1. Зв'язок проблем фармацевтичної хімії з фармакокінетикою та фармакодинамікою
До кінця 50-х - початку 60-х рр.. XX ст. було звернуто увагу на залежність фармакологічної активності від таких фізичних факторів, як ступінь подрібнення і явище поліморфізму, а також від технологічних процесів одержання ЛЗ. Виникло своєрідне протиріччя між існуючими нормами оцінки якості та фактичним дією ЛЗ. Останні за результатами аналітичного контролю відповідали однаковою мірою вимогам фармакопеї (ФС), але розрізнялися по фармакологічному ефекту. Так виникло поняття про терапевтичну нееквівалентності ЛЗ. Воно означає, що одні й ті ж ЛФ, що містять однакові кількості ЛВ, але виготовлені різними способами, надають неоднаковий терапевтичний ефект. Встановити причину такого явища можна лише проведенням біофармацевтичних та фармакокінетичних досліджень.
Сформульовані до цього часу основні принципи встановлення кількісних співвідношень між хімічною структурою та фармакологічною активністю можна представити у вигляді трьох основних стадій. Перша - біофармацевтичних - включає дослідження вихідного біологічно активної речовини і створення на його основі готової лікарської форми. Друга стадія - фармакокінетична - включає дослідження таких відбуваються в організмі кінетичних процесів, як всмоктування, розподіл, зв'язування з білками, біотрансформація і виведення (екскреція) ЛВ. Ці процеси вивчаються у зіставленні з фармакологічним або токсичною дією цих речовин на організм. Третя стадія - фармакодинамічна - включає дослідження взаємодії ЛВ з рецептором і вплив на регуляторні системи. Тільки на цій стадії в повній мірі проявляються і є специфічною взаємозв'язок хімічної структури ЛВ і його фармакологічного ефекту. Отже, біологічна активність ліків пояснюється послідовно відбуваються трьома фазами: біофармацевтичної, фармакокінетичною та фармакодинамічною.
Вивчення механізму якісних і кількісних змін ЛВ в органах та біологічних рідинах організму входить у завдання фармакокінетики. На фармакокінетику Л В впливають різні чинники: вікові, генетичні, статеві, маса тіла, харчування, вагітність, а також різні патологічні процеси, наприклад захворювання печінки, нирок, серцево-судинної системи, шлунково-кишкового тракту, ендокринні, інфекційні та інші захворювання .
Проведення фармакокінетичних випробувань здійснюється на стику декількох наук і вимагає участі різних фахівців: лікаря-клініциста, лікаря-лаборанта, біохіміка, провізора-аналітика, мікробіолога, а в ряді більш складних випадків також біофізика, математика, програміста.
Дослідження в області фармакокінетики проводяться на тварин у період предклініческіх випробувань, під час клінічних випробувань, при розробці технології виробництва і контролю якості ЛФ, а також тривають після впровадження ЛЗ в медичну практику.
Проведення фармакокінетичних досліджень можливе тільки на основі застосування сучасних методів біофармацевтичної аналізу, що дозволяють простежити процес всмоктування та розподілу ЛВ в органах і тканинах. Вони включають з'ясування впливу різних біофармацевтичних чинників на терапевтичну ефективність Л В; вивчення їх біологічної доступності та розробку методів її визначення; створення способів визначення ЛВ та їх метаболітів у біологічних рідинах. Основним фармакокінетичним параметром є тривалість досягнення і збереження максимального рівня концентрації лікарської речовини в крові, а також швидкість і характер її зниження. Це обумовлено наявністю кореляції між терапевтичним ефектом і тривалістю циркуляції ЛВ в плазмі крові.
Виконання фармакокінетичних досліджень веде до накопичення відомостей про кількісній оцінці ряду кінетичних параметрів у людей. Так, наприклад, є численні дані про зв'язуванні більшості застосовуваних у медицині ЛВ з білками плазми, біодоступності при прийомі всередину, виділення незміненого ЛВ з сечею (у відсотках до дозі), а також про терапевтичних концентраціях у плазмі крові (мкг / мл) і періоді напіввиведення з плазми крові (в годинах) у нормі, при нирковій та печінковій недостатності, у людей різного віку.
Ці дані дають можливість орієнтуватися в розумінні механізму дії, прогнозування хімічної структури ЛВ, обумовлює спрямовану дію. Інакше кажучи, результати фармакокінетичних досліджень суттєво доповнюють дані про зв'язок між хімічною структурою та фармакологічною активністю ЛВ.
Ефективність впливу ЛВ знаходиться в залежності від шляхів його введення в організм.
Процес надходження лікарської речовини з місця введення в кров позначають терміном «всмоктування». Цей процес відбувається при всіх шляхах введення ЛЗ, за винятком внутрішньовенного і внутрішньоартеріального. Всмоктування залежить від шляху введення і розчинності ЛВ, а також від кровотоку в місці введення. При проходженні через слизові оболонки всмоктування визначається розчинністю в ліпідах, рН середовища в шлунку і в кишечнику, іонізацією, активністю їх транспорту, швидкістю абсорбції в різних відділах шлунково-кишкового тракту. Значним перетворенням піддаються ЛВ під впливом ферментів шлунково-кишкового тракту і печінки, що викликають утворення різних метаболітів. На швидкість і повноту всмоктування ЛВ впливають моторика шлунково-кишкового тракту, обсяг і склад їжі, інтервал часу між їжею і прийомом ЛЗ, вплив їжі на секрецію шлункового соку, об'єм рідини, що приймається разом з ЛЗ.
Потрапивши в системний кровотік, ЛВ розподіляється по тканинах організму. Цей процес носить назву розподілу. Він залежить від безлічі різних факторів, найбільш важливими з яких є розчинність в ліпідах, ступінь зв'язування з білками плазми крові, інтенсивність кровотоку. Розчинні в ліпідах ЛВ швидко поширюються по всьому організму. Багато ЛВ через великий фізико-хімічної спорідненості до білків плазми крові (особливо до альбуміну) зв'язуються ними (іноді на 90%) і обмежують їх концентрацію в тканинах у місці дії. Утворені комплекси з білком позбавлені фармакологічної активності. Найбільша інтенсивність системного кровотоку спостерігається в тих органах і тканинах, які активно перфузируется кров'ю, - у серці, печінці, нирках. Значно повільніше насичуються ЛВ м'язи, слизові оболонки, шкіра, жирова тканина. Для досягнення терапевтичної концентрації в цих тканинах необхідно нерідко кілька годин. Важливим фактором, що визначає розподіл ЛВ, є також швидкість його дифузії в різні тканини.
Таким чином, всмоктування і розподіл лікарського засобу залежать не тільки від шляхів введення, а й від багатьох інших факторів, обумовлених як фізико-хімічними властивостями Л В, так і фізіологічними процесами, що відбуваються в організмі.
2. Фармакокінетичні параметри
Кількісно характеризують процеси, що відбуваються з ЛВ в організмі, основні фармакокінетичні параметри, які відображають зв'язок між концентрацією ЛВ в біологічних рідинах і його фармакологічною дією.
Константа швидкості всмоктування - параметр, що відображає швидкість надходження (ч, хв) ЛВ з місця введення в системний кровотік. Використовують цей параметр при всіх шляхах введення, крім внутрішньовенного і внутрішньоартеріального.
Константа швидкості елімінації (ч, хв -1) характеризує швидкість видалення (елімінації) ЛВ з організму шляхом екскреції або біотрансформації.
Константа швидкості екскреції характеризує швидкість виділення ЛВ (ч -1, хв -1) з сечею, слиною, калом, молоком або іншими екскрету.
Важливим фактором, що впливає на терапевтичний ефект, є зміст Л В в організмі. Воно залежить від тривалості виведення або елімінації з організму. Показником виділення є кліренс (мл / хв). Загальний кліренс - це обсяг плазми або крові, з якого за одиницю часу ЛВ виводиться нирками, печінкою, легенями або біотрансформується в організмі. Параметр, що визначає швидкість очищення організму від лікарської речовини нирками, носить назву нирковий кліренс, а іншими шляхами - позаниркових кліренс. Кліренс в клінічній практиці використовують для розрахунку терапевтичної або підтримуючої дози ЛВ в крові.
Обсяг розподілу лікарської речовини - це гіпотетичний обсяг рідин організму, який необхідний для рівномірного розподілу всієї кількості ЛВ в тій же концентрації, в якій він міститься в плазмі крові. Цей показник знаходиться в залежності від статі, віку, загальної маси жирів в організмі хворого. Розподіл ЛВ залежить від таких його фізико-хімічних властивостей, як розчинність в воді і в ліпідах, молекулярна маса, полярність, рівень іонізації. Обсяг розподілу використовують для розрахунку дози ЛВ, необхідної для досягнення потрібної концентрації його в крові.
Про виведення ЛВ з організму судять за періодом підлогу біля ви веден ия, або напівелімінації. Під ним розуміють час, протягом якого відбувається зниження на 50% концентрації ЛВ в порівнянні з введеним кількістю. За один період напівелімінації з організму виводиться 50%, за два періоди - 75%, за три періоди - 90% ЛВ.
Рівноважна концентрація - це стан, при якому кількості вводиться і адсорбуються ЛВ рівні між собою. Тому при рівноважній концентрації зміст ЛВ в організмі коливається між максимальними і мінімальними його значеннями. Це відповідає оптимальному прояву клінічного ефекту.
Період напівабсорбції (напіввиведення) - час (год, хв), необхідне для всмоктування ЛВ з місця введення (крім внутрішньосудинного) в системний кровотік половини введеної дози.
Період напіврозподілу (ч, хв) - умовний параметр, що характеризує розподіл ЛВ між центральною камерою (плазма крові) і периферичної камерою (органи, тканини).
Площа під фармакокінетичною кривою - площу фігури, обмеженої на графіку фармакокінетичною кривою і осями координат, одна з яких позначає концентрацію ЛВ в плазмі крові (мкг / мл), а інша - час після введення ЛВ (хв).
2.1 Основи фармакодинаміки
Різноманітні зміни, які відбуваються в організмі під впливом Л В, називаються фармакодинамікою.
Первинна фармакологічна реакція супроводжується процесом перенесення протонів і електронів з однієї речовини на інше. Це здійснюється за рахунок різних типів хімічних зв'язків. Найбільш часто зустрічається ванн дер-Ваальса тип зв'язку. Такі зв'язки виникають між двома функціональними групами, одна з яких входить до складу молекули ЛВ, а інша - в біологічну молекулу. Ван-дер-ваальсові зв'язку виникають у тих випадках, коли молекули знаходяться на близькій відстані один від одного, що не перевищує 0,2 нм, а енергія зв'язку становить 0,836-4,18 кДж / моль.
Найбільш важливе значення в дії ЛВ мають водневі зв'язки (-ОН ... О-) з енергією-8 ,4-21 кДж / моль. Водневий зв'язок з'являється тільки в тому випадку, якщо атом, що бере участь у її освіті, розташовується на відстані не більше 0,3 нм. Атом водню може пов'язувати атоми сірки, кисню, азоту, галогенів.
Між іонами, що мають різнойменні заряди, виникають іонні зв'язки. Можливості для їх утворення в організмі практично безмежні через наявність великої кількості іонів у біологічних середовищах. Енергія іонних зв'язків становить -21-42 кДж / моль, але тривалість їх існування в організмі дуже нетривала і не перевищує 10 ~ 5 с.
Чималу роль у фармакологічних реакціях відіграє йон-дипольна зв'язок, що має енергію порядку -8,4-21 кДж / моль. Такий зв'язок орієнтує молекули ЛВ щодо відповідної функціональної групи ферменту або рецептора. Можливі також диполь-дипольні зв'язку, які беруть участь у фіксації ЛВ на функціональній групі рецептора. Їх енергія дорівнює -4,2-12,5 кДж / моль.
Найбільш міцної є ковалентний зв'язок. Вона утворюється між двома атомами за рахунок загальної пари електронів і має енергію 42-627 кДж / моль.
Таким чином, основою первинного взаємодії між Л В і тканинами організму є процес, що супроводжується утворенням ван-дер-ваальсових, водневих, іонних, дипольних зв'язків. Передбачається, що ЛВ притягується рецептором, потім відбувається орієнтація її молекули і, нарешті, фіксація молекули на рецепторному полі. Отже, специфічний відповідь клітини органа або організму в цілому відбувається після адсорбції ЛВ на рецепторі.
Біофармацевтичні та фармакокінетичні дослідження дозволяють вирішити ряд практичних завдань, наприклад дати рекомендації щодо зміни фізичних чи хімічних властивостей Л В для підвищення їх фармакологічної активності; обгрунтувати оптимальний вибір біофармацевтичних факторів при виробництві тих чи інших ЛФ. Практичне значення мають і такі рекомендації, як уточнення показань і протипоказань, встановлення раціональних терапевтичних доз і періодичності їх прийому протягом доби, визначення оптимальних шляхів запровадження ЛЗ в організм, розробка науково обгрунтованих схем лікування тих чи інших захворювань.
3. Поняття про біофармацевтичні факторах
ЛЗ представляють собою складні хімічні системи, які вступають у певні взаємодії з біологічними системами організму. На цей процес суттєво впливають самі різні чинники, відомі під назвою біофармацевтичних факторів. Найбільш істотними з них є поліморфізм, ступінь дисперсності, фізичні і хімічні властивості допоміжних речовин, що використовуються при виготовленні лікарських форм.
Фармакологічна дія кристалічних речовин залежить від освіти поліморфних форм. Поліморфізм - здатність речовини однієї і тієї ж хімічної структури кристалізуватися в різних формах, тобто змінювати свою сингонії в залежності від термодинамічних умов. Одне і те ж речовина при відповідних умовах може утворювати кілька поліморфних структур, що відрізняються один від одного фізичними та фізико-хімічними властивостями. Вони можуть відрізнятися по щільності, питомої теплоємності, провідності, оптичним та іншим констант. Встановити наявність таких модифікацій можна по розчинності, температури плавлення, а також за допомогою фізико-хімічних методів (ІЧ-, ЯМР-спектроскопія).
Ступінь дисперсності дуже впливає на процес всмоктування і терапевтичну активність. Як правило, остання зростає зменшенням розміру диспергованих частинок ЛВ. Зменшення в 30 разів (у порівнянні з прийнятим ГФ) розміру часток кислоти ацетилсаліцилової посилює вдвічі її дію на організм. Якщо піддати дуже тонкому подрібненню сульфаніламідні препарати, деякі препарати гормонів, то адекватна терапевтична активність при їх застосуванні досягається вдвічі меншими дозами. У деяких випадках, наприклад при застосуванні похідних нітрофурану, ЛВ слід призначати у вигляді великих кристалів, щоб зменшити подразнюючу дію на слизові шлунково-кишкового тракту.
Біофармацевтичні дослідження дуже важливі для оцінки ролі фізичних і хімічних властивостей допоміжних речовин, що використовуються для приготування ЛФ. Допоміжні речовини далеко не індиферентні в хімічному і фармакологічному відношенні. Вони можуть знижувати фармакологічну активність ЛВ, підвищувати її і навіть змінювати характер фармакологічної дії під впливом різних фізичних і хімічних процесів.
4. Способи встановлення біологічної доступності лікарських засобів
Біологічна доступність - це ступінь всмоктування JIB з місця введення в системний кровотік і швидкість, з якою цей процес відбувається. Таке поняття визнано ВООЗ.
Терапевтичний ефект залежить від того, яка частина введеного JIB потрапить в системний кровотік і потім буде доставлена в ті тканини або органи, в яких здійснюється його специфічну дію. Цей показник характеризує біологічну доступність. При внутрішньовенному введенні вона дорівнює 100%, при всіх інших способах застосування - завжди нижче 100%. Це викликано тим, що, перш ніж потрапити в кровотік, JIB повинно пройти цілий ряд біологічних мембран клітин слизової шлунка, печінки, м'язів і т.д.
На біодоступність впливають біофармацевтичні чинники, зокрема лікарська форма, шляхи її введення, індивідуальні особливості організму людини, фізіологічне і патологічний стан шлунково-кишкового тракту, серцево-судинної системи, печінки, нирок та ін
Біодоступність вивчають шляхом порівняльного дослідження змін концентрацій JIB в плазмі крові або в сечі після введення випробуваної і стандартною ЛФ. Оскільки внутрішньовенне введення забезпечує 100%-ную біодоступність, можна встановити абсолютну біодоступність, тобто частку всмоктався в організм ЛВ, введеного різними шляхами, по відношенню до його кількості після внутрішньовенного введення. Значно частіше визначають відносну біодоступність, яка відображає порівняльну оцінку всмоктування одного і того ж ЛВ з випробуваної і стандартною ЛФ. Визначення ведуть за змістом ЛВ в крові або в сечі після одноразового або багаторазового введення.
Терапевтична нееквівалентність ЛВ (ЛФ), виготовлених за різними технологіями (або різними фірмами), залежить від різної їх біодоступності. У зв'язку з цим існує поняття біоеквівалентності лікарських речовин. Біоеквівалентність встановлюють за такими трьома параметрами, як максимум концентрації ЛВ в крові, час досягнення максимальної концентрації та площа під кривою зміни концентрації ЛВ в плазмі або сироватці крові, виміряна в часі. Біоеквівалентними називають такі ЛВ, які забезпечують однакову концентрацію в крові і тканинах організму. Нерідкі випадки, коли аналогічні ЛВ біологічно нееквівалентні, оскільки мають різну біодоступність. Тому при оцінці біоеквівалентності слід враховувати найважливіші параметри біодоступності ЛВ. Іншими словами, оптимізація лікарської форми повинна здійснюватися з точки зору забезпечення максимально можливою для даного ЛВ ступеня біодоступності.
Біологічну доступність ЛЗ можна встановити трьома різними шляхами: методами in vitro за допомогою приладів; методами in vivo на тваринах або у здорових людей-добровольців. Встановлення біологічної доступності методами in vitro засноване на кореляційної залежності між швидкістю всмоктування і швидкістю розчинення ЛВ. Тому для розчинних речовин метод визначення швидкості розчинення служить основним методом визначення ефективності вивільнення ЛВ з ЛФ.
Принцип дії створених для цього численних приладів полягає в механічному руйнуванні ЛФ і дифузії ЛВ у воду або іншу розчинювальну середу, що імітує біологічну рідину. У міру вивільнення або після повного вивільнення ЛВ розчинювальну рідина видаляють з приладу. Отримані проби піддають аналізу, використовуючи хімічні або фізико-хімічні методи. Аналітичний контроль - найважливіший етап випробування. Лікарська форма визнається вимогам швидкості вивільнення, якщо протягом встановленого інтервалу часу з неї переходить в розчинювальну рідина оптимальну кількість ЛВ. Слід зазначити, що вивчення кінетики вивільнення лікарської речовини in vitro в модельних умовах не може замінити дослідження in vivo. Викликано це розходженням у механізмах процесів. Так, при всмоктуванні in vivo слідом за стадією розчинення ЛВ слід стадія проникнення через стінки шлунка та кишечника. У той же час в умовах in vitro моделюється лише стадія розчинення.
Біологічна доступність методами in vivo встановлюється на лабораторних тваринах (кролях, собаках і ін.) При цьому або визначають зміст ЛВ (метаболітів) у крові, або встановлюють швидкість їх виведення з сечею через певні проміжки часу. Найважливіший етап цих випробувань - кількісний аналіз. Він ускладнюється в порівнянні з методами in vitro, оскільки доводиться аналізувати складну суміш, що включає не тільки ЛВ або їх метаболіти, а й різні сполуки, що входять до складу біологічних рідин.
Для характеристики біодоступності широко застосовують спосіб, заснований на оцінці максимальної концентрації ЛВ в крові після введення всередину досліджуваної ЛФ. Такий спосіб є дуже приблизними, так як біодоступність зави сит не тільки від ступеня і швидкості всмоктування, але і від розподілу та елімінації ЛВ в організмі.
Для визначення біологічної доступності у здорових людей підбирають групи добровольців певного віку і відповідним чином їх готують: стандартизуються дієта, кількість випитої води, фізична активність, виключається прийом інших ліків, можливість стресових станів і т.д. Сутність випробувань полягає у встановленні швидкості виведення ЛВ з сечею через певні проміжки часу після введення ЛЗ. Концентрацію ЛВ або їх метаболітів встановлюють за допомогою методик біофармацевтичної аналізу.
Таким чином, одним з основних етапів будь-якого дослідження біологічної доступності ЛЗ є використання біофармацевтичної аналізу для визначення концентрації ЛВ (метаболіту) в біологічних рідинах.
5. Особливості біофармацевтичної аналізу
Біофармацевтичний аналіз - новий перспективний напрям фармацевтичної хімії. Завданням біофармацевтичної аналізу є розробка способів виділення, очищення, ідентифікації та кількісного визначення ЛВ та їх метаболітів у таких біологічних рідинах, як сеча, слина, кров, плазма або сироватка крові та ін Тільки на основі застосування таких методик можна виконувати біофармацевтичні дослідження, т. е. вивчати питання всмоктування, транспорту і виведення ЛВ, його біологічну доступність, процеси метаболізму. Все це дозволяє попереджати можливе токсичний вплив ЛЗ, розробляти оптимальні режими фармакотерапії і контролювати процес лікування. Особливо важливо визначати в біологічних рідинах концентрацію ЛВ, коли вони поряд з терапевтичним ефектом виявляють токсичність. Необхідно також контролювати утримання ЛВ в біологічних рідинах хворих, які страждають шлунково-кишковими захворюваннями і захворюваннями печінки і нирок. При таких захворюваннях змінюються процеси всмоктування, порушуються метаболічні процеси, сповільнюється виведення ЛВ з організму.
Біологічні рідини - дуже складні об'єкти для виконання аналізу. Вони являють собою багатокомпонентні суміші, що включають велике число неорганічних і органічних сполук різної хімічної структури: мікроелементи, амінокислоти, поліпептиди, білки, ферменти та ін Їх концентрація коливається від 10 мг / мл до кількох нанограмів. Навіть у такій відносно простою фізіологічної рідини, як сеча, ідентифіковано кілька сотень органічних сполук. Кожен біологічний об'єкт - дуже динамічна система. Її стан і хімічний склад залежать від індивідуальних особливостей організму, впливу факторів зовнішнього середовища (склад їжі, фізична і психічна навантаження і т.д.). Все це ще більшою мірою ускладнює виконання біофармацевтичної аналізу, тому що на тлі такої великої кількості складних за хімічною будовою органічних речовин потрібно визначати нерідко дуже малі концентрації ЛВ. Введені в біологічні рідини ЛВ в процесі біологічної трансформації утворюють метаболіти, кількість яких нерідко обчислюється кількома десятками. Виділення цих речовин зі складних сумішей, поділ на індивідуальні компоненти і встановлення хімічного складу - завдання надзвичайно важке.
Таким чином, можна виділити наступні особливості біофармацевтичної аналізу:
Об'єкти дослідження являють собою багатокомпонентні суміші сполук.
Кількості визначених речовин, як правило, обчислюються мікрограма і навіть нанограма.
Досліджувані ЛВ та їх метаболіти знаходяться в середовищі, що складається з великого числа природних сполук (білків, ферментів та ін.)
Умови виділення, очищення та аналізу досліджуваних речовин залежать від виду біологічної рідини, що піддається
дослідженню.
Крім теоретичного значення, яке мають дослідження в області біофармацевтичної аналізу для вивчення новостворюваних ЛВ, безсумнівна і практична роль цієї галузі знань.
Отже, біофармацевтичний аналіз являє собою своєрідний інструмент, необхідний для проведення не тільки біофармацевтичних, але і фармакокінетичних досліджень.
6. Метаболізм та його роль у механізмі дії лікарських речовин
Метаболізму (біотрансформації) піддаються всі речовини, в тому числі і лікарські, незалежно від шляхів введення їх в організм. Утворилися продукти перетворення називаються метаболітами.
Метаболізм - це комплекс відбуваються в організмі фізико-хімічних і біохімічних процесів, що сприяють перетворенню в більш полярні водорозчинні компоненти, які легше виводяться з організму. Вивчення метаболізму дозволяє встановити механізм дії ЛВ, фармакологічну активність або токсичність метаболітів, швидкість їх накопичення або виведення з організму й інші явища біотрансформації.
Прийнято розділяти лікарські речовини на властиві організму і чужорідні йому. Властиві організму речовини, такі як гормони, вітаміни, амінокислоти, цукру, жирні кислоти, нуклеозиди, полінуклеотіди, метаболізуються специфічними ферментними системами, що забезпечують функцію організму.
Більшість синтетичних органічних і неорганічних сполук, а також природні речовини рослинного походження є чужорідними організму. Їх називають також ксенобіотиками. Вони метаболізуються головним чином у мікросомах клітин з участю різних неспецифічних ферментів (оксидаз, трансфераз та ін.) Ксенобіотики, розчинні в ліпідах, повільніше виводяться з організму і повільніше метаболізуються, а тому накопичуються в ньому. Метали (ртуть, миш'як, свинець, срібло та ін) утворюють з білком міцну ковалентний зв'язок і також накопичуються в організмі. Ксенобіотики, прийняті перорально, послідовно метаболіт зіруются спочатку у слизових оболонках шлунково-кишкового тракту, а потім у печінці, куди поступають після всмоктувача вання.
Метаболіти лікарських речовин можуть бути фармакологічно активними, а також зовсім неактивними у фармакологічному відношенні.
Більш висока активність метаболітів в порівнянні з їх попередниками - лікарськими речовинами - обумовлена такими факторами, як перетворення більш полярної молекули в менш полярну (це призводить до збільшення її ліпофільності і полегшенню транспорту через біомембрани), посилення внутрішньопечінкової циркуляції, зміна швидкості виведення речовини з організму, перерозподіл метаболітів між органами і тканинами.
Значно рідше метаболізм призводить до утворення токсичних для організму речовин. Так, наприклад, токсичність метилового спирту обумовлена тим, що відбувається в організмі окисленням його молекули до формальдегіду і мурашиної кислоти.
Таким чином, в організмі можуть відбуватися як процеси синтезу, так і руйнування (деградації) молекул ЛВ. При синтезі утворюються більш складні молекули нових сполук, менш токсичні для організму і більше полярні, що покращує їх розчинність в воді і прискорює виведення з організму. Такий процес називається кон'югації, а продукти синтезу - кон'югатів.
Процес перетворення ЛВ в метаболіти відбувається по-різному. Одні практично повністю перетворюються на метаболіти, інші - тільки на декілька відсотків від введеної дози. З одного лікарської речовини може утворитися декілька метаболітів, іноді десятки. Утворилися метаболіти або виводяться з організму, або піддаються подальшим перетворенням.
Відповідно до сучасних уявлень метаболічні процеси умовно ділять на дві фази. У першій фазі в результаті процесів окислення, відновлення або гідролізу змінюється молекула ЛВ з утворенням функціональних груп, які мають активні атоми водню (оксигрупп, карбоксігруппа, первинні та вторинні аміногрупи та ін.) У другій фазі відбувається процес кон'югації утворилися функціональних груп з високополярнимі кислотними залишками глюкуроновою, сірчаної кислот, деякими амінокислотами та ін У результаті цього процесу гідрофільність молекул метаболітів зростає настільки, що вони легко виводяться із сечею. Не всі ЛВ метаболізуються за вказаною двофазної системі. Деякі з них утворюють кон'югати, минаючи першу фазу, інші після першої фази виводяться нирками без наступної кон'югації.
На біотрансформацію ЛВ впливають стать, вік, умови життя, характер харчування, захворювання і т.д. Крім впливу різних захворювань, можливі також індивідуальна варіабельність кінетики метаболізму, індукція і пригнічення метаболізуючих ферментів. Все це свідчить про те, що біотрансформація ЛВ є надзвичайно складним процесом, що залежать від багатьох екзогенних і ендогенних факторів.
Дослідження механізму процесів метаболізму - проблема, яка входить в коло завдань різних областей хімічних, біологічних, фармацевтичних наук, в тому числі фармацевтичній хімії.
7. Порівняльна оцінка методів, використовуваних в біофармацевтичної аналізі
Велике значення має вибір методу проведення біофармацевтичної аналізу при фармакокінетичних дослідженнях. Обраний метод повинен мати високу чутливість, можливість роботи з малими обсягами проб, більшу специфічність і вибірковість, відрізнятися швидкістю виконання аналізу, простотою підготовки аналізованих проб, простотою обслуговування аналітичного приладу, надійністю і відтворюваністю методу, його універсальністю (придатністю для аналізу різних ЛВ), малої трудомісткістю, великий продуктивність «) і можливістю автоматизації процесу аналізу.
Обраний для цієї мети метод повинен бути настільки чутливим, щоб він дозволяв достовірно і точно визначати в 10 разів менша кількість, ніж середня кількість речовини, всмоктується після прийому одноразової дози. Разом з тим метод повинен бути досить специфічним, щоб визначати незмінну частину ЛВ у присутності його метаболітів і ендогенних сполук.
Вимогам, що пред'являються до біофармацевтичної аналізу, відповідають тільки чутливі фізико-хімічні методи.
Процес виконання біофармацевтичної аналізу включає кілька послідовно виконуваних стадій: екстракцію з біологічної рідини, поділ, ідентифікацію та кількісне визначення ЛВ або його метаболітів.
Перед екстракцією необхідно осадити білки (сульфатом амонію, розчином трихлороцтової або хлорним кислоти). Для осадження білків використовують зазвичай пробу, яка містить близько 0,2 мл сироватки крові, до якої додають 0,5 мл 20%-ного розчину трихлороцтової кислоти і центрифугують при 3000 об / хв протягом 20 хв. При цьому досягається повне осадження сироваткових білків. Надосадову рідину декантирують і екстрагують з неї випробовувані речовини.
Процеси екстракції аналізованих лікарських речовин і їх метаболітів з біологічних об'єктів здійснюють за допомогою таких органічних розчинників, як діетиловий ефір, хлороформ, бензол, дихлоретан, дихлорметан, я-гексан, ізопропілхлорід, я-гептан, метиленхлорид, етилацетат, ацетон. Нерідко поєднують в екстрагентів два із зазначених розчинників. Такий спосіб називаютдвухфазним екстрагуванням. Найкраща повнота поділу досягається, якщо послідовно витягують з біологічної рідини ЛВ або його метаболіти кількома розчинниками, наприклад ефіром, етилацетатом, хлороформом, ацетоном, водою. Екстракцію проводять в присутності кислот, лугів або буферних розчинів, створюючи рН середовища, оптимальне для вилучення ЛВ або його метаболіту.
Речовини, що містяться в отриманих екстрактах (реекстрактах), визначають фотометричним, спектрофотометрическим або флуоріметріческім методом.
Дуже перспективний чутливий екстракційно-фотометричний метод, заснований на екстракції ЛВ з біологічної рідини з подальшим взаємодією з кислотними або основними барвниками (бромтімоло-вим синім, метиловим оранжевим, бромкрезоловим зеленим та ін.) Утворені забарвлені продукти (іонні асоціати) нерідко специфічні для ЛВ і кількісно екстрагуються органічним розчинником (хлороформом, бензолом, дихлоретаном).
Найбільш часто в біофармацевтичної аналізі используютспектрофотометрию в УФ-та видимій областях спектру. Цей метод відрізняється простотою виконання і достатньою точністю, не вимагає великої кількості операцій при підготовці до аналізу випробуваного зразка. Порівняно невисока чутливість спектрофотометричних методик (від 1 мкг / мл до 1 мг / мл) обмежує застосування даного методу для тих груп ЛВ, добова доза яких становить близько 1 м.
Чутливість флуоріметріческого аналізу - близько 0,0! мкг / мл. У порівнянні з УФ-спектрофотометрією вона вища у 10-100 разів. Тому за допомогою флуоріметріческіх методик можна піддавати біофармацевтичної аналізу ЛВ, добові дози яких становлять кілька міліграмів. Особливо високою чутливістю відрізняються спектрофлуоріметріческіе визначення. Проте слід враховувати, що в біологічних рідинах організму нерідко містяться речовини, що володіють флуоресценцією. Флуоресцировать можуть і метаболіти ЛВ.
Тонкошарова хроматографія (ТШХ) широко застосовується в біофармацевтичної аналізі зважаючи високої роздільної здатності та чутливості. Підвищити роздільну здатність ТШХ можна, використовуючи метод двовимірної хроматографії. Метод ТШХ дозволяє виявляти до 0,025 мг ЛВ. Виконання аналізу займає від 30 хв до 2 год ТШХ відрізняється простотою виконання, однак при аналізі складних сумішей, що містять велику кількість компонентів, цей метод не завжди дозволяє досягти потрібного ефекту. Більш перспективним є використання ТШХ у поєднанні з такими методами, як планіметрія і денситометрія. Біофармацевтичний аналіз методом ТШХ найчастіше поєднують з УФ-спектрофотометрією і флуоресцентним методом (хроматоспектрофотометрія, хроматофлуоресценція).
Дуже перспективне використання в біофармацевтичної аналізі мас-спектрометрії. Метод відрізняється високою роздільною здатністю, в десятки разів перевищує інші методи. Відомі різні варіанти мас-спектрометрії. Один з них заснований на застосуванні мас-спектрометрії з низькою енергією іонізуючих електронів після попереднього виділення фракції біологічної рідини екстракцією або паперовій хроматографією.
Газорідинна хроматографія (ГЖХ) через високу чутливості, хорошою відтворюваності і точності стоїть на одному з перших місць серед фізико-хімічних методів, які використовуються для аналізу ЛВ та їх метаболітів у біологічних рідинах. Він дозволяє визначити мікрограммовие і нанограммовие кількості цих речовин. До виконання аналізу методом ГЖХ необхідно попередньо здійснювати багаторазову екстракцію (частіше ефіром, хлороформом або етилацетатом) і реекстракцію ЛВ або його метаболітів.
Очищений екстракт концентрують і упарюють досуха (якщо потрібно, в струмі сухого азоту). Залишок піддають ГЖХ аналізу у вибраних оптимальних умовах з внутрішнім стандартом і використанням газу-носія-азоту при температурі випарника 245 ° С, детектора 305 ° С. Іноді екстрагуються речовини перетворюють спочатку в похідні, а потім виконують їх ГЖХ-аналіз. Відносна похибка методу ± (8-15)% при вмісті 10-25 нг / мл ЛВ в біологічній пробі.
Високоефективна або високошвидкісна рідинна хроматографія (ВЕРХ) відрізняється від ГЖХ тим, що дозволяє відчувати сполуки, які мають термічної нестійкістю і молекулярною масою більше 400. Для цих сполук виключається фаза перекладу в летючі похідні. У порівнянні з ТШХ метод ВЕРХ вимагає менших витрат часу на виконання аналізу. Це зумовило широке впровадження методу в практику біофармацевтичної аналізу. В останні роки створені системи для ВЕРХ, що дозволяють з 0,5 мл сечі в одну стадію без попередньої екстракції отримати до 150 піків індивідуальних речовин.
Особливо гарні результати в біофармацевтичної аналізі були досягнуті при комбінованому застосуванні газорідинного хроматографа і мас-спектрометра в одному приладі (хромато-мас-спектрометрія). На основі такого поєднання був створений принципово новий метод аналізу трудноразделяемих сумішей - мас-фрагментографія. Суть методу полягає в тому, що мас-спектрометр використовується як високочутливий детектор до газової хроматографії. Основна перевага мас-фрагментографіі - надзвичайно велика чутливість, що досягає декількох пікограмів (1 пг = 10-12 г). Це в 1000-10 000 разів вища, чому ГЖХ. Висока специфічність дозволяє аналізувати нерозділені компоненти цих сумішей, а висока чутливість дає можливість визначати метаболіти ЛВ, застосовуваних у дуже малих терапевтичних дозах.
Великі можливості в біофармацевтичної аналізі відкриває застосування радіоактивних ізотопів. В за следние голи стали застосовувати стабільні ізотопи, абсолютно нешкідливі для живого організму в кількостях, необ хідних для експерименту. Стабільні ізотопи можна довго зберігати, так як вони на відміну від радіоактивних ізотопів не розпадаються. Радіохімічні методи відрізняються високою чутливістю і в поєднанні з хроматографією дають можливість виявити всі речовини з радіоактивною міткою. Використання мічених молекул дозволяє встановити рас прерозподіл і локалізацію введеного JIB і метаболітів у всіх системах організму з великою специфічністю і чутливістю. У результаті можна отримати чітке уявлення про процес транспорту та виведення з організму цих речовин.
Для визначення малих концентрацій ЛВ та їх метаболітів у біологічних рідинах (крові, сечі, тканинах), а також для вивчення метаболізму та проведення фармакокінетичних досліджень застосовують імунохімічні методи. Вони засновані на високочутливої і специфічною реакції антитіл з гаптенами (відповідними низькомолекулярними біологічно активними сполуками) і на здатності гаптену, що містить спеціально введену мітку, конкурувати за активний центр антитіла.