінози і Н + - ксилози. Ці сімпортери, як і описувана нижче система транспорту Н + - лактози, використовують для акумуляції зазначених Сахаров електрохімічний протонний градієнт. Переносник глюкози з мембрани еритроцитів не транспортує Н + і не здатний до транспорту проти градієнта глюкози. Дуже важливими представляються роботи з вивчення взаємозв'язку структури білкового комплексу та механізму його роботи.

5.4 Лактозопермеаза з е. Соli

Цей комплекс вивчений найбільш повно з усіх сімпортних білків. Він кодується lacY-геном, який є частиною lac-оперону, і його часто називають lac-пермеаз. Ген lacY був клонований і секвенований, і з штаму-сверхпродуцентов був виділений білок - продукт цього гена. Пермеаз можна вивчати в цитоплазматичних мембранних везикулах (кабакосомах), в інтактних клітинах або в реконструйованих протеоліпосомах. Судячи за даними про амінокислотної послідовності, білок має мовляв. масу 46 500, хоча результати електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН дають іншу величину. Майже не викликає сумніву, що функціональною одиницею в мембрані є мономер, хоча деякі дані свідчать про існування димерной форми пермеаз in vivo.

На підставі даних про амінокислотної послідовності лактозопермеази були побудовані моделі, згідно з якими цей білок має 12 або 14 трансмембранних α-спіралей. Це в основному узгоджується з спектроскопічними даними, що свідчать про високий вміст α-спіралей, і нечисленними топологічними даними.

Кінетику транспорту за допомогою пермеаз вивчали, використовуючи підходи:

1) виведення лактози за градієнтом або транспорт у везикули (нуль з транс-сторони);

2) активний транспорт лактози проти градієнта концентрації, пов'язаний з протонним електрохімічним градієнтом;

3) рівноважний обмін;

4) противоток (нескінченність з цис-боку).

1. Пермеаз має одну або більше місць зв'язування для протона і одне - для лактози. Ці місця бувають по черзі звернені до періплазматіческой і цитоплазматичної сторонам мембани, і відповідний конформаційний перехід є лімітуючим щей стадією процесу. Максимальна швидкість транспорту дорівнює 25-50 с-1. При наявності трансмембранного протонного електрохімічного потенціалу (ДДН +) Км для лактози становить - 80 мкМ; місце зв'язування протона, можливо, характеризується високим РКЛ, тому більшу частину часу протонувати.

При ДДН + = 0 значення Км для лактози набагато вище - 15-20 мМ.

2. Транспорт лактози обов'язково супроводжується транспортом Н + зі стехіометрією 1:

3. Кінцевим результатом транспорту є перенесення через бішар позитивного заряду. Отже, важливу роль у встановленні рівноваги і швидкості транспорту грають трансмембранний електричний потенціал і різниця протонного хімічного потенціалу.

6. Кілька прикладів активних переносників, що використовують енергію атр і фосфоенолпіруват

Є кілька зауважень, що стосуються первинних активних переносників. Охарактеризовано досить багато систем, за допомогою яких відбувається поєднання транспорту тих чи інших речовин через мембрану з гідролізом макроергічних фосфатних зв'язку або з іншого реакцією, в ході якої вивільняється енергія.

Як вже зазначалося, в основі кінетичних моделей багатьох первинних активних транспортних систем лежить концепція чергування конформаційних змін. При цьому зовсім необов'язково, щоб реакція, в ході якої вивільняється енергія, наприклад реакція гідролізу АТР, була прямо пов'язана з конформаційним переходом, необхідним для транспорту; важливо лише, щоб таке сполучення існувало з однією або кількома стадіями кінетичного циклу. Вимоги, що пред'являються до структури трансмембранного "каналу" первинного активного переносника, аналогічні таким для інших переносників, але тут виникає додаткова складність - необхідність контролю сполучення хімічної реакції, в ході якої вивільняється енергія, і транспорту розчинної речовини.

Про молекулярній структурі первинних активних транспортних систем відомо навіть менше, ніж про транспортні білках, що обговорювалися раніше в цій главі. Ідентифікувати групи споріднених переносників, близьких за будовою і механізму роботи, допомагають дані про їх амінокислотної послідовності, яких стає все більше. Проте достовірні дані про те, яке будова ділянок, безпосередньо залучених в транспорт речовин, відсутні. В основі різного роду структурних моделей активних переносників лежить припущення про те, що трансмембранний канал, через який транспортуються речовини, утворений кластером трансмембранних амфіфільних α-спіралей. Подібним чином і моделі, які описують сполучення хімічних реакцій і транспорту речовин, спираються на досить нечисленні експериментальні дані. Моделі пари можна розділити на дві головні групи. Відповідно до моделі прямого сполучення, хімічна реакція безпосередньо впливає на перенесення речовини, що транспортується, причому цей процес не вимагає значних опосередкованих білком конформаційних змін. Наприклад, протони, які беруть участь у гідролізі АТР, могли б бути саме тими іонами, які транспортуються через мембрану в ході даної реакції. Для цього необхідно, щоб ділянка комплексу, де протікає хімічна реакція (наприклад, гідроліз АТР), і ділянка зв'язування речовини, що транспортується були розташовані дуже близько один до одного. На відміну від цього моделі непрямого сполучення хімічна реакція впливає на транспортний процес через опосередковані білком конформаційні зміни. Допускається навіть, що хімічна реакція і активний транспорт можуть бути пов'язані з різними субодиницями всередині комплексу. Ці моделі мають ту перевагу, що з їх допомогою неважко пояснити транспорт різних речовин (наприклад, Na +, Н +) одними і тими ж або близькородинними білками за участю одних і тих самих механізмів.

Активні транспортні системи функціонують зі швидкостями, типовими для багатьох ферментів, т.е.102-103 с-1 в умовах насичення. На відміну від канальних білків селективність відносно субстрату обумовлюється головним чином спорідненістю речовини, що транспортується до активного переносники. Більше того, більшість первинних активних переносників зазвичай функціонує в умовах, коли концентрація стерпного речовини з цис-боку близька або трохи перевищує Км і лімітуючою стадією транспорту є конформаційний перехід білка або хімічна реакція, що служить джерелом енергії для даної системи.

І нарешті, роль первинних активних транспортних систем полягає у переміщенні речовини через мембрану проти його концентраційного градієнта в одному напрямку (цис → транс). Оскільки переносник після вивільнення речовини, що транспортується повинен знову змінити свою орієнтацію з транс на цис, необхідний якийсь механізм, що перешкоджає поверненню на цис-бік завантаженого переносника (тобто зворотному транспорту речовини). Отже, спорідненість активного переносника до транспортованого речовині повинне бути / вище з цис-боку (де цей субстрат при низьких концентраціях зв'язується з переносником), ніж з транс-сторони (де воно дисоціює при набагато більш високих концентраціях). Якби це було не так, переносник працював би дуже неефективно при високих концентраціях субстрату з транс-сторони. У такій реакції енергія витрачається головним чином на зміну спорідненості переносника до транспортованого речовини. Наприклад, ение Na + / К + - АТР-ази або Са2 + - АТР-ази за допомогою АТР веде до стабілізації конформації тих переносників, у яких місце зв'язування іонів звернуто назовні і які мають низьку спорідненість відповідно до Na + або Са2 +. У той же час зв'язування АТР стабілізує ту форму Na + / К + - АТР-ази, в якій місця зв'язування іонів, звернені до цитоплазми, мають низьку спорідненість до К +. Отже, механізм сполучення реакції, в ході якої вивільняється енергія, і транспорту, катализируемого активними переносниками, краще за все розглядати виходячи з термодинамічних принципів, тобто як тимчасову стабілізацію певних конформацій і зміна спорідненості до транспортованого речовини.

Можна виділити п'ять груп переносників, які використовують вільну енергію макроергічних фосфатних зв'язків для здійснення транспорту речовин, тобто природа знайшла кілька шляхів вирішення цього завдання.

6.1 Переносники катіонів плазматичної мембрани (е1e2-типу): атр-залежні іонні насоси

Кілька про - і еукаріотичних іон-переносять АТРази складають єдине сімейство і володіють схожими амінокислотними послідовностями і механізмами перенесення іонів (табл.2).

Таблиця 2.

Найбільш повно охарактеризовано Nа + / К +-АТРази з плазматичної мембрани клітин тварин і Са2 + - АТРази з саркоплазматичного ретикулума. Більшість ферментів цієї групи представляють собою єдиний поліпептид з мовляв. масою 100000; виняток становить Na + / К + - АТРази, виділена з декількох джерел, яка містить другу, меншу субодиницю з невідомою функцією. Ці переносники ингибируются ванадатів і прямо фосфорилюються АТР з утворенням фосфорильованого інтермедіату, що грає важливу роль в транспорті (див. рис.3).

Рис.3 Кінетична схема для Na + / К + - АТРази. Для Са2 + - АТРази можна використовувати той же механізм, за винятком того, що слідом за лефосфорілірованіем Е2 - Р переносник повертається в конформацію E1 в незавантаженому стані (пунктирна лінія).

Катіонні переносники цієї групи значно різняться за іонної специфічності (див. табл.2). Неоднакова і стехіометрія транспорту. Наприклад, Са2 + - АТРази переносить 2Са2 + / АТР в порожнину саркоплазматичного ретикулуму, в той час як Na + / К + - АТРази переносить 3Na + назовні і 2К + в цитоплазму через плазматичну мембрану. При цьому відмінності в роботі АТРази стосуються не тільки стехіометрії і природи переносимих іонів, але також і того, що Са2 + - АТРази здатна переносити іони лише в одному напрямку, в той час як Na + / K + - АТРази робить це в обох напрямках.

2-типа" было введено в работе, посвященной Na+/К+-АТРазе. Назва "фермент Е1 E 2-типу" було введено в роботі, присвяченій Na + / К +-АТРази. Як показали дослідження, цей білок існує щонайменше у двох розрізняються конформаціях, для яких характерні різний зв'язування субстратів і неоднакова схильність м'якому протеолізу. Форма Е1 відповідає конформації, в якій місця зв'язування іонів звернені у бік цитоплазми (висока спорідненість до Na +, низьке - до К +) і яка володіє високою спорідненістю до АТР. Місця зв'язування іонів у фосфорильованій формі Е2 звернені назовні (високу спорідненість до К +, низьке-до Na +). На рис.3 зображено транспортний цикл, у якому беруть участь дві ненавантажені форми переносника і дві навантажені, Е2 (2К +) зв'язку E1 (3Na +) зв'язок зі "захованими" всередині насосного комплексу іонами. Вивчення зв'язування К + фосфорильованій формою переносника (Е2-Р) показало, що воно відбувається в двох різних місцях.

Основні особливості каталітичного циклу.

1. E1-форма пов'язує три іона Na + з цитоплазматичної сторони мембрани і потім взаємодіє з АТР, утворюючи фосфорилювання фермент. Фосфорилюється при цьому специфічний аспартат, консервативний в цій групі ферментів.

2. Після від'єднання ADP іони виявляються "захованими" усередині комплексу.

3. Фосфорилювання білка стабілізує конформацію з низькою спорідненістю до Na +; при цьому місця зв'язування іонів звернені назовні. Це сприяє переходу E1-P в E2-P, в результаті якого і здійснюється перенесення.

4. У формі Е2-Р місця зв'язування іонів звернені в позаклітинне середовище; ця конформація володіє високою спорідненістю до К +, який пов'язується, каталізує дефосфорілірованіе і залишається "захованим" усередині комплексу. Зверніть увагу, що Na + необхідний для швидкого фосфорилювання, а К + - для швидкого дефосфорилювання. Ванадат зв'язується з формою Е2, можливо, як якийсь аналог перехідного стану фосфату. В інших ферментів E1E2-тіпa, наприклад Са2 + - АТРази, форма Е2-Р дефосфорилюється і переходить у форму E1, яка в свою чергу перетворюється на незавантажених форму.

5. Лімітуючою стадією каталітичного циклу є, по всій вірогідності, звільнення К + і перехід його з пов'язаного з ферментом стану у вільний. Цей процес стимулюється зв'язуванням АТРс сайтом, які мають низьку спорідненість.

Отже, АТР виконує дві різні функції, виступаючи в якості субстрату і аллостеріческого ефектора. Скільки місць зв'язування АТР має фермент, поки неясно.

Визначено амінокислотна послідовність кількох АТРази E1E2-типу, включаючи Na + / К + - АТРази (а-субодиниця) з декількох джерел, Са2 + - АТРази, Н + - АТРази з плазматичної мембрани дріжджів і Neurospora crassa і К + - АТРази з S. faecalis. Виходячи з профілів гідрофобності, були побудовані моделі, згідно з якими ці білкові комплекси мають 6, 8 або 10 трансмембранних α-спіральних сегментів (рис. 4).

Рис.4

Деякі ділянки поліпептидів, в тому числі і сегмент, що містить сайт фосфорилювання, в значній мірі гомологічних. Всі білки мають велику гідрофільну петлю, яка містить домени, з якими, ймовірно, зв'язуються нуклеотиди і де відбувається фосфорилювання.

У Са + - АТРази один розщеплюється трипсином сайт, чутливий до конформаційний перехід Е1 → Е2, перебуває у "трансдукціонном" домені (рис.4). Досліджувався також зв'язування Са2 + з ферментом; було висловлено припущення, що транспорту Са2 + передує зв'язування двох іонів Са2 + з певними ділянками всередині білкового комплексу. По всій імовірності, у Са2 + - АТРази місця зв'язування Са2 + з високою спорідненістю розташовуються на значній відстані від місця зв'язування нуклеотидів, проте цю гіпотезу потрібно ще перевірити. Основні особливості будови Са2 + - АТРази, представлені на рис.4, узгоджуються з даними електронної мікроскопії, згідно з якими цей білковий комплекс сильно виступає з біослоя в цитоплазму. Ймовірно, в умовах in vivo АТРази Е1 / Е2 - типу агрегує, утворюючи щонайменше димери, але підтвердити це припущення експериментально дуже важко. Тим не менш очевидно, що мономери також здатні до каталізу, принаймні в деяких випадках.

Визначено амінокислотна послідовність меншою α-субодиниці Na + / К + - АТРази. Було висловлено припущення, що ця субодиниця має одну або чотири трансмембранні а-спіралі.

На закінчення відзначимо, що завдяки легкості клонування цих мембранних АТРази та можливості використання різних експериментальних підходів ці системи є чудовим об'єктом для застосування до них спрямованого мутагенезу та інших генетичних методів. Подібні методи вже застосовуються в дослідженнях F1F0 - АТРази.

6.2 АТР-ази F1F0-типу з мітохондрій, хлоропластів і бактерії

Більшість бактерій, а також мітохондрії і хлоропласти містять родинні АТРази F1F0 - типу, які використовують трансмембранний протонний електрохімічний градієнт для синтезу АТР з ADP і неорганічного фосфату. У фізіологічних умовах ці ферменти є АТР-синтази. Вони містять від 8 (тобто coli) до 13 (мітохондрії серця бика) різних субодиниць і, таким чином, є набагато більш складними структурами, ніж АТРази E1E2-тіпa з плазматичних мембран. АТРази F1F0-типу складаються з двох частин:

1) гідрофільного глобулярного F1-комплексу, що містить місця зв'язування нуклеотидів і функціонуючого в якості АТРази, і 2) мембранозв'язаних F0 - комплексу, який функціонує як Н + - провідний канал. F1 - і F0 - комплекси можуть від'єднуватися один від одного, а після очищення їх можна реконструювати з відновленням функціональної активності.

F1-комплекс з Є. coli містить п'ять субодиниць в стехіометрії aifiiybe. Між трьома парами в складі F1 спостерігається асиметрія, що виникає, ймовірно, в результаті асиметричних взаємодій з іншими субодиницями. У складі кожного комплексу є по три каталітичних центру, і для швидкого обороту ферменту необхідно, щоб АТР був пов'язаний більш ніж з одним місцем зв'язування. Для пояснення механізму каталізу були побудовані різні моделі з чергуванням місць зв'язування, зокрема модель, згідно з якою в ході каталізу відбувається фізичне обертання частин ферменту.

2 c 10. F0-комплекс з ферменту Є. coli влаштований досить просто, він містить лише три субодиниці в стехіометрії a1 b 2 c 10. Всі ці субодиниці необхідні для формування Н + - провідного каналу. Залишається неясним, чи можна розглядати F0 як канал у тому сенсі, як ми його розуміємо в цьому розділі. Вважають, що Н + - провідна частина F0 утворена α-спіралями з множинних копій γ - суб'едіііци. - субъединицы - по одной. По всій імовірності, ця субодиниця містить п'ять трансмембранних α - спіралей, в той час як а - і b - субодиниці - по одній. Результати, отримані за допомогою генетичних методів, узгоджуються з припущенням, згідно з яким занурені в мембрану частини всіх трьох субодиниць грають важливу роль у забезпеченні протонної провідності.

Вивчення цієї системи показує нам, наскільки успішним може бути застосування генетичних методів для дослідження будови мембранних білків, для яких відсутні кристалографічні дані високої роздільної здатності. Дуже важливо з'ясувати, чи приводить заміна єдиною амінокислоти в такому білку до конформаційних змін, які позначаться на каталізі. Мабуть, результат такої заміни сильно залежить від природи переносника. Наприклад, як ми вже обговорювали, дуже обнадійливими в цьому відношенні є дані, отримані для лактозопермеази. Очевидно, в наступному десятилітті у вивченні взаємозв'язку між структурою і функцією мембранних білків головну роль будуть грати різні генетичні методи, зокрема спрямований мутагенез.

Розглянемо результати, отримані до теперішнього часу для F1F0 - ATPaзи з Є. coli.

1. Наявність численних мутантних форм дозволяє ідентифікувати ділянку, яка є, по всій вірогідності, каталітичним нуклеотідсвязивающім доменом. Дослідження мутантних форм показало також, що між α - і β - субодиниця є конформационное сполучення.

2. Показано, що мутантні форми нездатні до об'єднання в пару транспорту Н + з каталізуються комплексом F1, АТРазною активністю, а також до зв'язування комплексів F1, і F0.

3. и γ опосредуют протонную проницаемость; имеющиеся генетические данные позволяют предположить, что субъединица b непосредственно контактирует в мембране с субъединицами а и γ . Показано, що певні амінокислотні залишки в субодиниці А, b і γ опосередковує протонну проникність; наявні генетичні дані дозволяють припустити, що субодиниця b безпосередньо контактує в мембрані з субодиницями а і γ.

Чи пов'язані всі ці явища з локальними або глобальними конформаційними змінами, покажуть подальші дослідження. Поки ж ми не може сказати точно, як відбувається сполучення гідролізу АТР та транспорту Н + при роботі АТРази F1F0-типу, а також з чим пов'язана протонна провідність.

Важливими в цьому відношенні можуть виявитися дані про те, що цитоплазматична мембрана анаеробної бактерії Propionigenium modestum містить Na + - залежну АТРази F1F0-типу. Якщо цей фермент працює як первинний АТР-залежний Na + - насос, то логічно припустити, що механізм функціонування Н + - АТРази та Na + - АТРази однаковий. Наприклад, це дозволить виключити моделі прямого сполучення.

6.3 Три інших класу переносників

Крім АТР-залежних активних переносників Е1Е2 - і F1F0 - типів є ще три класи активних переносників, що використовують вільну енергію гідролізу макроергічних фосфатних зв'язків. Про реальні механізми транспорту або сполучення в цих системах відомо небагато. Відзначимо кілька цікавих їх особливостей.

1. Бактеріальні фосфотрансферази. Цей комплекс був виявлений тільки в бактеріях; він каталізує транспорт Сахаров, таких, як глюкоза і манітол. Унікальною особливістю цієї системи є те, що транспорт цукру супроводжується його фосфорилюванням. Отримувана фосфатне похідне цукру вже не може служити субстратом для переносника в бактеріальної мембрані, і таким чином запобігає зворотний потік цукру через цю систему. Згадаймо, що в переносниках Е1Е2-типу фосфорилювання переносника стабілізує форму з низькою спорідненістю до переносимості речовини (наприклад, Са2 + або Na +), що також перешкоджає зворотному переносу речовин, що транспортуються.

Кінцевим донором фосфату в фосфотрансферазной системі є фосфоенолпіруват. или Е II . Фосфат переноситься специфічної послідовністю розчинних фосфорильованих інтермедіатів в цитоплазму до мембранозв'язаних транспортного білку, званому фермент II або Е II. -типа, специфичных к разным сахарам, но обладающих сходной первичной структурой. Існує група ферментів Е II-типу, специфічних до різних цукрів, але володіють схожою первинною структурою. - типа образуют димеры. По всій імовірності, всередині мембрани ферменти Е II - типу утворюють димери. Висловлювалося припущення, що вони формують канали. Ці білки чутливі до реагентів, що діють на сульфгідрильні групи, і до окислення, що може грати важливу роль в умовах in vivo. - типа осуществляют транспорт и фосфорилирование сахаров. Трохи відомо про те, яким чином фосфорильовані ферменти Е II - типу здійснюють транспорт і фосфорилювання цукрів. Розумною представляється модифікована модель з чергуванням конформацій і єдиним місцем зв'язування.

2. Бактеріальні періплазматіческіе транспортні системи. На додаток до систем сімпорта (катіон - цукор) і фосфотрансферазной системі бактерії мають ще одну систему активного транспорту розчинних речовин, яка використовується для різних амінокислот і цукрів. Так, охарактеризовано системи, специфічні до гістидину (S. typhimurium) і мальтози (Є. coli). На жаль, біохімічні дані, які могли б доповнити інтенсивні генетичні дослідження мембранозв'язаних компонентів цих систем, вельми нечисленні. Унікальною особливістю цих систем є те, що вони містять субстратспеціфічние зв'язуючі білки, локалізовані в періплазматіческом просторі. Роль цих білків полягає у зв'язуванні стерпного речовини і подальшої передачі його власне транспортує системі цитоплазматичної мембрани. Специфічність системи визначається як зв'язуючими білками, так і мембранозв'язаних компонентами. Цитоплазматичний мембранний компонент містить три субодиниці, дві з яких є трансмембранних білків, а третя, ймовірно, міцно пов'язана з цитоплазматичною стороною мембрани. Як виявилося, цей третій компонент транспортного комплексу містить місце зв'язування нуклеотидів, де, як передбачається, відбувається гідроліз АТР - реакція, що є рушійною силою активного транспорту. Однак прямі дані, що підтверджують цю гіпотезу, відсутні. Практично нічого не відомо про механізм транспорту, за винятком того, що для нього необхідний розчинна зв'язуючий білок.

По всій імовірності, ця система аналогічна транспортній системі ссавців, яка використовується ними для виведення з клітини небажаних лікарських речовин і забезпечує множинну лікарську стійкість. Мабуть, транспорт різних лікарських речовин єдиною транспортною системою опосередковується групою НЕМЕМБРАННИХ зв'язуючих білків. Подібне припущення висловлювалося щодо кодируемой плазмидой бактеріальної транспортної системи, яка виводить з клітин арсенати. Передбачається, що ці системи також використовують гідроліз АТР в якості джерела енергії, однак це не було прямо продемонстровано.

3. Вакуолярно Н + - АТРази. В еукаріотичних клітинах є Н + - АТРази, локалізовані в мембранах різних внутрішніх органел (крім мітохондрій). Ці АТРази відрізняються від АТРази як F1F0 -, так і Е1Е2-типів. У деяких випадках функцією Н + - АТРази є транспорт протонів всередину тієї чи іншої органели для закислення її вмісту. Наприклад, відомо, що низький рН в ендоцітозних бульбашках необхідний для від'єднання лігандів від їх рецепторів, що відбувається слідом за ендоцитозу. Хоча достовірні дані про структурний спорідненість цих Н + - АТРази поки не отримані, відомо, що всі вони 1) містять більше однієї субодиниці;

2) не утворюють фосфорильованого інтермедіату;

3) нечутливі до ванадат;

4) транспортують Н +. Проте всі ці питання вимагають додаткових біохімічних і структурних досліджень.

Висновок

Таким чином, розглянувши будову, механізм роботи та різноманітні функції переносників, можна зробити висновок про те, що вони мають величезне значення в життєдіяльності людського організму.