Реферат на тему:
Аффінниє імуносорбент.
Використання радіоактивних ізотопів
1. Імунізувати кролика якимось добре очищеним білком.
2. Той же білок ковалентно закріпити на матриці, наприклад, у колонці BrCN-активованої сефарози.
3. Імунну антисироватки крові кролика пропустити через цю колонку. Всі інші антитіла легко змити, а специфічні для нашого білка антитіла на ній залишаться.
4. Їх можна потім зняти зміною рН буфера або подачею високої концентрації солі. (Антитіла чудово зберігаються)
5. Якщо ми зуміємо надійно посадити ці антитіла на іншу колонку, причому так, що вони не втратять здатності зв'язуватися зі своїм антигеном, то з її допомогою можна буде отримати з будь-якої складної суміші той білок, який нас цікавить, а потім зняти і його в зовсім очищеному вигляді "
Для конкретизації способу здійснення цього плану нам будуть потрібні додаткові відомості про структуру і властивості антитіл. По-перше, зазначимо точне місце знаходження антитіл у складі крові.
Якщо кров налити в пробірку і почекати поки вона згорнеться, а потім центрифугуванням прибрати осад, то з ним підуть і червоні кров'яні клітини (еритроцити), і білі (лейкоцити і лімфоцити), і білок фібриноген, який здійснює згортання.
Залишиться прозора рідина, іменована сироваткою крові. У ній розчинені цукру, гормони, вітаміни, солі та інші низькомолекулярні речовини, а також різноманітні і численні білки крові. Основну їх масу складають два класи білків: альбуміни і глобуліни. Їх можна розділити додаванням сульфату амонію до концентрації в 2М.
Глобуліни випадають в осад. Якщо ж всю сироватку піддати фракціонування електрофорезом при рН8, 6, то вперед швидко підуть альбуміни, а потім підуть а-, (3-й у-глобуліни.
Ось у цій останньої фракції, так званих імуноглобулінів і знаходяться антитіла. Існує кілька типів імуноглобулінів. З них багатшим за інших представлений в крові і використовується для дослідницьких цілей один - імуноглобулін типу G, що позначається IgG.
Сироватку крові тварини, який встиг виробити "імунна відповідь", тобто антитіла, специфічні для введеного ззовні антигену, і називають антисироватки.
Іноді в її повну назву вказують і стимулював цю антисироватки антиген і навіть його походження. Наприклад, "Антисироватка кролика проти еритроцитів кози".
Назва довге, зате повністю описує конкретний випадок: в кров кролика були введені еритроцити з крові кози. Вони - чужі і тому викликали імунну відповідь.
Взагалі-то кажучи, у людини відомо чотири варіанти: від IgGI до IgG4, та ще певна кількість інших імуноглобулінів: IgM, IgA, IgE, що грають дещо різні ролі.
Але ми в ці деталі вникати не будемо. Відмінності їх структур незначні і більше 60% припадає на частку IgGI. Саме його ми будемо далі мати на увазі під терміном "антитіло". Молекулярна маса IgGI становить 146 000 дальтон.
Вся його просторова конфігурація встановлена методом рентгеноструктурного аналізу. Під електронним мікроскопом антитіло виглядає подібно латинської букви "Y".
На її "стрижні" і обох "гілках" можна розрізнити окремі ділянки ("домени"), де поліпептидний ланцюг білка скручена і утворює щось на кшталт півсфери, як це зображено на мал.1.
Рис. 1
Помітна на малюнку парність доменів відображає дійсний подобу будови членів кожної пари, але всі вони водневими, гідрофільними, а головне - дисульфідними містками пов'язані в одну молекулу.
Найважливіше для нас те обставина, що всі чотири домену "стрижня" і ближні до нього пари доменів "гілок" незмінні за своїм амінокислотним складом і будовою у всіх антитіл ("константних частина").
І лише дві пари кінцевих доменів представляють собою вариабильность частина антитіла, що визначатиме її антигенну специфічність. У цих доменах є ділянки, які іменуються "гіперваріабільнимі областями" (на рис. - Заштриховані).
У них відмінності антитіл, специфічних для різних антигенів, особливо яскраво виражені. У кожній парі кінцевих доменів вони утворюють якусь подобу "ущелини".
Можна очікувати, що саме тут пов'язується антиген. Таке припущення знайшло пряме підтвердження після того, як вдалося кристалізувати кінцевий фрагмент одного з антитіл разом із зв'язаним з ним антигеном (вітаміном К).
Аналіз рентгенограми показав, що молекула вітаміну лежить в "ущелині" області впізнавання і різні її частини зближені і взаємодіють з певними амінокислотами в гіперваріабільной області.
На рис. зображена просторова конфігурація одного з вариабильность кінцевих доменів IgGl. Поліпептидна ланцюжок з 104 амінокислот згорнута так, що три її заштрихованих (гіперваріабільних) ділянки виходять на поверхню домену приблизно в одній площині, утворюючи один із схилів "ущелини" зв'язку.
Точками на цьому ж малюнку позначено місця з'єднання з парним доменом краю тієї ж гілки, що створює другий схил. Амінокислотний склад гіперваріабільних ділянок на обох схилах, очевидно, різний. Але "ущелині" на кінці другої гілки молекули антитіла є точною копією "ущелини" на першій гілки.
Безпосередню область впізнавання і зв'язування антигену в "ущелині" на кінці гілки утворюють близько 20 амінокислот. Але ще не менш 70 амінокислот кожного з кінцевих доменів беруть участь у визначенні просторової конфігурації цієї області.
Але повернемося до нашої програми створення афінно-імунної колонки. Зрозуміла можливість реалізації чотирьох її перших пунктів. З сироватки імунізованих кролика, двухмолярним розчином сульфату амонію осаджують сумарну фракцію глобулінів.
Потім її розчиняють, діалізом звільняють від солі і наносять в буфері рН6, 5 на колонку ДЕАЕ-целюлози. При такому значенні рН IgG не затримується на колонці і виходить відразу очищеним, оскільки всі інші глобуліни залишаються на колонці.
Одночасно готують колонку на основі BrCN-активованої сефарози і фіксують на ній білок, яким був імунізований кролик. Розчин сумарної фракції IgG пропускають через цю колонку і промивають її буфером. У результаті на колонці затримуються лише антитіла, специфічні для цього білка-антигену. Їх можна зняти 0,1 М розчином оцтової кислоти або 4,5 М розчином MgClg. Отриманий таким чином розчин потрібних антитіл нейтралізують, діалізу від солей і, якщо треба, концентрують упариванием води.
Тепер встає останнє запитання. Як пов'язати ці антитіла з матрицею ще однієї колонки, причому так, щоб не постраждала їх антигенна активність і специфічність? Нелегкий питання!
Але тут природа зробила дослідникам розкішний подарунок. Виявилося, що якийсь білок з оболонки бактерії Staphylococcus aureus, названий "білком А", здатний міцно зв'язуватися з незмінною частиною ("стрижнем") більшості IgG.
За словом "виявилося" ховається багато чого. Навряд чи білок з такою властивістю спеціально шукали саме у цієї бактерії. Швидше за все його виявили випадково. (Але, як говорить прислів'я, вчений той, хто бачить те ж, що бачать всі, але помічає те, що не помітив ніхто!).
Так чи інакше, але виявлення зазначеного властивості білка А відкрило шлях до здійснення останнього етапу нашої програми. На колонку активованої сефарози хімічно міцно садять білок А (навіть є в продажу готова "Protein А - Sepharose CL-4В") і через неї в певних умовах пропускають розчин специфічних антитіл. Вони закріплюються на колонці через свої "стрижні" і білок А.
Обидва кінці розгалуження залишаються вільними. Колонка готова - створений афінних імуносорбент для негайної очищення з будь-якої білкової суміші того білка, який був використаний для імунізації кролика. Зняти його з колонки після очищення не становить труднощів - кислотою або сіллю ...
Аффінниє імуносорбент знайшли широке застосування і, до речі сказати, не тільки для очищення білків. У 1978 р. Stumphet зуміли цим методом із суміші фрагментів ядерної ДНК відокремити гібридні ДНК-РНК шматки. За цим гібридам визначили гени, відповідальні за синтез рибосомних РНК. (Кролика в цьому випадку імунізували двухнитевой синтетичним гібридом поліаденіловой кислоти і полидезоксириботимидиновой кислоти) Виявилося, що такий гібрид відмінно імітує щодо спеціалізації антитіл гібрид ДНК-РНК.
Тут можна використовувати поєднання вибірковості іммуноспеціфіческого зв'язування з дуже чутливим способом використання радіоактивності. Цікавлять дослідника білком імунізують кролика і очищають з його крові антисироватки. Розроблено і є у продажу спеціальна, так звана "Діазобумага".
Вона має здатність за своїми активними диазогруппа ковалентного хімічним зв'язком приєднувати будь-які білки.
Після закінчення електрофорезу з верхньої поверхні гелю фільтрувальним папером видаляють надлишок вологи і кладуть на нього Діазобумага, зафіксувавши її положення на гелі проколами по двох кутах папери і гелю. Потім цю пару, гелем вниз, поміщають в систему "блотів", для перенесення ДНК з агарозного гелю на нітроцелюлозні фільтр.
Тобто кладуть гель на лист товстої фільтрувального паперу, постійно змочувані буфером, а на Діазобумага накладають стопку фільтрувального паперу і через пластинку скла притискають вантажем. Струмом рідини, що йде вгору по капілярах, частина білків з кожної смуги переноситься на Діазобумага і там міцно фіксується.
Невикористані диазогруппа між білковими "репліками" закривають вимочуванням в 10%-ном розчині етаноламіну, який у відносинах з диазогруппа імітує білок. Потім Діазобумага поміщають в розчин отриманої раніше антисироватки і витримують 12 годин при 37 ° С.
За цей час завершується реакція зв'язування специфічних антитіл, що є в антисироватки з фіксованим на папері антигеном. (Для всіх інших білків в антисироватки, - навіть сумарної, - немає специфічних антитіл) залишилися вільними антитіла відмивають буфером.
Нарешті, Діазобумага, на якій є репліка шуканого білка разом з пов'язаними з ним антитілами, інкубують 2 години при 37 ° С у розчині міченого радіоактивним йодом білка А (він доступний у вигляді готового препарату).
Чи не сорбованих на "стрижнях" антитіл білок А відмивають міцним сольовим розчином. Папір сушать і методом авторадіографії (описаним в наступному розділі) на рентгенівській плівці локалізують положення смуги шуканого білка. Для подальшого правильного поєднання плівки з Діазобумага (а через неї і з гелем), на папері перед авторадіографія роблять дві позначки радіоактивними чорнилом.
1. Відомі три види радіоактивного випромінювання: а, (3 і у. Ос-частинки являють собою ядра гелію; (З-частинки - це звичайні електрони (Р-електрони) і в - дуже короткохвильове електромагнітне вивчення. У біології використовуються тільки два останні види.
2. Р-електрони випромінюються ядрами атомів і тому хімічні властивості відповідних радіоактивних ізотопів (їх валентності та хімічні зв'язку) при цьому не змінюються.
3. Інтенсивність випромінювання будь-якого радіоактивного препарату зменшується з часом, оскільки зменшується число атомів, здатних до радіоактивного розпаду в суміші з тими, в яких він вже стався. Швидкість цього зменшення характеризується так званим часом напіврозпаду (ТУ).
Тобто часом, протягом якого будь-який даний кількість ізотопу (а з ним і інтенсивність випромінювання) зменшується удвічі. Очевидно, що ця характеристика залишається незмінною протягом усього "періоду життя" цього ізотопу. Час напіврозпаду для різних ізотопів коливається в дуже широких межах.
Для ізотопів, які використовуються в біології, - від декількох днів до декількох тисяч років (див. таблицю нижче). Знання величини ТУ дуже істотно: в одних випадках навіть при тривалому зберіганні радіоактивного препарату інтенсивність його випромінювання практично не змінюється, в інших - вона може впасти майже до нуля за пару тижнів.
4. Інтенсивність випромінювання даного радіоактивного препарату в даний момент часу характеризується числом радіоактивних розпадів (актів випромінювання) в хвилину. Його найчастіше виражають в одиницях "Кюрі" (Кі). Це - дуже велика едініца.1Кі == 2,2 10 грудня розпадів за хвилину.
Інша величина, прийнята в системі одиниць СІ, виявилася, навпаки, занадто мала: 1 Беккерель (Бк) = 1 розпаду в секунду. Тому до цих пір інтенсивність воліють виражати числом мілікюрі (мки) або мікрокюрі (мкКі).
5. Практичний інтерес представляє питома радіоактивність (УА), тобто радіоактивність 1 мілімоля радіоактивної речовини, в якому частина атомів вже зазнала радіоактивний розпад. Крім того, в переважній більшості випадків істинно радіоактивні ізотопи становлять лише певну частку від загального числа атомів (або молекул) речовини, іменованої радіоактивним. УА виражають в одиницях Кі / ммоль або мки / ммоль.
6. Дуже важливою характеристикою радіоактивного випромінювання є енергія вилітають частинок (у-випромінювання теж відбувається окремими порціями енергії - "у-квантами"). І Р-електрони, і у-кванти, що випускаються різними атомами одного і того ж радіоактивного препарату, можуть мати різні величини енергії.
В якості характеристики ізотопу прийнято вказувати величину максимально можливої енергії відповідних частинок або квантів. Її виражають в "Електронвольт" (еВ) або кілоелектронвольт (КеВ). З курсу фізики відомо, що 1еВ відповідає енергії, що купується електроном при прольоті у вакуумі ускоряющего електричного поля з різницею потенціалів в 1 Вольт.
У нижченаведеної таблиці зібрані всі ці дані для ізотопів, які використовуються в біології.
(Цифра, що стоїть зліва вгорі у хімічного символу ізотопу, вказує його масу в одиницях маси атома нормального водню. Вона може бути більше або менше маси відповідного нерадіоактивного атома. Пояснення цьому - в курсі фізики)
Іноді УА препарату висловлюють не в Кюрі, а числом імпульсів у хвилину (імп / хв), які реєструє прилад, і відносять не до мілімоля, а до міліграмів або мікрограмів речовини (імп / хв / мг). Строго кажучи, це некоректно, тому що включає сюди ефективність підрахунку імпульсів, яка може бути далеко не стовідсотковою.
Але для порівняльних вимірювань, наприклад, для спостереження за ходом очищення індивідуального, радіоактивно міченого білка - цілком прийнятно. Крім того, радіоактивність найчастіше використовують для "детектування" - відділення мічених препаратів певної природи від таких же, але не мічених. Тут ефективність рахунку не істотна.
Слід віддавати собі звіт в тому, що зазначені в таблиці значення максимальної енергії корисні для зіставлення енергетичних можливостей (проходження через перешкоди) кожного з ізотопів, але аж ніяк не представляють енергію більшості реально випускаються частинок або квантів.
Це добре видно з графіків розподілу по енергіях електронів, представлених на рис. По осях абсцис на цих графіках відкладені величини енергії в КеВ, природно, в різних масштабах (див. цифри). По осях ординат відносний вміст електронів зазначеної енергії. (Криві не доходять до осі ординат, тому що енергії електронів, близькі до нуля не піддаються вимірюванню) Зазначені значення Е відповідають середній величині енергії електронів відповідного ізотопу, на яку слід орієнтуватися в оцінці можливостей їх реєстрації.
Рис. 2
2. Курашвілі Л.В., Савченко Р.П. Зміна показників ліпідного обміну у хворих з хронічною нирковою недостатністю, що знаходяться на програмованому гемодіалізі / Лабораторне справу. - N 12. - 1986. - С.717-719.
3. Курашвілі Л.В., Миколаїв П.М. Нове в лабораторній діагностиці опікових хворих. Науково-практична конференція, присвячена 140-річчю обласної лікарні ім.Н. Н. Бурденка і 110-річчю з дня народження академіка М.М. Бурденка. Тез. доповідей. - Пенза, 1986. - С.103-105
Аффінниє імуносорбент.
Використання радіоактивних ізотопів
Аффінниє імуносорбент
Високий ступінь вибірковості зв'язку антиген - антитіло відкриває перспективу створення афінних хроматографічних колонок для очищення будь-яких білків, що не мають подібно ферментам і іншим біологічно родинним парам, своїх специфічних партнерів. Загальний план дій тут такий:1. Імунізувати кролика якимось добре очищеним білком.
2. Той же білок ковалентно закріпити на матриці, наприклад, у колонці BrCN-активованої сефарози.
3. Імунну антисироватки крові кролика пропустити через цю колонку. Всі інші антитіла легко змити, а специфічні для нашого білка антитіла на ній залишаться.
4. Їх можна потім зняти зміною рН буфера або подачею високої концентрації солі. (Антитіла чудово зберігаються)
5. Якщо ми зуміємо надійно посадити ці антитіла на іншу колонку, причому так, що вони не втратять здатності зв'язуватися зі своїм антигеном, то з її допомогою можна буде отримати з будь-якої складної суміші той білок, який нас цікавить, а потім зняти і його в зовсім очищеному вигляді "
Для конкретизації способу здійснення цього плану нам будуть потрібні додаткові відомості про структуру і властивості антитіл. По-перше, зазначимо точне місце знаходження антитіл у складі крові.
Якщо кров налити в пробірку і почекати поки вона згорнеться, а потім центрифугуванням прибрати осад, то з ним підуть і червоні кров'яні клітини (еритроцити), і білі (лейкоцити і лімфоцити), і білок фібриноген, який здійснює згортання.
Залишиться прозора рідина, іменована сироваткою крові. У ній розчинені цукру, гормони, вітаміни, солі та інші низькомолекулярні речовини, а також різноманітні і численні білки крові. Основну їх масу складають два класи білків: альбуміни і глобуліни. Їх можна розділити додаванням сульфату амонію до концентрації в 2М.
Глобуліни випадають в осад. Якщо ж всю сироватку піддати фракціонування електрофорезом при рН8, 6, то вперед швидко підуть альбуміни, а потім підуть а-, (3-й у-глобуліни.
Ось у цій останньої фракції, так званих імуноглобулінів і знаходяться антитіла. Існує кілька типів імуноглобулінів. З них багатшим за інших представлений в крові і використовується для дослідницьких цілей один - імуноглобулін типу G, що позначається IgG.
Сироватку крові тварини, який встиг виробити "імунна відповідь", тобто антитіла, специфічні для введеного ззовні антигену, і називають антисироватки.
Іноді в її повну назву вказують і стимулював цю антисироватки антиген і навіть його походження. Наприклад, "Антисироватка кролика проти еритроцитів кози".
Назва довге, зате повністю описує конкретний випадок: в кров кролика були введені еритроцити з крові кози. Вони - чужі і тому викликали імунну відповідь.
Взагалі-то кажучи, у людини відомо чотири варіанти: від IgGI до IgG4, та ще певна кількість інших імуноглобулінів: IgM, IgA, IgE, що грають дещо різні ролі.
Але ми в ці деталі вникати не будемо. Відмінності їх структур незначні і більше 60% припадає на частку IgGI. Саме його ми будемо далі мати на увазі під терміном "антитіло". Молекулярна маса IgGI становить 146 000 дальтон.
Вся його просторова конфігурація встановлена методом рентгеноструктурного аналізу. Під електронним мікроскопом антитіло виглядає подібно латинської букви "Y".
На її "стрижні" і обох "гілках" можна розрізнити окремі ділянки ("домени"), де поліпептидний ланцюг білка скручена і утворює щось на кшталт півсфери, як це зображено на мал.1.
Рис. 1
Помітна на малюнку парність доменів відображає дійсний подобу будови членів кожної пари, але всі вони водневими, гідрофільними, а головне - дисульфідними містками пов'язані в одну молекулу.
Найважливіше для нас те обставина, що всі чотири домену "стрижня" і ближні до нього пари доменів "гілок" незмінні за своїм амінокислотним складом і будовою у всіх антитіл ("константних частина").
І лише дві пари кінцевих доменів представляють собою вариабильность частина антитіла, що визначатиме її антигенну специфічність. У цих доменах є ділянки, які іменуються "гіперваріабільнимі областями" (на рис. - Заштриховані).
У них відмінності антитіл, специфічних для різних антигенів, особливо яскраво виражені. У кожній парі кінцевих доменів вони утворюють якусь подобу "ущелини".
Можна очікувати, що саме тут пов'язується антиген. Таке припущення знайшло пряме підтвердження після того, як вдалося кристалізувати кінцевий фрагмент одного з антитіл разом із зв'язаним з ним антигеном (вітаміном К).
Аналіз рентгенограми показав, що молекула вітаміну лежить в "ущелині" області впізнавання і різні її частини зближені і взаємодіють з певними амінокислотами в гіперваріабільной області.
На рис. зображена просторова конфігурація одного з вариабильность кінцевих доменів IgGl. Поліпептидна ланцюжок з 104 амінокислот згорнута так, що три її заштрихованих (гіперваріабільних) ділянки виходять на поверхню домену приблизно в одній площині, утворюючи один із схилів "ущелини" зв'язку.
Точками на цьому ж малюнку позначено місця з'єднання з парним доменом краю тієї ж гілки, що створює другий схил. Амінокислотний склад гіперваріабільних ділянок на обох схилах, очевидно, різний. Але "ущелині" на кінці другої гілки молекули антитіла є точною копією "ущелини" на першій гілки.
Безпосередню область впізнавання і зв'язування антигену в "ущелині" на кінці гілки утворюють близько 20 амінокислот. Але ще не менш 70 амінокислот кожного з кінцевих доменів беруть участь у визначенні просторової конфігурації цієї області.
Але повернемося до нашої програми створення афінно-імунної колонки. Зрозуміла можливість реалізації чотирьох її перших пунктів. З сироватки імунізованих кролика, двухмолярним розчином сульфату амонію осаджують сумарну фракцію глобулінів.
Потім її розчиняють, діалізом звільняють від солі і наносять в буфері рН6, 5 на колонку ДЕАЕ-целюлози. При такому значенні рН IgG не затримується на колонці і виходить відразу очищеним, оскільки всі інші глобуліни залишаються на колонці.
Одночасно готують колонку на основі BrCN-активованої сефарози і фіксують на ній білок, яким був імунізований кролик. Розчин сумарної фракції IgG пропускають через цю колонку і промивають її буфером. У результаті на колонці затримуються лише антитіла, специфічні для цього білка-антигену. Їх можна зняти 0,1 М розчином оцтової кислоти або 4,5 М розчином MgClg. Отриманий таким чином розчин потрібних антитіл нейтралізують, діалізу від солей і, якщо треба, концентрують упариванием води.
Тепер встає останнє запитання. Як пов'язати ці антитіла з матрицею ще однієї колонки, причому так, щоб не постраждала їх антигенна активність і специфічність? Нелегкий питання!
Але тут природа зробила дослідникам розкішний подарунок. Виявилося, що якийсь білок з оболонки бактерії Staphylococcus aureus, названий "білком А", здатний міцно зв'язуватися з незмінною частиною ("стрижнем") більшості IgG.
За словом "виявилося" ховається багато чого. Навряд чи білок з такою властивістю спеціально шукали саме у цієї бактерії. Швидше за все його виявили випадково. (Але, як говорить прислів'я, вчений той, хто бачить те ж, що бачать всі, але помічає те, що не помітив ніхто!).
Так чи інакше, але виявлення зазначеного властивості білка А відкрило шлях до здійснення останнього етапу нашої програми. На колонку активованої сефарози хімічно міцно садять білок А (навіть є в продажу готова "Protein А - Sepharose CL-4В") і через неї в певних умовах пропускають розчин специфічних антитіл. Вони закріплюються на колонці через свої "стрижні" і білок А.
Обидва кінці розгалуження залишаються вільними. Колонка готова - створений афінних імуносорбент для негайної очищення з будь-якої білкової суміші того білка, який був використаний для імунізації кролика. Зняти його з колонки після очищення не становить труднощів - кислотою або сіллю ...
Аффінниє імуносорбент знайшли широке застосування і, до речі сказати, не тільки для очищення білків. У 1978 р. Stumphet зуміли цим методом із суміші фрагментів ядерної ДНК відокремити гібридні ДНК-РНК шматки. За цим гібридам визначили гени, відповідальні за синтез рибосомних РНК. (Кролика в цьому випадку імунізували двухнитевой синтетичним гібридом поліаденіловой кислоти і полидезоксириботимидиновой кислоти) Виявилося, що такий гібрид відмінно імітує щодо спеціалізації антитіл гібрид ДНК-РНК.
Відшукування антигену після електрофорезу суміші білків
Це - ще один вельми корисний варіант використання іммуноспеціфіческого зв'язування антитіл з їх антигенами. Уявімо собі, що після розділення суміші білків електрофорезом в ПААГ виходить велика кількість білкових смуг, з яких одна мусить містити шуканий білок.Тут можна використовувати поєднання вибірковості іммуноспеціфіческого зв'язування з дуже чутливим способом використання радіоактивності. Цікавлять дослідника білком імунізують кролика і очищають з його крові антисироватки. Розроблено і є у продажу спеціальна, так звана "Діазобумага".
Вона має здатність за своїми активними диазогруппа ковалентного хімічним зв'язком приєднувати будь-які білки.
Після закінчення електрофорезу з верхньої поверхні гелю фільтрувальним папером видаляють надлишок вологи і кладуть на нього Діазобумага, зафіксувавши її положення на гелі проколами по двох кутах папери і гелю. Потім цю пару, гелем вниз, поміщають в систему "блотів", для перенесення ДНК з агарозного гелю на нітроцелюлозні фільтр.
Тобто кладуть гель на лист товстої фільтрувального паперу, постійно змочувані буфером, а на Діазобумага накладають стопку фільтрувального паперу і через пластинку скла притискають вантажем. Струмом рідини, що йде вгору по капілярах, частина білків з кожної смуги переноситься на Діазобумага і там міцно фіксується.
Невикористані диазогруппа між білковими "репліками" закривають вимочуванням в 10%-ном розчині етаноламіну, який у відносинах з диазогруппа імітує білок. Потім Діазобумага поміщають в розчин отриманої раніше антисироватки і витримують 12 годин при 37 ° С.
За цей час завершується реакція зв'язування специфічних антитіл, що є в антисироватки з фіксованим на папері антигеном. (Для всіх інших білків в антисироватки, - навіть сумарної, - немає специфічних антитіл) залишилися вільними антитіла відмивають буфером.
Нарешті, Діазобумага, на якій є репліка шуканого білка разом з пов'язаними з ним антитілами, інкубують 2 години при 37 ° С у розчині міченого радіоактивним йодом білка А (він доступний у вигляді готового препарату).
Чи не сорбованих на "стрижнях" антитіл білок А відмивають міцним сольовим розчином. Папір сушать і методом авторадіографії (описаним в наступному розділі) на рентгенівській плівці локалізують положення смуги шуканого білка. Для подальшого правильного поєднання плівки з Діазобумага (а через неї і з гелем), на папері перед авторадіографія роблять дві позначки радіоактивними чорнилом.
Радіоактивні ізотопи, що використовуються в біології
Явище радіоактивного розпаду вивчається в шкільному курсі фізики, і тому фізичну природу радіоактивності ми тут розглядати не будемо. Перерахую тільки ті характеристики цього явища, які істотні для подальшого викладу.1. Відомі три види радіоактивного випромінювання: а, (3 і у. Ос-частинки являють собою ядра гелію; (З-частинки - це звичайні електрони (Р-електрони) і в - дуже короткохвильове електромагнітне вивчення. У біології використовуються тільки два останні види.
2. Р-електрони випромінюються ядрами атомів і тому хімічні властивості відповідних радіоактивних ізотопів (їх валентності та хімічні зв'язку) при цьому не змінюються.
3. Інтенсивність випромінювання будь-якого радіоактивного препарату зменшується з часом, оскільки зменшується число атомів, здатних до радіоактивного розпаду в суміші з тими, в яких він вже стався. Швидкість цього зменшення характеризується так званим часом напіврозпаду (ТУ).
Тобто часом, протягом якого будь-який даний кількість ізотопу (а з ним і інтенсивність випромінювання) зменшується удвічі. Очевидно, що ця характеристика залишається незмінною протягом усього "періоду життя" цього ізотопу. Час напіврозпаду для різних ізотопів коливається в дуже широких межах.
Для ізотопів, які використовуються в біології, - від декількох днів до декількох тисяч років (див. таблицю нижче). Знання величини ТУ дуже істотно: в одних випадках навіть при тривалому зберіганні радіоактивного препарату інтенсивність його випромінювання практично не змінюється, в інших - вона може впасти майже до нуля за пару тижнів.
4. Інтенсивність випромінювання даного радіоактивного препарату в даний момент часу характеризується числом радіоактивних розпадів (актів випромінювання) в хвилину. Його найчастіше виражають в одиницях "Кюрі" (Кі). Це - дуже велика едініца.1Кі == 2,2 10 грудня розпадів за хвилину.
Інша величина, прийнята в системі одиниць СІ, виявилася, навпаки, занадто мала: 1 Беккерель (Бк) = 1 розпаду в секунду. Тому до цих пір інтенсивність воліють виражати числом мілікюрі (мки) або мікрокюрі (мкКі).
5. Практичний інтерес представляє питома радіоактивність (УА), тобто радіоактивність 1 мілімоля радіоактивної речовини, в якому частина атомів вже зазнала радіоактивний розпад. Крім того, в переважній більшості випадків істинно радіоактивні ізотопи становлять лише певну частку від загального числа атомів (або молекул) речовини, іменованої радіоактивним. УА виражають в одиницях Кі / ммоль або мки / ммоль.
6. Дуже важливою характеристикою радіоактивного випромінювання є енергія вилітають частинок (у-випромінювання теж відбувається окремими порціями енергії - "у-квантами"). І Р-електрони, і у-кванти, що випускаються різними атомами одного і того ж радіоактивного препарату, можуть мати різні величини енергії.
В якості характеристики ізотопу прийнято вказувати величину максимально можливої енергії відповідних частинок або квантів. Її виражають в "Електронвольт" (еВ) або кілоелектронвольт (КеВ). З курсу фізики відомо, що 1еВ відповідає енергії, що купується електроном при прольоті у вакуумі ускоряющего електричного поля з різницею потенціалів в 1 Вольт.
У нижченаведеної таблиці зібрані всі ці дані для ізотопів, які використовуються в біології.
| Ізотоп | Туз | УА (Кі / ммоль) | Енергія (КеВ) | |
| Р-електронів, Emax | у-випромінювання | |||
| "Н | 12,3 років | 29 | 19 | - |
| 14 ^ | 5730 років | 62 (мки / ммоль) | 156 | - |
| 35g | 87,4 діб. | 1 500 | 167 | - |
| 32Р | 14,3 діб. | 9 000 | 1708 | , - |
| 125J | 60 діб. | 2 000 | 6 | 35 |
| 131J | 8 діб. | 16 000 | 250-810 | 80-720 |
Іноді УА препарату висловлюють не в Кюрі, а числом імпульсів у хвилину (імп / хв), які реєструє прилад, і відносять не до мілімоля, а до міліграмів або мікрограмів речовини (імп / хв / мг). Строго кажучи, це некоректно, тому що включає сюди ефективність підрахунку імпульсів, яка може бути далеко не стовідсотковою.
Але для порівняльних вимірювань, наприклад, для спостереження за ходом очищення індивідуального, радіоактивно міченого білка - цілком прийнятно. Крім того, радіоактивність найчастіше використовують для "детектування" - відділення мічених препаратів певної природи від таких же, але не мічених. Тут ефективність рахунку не істотна.
Слід віддавати собі звіт в тому, що зазначені в таблиці значення максимальної енергії корисні для зіставлення енергетичних можливостей (проходження через перешкоди) кожного з ізотопів, але аж ніяк не представляють енергію більшості реально випускаються частинок або квантів.
Це добре видно з графіків розподілу по енергіях електронів, представлених на рис. По осях абсцис на цих графіках відкладені величини енергії в КеВ, природно, в різних масштабах (див. цифри). По осях ординат відносний вміст електронів зазначеної енергії. (Криві не доходять до осі ординат, тому що енергії електронів, близькі до нуля не піддаються вимірюванню) Зазначені значення Е відповідають середній величині енергії електронів відповідного ізотопу, на яку слід орієнтуватися в оцінці можливостей їх реєстрації.
Рис. 2
Література
1. Курашвілі Л.В., Миколаїв П.М. Діагностична значимість дослідження холестерину в ЛПВЩ у опікових хворих. III Всесоюзна конференція з проблеми: Сучасні засоби першої допомоги і методи лікування опікової хвороби / Тези / - Москва, 1986. - С.186-187.2. Курашвілі Л.В., Савченко Р.П. Зміна показників ліпідного обміну у хворих з хронічною нирковою недостатністю, що знаходяться на програмованому гемодіалізі / Лабораторне справу. - N 12. - 1986. - С.717-719.
3. Курашвілі Л.В., Миколаїв П.М. Нове в лабораторній діагностиці опікових хворих. Науково-практична конференція, присвячена 140-річчю обласної лікарні ім.Н. Н. Бурденка і 110-річчю з дня народження академіка М.М. Бурденка. Тез. доповідей. - Пенза, 1986. - С.103-105