Асиметрія мембран

Використання антитіл проти синтетичних пептидів, що відповідають окремим білковим фрагментами, дозволяє точно з'ясувати, чи доступна ця область білка для зв'язування антитіла. Якщо антитіла, специфічні до певної амінокислотної послідовності, зв'язуються з нативною формою білка в мембрані, то дослідник отримує потужний інструмент для визначення топографії білка. Цим шляхом можна перевіряти окремі топографічні моделі. , микросомному цитохрому Р450 и ацетилхолиновому рецептору. Прикладами успішного використання даного підходу є роботи з лактозопермеазе Є. coli, мікросомному цитохрому Р450 і ацетилхолінових рецепторів. На жаль, немає гарантій, що антіпептндние антитіла взагалі будуть зв'язуватися з білком. Потенційний центр зв'язування в нативному білку може перебувати в такій конформації або так бути захованим всередині білкової глобули, що не буде пізнаний антитілом або доступний для нього. Дійсно, в деяких випадках антіпептідние антитіла не зв'язуються з білком навіть після його денатурації в ПДН.

Дуже дотепним є підхід до визначення топографії поліпептиду, заснований на методах молекулярної генетики. Він полягає у введенні чужорідного епітопів в амінокислотну послідовність мембранного білка з подальшим використанням антитіл, специфічних до цього епітопи.

Хімічна модифікація

Цей підхід широко використовувався для локалізації білків або їх окремих ділянок на поверхні мембрани або в її гідрофобної області. Білок вступає в реакцію з реагентом, який може діяти лише на одній стороні орієнтованої мембрани або в її гідрофобною серцевині. Реагент, призначений для ідентифікації білка на поверхні мембрани, повинен бути сильно полярним; він не повинен адсорбуватися на мембрані або накопичуватися всередині її. Для локалізації ж тієї частини білка, яка знаходиться в контакті з вуглеводневими хвостами ліпідних молекул, слід використовувати дуже неполярні реагенти, які концентруються в гідрофобної області мембрани. Артефакти, що виникають при цьому підході, частіше всього бувають пов'язані з тим, що реагент модифікує білок не тільки в тому реакційному просторі, для якого він був призначений. Наприклад, реагент, спрямований на модифікацію поверхні мембрани, може мати досить неполярний характер, щоб проникати через мембрану і отримувати доступ до білків внутрішнього компартмента. Хімічна модифікація може також призвести до пошкодження мембрани і зробити її проникною для того реагенту, який, як очікується, повинен бути непроникаючих. У табл. 1 перераховані деякі з хімічних реагентів, що використовуються для вивчення топографії мембранних білків.

Модифікацію білків на поверхні мембрани часто проводять за допомогою ферменту лактопероксідаза, яка каталізує іодірованіе доступних залишків тирозину або гістидину. Оскільки реакція між I "і Н ₂ О ₂ відбувається в активному центрі лактопероксідаза, остання повинна бути найвищою мірою «векторної», тобто локалізованої тільки на одній стороні мембрани. Однак за певних умов під час реакції може утворюватися Ь, який, проникаючи через мембрану, здатний иодированная амінокислотні залишки на внутрішній стороні мембрани. Це показує, наскільки важливий суворий контроль умов перебігу реакцій для виключення артефактів.

-таурин. Для поверхневої модифікації часто використовуються і інші реагенти - солі діазонію, які реагують з бічними ланцюгами залишків лізину, цистеїну, тироксину і гістидину, а також фотоак-тівіруемие реагенти, наприклад NAP-таурин.

У табл. 1 перерахований також ряд неполярних фотоактівіруемих реагентів, які використовуються для виборчої модифікації амінокислотних залишків білка, що контактують з гідрофобною областю бішару. Ці реагенти зазвичай додають до мембранного препарату, дають їм можливість накопичитися в бішарі і потім піддають їх фотоактивації. Перевага утворюються при цьому нітренов і карбенів полягає в тому, що їх реакції набагато менш специфічні в порівнянні з реакціями інших активних часток, так що ковалентний модифікація не обмежується бічними ланцюгами будь-яких певних амінокислот. Правда, нітрит проявляють вибірковість по відношенню до нуклеофілом. Використання карбенів переважніше, оскільки вони вступають в реакцію з більш високим виходом. Для отримання інформації про вторинну структурі трансмембранних ділянок поліпептидного ланцюга шляхом визначення тих залишків, які контактують з ліпідами, використовували реагент ТІД. Наприклад, спіраль З бак-

Таблиця 1. Деякі реагенти, що застосовують для вивчення топографії мембранних білків

теріородопсіна включає мітку лише з одного боку, це узгоджується з уявленням про те, що дана спіраль є трансмембранної, причому її неполярная область звернена в ліпідну фазу.

Локалізація специфічних центрів

Цінну інформацію іноді можна отримати, визначаючи становище специфічних центрів у ряді білків. Наприклад, місця приєднання цукрових залишків у глікопротеїну плазматичної мембрани завжди знаходяться на її зовнішній поверхні, так що виявлення їх у поліпептидного ланцюга має і топологічну цінність. Настільки ж інформативними можуть бути і дані про локалізацію сайтів модифікації білка, наприклад сайтів фосфорилювання, якщо локалізація модифікуючий ферменту відома. Так, в білках плазматичної мембрани фосфорильовані амінокислотні залишки знаходяться на цитоплазматичній стороні. Аналогічним чином може виявитися корисною локалізація специфічних місць зв'язування. наружной мембраны Е. coli ; для этого использовались мутантные белки. Наприклад, були ідентифіковані місця зв'язування бактеріофага із змістом на поверхні клітини ділянками білків отрут і LamB зовнішньої мембрани Є. coli; для цього використовувалися мутантні білки.

Генетичні підходи

Можливість генетичної модифікації мембранних білків призвела до створення нових підходів до їх топографическому аналізу. Такі методи, цілком ймовірно, будуть застосовуватися всі ширше, однак поки число вдалих прикладів не настільки велика, щоб судити про їх надійності та універсальності. Так, в білок отрав методами генної інженерії були вбудовані в певні місця короткі пептиди, потім був проведений протеоліз і за його результатами визначено, чи були ділянки, що містять включений пептид, експоновані на поверхні клітини. Аналіз мутантних варіантів дозволив ідентифікувати також місця зв'язування фага і відповідні епітопи в білках, експонованих на зовнішній стороні мембрани.

Цінні дані щодо топографії білків цитоплазматичної мембрани Є. coli були отримані і за допомогою методу гібридизації білків. -концевой участок будет представлен мембранным белком, а на С-конце будет находиться каталитический центр щелочной фосфатазы. Гібридні білки можна сконструювати так, що їх N-кінцевий ділянка буде представлений мембранним білком, а на С-кінці буде знаходитися каталітичний центр лужної фосфатази. , куда она транспортируется и где проявляет свою ферментативную активность. Лужна фосфатаза звичайно локалізується в періплазматіческом просторі Є. coli, куди вона транспортується і де проявляє свою ферментативну активність. -конца. Синтез багатьох мембранних білків, мабуть, здійснюється лінійним чином, починаючи з N-кінця. Тому, якщо місце зчленування, де починається послідовність лужної фосфатази, локалізовано на періплаз-тичного стороні мембрани, то гібридний білок буде транспортуватися в периплазмі і проявляти ферментативну активність. Якщо ж місце зчленування знаходиться на цитоплазматичній стороні, то лужна фосфатаза в гібридному білку залишиться всередині клітини і буде виявляти низьку ферментативну активність. Отже, ті місця зчленування в гібридних білках, які призводять до високої активності лужної фосфатази, будуть відповідати зовнішнім доменам мембранного білка.

1.2 ПРИКЛАДИ АНАЛІЗУ ТОПОГРАФІЇ МЕМБРАННИХ БІЛКІВ

Один з найбільш яскравих прикладів детального топографічного аналізу мембранного білка - це вивчення бактериородопсина. Як показують дані по реконструкції зображення, бактеріо-родопсин має сім трансмембранних сегментів, мабуть представляють собою а-спіралі. Результати протеолізу, хімічної модифікації і зв'язування антитіл узгоджуються з цією моделлю, хоча точні межі трансмембранних сегментів не встановлені.

Ще один білок, для якого отримані несуперечливі топографічні дані, - це бичачий родопсин. У цьому випадку аналіз первинної структури теж припускає наявність семи трансмембранних а-спіралей з їх з'єднують петлями. З такою моделлю узгоджуються результати вивчення топографії за допомогою антитіл та протеаз, а також дані про локалізацію місць фосфорилювання і приєднання вуглеводів. Зверніть увагу, що хоча бактеріородопсин і родопсин пов'язують одну і ту ж простетичної групу - ретиналь - і, мабуть, покладені в мембрані однаковим чином, ніякої гомології в їх амінокислотної послідовності не спостерігається і виконують вони різні функції. Бактеріородопсин є бактеріальним світлочутливим протонним насосом, а родопсин - це зоровий пігмент, що міститься в паличках сітківки. Під дією світла родопсин зазнає світлозалежна конформаційні зміни, ініціюючи цілий каскад подій, кінцевим результатом яких є зоровий сигнал.

Велику увагу було приділено аналізу топографії ще одного трансмембранного білка - ацетилхолінового рецептора. Виходячи з аналізу первинної послідовності, було запропоновано кілька топографічних моделей цього рецептора, адекватність яких перевірялася за допомогою імунологічних методів. Слід, однак, відзначити, що отримані дані дуже суперечливі; це означає, що застосування цих методів не завжди є виправданим.

Як останній приклад можна навести мікросомний цитохром Ь $. Цей білок функціонує як переносник електронів, беручи участь в деяких окислювально-відновних реакціях в еідоплазматіческом ретикулумі. — это амфифильный белок, в котором гемсвязывающий каталитически активный домен соединяется с помощью десяти аминокислотных остатков с неполярным доменом — мембранным якорем. Цнтохром bs - це амфіфільних білок, в якому гемсвязивающій каталітично активний домен з'єднується з допомогою десяти амінокислотних залишків з неполярних доменом - мембранним якорем. Ці два домени можна відокремити один від одного шляхом проте-оліза. Структуру гемсвязивающего фрагмента вивчали методом рентгеноструктура аналізу. Будова якірного пептиду на С-кінці білка невідомо. - и С-концы оказываются по одну сторону мембраны? Топографічні дослідження, що проводилися в кількох лабораторіях, були спрямовані на з'ясування одного простого запитання: перетинає чи цей якір бішар або він занурений у нього тільки наполовину і, зробивши петлю, йде назад, так що його N - і С-кінці виявляються з одного боку мембрани ? Незважаючи на всі зусилля, остаточну відповідь на це питання поки не отримана. , встроенный в фосфолипидные везикулы. У більшості досліджень використовувався очищений цитохромом bs, вбудований в фосфоліпідних везикули. Проблема полягає в тому, що різні методики реконструкції дають різні кон-формації білкової молекули. При «неміцному» зв'язуванні цито-хрому bs и локализован на той же стороне, что и гемсвязывающий домен. З-кінець доступний для карбоксипептидази Y і локалізований на тій же стороні, що й гемсвязивающій домен. Однак за допомогою певних методик можна отримати «міцно» пов'язаний домен, в якому С-кінець недоступний для протеолізу, що, ймовірно, відповідає топографічної орієнтації білка in . vivo. Корану і ін намагалися вирішити це питання, вивчаючи модифікацію двох форм цього білка за допомогою фотоактівіруемих аналогів фосфоліпідів. Вони прийшли до висновку, що в «міцно» зв'язаній формі білка мембранний якір пронизує біс-лій. Цей висновок, однак, не знайшов повної підтримки. Інші підходи або взагалі не дозволили зробити вибір на користь тієї або іншої моделі, або дали суперечливі результати.

Все сказане вище показує, що за відсутності структурних даних високого дозволу важко визначити спосіб укладання інтегральних білків в мембрані. І справді, кількість білків, для яких це вдалося зробити, дуже мало.

2. Цитоскелет

У принципі як трансмембранне, так і латеральне розподіл мембранних компонентів може залежати від їх взаємодії зі структурами, що знаходяться на поверхні мембрани. У ряді випадків така залежність була чітко виявлена, зокрема з цим пов'язаний все більш зростаючий, інтерес до взаємодії мембрани з цитоскелетом. Цитоскелет - це складна мережа волокон різного типу, виявлена ​​в еукаріотичних клітинах. У прокаріоти-чеських клітин нічого подібного не виявлено. Основна функція цієї системи, мабуть, пов'язана з механікою клітини. Цитоскелет забезпечує механічну опору для плазматичної мембрани і тим самим визначає форму клітини, а також місце розташування клітинних органел і їх переміщення при мітозі. З рухливістю внутрішньоклітинних мембранних везикул пов'язані такі процеси, як ендоцитоз, екзоцитоз і фагоцитоз, а також переміщення плазматичної мембрани при амебоідному руху клітин. Всі ці процеси здійснюються за участю цитоскелету. По суті цитоскелет є динамічним каркасом клітини, що реагує як на внутрішні, так і на зовнішні стимули. Частина цієї системи тісно пов'язана з плазматичною мембраною. В даний час найкраще охарактеризований мембранний скелет еритроцитів ссавців. Менш детально вивчені біохімічні властивості цитоскелету мікроворсинок щіткової облямівки кишкового епітелію. Зазвичай ці-тоскелет являє собою тривимірну мережу волокон, що охоплює всю клітину. У деяких точках він прикріплений до плазматичної мембрани, і ці області, як відомо, беруть участь у міжклітинних контактах або в фокальних контактах, з допомогою яких клітини прикріплюються до субстрату в клітинних культурах.

Передбачається, що саме завдяки взаємодіям цитоскелета з мембраною виникає трансмембранне розподіл ли-пидов, стабілізуються латеріальние білкові домени і забезпечується спрямоване переміщення білків в мембрані.

Цитоскелетного мережу утворюють три типи волокон: 1) микроф-менти, що складаються з актину і пов'язаних з ним білків, 2) проміжні філаменти, що складаються з кератинів та споріднених їм білків; 3) мікротрубочки, що складаються з тубуліну. У біохімічному відношенні краще всього вивчено зв'язування з мембраною Актинові мік-рофіламентов. Особливого розгляду тут заслуговує актин-спектріновая мережа еритроцитів. Ці білки сприяють об'єднанню Актинові волокон в пучки, прикріплюють філаменти до мембрани, утворюють зшивання в актине, регулюють довжину філаментів, впливають на їх скоротливу здатність і забезпечують відгук на Са ^{2 +.} У ряді випадків актин бере участь у скорочувальної активності. Мікрофіламенти руйнуються цітоха-Лазініо.

Мікрофіламенти можуть розташовуватися паралельно цитоплазматичній мембрані, як у скоротні кільці в делящейся клітці, або можуть бути пов'язані з плазматичною мембраною одним своїм коццом, як в місцях адгезії в області контакту клітина-клітина чи клітина-субстрат. Вважають, що зв'язування актину з мембранами забезпечується декількома мембранними білками. З даних про фізичну близькість мікро-філаментів до мембрани, про біохімічні взаємозв'язках микроф-ментів і руйнує впливі цітохалазіна випливає, що мікрофіламенти беруть участь у багатьох мембранних процесах, зокрема в опосередковуваного рецепторами ендоцитозу, петчінге і кеппінге, клітинної рухливості і цитокінез. З біохімічної точки зору краще всього охарактеризовано взаємодії актину з мембраною у еритроцитів.

Проміжні філаменти

Це полімери, що складаються з одного або двох фібрилярних поліпептидів, які розрізняються в клітинах різного типу і кодуються сімейством мультігенов. Прикладом є кератини з епітеліальних клітин і віментин з клітин мезенхіми.

Функції проміжних філаментів невідомі. Мало що можна сказати і про біохімічної основі їх взаємодії з мембранами.

Мікротрубочки

Вони складаються з тубуліну, який добре охарактеризований і являє собою а /?-Гетеродімерний білок. Мікротрубочки утворюють цитоплазматичну мережу, яка, як вважають, пов'язує плазматичну мембрану з органелами, наприклад з мітохондріями. Уздовж мікротрубочок, мабуть, відбувається переміщення ендосом і лізосом. Є докази, що тубулін прикріплюється до мембран в особливих точках. Виділено мембранний білок сінапсін I, який, мабуть, взаємодіє з тубуліну. У ході мітозу цитоплазматична мережа мікротрубочок розпадається і перебудовується в мітотичний веретено. Мікротрубочки руйнуються під дією колхіцину.

МЕМБРАНА І цитоскелета еритроцитів

Найбільш детально вивчені мембрана і цитоскелет еритроцитів ссавців. У табл. 4.2 перераховані основні білки, які були розділені за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу. Цифрові позначення поліпептидів пов'язані з їх відносною електрофоретичною рухливістю в гелі. При промиванні мембрани розчинами з низькою іонною силою видаляються периферичні мембранні білки, до яких насамперед належать компоненти цитоскелету. Основними інтегральними білками цитоскелету є білок смуги 3 і глікофорину А, В і С. Білок смуги 3 являє собою аніонний переносник, а функції гли-кофорінов, що відносяться до класу глікопротеїнів, невідомі. В електронному мікроскопі цитоскелет виглядає як упорядкована мережа на внутрішній стороні мембрани. Як видно з табл. 4.2, білки цитоскелету є основними мембранними компонентами, і це полегшує їх біохімічну характеристику. По суті білковий каркас складається з спектрин-актинового комплексу, який пов'язаний з плазматичною мембраною завдяки взаємодіям як з білком смуги 3, так і з глікофорину; ці взаємодії здійснюються за допомогою спеціальних білків - ан-

Таблиця 2. Властивості, ступінь асоціації і функції еритроцитарних мембранних білків

Кіріна і білка смуги 4.1. Основні компоненти були очищені до гомогенного стану і вивчені in . vitro. Комплекси між основними білками, такими, як білок смуги 3 і анкирин або анкирин і спектрин, характеризуються константами дисоціації порядку Ю ^-7 М, які можуть змінюватися у фізіологічних умовах. Фосфорилювання анкирина впливає на його афінність по відношенню до спектрин, а взаємодія між білком смуги 4.1 і глікофорину, мабуть, модулюється фосфатидилінозит-толамі.

Цікаво, що білки, близькоспоріднені компонентів цитоскелету еритроцитів, виявлені в ряді неерітроідних клітин. Великий інтерес до цитоскелету еритроцитів, цілком ймовірно, обумовлений тим, що дана система не є унікальною лише для цих клітин, а представлена ​​у вигляді кортикального цитоскелету і в клітинах іншого типу. Розглянемо властивості деяких цитоскелет-іих білків.

/ J объединены по схеме «конец-к-концу». 1. Спектрин. Це тетрамер типу м, в якому два гетероді-міра a / J об'єднані за схемою «кінець-к-кінця». Молекула може досягати в довжину 2000 А. Спектрин пов'язаний з анкірііом і білком смуги 3 по сайтах, розташованим на протилежних кінцях молекули. Крім того, спектрин пов'язаний з актином, можливо, в комплексі з білком смуги 4.1. Спектрінопо-

добние молекули, наприклад фодрін, виявлені в клітинах різного типу.

2. Актин. Це глобулярний білок, який існує у вигляді лінійних олігомерів, що містять по 12-18 молекул. Вони виглядають на електронних мікрофотографіях як короткі стрижні, до яких може бути прикріплено до шести спектрінових тетрамеров.

3. Анкирин. Це найбільш охарактеризований розчинний білок, що забезпечує взаємодії між інтегральними мембранними білками і цитоскелетом. Він має окремі домени, відповідальні за незалежну зв'язування зі спектрином і з цітоп-лазматіческім доменом білка смуги 3. Анкирин був виявлений і в неерітроідних клітинах.

4. Білок смуги 4.1. Він також належить до класу білків, що забезпечують зв'язок цитоскелета з мембраною. Білок смуги 4.1 пов'язується зі спектрином і актином, а також з глікофорину. Крім того, за певних умов він може зв'язуватися і з білком смуги 3. Білку смуги 4.1, мабуть, родинний сінапсін I, виявлений в мембрані синаптичних везикул.

5. Білок смуги 3. Це основний аніонний переносник в еритроцитах. -конце кислый участок, который связывается с некоторыми гликоли-тическими ферментами, а также с гемоглобином. Цитоплазматичний домен містить на N-кінці кислий ділянку, який зв'язується з деякими гліколі-тичні ферментами, а також з гемоглобіном. Цитоплазматичний домен не бере участь у транспорті аніонів. Його сегмент, розташований поблизу мембрани, зв'язується з Анкіри-ном і з білком смуги 4.2. На підставі аналізу амінокислотної послідовності було висловлено припущення, що білок смуги 3 має 12 трансмембранних сегментів, але отримані до теперішнього часу експериментальні дані не дозволяють ні підтвердити, ні спростувати це положення.

6. Глікофорину А. Це основний сіалосодержащій глікопротеїн; На відміну від білка смуги 3 він має відносно невеликий цитоплазматичний домен і один трансмембранний сегмент. Вважають, що цей білок зв'язується з білком смуги 4.1. Інші його функції невідомі.

Трансмембранний асиметрія ліпідів

Мембранні білки, перебуваючи в площині бішару, не змінюють Свою топологічну орієнтацію. Вони вбудовуються в мембрану в jCTporo певної орієнтації і залишаються в такому положенні протягом усього часу їх життя. Ліпіди ш ряді біологічних мембран, навпаки, з досить великою частотою мігрують з одного боку мембрани на іншу. Визначити швидкість трансмембранної міграції ліпідів дуже важливо з двох причин: це допомагає зрозуміти Природу ліпідної асиметрії і дозволяє критично оцінити придатність методів, використовуваних для знаходження розподілу ліпідів між двома сторонами бішару. Щоб вимірювання утримуючи-1кія, наприклад, фосфатидилсерин на зовнішній стороні мембранних везикул були достовірними, вони повинні бути завершені до того, як фосфатидилсерин з внутрішнього монослоя переміститься в зовнішній. Деякі методи встановлення ліпідної асиметрії модифікують саму досліджувану систему і індукують трансмембранну міграцію ліпідних молекул, тому отримані результати буває важко інтерпретувати. Детальна оцінка достоїнств і недоліків методів вивчення ліпідної асиметрії в мембранах дається, наприклад, в оглядах.

МЕТОДИ ВСТАНОВЛЕННЯ Трансмембранний РОЗПОДІЛУ ЛІПІДІВ

Хімічна модифікація фосфоліпідів

Відносно легко піддаються хімічній модифікації тільки амінофосфоліпіди, наприклад фосфатидилсерин і фосфат-ділетаноламін. При цьому мембранний препарат з відомою топологічної орієнтацією обробляють реагентом, який не проникає через бішар і ковалентно зв'язується з вільними аміногрупами тих амінофосфоліпідов, які знаходяться тільки на зовнішній поверхні мембрани. Найчастіше з цією метою використовують ТНБС. Частка фосфатидилетаноламін, що вступив у реакцію, повинна служити мірою його змісту на зовнішній стороні мембрани. Очевидно, проте, що такий висновок неправомочний, якщо реакція не доходить до кінця або якщо в ході реакції значну кількість фосфатидилетаноламін переміщається з боку мембрани на зовнішню і стає доступним для реагенту. Як правило, в реальній ситуації мають місце обидва обставини, що значно ускладнює інтерпретацію результатів.

-группам. Запропоновано варіант цього підходу, що передбачає синтез аналогів фосфоліпідів з реакційноздатними сульфгідрильних-ми групами з подальшим використанням непроникаючих реагентів, вибірково реагують по SH-групам. Природно, що ці ліпідні аналоги слід включати в досліджувані мембрани перед обробкою реагентами, і бажано попередньо дослідити їх поведінку в модельних системах.

Фосфоліпідний обмін

Спонтанний обмін фосфоліпідами між мембранами, як правило, протікає з пренебрежимо малою швидкістю. Проте були виділені білки, звані ліпідпереносящімі білками, які каталізують обмін. Ці білки найчастіше виділяють з тканин ссавців. Найбільш вивчений білок з печінки щура, який володіє абсолютною специфічністю по відношенню до фосфатидилхоліну і каталізує його обмін між мембранами. Більшість інших ліпідперенося-щих білків менш специфічні до полярних голівок ліпідних молекул. Це розчинні білки, які мають високоафінні місця зв'язування фосфоліпідних молекул. Механізм обміну невідомий, однак ЛПБ можна використовувати для вивчення ліпідної асиметрії, оскільки вони пов'язують ліпіди тільки зовнішньої поверхні бішару, з якими вони контактують. Зазвичай мембранні везикули інкубують з надлишком ліпосом, що містять радіоактивно мічений фосфолипид, у присутності ліпідперенося-ного білка. Фосфоліпідний обмін зі стехіометрією 1:1, який каталізується зазначеними білками, не призводить до зміни складу мембран, при цьому ступінь обмінності фосфоліпідів можна визначити, вимірявши питому радіоактивність мембрани. Якщо фосфолипид в мембрані повністю доступний для обміну, то його питома радіоактивність в ліпосоми і мембранах в кінці експерименту буде однаковою. Якщо ж досліджуваний ліпід на внутрішній стороні мембрани недоступний для обміну, то його питома радіоактивність в мембрані буде нижче, ніж в ліпосоми. Якщо трансмембранний міграція протікає повільніше, чим встановлюється рівновага при обміні, то питома радіоактивність буде зростати у часі, і це зростання буде відображати швидкість фліп-флопа. При проведенні цих експериментів необхідно відокремлювати ліпосоми від досліджуваних мембран; для цього зазвичай використовують центрифугування.

Гідність цієї методики полягає в тому, що ЛПБ не проникають через мембрану, недолік же пов'язаний з тим, що рівновага встановлюється повільно, за кілька годин або навіть більше. Тому дана методика застосовується, коли відбувається швидка трансмембранний міграція, але її можна використовувати в поєднанні з іншими методами. Наприклад, можна провести обмін радіоактивних ліпідів, що знаходяться на зовнішній поверхні бішару, а потім використовувати фосфоліпази для оцінки швидкості, з якою ці липи-ди мігрують з зовнішнього боку мембрани на внутрішню.

Фосфоліпази

Фосфоліпази - це ферменти, що гідролізують фосфоліпіди у зв'язках, вказаним на рис. 4.3. Фосфоліпази представляють собою

розчинні білки, які взаємодіють тільки з зовнішньою поверхнею бішару і тому є цінним інструментом для вивчення асиметрії фосфоліпідів і швидкості їх трансмембранної міграції. При роботі з фосфоліпазами слід мати на увазі два моменти: 1) не всі фосфоліпіди на зовнішній стороні мембрани легко вступають в реакцію, 2) продукти реакції зазвичай дестабілізують бішар. Навіть якщо при дії фосфоліпаз цілісність бішару не порушується, швидкість трансмембранної міграції фосфоліпідів може істотно зрости. Тому хід реакції необхідно ретельно контролювати, а висновки, зроблені на підставі отриманих результатів, - критично аналізувати.

Інші методи

Для встановлення трансмембранного розподілу ліпідів були запропоновані й інші спеціальні методи. Розглянемо деякі з них.

1. Розподіл кардіоліпіну можна визначити по специфічному зв'язуванню з ним адриамицина.

2. Розподіл гликолипидов можна визначити, окислюючи їх або галактозооксідазой, або перйодатом натрію з подальшим відновленням ³ Н-боргідридом натрію.

3. Розподіл стеролів можна визначити кількома методами. Стероли можуть мимоволі обмінюватися між мембранами навіть без участі особливих білків. Тому їхня присутність у зовнішньому монослое мембрани можна визначити по перенесенню в ліпосоми або з ліпосом. Розподіл холестеролу між двома сторонами мембрани встановлювали, вивчаючи кінетику утворення комплексу між ним і Філіппіни. Нарешті, для визначення вмісту холестеролу в зовнішньому монослое мембрани використовували холестеролоксідазу, однак виникають при цьому артефакти ставлять можливість застосування цього ферменту під сумнів.

ПРИКЛАДИ ЛІПІДНИЙ АСИМЕТРІЇ

Через експериментальних труднощів, пов'язаних з визначенням ліпідної асиметрії, можна навести лише кілька прикладів, в яких асиметрія безсумнівно доведена. Перш за все слід згадати еритроцити людини, які в цьому відношенні були, детально вивчені, причому всі використані методи дали добре узгоджуються між собою результати. Інший приклад такого роду - це висока ступінь асиметрії зовнішньої мембрани грамот від'ємних бактерій; втім, ця мембрана незвичайна в тому відношенні, що її основним компонентом є унікальний ліпо-полісахарид. Немає жодних сумнівів, що асиметричний розподіл ліпідів властиво й іншим біологічних мембран, однак переконливі дані отримані лише в небагатьох випадках.

Ліпідна асиметрія у фосфоліпіди везикулах

Для малих моноламеллярних везикул, що складаються з двох різних ліпідів, характерна асиметрична розподіл ліпідів. Наприклад, у везикулах, що складаються з суміші фосфатидилхоліну з іншими ліпідами, зовнішній моношар збагачений сфінгоміелін або фосфатіділгліцеролом, а фосфат-ділсерін, фосфатидилетаноламін, фосфатидилинозитол і фосфо-тідная кислота воліють перебувати на внутрішній поверхні. Загальновизнано, що в цих випадках ліпідна асиметрія виникає насамперед через відмінності в упаковці молекул на двох сторонах бішару ММВ. Ліпіди з більш об'ємними полярними головками прагнуть перебувати в зовнішньому монослое, тому що там більше площа поверхні, що припадає на молекулу. Проте біологічні мембрани, за окремими винятками, не мають ділянок з настільки великою кривизною, так що ці висновки не можна беззастережно поширити на будь-які біологічні мембрани. За допомогою трансмембранного градієнта рН ліпідну асиметрію можна індукувати і у великих моноламеллярних везикулах.

Ліпідна асиметрія в еритроцитах людини

Чітко показано, що розподіл ліпідів у мембрані еритроцитів у вищій мірі асиметрично. Як видно з рис. 4.4, фосфо-тіділхолін і сфінгоміелін знаходяться переважно в зовнішньому монослое, тоді як фосфатидилетаноламін і фосфатіділсе-рин - в основному у внутрішньому.

Є переконливі дані про те, що для збереження ліпідної асиметрії необхідна цілісність цитоскелету. Вона порушена в клітинах, дефіцитних по спектрин або білку смуги 4.1. Дії, що порушують цитоскелет, змінюють і ліпідну асиметрію, хоча неясно, чи є ці ефекти прямим наслідком пошкодження цитоскелету. Крім того, в малих везикулах, отриманих з мембрани еритроцитів, розподіл ліпідів менш асиметрично. Ці дані показують, що цитоскелет відіграє певну роль у підтриманні ліпідної асиметрії. Механізм такого впливу неясний, однак можна припустити, що має місце пряме зв'язування цітоске-льотних білків з амінофосфоліпідамі.

Пряма стабілізація асиметрії, якщо вона існує, - це тільки одна сторона питання. Так, екзогенні фосфоліпіди, включені в мембрану еритроцитів за допомогою обмінюють білків, приблизно через добу перерозподіляються, і їх асиметрія приймає такий же характер, як і в ендогенних ліпідів. На рис. 4.5 наведена схема цих експериментів. Вимірюючи кінетику гідролізу під дією фосфоліпаз, можна визначити швидкість фліп-флопа ліпідних молекул. Ця швидкість зростає в ряду фосфатидилсерин> фосфатидилетаноламін> фосфатидил-холін> сфіігоміеліі. Подібні результати були отримані за допомогою спін-мечеіних ліпідів і лізофосфоліпідов. Таким чином, ті ліпіди, які локалізуються на внутрішній стороні мембрани, мають і відносно велику швидкість транс-мембраііой міграції. Ті ж ліпіди, які знаходяться на зовнішній стороні, мігрують значно повільніше або взагалі не здійснюють фліп-флоп-перескоків.

Дуже важливим є висновок про те, що швидка трансмембранний міграція амінофосфоліпідов, мабуть, є АТР-залежної і значно сповільнюється в клітинах, дефіцитних по АТР. Це послужило підставою для припущення про те, що специфічний фліп-флоп ліпідів каталізується особливими ферментами типу транслоказ. На користь цього припущення з'являється все більше даних, правда, багато хто з них є непрямими.

Є два погляди на те, як підтримується ліпідна асиметрія в мембранах; вони взаємно доповнюють один одного і можуть бути в рівній мірі важливі. Один з них дає статичну картину з акцентом на стабілізацію асиметрії за рахунок специфічних взаємодій фосфоліпідів з цитоскелетного білками, тоді як інший представляє асиметрію як динамічний феномен, коли енергозалежні транслокази вибірково переносять ліпіди через бішар, підтримуючи їх стаціонарне асиметричне трансмембранне розподіл.

Ліпідна асиметрія зовнішньої мембрани бактеріальних клітин

Зовнішня мембрана грамнегативних бактерій на відміну від мембрани еритроцитів не може служити моделлю інших бактеріальних мембран. Це пов'язано з тим, що міститься в ній ліпо-полісахарид є у своєму роді унікальним мембранним компонентом. Детальні дослідження показали, що ця мембрана являє собою високоасімметрічную структуру. Зазначений ліпополісахарид був виявлений тільки на зовнішній стороні бішару, а більша частина фосфоліпідів локалізована у внутрішньому монослое, зверненому в периплазмі. Ліпополісахариди грає важливу роль як бар'єр для проникнення всередину клітини деяких речовин; зокрема, саме завдяки йому бактерії набувають стійкості до ряду антибіотиків. Одним з основних компонентів зовнішньої мембрани явлется так званий ліпопротеїн Брауна, який закріплений в мембрані з допомогою ковалентно пов'язаних з ним ліпідів, а крім того, пов'язаний з пептідоглікановой стінкою за рахунок ковалентних і нековалентних взаємодій.

Трансмембранний МІГРАЦІЯ ЛІПІДІВ

Біосинтез фосфоліпідів та збирання мембрани протікають асиметрично. Активні центри ферментів біосинтезу фосфоліпідів локалізовані на одній, а не на двох сторонах мембрани. Наприклад, фосфоліпіди синтезуються і впроваджуються в мембрану на цитоплазматичній стороні ендоплазматичного ре-тікулума печінки щура і на внутрішній стороні бактеріальної цитоплазматичної мембрани. Ясно, що ці ліпіди повинні перетнути мембрану, щоб досягти протилежного боку бішару.

Швидкість трансмембранної міграції фосфоліпідів у фосфолі-ліпідних везикулах пренебрежимо мала: її характерний час становить декілька діб. Фліп-флоп-перехід може прискорюватися у присутності таких інтегральних мембранних білків, як глікофорину, або при збуреннях в бішарі відбуваються, наприклад, при обробці фосфоліпазами. Як і слід очікувати, переміщення ліпідних молекул ускладнюють саме полярні головки, оскільки похідні диацилглицерол дуже швидко мігрують через бішар. Для деяких біологічних мембран, наприклад мембрани вірусу грипу і внутрішньої мембрани мітохондрій, також характерна дуже мала швидкість трансмембранної міграції фосфоліпідів.

Проте є мембрани, в яких міграція ліпідів протікає дуже швидко, з порядку декількох хвилин. . Такі дані отримані для ендоплазматичного ретикулуму печінки щура, а також для цитоплазматичної мембрани грамположітель-них бактерій В. megaterium. У цих мембранах відбувається синтез ліпідів, і в них, мабуть, присутні спеціальні транслокази, які забезпечують швидку трансмембранну міграцію ліпідних молекул. Таке припущення було висловлено щодо ендоплазматичного ретикулума, але воно поки що не знайшло експериментального підтвердження. Характерне час трансмембранної міграції ліпідів у мембрані еритроцитів має проміжне значення і складає величини порядку декількох годин в залежності від структури досліджуваного ліпіду. Такі ж результати були отримані при вимірюванні швидкості фліп-флопа спін-мічених аналогів фосфоліпідів і екзогенних Лизо-фосфоліпідів. Було встановлено, що швидкість міграції зростає при порушеннях цитоскелету, а також під дією агентів, які впливають на структуру ліпідів бішару. Можливо, цитоскелет відіграє певну роль у зменшенні швидкості міграції ліпідів через бішар завдяки зв'язуванню амінофосфоліпідов. Характерно, що ні ендоплазматичний ретикулум, ні бактеріальна ци-топлазматіческая мембрана, для яких характерна висока швидкість фліп-флопа ліпідів, не пов'язані з цитоскелетом.

Той факт, що швидкість трансмембранної міграції ліпідів в еритроцитах є АТР-залежної, передбачає присутність у цій мембрані енергозалежною транслокази. АТР-залежна трансмембранний міграція амінофосфоліпідов спостерігається також у плазматичної мембрани фібробластів і лімфоцитів. Однак жодна з фосфоліпідних транслоказ до цих пір не виділена, тому можливість існування таких ферментів та їх потенційна роль у підтримці ліпідної асиметрії або в біогенезу мембран представляються ймовірними, але не більше того.

Латеральна гетерогенність мембран

Вихідна рідинно-мозаїчна модель передбачає, що розподіл білкових і ліпідних компонентів у площині бішару є гомогенним. Однак не викликає сумнівів, що в ряді мембран існують домени або області, що відрізняються за складом від іншої частини мембрани внаслідок обмежень в дифузійному обміні їх компонентів. Є різні види мембранних доменів, про які можна говорити в рамках рідина-но-мозаїчної моделі, вводячи певні обмеження, які накладаються додатковими стабілізуючими ці домени взаємодіями.

1. Макроскопічні домени, як правило, являють собою великі ділянки на поверхні клітини з характерною морфологією і чіткими кордонами. Прикладами є апикальная і базолатеральіая області поляризованих епітеліальних клітин. У тилакоїди дотичні і несоприкасающихся ділянки фото-сінтезіруюшіх мембран теж мають різний склад і, мабуть, стабілізуються міжмембранні взаємодіями в стопках.

2. Агрегація білків в площині мембрани може призводити до утворення досить великих острівців, або доменів, які збагачені певним білком і знаходяться в суміші з будь-якими іншими компонентами. , содержащие бактериородопсин, или щелевые контакты, содержащие коннексин. Прикладами є пурпурні мембрани Н. halobium, що містять бактеріородопсин, або щілинні контакти, які містять коннексін.

3. Домени, що формуються за участю цитоскелету, в принципі можуть утворитися шляхом асоціації певних мембранних білків за рахунок їх взаємодії з внутрішньоклітинними білками. В основі такої латеральної організації мембранних білків могли б лежати особливості взаємодій, які спостерігаються в разі цитоскелету еритроцитів. Поки чіткі приклади існування таких доменів відсутні, однак можна припустити, що петчінг і кеппінг антигенів на клітинній поверхні здійснюються саме за участю цитоскелету і що концентрування специфічних рецепторів у облямованих ямках плазматичної мембрани перед Ен-доцітозом здійснюється завдяки їхній взаємодії з компонентами цитоскелету або з клатріном.

4. Ліпідні мікродомени можуть бути термодинамічно стабільні як в біологічних мембранах, так і в модельних ліпід-них системах. Про це свідчать численні непрямі дані, хоча чіткі докази існування таких доменів поки що немає.

Наведена класифікація доменів умовна; зазначені чотири категорії аж ніяк не виключають один одного при розгляді способів стабілізації латеральної гетерогенності мембран.

Макроскопічно ДОМЕНИ І БАР'ЄРИ У плазматичної мембрани

Плазматична мембрана клітин часто буває розділена на окремі домени, які можна навіть виділити і охарактеризуйте-

вати. Як правило, ці домени розділені бар'єрами, які перешкоджають переходу білків і, можливо, ліпідів з одного домену в іншій. У межах же областей, обмежених цими бар'єрами, білки і ліпіди дифундують вільно. На рис. 4.7 наведено кілька прикладів таких доменів.

1. Апикальная і базолатеральную області мембрани поляризованих епітеліальних клітин мають різний склад. Показано, наприклад, що гангліозид не перетинають кордон між цими областями, яка в даному випадку представляє собою область щільних контактів між клітинами.

2. Плазматична мембрана сперміїв складається з чітко розмежованих ділянок різного складу, які можна розділити. Кордон між доменами перешкоджає вільній дифузії мембранних білків.

3. З'єднувальний відросток на паличці сітківки поділяє її зовнішній і внутрішній сегменти. Родопсин початково включається в мембрану внутрішнього сегмента, а потім концентрується в мембрані зовнішнього сегмента. Ймовірно, в мембрані палички існує дифузійний бар'єр, що підтримує цю різницю концентрацій.

4. Натрієві і калієві канали локалізовані в різних областях мембрани міелінізірованние аксона. Можливо, така організація стабілізується завдяки контактування мембрани з гліальіимі або шванівськими клітинами, які утворюють миелиновую оболонку навколо нервового волокна.

Слід зазначити, що макроскопічна латеральна гетерогенність може бути характерна і для мембран прокаріотів клітин. Наприклад, в мембранах грамнегативних бактерій є області адгезії, в яких, мабуть, здійснюється контакт між зовнішньою і внутрішньою мембранами. У пурпурних несерних фотосинтезуючих бактерій фотосинтетичний апарат локалізований в спеціалізованих мембранах, що утворюються в результаті інвагінації цитоплазматичної мембрани.

Експериментальні дослідження в цій області утруднені, тому про природу бар'єрів, що розділяють різні мембранні домени, відомо дуже мало.

Тилакоїдних МЕМБРАНИ

Мембрани тилакоїдів в хлоропластах вищих рослин містять фотосинтетичний апарат. Ці мембрани зібрані в стопки, так звані грани. Дотичні та несоприкасающихся-

щиеся ділянки мембрани тилакоїдів мають різну морфологію, і їх можна розділити. Відомо також, що ці дві області мембрани мають різний склад, ймовірно що стабілізується завдяки взаємодіям між мембранами. Одним з факторів стабілізації мембран в стопках є пряме зв'язування світлозбиральних комплексів один з одним в стичних мембранах. Важливу роль в стабілізації стопок можуть грати і електростатичні взаємодії. Деталі цих взаємодій багато в чому неясні, проте очевидно, що вони якимось чином призводять до функціонально значущого латерального поділу компонентів. Наприклад, дві фотосистеми, I і II, які є компонентами електронтранс-кравець ланцюга, розташовані в різних мембранних доменах, але пов'язані біохімічно за допомогою диффундирующего пластохинона. Розподіл Світлозбиральні комплексу між цими двома доменами залежить від ступеня його фосфорилювання.

Вірусів з оболонкою

Віруси з оболонкою мають нуклеокапсид, оточений ліпідного бішару. Останній відбувається від мембрани клітини-хазяїна і утворюється при брунькування вірусу. Вірус саркоми Рауса і вірус везикулярного стоматиту відгалужуються від плазматичної мембрани клітини-хазяїна в середу, а інші віруси вивільняються у внутрішні компартменти клітини, наприклад в апарат Гольджі або ендоплазматичний ретикулум. Ці віруси дуже корисні як моделі для вивчення мембранного біогенезу і внутрішньоклітинного мембранного транспорту. Крім того, вони становлять інтерес і з точки зору вивчення утворення доменів у мембранах. Як показано на рис. 4.9, процес отпочковиванія включає взаємодію мембрани з нуклеокапсидом і трансмембранних білків шіловідние виростів вірусу. Глікопротеїни цих виростів впроваджуються в плазматичну мембрану клітини-господаря і за допомогою своїх цитоплазматичних доменів взаємодіють з білками вірусного матриксу, які пов'язані з вірусною нуклеокапсидом. У процесі отпочковиванія концентрація білків шіловідние вірусів в зростаючій нирці збільшується, а білки плазматичної мембрани клітини-хазяїна повністю з неї виключаються. Сформована вірусна оболонка містить тільки білки шіловідние виростів і зовсім не містить білків клітини-господаря. Передбачається, що саме взаємодія між матриксних білками і білками виростів обумовлює латеральне поділ компонентів, що відбувається в плазматичної мембрани. Цікаво, чи що-ліпідних складу вірусної оболонки не збігається зі складом плазматичної мембрани клітини-хазяїна. Простіше за все пояснити

це переважними взаємодіями між глікопротеїнами шіловідние виростів і певними ліпідними компонентами. Ця модельна система виявиться корисною і для подальших досліджень латеральної гетерогенності в мембранах.

ЛІПІДНИЙ МІКРОДОМЕНИ

При відповідних умовах ліпіди піддаються латерального фазовому поділу з утворенням стабільних ламеллярной доменів. Такий поділ можна індукувати зміною температури, тиску або іонної сили або додаванням двовалентних катіонів або білків. Питання про те, чи існують мікродомени, подібні спостерігаються в модельних ліпідних системах, також і в біологічних мембранах, завжди викликав великий інтерес У дослідників. Отримані результати не є абсолютно переконливими, оскільки ліпідні домени не вдається виділити і охарактеризувати, як у випадку латеральної гетерогенності, розглянутої вище. Звичайно, найкраще було б провести фрагментацію мембрани і проілюструвати відмінності у розподілі компонентів у виділених мембранних фракціях. Для виявлення латеральної гетерогенності біологічних мембран часто використовують електронну мікроскопію. Про таку гетерогенності можна судити також за даними біофізичних методів, якщо отриманий від зразка сигнал свідчить про наявність різних мембранних популяцій, а не однієї гомогенної популяції. Як приклад можна навести вимірювання коефіцієнта дифузії флуоресцентних аналогів ліпідів у протопластах сої. Про мікрогетерогенності мембран іноді можна судити з поведінки ферментів, якщо ферментативна активність не відповідає усередненим фізичному стану ліпідної фази по всій масі мембрани. Часто ці методи свідчать про наявність у мембрані областей з різною плинністю ліпідів, що вказує на співіснування фази гелю та рідкокристалічний фази. Такі висновки були зроблені в ряді досліджень, де різні обурення, викликані присутністю цис-і транс-ненасичених жирних кислот, пояснювалися їх різним розподілом між доменами, що знаходяться в рідкокристалічному стані і в фазі гелю.

Всі ці дослідження узгоджуються з припущенням про наявність в біологічних мембранах мікродоменов, але в більшості випадків таке пояснення не є єдино можливим або безсумнівним. Тим не менш ідея про існування ліпідних мікродоменов дуже приваблива. Адже завдяки їм ферменти в одній і тій же мембрані можуть перебувати в різному оточенні, і їхня активність може регулюватися за рахунок специфічних взаємодій з ліпідами або іншими білками. Крім того, на кордонах між доменами можуть виявлятися «дефекти» упаковки ліпідного бішару. Як вважають, такі кордони з різкою зміною упаковки ліпідів у ряді випадків мають вирішальний вплив на функції бішару. Дослідження модельних ліпідних систем показали, що при фазовому переході, коли співіснують фаза гелю і рідкокристалічна фаза, пасивний транспорт як гідрофобних, так і гідрофільних речовин прискорюється в кілька разів у порівнянні з рідкою фазою. Мабуть, в областях бішару з дефектами упаковки, де стисливість ліпідів висока, можуть утворюватися пори. Завдяки наявності дефектів у прикордонних областях бішару може прискорюватися фліп-флоп фосфоліпідів, зростати їх доступність для фосфоліпаз, а також посилюватися тенденція ліпідних везикул до злиття.

Ідея ліпідних мікродоменов в мембранах дуже приваблива, оскільки вона дозволяє легко пояснити багато фактів, але вона все ще потребує підтвердження.

Резюме

Безліч фактів свідчить про гетерогенність біологічних мембран як в поздовжньому, так і в поперечному напрямках. Трансмембранний асиметрія означає, що різні половини бішару мають різний склад. Встановлено, що інтегральні мембранні білки вбудовані в мембрану асиметрично і ця асиметрія стабільна. Таким чином, до цитоплазматичної і зовнішньої поверхонь мембрани звернені різні білкові домени. Отримано безліч даних про те, що зовсім різним може бути і фосфоліпідний склад двох половин бішару. Як створюється ця ліпідна асиметрія і за рахунок чого вона підтримується - поки неясно, хоча є дані про існування АТР-залежних транслоказ, які прискорюють перенесення ліпідів через бішар. Іншими факторами, що визначають асиметрію мембран тваринних клітин, є взаємодії ліпідів з цитоскелетом і з позаклітинним матриксом иа її поверхні.

Є дані і про латеральної гетерогенності біологічних мембран. Це можуть бути досить великі спеціалізовані ділянки мембрани, наприклад апикальная або базолатеральную області плазматичної мембрани поляризованих епітеліальних клітин. Прикладом того, як в межах однієї мембрани сусідять ділянки з різним складом та функціями, можуть служити менш протяжні дотичні і несоприкасающихся ділянки тила-коідной мембрани. Все це показує, що молекулярна організація мембран набагато складніше, ніж це випливає з рідинно-мозаїчний-ної моделі, спочатку запропонованої Сінгером і Ніколсоном.