Адсорбційної хроматографії
Поділ методом адсорбційної хроматографії здійснюється в результаті взаємодії речовини з адсорбентами, такими, як силікагель або оксид алюмінію, що мають на поверхні активні центри. Різниця в здатності до взаємодії з адсорбційними центрами різних молекул проби призводить до їх поділу на зони в процесі руху з рухомою фазою по колонці. Досягається при цьому поділ зон компонентів залежить від взаємодії як з розчинником, так і з адсорбентом.
В основі сорбції на поверхні адсорбенту, який має гідроксильні групи, лежить специфічна взаємодія між полярною поверхнею адсорбенту і полярними (чи здатним поляризуватися) групами або ділянками молекул. До таких взаємодій відносять диполь-дипольномувзаємодія між постійними або індукованими диполями, освіта водневого зв'язку аж до утворення π-комплексів або комплексів з переносом заряду. Можливим і досить частим в практичній роботі є прояв хемосорбції, яка може привести до значного підвищення часу утримування, різкого зниження ефективності, появи продуктів розкладання або незворотної сорбції речовини.
Ізотерми адсорбції речовин мають лінійну, опуклу або увігнуту форму. При лінійної ізотермі адсорбції пік речовини симетричний і час утримування не залежить від розміру проби. Найчастіше ізотерми адсорбції речовин нелінійні і мають опуклу форму, що призводить до певної асиметрії піку з утворенням хвоста.
Найбільше застосування в ВЕРХ знаходять адсорбенти з силікагелю з різним обсягом пір, поверхнею, діаметром пор. Значно рідше використовують оксид алюмінію і вкрай рідко - інші адсорбенти, широко застосовуються в класичній колоночной і тонкошарової хроматографії. Основна причина цього - недостатня механічна міцність більшості інших адсорбентів, що не дозволяє упаковувати їх і використовувати при підвищених тисках, характерних для ВЕРХ.
Полярні групи, що зумовлюють адсорбцію і знаходяться на поверхні силікагелю та оксиду алюмінію, за властивостями близькі. Тому зазвичай порядок елюювання сумішей речовин і елюотропний ряд розчинників для них однакові. Однак різниця хімічної будови силікагелю та оксиду алюмінію іноді призводить до появи відмінностей у селективності - тоді перевагу віддають тому чи іншому адсорбенти, більш відповідному для даного конкретного завдання. Наприклад, оксид алюмінію забезпечує більшу вибірковість при розподілі деяких багатоядерних ароматичних вуглеводнів.
Перевага, що віддається зазвичай силікагель в порівнянні з оксидом алюмінію, пояснюється більш широким вибором силікагелів по пористості, поверхні і діаметру пір, а також значно вищою каталітичною активністю оксиду алюмінію, нерідко приводить до спотворення результатів аналізу внаслідок розкладу компонентів проби або їх незворотною хемосорбції.
Адсорбційна хроматографія на силікагелі
Адсорбційну хроматографію з використанням в якості наповнювача колонок силікагелю дуже широко застосовують у класичному варіанті рідинної хроматографії. При одноразовому поділі силікагель виявляється досить зручним, ефективним і недорогим сорбентом. Дуже інтенсивно використовують силікагель в якості адсорбенту для ТШХ (також одноразово). Адсорбційна активність силікагелю досить легко відтворюється шляхом певних операцій гідроксилювання, сушки, активації. Великий досвід застосування силікагелю в ТШХ і колонкової хроматографії, природно, стимулював широке його використання на ранніх стадіях розвитку ВЕРХ.
Виявилося, що при багаторазовому використанні досить важко підтримувати колонку з силікагелем в умовах роботи, при яких часів утримування і отримується поділ залишалися б стабільними (на відміну від ТШХ і класичної колоночной ЖХ). Це пов'язано з тим, що алкани, використовувані в якості основних розчинників (н - гексан, н - гептан, ізооктан), містять дуже невелику кількість води (десятки ппм) в стані насичення або менше, якщо їх осушували тим чи іншим способом. Силікагель у колонці, що не має на поверхні адсорбованої води, є ефективним осушувачем і забирає воду від розчинника, змінюючи при цьому свою активність як адсорбент. Хроматографічні характеристики його при цьому, природно, також змінюються.
Це продовжується до тих пір, поки не встановиться рівновага між кількістю води, що поглинається і віддається силікагелем. Якщо при зміні розчинника нова партія буде мати іншу ступінь насиченості водою, ніж старий розчинник, знову почнеться процес встановлення нового динамічного рівноваги, і хроматографічні характеристики знову зміняться.
Аналогічний процес може йти і у зворотному напрямку, коли розчинник добре висушений, а силікагель містить багато адсорбованої води.
Основна проблема тут полягає в тому, щоб мати розчинник, наприклад гексан, з постійною вологістю, наприклад, що становить 50% від максимальної. Зазвичай цього домагаються, змішуючи безпосередньо перед використанням рівні об'єми гексану, що знаходиться в рівновазі з водою, і абсолютно безводного.
Якщо зволоження і осушення проводять ідентично і відтворено, то і вологість виходить одна й та сама, силікагель працює в стані динамічної рівноваги »і Хроматографічні характеристики колонки зберігаються. Правда, встановлення рівноваги займає багато часу, тому що для встановлення початкового рівноваги потрібно пропустити через колонку більше 200 обсягів колонки розчинника.
Існують ще методи, які дозволяють отримати відтворювані хроматографічні характеристики колонки з силікагелем. Один з них полягає у використанні безводного гексану, модифікованого для отримання потрібної селективності метиленхлоридом або ацетонітрилі.
Тому що їх вміст у генсане істотно вище, ніж води (при рівній елюірующей силі), рівновага встановлюється істотно швидше, і його легше підтримувати. При цьому завдання отримання безводного гексану залишається.
В іншому методі з використанням гексану при його модифікації водою застосовують так звану систему контрольованої вологості (ВКВ). Метод заснований на створенні замкнутого циклу розчинника, який після детектора повертається в систему через велику колонку з обігрівається термостатом сорочкою.
Велика колонка містить силікагель або оксид алюмінію (зволожені) і служить для утримування компонентів проб і підтримки необхідної вологості гексану.
велічівая або знижуючи температуру в сорочці, можна змінювати кількість води в циркулюючому гексані і, отже, змінювати параметри утримування аналітичної колонії. Детально пристрій і робота системи ВКВ описані в літературі [6].
При аналізі речовин, досить сильно взаємодіючих з силікагелем, наприклад фенолів, спиртів, часто аліфатичні вуглеводні модифікують спиртами, наприклад ізопропанолом.
На рис. 1 представлена хроматограмма, що демонструє високу селективність у поділі складної суміші метілфенолов і фенолу: розділені ізомери, дуже складно колективні методом газової хроматографії і що володіють дуже близькими властивостями, такі, як м і n-крезоли і 2,4 - і 2,5-ксиленоли.
Рис. 1. Хроматограмма суміші амінних стабілізаторів полімерів, отримана на колонці розміром 250 x 4,1 мм з сіласорбом-600 (5 мкм), рухома фаза - гексан - метиленхлорид - ізопропанол - діетил-амін (100:10:1:0,01 за об'ємом) , витрата 1 мл / хв, детектор - УФ (254 нм), проба 2 мкл: 1 - феніл-β-нафтиламін, 2 - N-феніл-N'-ізопропіл-n-фенілендіамін, 3 - N-1, 3 - діметілбутіл-N'-феніл-n-фенілендіамін, 4 - N, N'-біс (1,4-діметіламіл-n-фенілендіамін)
Найбільш сильний вплив на утримування фенолів надає, як видно з хроматограми, екранування гідроксильної групи навіть такий малооб'ємної і слабоекранірующей групою, як метильная. За рахунок цієї різниці відбувається чіткий поділ на 3 групи: орто -, орто '- заміщені; орто - заміщені з неекрані-рова гідроксильною групою (не має орто - заступників). Приклад поділу амінних стабілізаторів - на рис. 2.2.
У загальному вигляді можна сформулювати наступне положення: утримання в адсорбційної хроматографії на силікагелі визначається хімічною природою функціональних груп або груп, здатних до взаємодії з центрами адсорбції на поверхні силікагелю, а також ступенем просторового труднощі при їх зближенні до настання такої взаємодії. У ряді функціональних груп емпіричний ряд збільшення утримування виглядає наступним чином: фтор - хлор
бром - йод - простий ефір - трет-амін - нітрил - нітрогрупа - складний ефір
кетон - альдегід - привчає-ний амін - амід - спирт - фенолкарбоновая кислота
сульфо-кислота. транс-Ізомери утримуються слабше, ніж цис-ізомери, ізомери з аксіально розташованими групами - слабше, ніж з розташованими екваторіально. Якщо групове поділ (по типу і кількості функціональних груп) методом адсорбційної хроматографії на силікагелі провести легко, то поділ членів гомологічного ряду всередині таких груп, як правило, досягається тільки для перших членів і швидко падає з ростом числа метиленових груп.
Популярність силікагелю в якості сорбенту для ВЕРХ почала падати з появою і зростанням застосування полярних щеплених сорбентів, таких, як амін, нітрил і діол. Останні більш зручні в роботі і дозволяють підбирати селективність, змінюючи фазу. Проте є якості силікагелю, які забезпечують йому досить надійне майбутнє в ВЕРХ. Це перш за все відносна дешевизна силікагелю, що дає йому великі переваги при препаративних поділах, особливо в тому випадку, коли масштаб їх наближається до виробничого. Це хороша механічна міцність, можливість регулювати розмір і об'єм пор, мати такий сорбент, який можна відмити кислотою від іонів металів змінної валентності, прожарити при високій температурі і т.д. Тому, хоча слід очікувати подальшого зменшення використання силікагелю в аналітичній практиці, його виробництво і споживання збільшуватимуться за рахунок препаративної хроматографії.
Адсорбційна хроматографія на оксиді алюмінію
Оксид алюмінію, так само як і силікагель, широко використовують в колонкової хроматографії низького тиску і в ТШХ. Так як був великий досвід розділень, спочатку його досить інтенсивно застосовували для ВЕРХ. Однак поступово його застосування зменшувалася, і в даний час зустрічаються поодинокі роботи, пов'язані із застосуванням оксиду алюмінію в якості адсорбенту. Фірми або не виробляють сорбентів такого типу, або ж виробляють раніше розроблені (можливо, навіть давно вироблені), не розробляючи нових варіантів.
З чим це пов'язано? Як правило, розділення, які проводять на оксиді алюмінію, легко можуть бути перенесені на силікагель або ж на прівітофазние полярні сорбенти на його основі. Хімічна ж однорідність поверхні силікагелю вище. Каталітична активність оксиду алюмінію значно вище, він набагато частіше викликає розкладання компонентів проби або їх необоротну сорбцію. При однаковій ціні за грам у колонку з оксидом алюмінію потрібно його в два рази більше за масою, ніж силікагелю, що вдвічі дорожче.
Можна вважати, що в даний час використання оксиду алюмінію в якості адсорбенту в якійсь мірі стимулюється тим, що багато дослідників його мають і використовують, коли намагаються перейти від ТШХ розділень на оксиді алюмінію до ВЕРХ варіанту. Використовують його і в тих випадках, коли відтворюють опубліковані більш ранні роботи.
Проте слід визнати, що, за винятком деяких особливих випадків застосування, коли сорбенти на основі оксиду алюмінію показали підвищену селективність порівняно з силікагелем (наприклад, у поділі багатоядерних ароматичних вуглеводнів, деяких амінів), застосування силікагелю більш доцільно.
Недоліки адсорбційної хроматографії, що обмежують її використання.
Популярність адсорбційної хроматографії в міру розвитку методу ВЕРХ поступово падала, вона все більше замінялася і продовжує замінюватися на інші варіанти, такі, як звернення-фазна і нормально-фазна ВЕРХ на сорбентах з прищепленої фазою. Які ж недоліки адсорбційної хроматографії призвели до цього?
Перш за все, це велика тривалість процесів урівноваження адсорбентів з розчинниками, що містять воду в мікрокількостей, труднощі приготування таких розчинників з певною і відтворної вологістю. З цього випливають погана відтворюваність параметрів утримування, дозволи, селективності. З цієї ж причини неможливо використовувати градієнтне елюювання - повернення до вихідного стану настільки тривалий, що значно перевершує виграш часу за рахунок використання градієнта.
Істотні недоліки адсорбентів, особливо оксиду алюмінію, пов'язані з частими випадками перегрупувань чутливих до каталізу сполук, їх розкладу, незворотною сорбції, також загальновідомі і неодноразово відзначалися в літературі. Необоротно сорбуючі речовини, накопичуючись на початковій ділянці колонки, змінюють природу сорбенту, можуть привести до підвищення опору колонки або навіть до повної її забиванні. Останній недолік може бути усунений шляхом використання предколонкі, яка в міру підвищення опору і забивання замінюється на нову або перезаполняется новим сорбентом. Однак необоротна сорбція, що має місце і в цьому випадку, призводить до отримання хроматограми, на якій повністю або частково відсутні чутливі до сорбції або каталитическому розкладанню компоненти проби.
Розподільної хроматографії
Розподільна хроматографія - це варіант ВЕРХ, в якому поділ суміші на компоненти здійснюється за рахунок різниці їх коефіцієнтів розподілу між двома несмешивающимися фазами: розчинником (рухома фаза) і фазою на сорбенті (нерухома фаза). Історично першими були сорбенти такого типу, які отримували нанесенням рідких фаз (оксідіпропіонітріла, парафінового масла та ін) на пористі носії, аналогічно тому, як готували і готують сорбенти для газорідинної хроматографії (ГРХ). Проте відразу ж виявилися і недоліки таких сорбентів, основним з яких було відносно швидке змивання фази з носія. За рахунок цього кількість фази у колонці поступово зменшувалася, часи утримування також зменшувалися, на початковій ділянці колонки з'являлися не покриті фазою центри адсорбції, що викликали утворення хвостів піків. З цим недоліком боролися, насичуючи розчинник нанесеною фазою ще до його потрапляння в колонку. Віднесення також зменшувався, коли використовували більш в'язкі і менш розчинні полімерні фази, однак у цьому випадку через труднощі дифузії з товстих полімерних плівок ефективність колонок помітно знижувалася.
Логічним виявилося прищепити хімічними зв'язками рідку фазу до носія таким чином, щоб винесення її став фізично неможливий, тобто перетворити носій і фазу в одне ціле - в так званий щеплено-фазний сорбент.
Перші щеплено-фазні сорбенти були отримані заміщенням гідрофільних силанольних груп, що знаходяться на поверхні силікагелю, в результаті їх реакції з спиртами або амінами. При цьому відщеплюється вода, а залишки спиртів або амінів хімічно прищеплювалися до поверхні силікагелю. Ці так звані «щіткові» сорбенти показали, що з їх використанням дійсно вдається отримати високу ефективність колонок при відсутності винесення фази з колонки і стабільності часів утримування. Однак стійкість таких сорбентів в умовах застосування водних розчинників і навіть слабоосновним або кислих середовищ була низькою: фаза відщеплюється хімічно за рахунок реакції гідролізу.
Надалі зусилля дослідників були спрямовані на пошук реагентів, щеплення яких протікала б досить швидко і повно, а утворилися зв'язку були максимально стійкими. Такими реагентами стали алкілхлорсілани та їх похідні, що дозволили за подібною технологією отримувати щеплено-фазні сорбенти різного типу і з різними як полярними, так і неполярними групами на поверхні.
Успішне застосування сорбентів останнього типу для ВЕРХ сприяло зростанню їх виробництва самими різними виробниками. Кожна фірма виробляла такі сорбенти, як правило, на основі свого виду силікагелю і за своєю технологією, яка зазвичай складає «ноу-хау» виробництва. В результаті велика кількість сорбентів, що називаються хімічно абсолютно однаково (наприклад, силікагель з щепленим октадецілсіланом), мають дуже сильно розрізняються хроматографічні характеристики. Це пов'язано з тим, що силікагель може мати пори ширше або вже, різну поверхню, пористість, його поверхня до щеплення може гідроксильованих чи ні, щепитися можуть моно-, ди-або трихлорсилану, умови щеплення можуть давати мономерний, полімерний або змішаний шар фази, використовуються різні методи видалення залишків реагентів, може використовуватися або не використовуватися додаткова дезактивація гідрофільних силанольних та інших активних груп.
Складність технології щеплення реагентів і підготовки сировини і матеріалів, її многостадийность призводять до того, що навіть отримані за однією технологією на одній фірмі-виробнику партії сорбентів можуть мати дещо різні хроматографічні характеристики. Особливо це стосується тих випадків, коли такі сорбенти використовують для аналізу багатокомпонентних сумішей, що містять речовини, помітно різняться за кількістю і положенням функціональних груп, по роду функціональності [9, 10].
Враховуючи вищезазначене, завжди слід прагнути до того, щоб при використанні описаної в літературі методики аналізу застосовувати саме той самий сорбент і ті ж умови роботи. У цьому випадку ймовірність того, що роботу не вдасться відтворити, є мінімальною. Якщо ж такої можливості немає, а береться сорбент іншої фірми з аналогічною прищепленої фазою, потрібно бути готовим до того, що буде потрібно тривала робота по переробці методики. При цьому існує ймовірність (і її слід враховувати), що на цьому сорбенті навіть і після тривалої розробки можна не добитися необхідного поділу. Наявність у літературі багатьох описаних методик поділу на давно вироблених старих сорбентах стимулює їх подальше виробництво і застосування з цієї причини. Однак у тих випадках, коли доводиться переходити до розробки оригінальних методик, особливо стосовно до речовин, схильним до розкладання, хемосорбції, перегрупування, доцільно починати роботу на сорбентах, розроблених останнім часом і випускаються за новими, поліпшеним варіантів технології. Нові сорбенти мають більш однорідний фракційний склад, більш однорідне і повне покриття поверхні прищепленої фазою, досконаліші остаточні стадії обробки сорбентів.
Перейдемо тепер до розгляду груп щеплено-фазних сорбентів, що є в даний час основними в ВЕРХ, а також сорбентів з нанесеними фазами для розподільної хроматографії.
Нормально-фазна розподільна хроматографія з щепленими фазами.
Недоліки, властиві адсорбційної хроматографії і детально розглянуті в розділі 2.1.3, а також прагнення дослідників подолати недоліки, характерні для розподільної хроматографії з нанесеними полярними фазами, сприяли розробці сорбентів з прищепленими полярними фазами. Такі сорбенти, принаймні основних типів, які знайшли найбільш широке застосування, в даний час випускаються більшістю виробників.
Основними щепленими фазами для нормально-фазною розподільної хроматографії в даний час є нітрильну і аминная. Кожна з них прищеплюється з використанням відповідного силану (діметіламінопропілхлор або диметилцианпропилхлорсилана). Нітрільниє і аминная щеплені фази можуть бути використані тому у двох варіантах: для нормально-фазної (з неполярними елюента) та обігу-фазної (з полярними елюента) розподільної ВЕРХ. Як нормально-фазних сорбентів вони працюють, подібно силікагель або оксиду алюмінію, з тими ж елюотропнимі рядами
Рис. 2. Хроматограмма вітамінів у харчових продуктах, отримана на колонці розміром 250 x 4 мм з нуклеосілом NH 2 (10 мкм), рухома фаза - гептан - хлороформ (80:20 за обсягом), витрата 3,5 мл / хв, детектор-УФ (254 нм), проба 5 мкл: 1 - оцтовий ефір вітаміну А, 2 - вітамін Е, 3 - вітамін Д3
розчинників і близькими (але не ідентичними) порядками елюювання сполук різних класів. За рахунок різної хімічної природи гідрофільних силанольних, аміно-і нітрильних груп нерідко виникає розбіжність у селективності розділення, що дозволяє віддати перевагу тому чи іншому сорбенту.
Основними перевагами сорбентів з прищепленими нітрильних або аміногрупами в порівнянні з адсорбентами є наступні: 1) внаслідок відсутності гідрофільних силанольних груп ймовірність незворотною адсорбції речовин помітно зменшується, 2) помітно зменшується вплив води на хроматографічне розділення, відпадає необхідність строго контролювати вміст води в розчинниках, 3) швидко досягається рівновага з новим складом розчинника, що дозволяє швидко переходити від методики до методики або успішно використовувати градієнтне елюювання, 4) можливе використання розчинників в широкому діапазоні полярностей, колонки легко можуть бути регенеровані; 5) сорбенти з прищепленими аміногрупами виявляють властивості слабких анионообменниками.
Слід брати до уваги і деякі особливості застосування сорбентів з амінофазамі. Не рекомендується використовувати в якості розчинників і компонентів проб речовини з альдегідні або кетонами групами, так як в цьому випадку можливе руйнування структури прищепленої фази з утворенням підстав Шиффа або зникнення деяких компонентів проб. Амінофаза може бути легко окислена, тому слід виключити дію на сорбент сильних окислювачів. Аналогічно, при використанні нітрильного прищепленої фази слід поцікавитися, чи не реагують з нітрилом вибраний розчинник або компоненти, що входять до складу проби.
Нітрил і амінофази застосовують в біології, медицині, біохімії, фармакології та ін (рис. 2). Ці фази знайшли найбільш широке визнання і випускаються майже всіма виробниками сорбентів Деякі фірми випускають варіанти амінофаз, що містять, наприклад, діетіламіноетільние або диметиламіно-пропильной групи.
Досить широко застосовують також ще одну щеплену полярну фазу - так звану «діольную», або просто «діол», яка містить в складі прищепленої групи дві гідроксильні групи. Її селективність також буде дещо відмінною через іншої хімічної природи полярних груп. Сорбенти з такими щепленими фазами випускають значно менше число виробників.
Сорбенти з іншими щепленими полярними групами (за винятком іонообмінників) випускаються ще меншим числом фірм або ж всього однієї-двома, а їх застосування також досить рідко. Це пов'язано з тим, що якась особлива селективність, що виправдує їх застосування (рис. 2.6), відзначається досить рідко. З чим же пов'язане те, що багато щеплені полярні фази різних типів, які були розроблені і навіть вироблялися, не придбали помітною популярності? Адже в ГЖХ цей шлях є основним, що дозволяє добитися розділення на колонці - нова фаза з особливими властивостями, що дає високу селективність.
Рис. 3. Хроматограмма моносахаридів, отримана на колонці розміром 250 x 4,6 мм з полігосілом 60 NH 2 (5 мкм), рухома фаза-ацетонитрил - вода (75:25 за обсягом), витрата 2 мл / хв, детектор - УФ (190 нм) : 1 - Рамноза; 2 - ксилоза, 3 - арабиноза, 4 - фруктоза, 5 - манноза; 6 - глюкоза, 7 - галактоза
Рис. 4. Хроматограмма цитохромів Ц різного походження, отриманий-ва на колонці розміром 250х4 мм з нуклеосілом CN (5 мкм), рухома фаза - 0,05 М розчин сульфату натрію в 0,1 М фосфатному буферному розчині (рН 2,0) - ацетонитрил (77 , 5:22,5 за обсягом), витрата 1 мл / хв, детектор - УФ (400 нм): 1 - коні, 2 - бика, 3 - собаки, 4 - тунця
Рис. 5. Хроматограмма поліциклічних вуглеводнів, отримана на колонці розміром 150 x 4,6 мм з нуклеосілом NO 2 (5 мкм), рухома фаза - ізооктан, витрата 1,4 мл / хв, детектор УФ (254 нм), проба 20 мкл:
1 - бензол, 2 - нафталін: 3 - Фенантрен, 4 - флюорит, 5 - пірен; 6 - 1,3,5-тріфенілбензол; 7 - хризо
Головна причина в тому, що в ГЖХ молекули розділяється речовини вступають у взаємодію з нерухомою фазою безпосередньо, а в ВЕРХ - тільки через молекули сольватовані розчинника, якого тим більше (а вплив прищепленої групи - слабший), чим більше сольватірующіе здатності розчинника і сольватіруемость полярних груп прищепленої фази. Хоча природа щеплених полярних груп (нітрил, амін, діол) помітно різниться, нівелює дію сольватамі-ційних оболонок згладжує ці відмінності. Тому покращення дозволу заміною сольватірующей полярну групу молекули або групи молекул на нову шляхом модифікації складу розчинника, введення нових компонентів розчинника або добавок до нього (при збереженні тієї ж прищепленої полярної групи) часто не тільки простіше для хроматографіста, а й дає істотно більш значущий результат.
Звернення-фазна розподільна хроматографія з щепленими фазами
Варіант розподільної хроматографії, в якому використовують сорбент з прищепленими неполярними (як правило, довгими алкільних або алкілсілільнимі) групами і полярний розчинник, наприклад водний метанол, отримав назву звернення-фазною ВЕРХ. Цей не зовсім вдалий термін, який вказує на зміну полярності нерухомої і рухомої фаз на протилежні в даному варіанті ВЕРХ прижився і став загальноприйнятим, що означає: рухома фаза полярна, нерухома - неполярна. На відміну від недостатньо вдалого назви сам метод виявився настільки вдалим, що в даний час є основним у ВЕРХ. За загальними оцінками, кожні два поділу з трьох, що з'являються в літературі і використовуваних у практичній роботі, відносяться до звернення-фазною ВЕРХ в її різних варіантах, тобто 60-70% роботи в даний час проводять цим методом. У чому ж причина такої популярності звернення-фазною хроматографії, що на всі інші варіанти ВЕРХ (адсорбційну, розподільну нормально-фазну, іонообмінну, ексклюзіонную та інші) припадає менше однієї третини застосувань?
Причин таких декілька, і кожна зіграла роль в широкому використанні методу звернення-фазною ВЕРХ. Були розроблені і швидко впроваджені у виробництво сорбенти для цього методу, що мають щеплені алкілсілільние групи різної довжини (від С2 до Саг з прямою алкильной ланцюгом, фенільного і ді-фенільного групами). Розчинники, які використовуються для цього методу (ацетонитрил, метанол, вода, меншою мірою - тетра-гідрофуран), дозволяють працювати в широкому УФ-діапазоні, так як вони УФ-прозорі зі 190-210 (ТГФ - з 220) нм. Це дозволяє застосовувати найбільш популярний детектор - УФ-спектрофотометр як при 190-210 нм, де він детектирует неселективно, і тому наближається до універсального детектору (аналіз Сахаров, жирів, складних ефірів, спиртів, олефінів), так і при будь-якій довжині хвилі, що забезпечує селективне детектування (наприклад, вітаміну А при 325 нм). Розчинники, які використовуються в обіг-фазних поділах, відносно легко розчиняють практично всі найважливіші групи речовин, що знаходяться в організмі людини, біологічних об'єктах, які використовуються у вигляді лікарських препаратів, пестицидів, гербіцидів широко використовуються в органічній хімії, нафтохімії, біоорганічної хімії (рис. 2.7- 2.10). Сорбенти в обіг-фазною ВЕРХ швидко приходять у рівновагу
Рис. 7. Хроматограмма суміші ароматичних вуглеводнів, отримана на колонці розміром 250х4, 6 мм з зорбаксом ОДС (6 мкм), рухома фаза - метанол - вода (90:10 за обсягом), витрата 1,5 мл / хв, детектор УФ (254 нм), проба 20 мкл: 1 - толуол, 2 - о-ксилол, 3 - трет-бутілбензол, 4 - n-трет-бутілтолуол, 5 - n-трет-аміл-толуол, 6 - n-трет-гексілтолуол; 7 - 3, 5-ді-трет-бутілтолуол; 8 - трет-гексил-о-ксилол
Рис. 8. Хроматограмма натуральної кави, отримана на колонці розміром 150х4, 6 мм з нуклеосілом С8 (5 мкм), рухома фаза - метанол - 0,01 М фосфатний буферний розчин з рН 7,0 (20:80), витрата 1,2 мл / хв , тиск 12 МПа, температура 25 ° С, детектор Уф (280 нм), проба 20 мкл: 1 - кофеїн
з новими розчинниками і при зміні складу розчинника, що дозволяє переходити від однієї методікікі до іншої з використанням однієї і тієї ж колонки, а
також широко застосовувати градієнтне елюювання з швидким відновленням рівноваги сорбенту з вихідним розчинником.
Сорбенти дають можливість використовувати розчинники в широкому діапазоні властивостей, а також добавки різних типів (солі, кислоти і підстави, іон-парні реагенти, органічні модифікатори).
Регенерація розчинників високої чистоти може бути здійснена з використанням чіткої ректифікації. Забруднене сорбент у колонці може бути промитий і приведений знову в робочий стан при прокачуванні через колонку розчинників, що видаляють забруднення.
Однак в обіг-фазною хроматографії існують і деякі проблеми, які потрібно брати до уваги і які часто ускладнюють, особливо для початківців, використання методу.
Перш за все, характеристики утримування і селективності для звернення-фазних сорбентів змінюються не тільки при переході від сорбенту одного виробника до сорбенту іншого (наприклад, від сферісорба ОДС до партісілу ОДС), формально визначених як ідентичні (силікагель з щепленим октадецілсіланом).
Ці характеристики змінюються більш-менш значно навіть при переході від однієї партії сорбенту до іншої партії того ж виробника.
Проблема ця була відзначена ще в початку виробництва і застосування звернення-фазних сорбентів, однак вона не вирішена і до теперішнього часу в повному обсязі.
Для щеплення фаз, які далі називають однаково, застосовують різні агенти, при цьому їх чистота (технічних сортів, які використовуються для виробництва) також різна.
Напри заходів, для отримання прищепленої фази ОДС (октадецілсілан) використовують
Рис. 9. Хроматограмма суміші полібромсодержащіх антипіренів, отримана на колонці розміром 250х4, 6 мм з зорбаксом ОДС, рухома фаза - метанол, витрата 1 мл / хв, детектор-УФ (254 нм), проба 10 мкл: 1 - гексабромбутен-2, 2 - гексабромбензол; 3,4 - домішки, 5 - декабромдіфенілоксід
октадецілтріхлорсілан, метілоктадецілдахлорсілан і диметил-октадецілхлорсілан. Якщо використовують ді-або три-функціональні сила, то залежно від ступеня безводного розчинників і силікагелю, на поверхні може вийти мономерна плівка фази (монослой) або ж полімерна (чим більше води, тим вище ступінь полімеризації). Властивості мономерний і полімерних плівок з різним ступенем полімеризації
різаціі помітно різняться. Нарешті, гідрофільних силанольних групи, що знаходяться на поверхні вихідного силікагелю, до яких прищеплюється фаза, не можуть через просторових утруднень бути повністю заміщені, наприклад, диметилоктадецилсилильными групами: у найжорсткіших умовах щеплення вдається замістити приблизно половину гідрофільних силанольних груп. Залишаються гідрофільних силанольних групи не вдається повністю усунути навіть у процесі так званого остаточного покриття поверхні силікагелю («енд кеппінга»), коли використовують молекули більш активного низькомолекулярного силану (зазвичай тріметілхлорсілана). Гідрофільних силанольних групи на поверхні такого прищепленого сорбенту можуть взаємодіяти з деякими компонентами проби і в деяких випадках бути основним фактором, відповідальним за утримання. Нерідко вони діють не безпосередньо, а через посередництво малих поляризованому молекул розчинника (метанолу, води), сольватовані сіланол-ними групами. У деяких випадках, коли в утриманні речовини беруть участь як щеплені, так і гідрофільних силанольних групи, це призводить до утворення хвостів піків.
Цікаво простежити, як виробники сорбентів міняли свої програми у міру розвитку уявлення про хімію поверхні щеплених сорбентів і про роль гідрофільних силанольних залишкових груп. Наприклад, фірма «Ватман» спочатку випускала тільки один сорбент виду ОДС - партісіл ОДС, який був одним з перших з'явилися у продажу звернення-фазних сорбентів і широко застосовувався. Однак вміст вуглецю в ньому становила лише 5%, і ступінь покриття поверхні становила 50% від можливої. Далі був випущений партісіл ОДС-2, який містив вже 15% С, але ступінь покриття поверхні збільшилася тільки до 75%, тобто покриття стали отримувати більш щільне, і плівка стала полімерною. Останнім з'явився партісіл ОДС-3, що містить 10% вуглецю, однак зі ступенем покриття 95%. Це досягнуто за рахунок того, що прищеплена фаза стала мономерний і остаточне покриття проводилося додатково. Аналогічно партісілам ОДС випущені сферісорби ОДС і ОДС-2, Р-сили С18 двох типів («високої щеплення» і «низької щеплення»). Ті ж виробники сорбентів, які з'явилися на ринку пізніше і використовували технологію, що враховує недоліки старих сорбентів і технологій їх отримання, як правило, відразу випускали сорбент з максимальним покриттям поверхні мономірних шаром фази, а для усунення залишкових гідрофільних силанольних груп користувалися остаточним покриттям.
У початківця хроматографіста відразу виникає питання: чому виробники не замінюють старий сорбент, який начебто гірше, на новий, а випускають новий додатково? Друге питання, так само природно виникає: якщо є нові, досконаліші сорбенти з поліпшеною хімією поверхні, то чому продовжують виробляти і купувати старі сорбенти, наприклад ліхросорб РП-18, при цьому часто за цінами, навіть більш високим? Звичайно, причина не в тому, що старі сорбенти добре і вміло рекламуються: та ж фірма «Ватман» рекомендує тепер партісіл ОДС як «унікальний сорбент, який працює і за механізмом звернення-фазною, і за механізмом aдcоpбціoннoй хроматографії», партісіл ОДС-2 - як «робочу конячку дослідної лабораторії, стабільно і довго працездатну», а партісіл ОДС-3, природно, як «найбільш інертну звернену фазу з оптимальним покриттям і найменшим впливом залишкових гідрофільних силанольних груп».
Причина в тому, що не тільки виробники, а й хроматографісти зацікавлені у випуску старих сорбентів поряд з новими, більш досконалими. Купуючи старий сорбент, хроматографіст набуває і можливість використовувати всі наявні в літературі розробки, виконані на цьому сорбенті. Перехід на інший сорбент, як правило, пов'язане з великими витратами праці і часу на переробку і доведення методики - нерідкі випадки, коли після тривалої роботи дослідник переконується в тому, що на новий сорбент перенести методику не вдається. Кожен сорбент в чомусь унікальний за властивостями, і повний збіг їх у двох сорбентів хоча в принципі і можливо, однак малоймовірно. Тому чим більше вибір сорбентів і заповнених ними колонок у дослідника, тим легше їй працювати, тим легше використовувати накопи-
ленний досвід, тим менше часу він витрачає на переробки методик. Це не означає, звичайно, що, відтворивши методику, дослідник не може спробувати використовувати більш новий і ефективний сорбент, інший розчинник і т.п. - Він все це може спокійно спробувати, знаючи, що в разі невдачі повернеться до відтвореної методикою з використанням сорбенту раніше згаданого в літературі.
З цього обговорення випливає ще один важливий висновок: жоден сорбент, як би хороший він не був з хімії поверхні, технології отримання, не може бути використаний для відтворення або вирішення будь-яких методик або завдань. Дослідник завжди повинен мати можливість використовувати ряд сорбентів для вирішення виникаючих аналітичних завдань.
Тому на третє питання, яке зазвичай задають початківці хроматографісти, - який звернення-фазний сорбент є найкращим, - відповісти однозначно не вдається жодному досліднику з великим досвідом роботи. Зазвичай він чесно і коротко говорить: «Я не знаю». Він може сказати, який сорбент або сорбенти найбільш підходять для його роботи, які тому найкращі для нього. Він може поділитися досвідом роботи з цими сорбентами, знає, як їх упаковувати, з якими розчинниками працювати, як регенерувати. Однак дати пораду, який сорбент є найкращим взагалі, очевидно, не може ніхто, незалежно від попереднього великого досвіду.
Одна з причин, що сприяли швидкому зростанню застосування звернення-фазних сорбентів в ВЕРХ, - це їх здатність чітко розділяти серії гомологів в порядку зростання їх молекулярної маси, що робить їх в цьому чимось схожими з популярними в ГЖХ поліметілсілоксановимі фазами. При цьому гомологи можуть, на відміну від поділюваних методами адсорбційної або нормально-фазною хроматографії, не мати функціональних груп - звернення-фазний сорбент може так само чітко розділити гексан і гептан, бензол і толуол, фенол і n-крезол, mреm-бутілтолуол і тре -амілтолуол. Це втягує в область аналізу методом ВЕРХ такі важливі об'єкти, як вуглеводні нафти, продукти нафтопереробки (бензини, гас, газойлі, мастила, ароматичні вуглеводні), сланці-і углепереработкі - дуже важливі великотоннажні продукти. Якщо потрібно розділити речовини неполярні або малополярние, практично будь-звернення-фазний сорбент може при відносно простому підборі розчинника забезпечити майже ідентичне розділення.
В даний час фірми-виробники випускають різні звернення-фазні сорбенти. Як видно з цього переліку, практично всі виробники випускають щеплені фази С3 і C 18 (останні нерідко в декількох варіантах), багато хто - C1-С3 (що нерідко позначає один і той же - щеплення тріметілхлорсілана, іноді діметілдіхлорсілана), деякі - феніл, С4 або С6. Якщо щільність щеплення фази однакова, то сорбент міститиме для С4 - фази в 2 рази менше, а для C 18 - фази більш ніж в 2 рази більше прищепленого вуглецю, ніж фаза С3. На практиці ця щільність дещо падає в ряду С4-С8-C18, тому вміст вуглецю для С4 трохи більше, а для C 18 - менше, ніж можна було очікувати. Так як утримування з'єднань в обіг-фазною хроматографії пропорційно вмісту прищепленого вуглецю (точніше, тієї частини прищепленого вуглецю, яка доступна для взаємодії з молекулами поділюваних речовин), то для сорбентів, однієї торгової марки утримування збільшується в ряду С2-С4-C8-C18. Однак якщо взяти сорбенти різних виробників, то заздалегідь нічого сказати не можна: нерідко в такому випадку сорбент з С8-фазою утримує не слабшим, а сильнішим, ніж з фазою C 18, що випускається іншою фірмою.
Поряд з неполярними щепленими фазами, що випускаються спеціально для звернення-фазною хроматографії, у зверненні-фазному варіанті часто використовують нітрильну і аминной щеплені фази, а іноді й діольную. У цьому випадку вони працюють і поділяють речовини в основному за зверненням-фазному механізму, як мають короткий (Сз) прищепленої алкілсілан, а полярні групи або не беруть участь у поділі, або грають другорядну роль, кілька змінюючи селективність для ряду речовин певної хімічної структури.
Як розчинників для звернення-фазною ВЕРХ використовують переважно метанол і ацетонитрил. Інші спирти, крім метанолу, використовують рідко, оскільки їх в'язкість значно вище і при роботі виникає занадто великий тиск, а ефективність падає внаслідок утрудненою дифузії в рухливій фазі. Тетрагідрофуран також використовують значно рідше, по-перше, через нестабільність при зберіганні (він швидко окислюється, накопичуючи гідропероксиди, які зменшують діапазон УФ-пропускання, здатні окислювати щеплену фазу та вибухонебезпечні), по-друге, через труднощі очищення перегонкою ( необхідно руйнувати пероксиди до перегонки щоб уникнути вибуху).
Ацетонитрил має ряд переваг перед метанолом. При гарному очищенню він краще пропускає в ближньому ультрафіолетовому діапазоні (нижче 210 нм) і дозволяє працювати в суміші вода - ацетонитрил при 200 і навіть 190 нм. Він зазвичай має кращі розчинювальними властивостями для проб, ніж метанол. При використанні сумішей метанол - вода в'язкість такої суміші не є адитивною величиною (так само як і для сумішей ацетонитрил - вода) і при 25 ° С змінюється від 0,89 і 0,57 МПа ⋅ с (для чистих води та метанолу відповідно) до 1,4 (цифри для суміші ацетонитрил - вода відповідно 0,89, 0,43 і 0,98). Велика в'язкість сумішей метанол - вода в порівнянні із сумішами ацетонитрил - вода (майже в 1,5 рази) ускладнює використання колонок, заповнених частинками сорбенту розміром 3 та 5 мкм, при використанні водно-метанольних сумішей. Точно так само при градієнтному елюювання колонки, що працюють з системою метанол - вода, піддаються при рівному витраті дії великих тисків і швидше виходять з ладу. Нарешті, не малу роль грає та обставина, що метанол відноситься до групи особливо небезпечних отрут, що знаходяться на строгому контролі і обліку, тоді як ацетонитрил до цієї групи не належить.
До недоліків ацетонітрилу, кілька обмежує його використання, відносяться його досить висока вартість (особливо високочистих сортів, призначених для ВЕРХ та УФ-спектроскопії), деяка токсичність, що вимагає обережності при роботі, а також те, що його важче, ніж метанол, звільняти від води , так як він утворює азеотропную суміш з водою. Це ускладнює його регенерацію з відпрацьованого розчинника, що особливо важливо при великому масштабі роботи, наприклад, при препаративної роботі.
Особливо слід сказати про якість води та про вимоги до неї. Вода, що є в даний час одним з найважливіших розчинників для ВЕРХ, є як самим доступним, так і дуже важким для ретельного очищення розчинником. Якщо для ізократіческіх розділень, особливо при використанні не дуже чутливих шкал і роботі не в ближньому УФ-діапазоні вдається обійтися бидистиллятом (не деіонізі-рова водою!), То для градієнтної роботи та роботи з високочутливими детекторами такої якості води вже недостатньо. Деіонізована вода, як правило, не підходить для використання в ВЕРХ: органічні іоніти, використовувані для вилучення з неї неорганічних іонів, дають воду з дуже низькою провідністю, однак дуже помітно збагачену органічними забрудненнями в порівнянні з водою до деіонізації. Видалити всі органічні сполуки з води дуже важко, особливо мікрокількості - ніяка перегонка або ректифікація не допомагають, тому що внаслідок освіти азеотропні сумішей відокремити домішки органічних сполук не вдається.
Існують системи високого очищення води, що здійснюють деіонізації з подальшим витяганням органічних сполук адсорбентами, проте вони досить дорогі. Розроблено системи, що дозволяють різко зменшити вміст органічних сполук у воді шляхом обробки її потужним УФ-опроміненням, іноді з наступною обробкою адсорбентами. Ці системи дешевше, але не так універсальні. Нарешті, існують патрони, заповнені адсорбентом, розрахованим на витяг органічних сполук з певного об'єму води (зазвичай з 15 л) - вони досить дешеві та зручні, дозволяють отримати рівно стільки очищеної води, скільки потрібно для найближчої роботи. Високочистих вода нестабільна при зберіганні, тому краще її використовувати досить швидко і свіжоприготовлену.
Як же бути в тому випадку, якщо таких систем або патронів в розпорядженні дослідника немає? Тоді слід взяти найбільш чисту воду, наявну в лабораторії, і пропустити її через колонку, заповнену чистим обращеннофазним сорбентом з прищепленої фазою C 18. Всі органічні домішки з води будуть сорбувати на початку колонки, а чиста вода без домішок - накопичуватися в посудині. Після пропускання певного обсягу води, що залежить від кількості органічних забруднень в ній, колонку промивають чистим метанолом або ацетонітрилі, змиваючи забруднення, після чого вона знову готова до роботи.
Можливі різні варіанти такого очищення. Можна просто при використанні градієнта високого тиску встановити колонку з щеплено-фазним сорбентом C 18, бажано не володіє великим гідравлічним опором (з зернового 20 або 15 мкм), після насоса, що подає чисту воду, до змішувача. У цьому випадку колонка буде очищати рівно стільки води, скільки потрібно для роботи, і вода буде найбільша свежеочіщенная. Можна використовувати скляну колонку, заповнивши її більшим препаративних сорбентом (наприклад, 40 - 63 мкм), і подавати воду під гідростатичним тиском, отримуючи стільки води, скільки треба на день роботи. Можна, нарешті, використовувати полупрепаратівную або препаративної колонку для ВЕРХ і качати воду насосом хроматографа, використовуючи для очищення води нічний час, коли аналітична робота не потрібна. Який варіант зручніше, вирішує сам дослідник. Працюючи в градієнтному режимі з водно-метанольних і водно-ацетонітрільнимі розчинами, завжди слід щодня дегазувати розчинники найкращим з можливих способів, особливо якщо використовують градієнт на стороні низького тиску. Ніколи не буде зайвим мати на виході з детектора клапан або гідравлічний опір, що підтримує в кюветі детектора надлишковий тиск близько 0,05 - 0,3 МПа. . Це просте пристосування дозволяє добитися того, що бульбашки повітря, якщо вони й утворюються, утворюються вже після такого клапана, за кюветою детектора, і не заважають роботі.
Розподільна хроматографія з нанесеними фазами
Цей варіант розподільної рідинно-рідинної хроматографії був одним з перших, застосованих для ВЕРХ. Однак на відміну від ГЖХ, де нанесення на носій рідкої нерухомої фази є найбільш популярним методом роботи, що забезпечує більшу частину аналітичних розділень, він не знайшов у ВЕРХ широкого застосування і був витіснений щеплено-фазними сорбентами. Тим не менш, роботи з його використанням проводять, і в деяких випадках застосування розподільчої хроматографії з нанесеними фазами цілком виправдано.
Нерухому фазу і розчинник зазвичай підбирають таким чином, щоб вони були практично взаємно нерозчинні. Це зрозуміло, тому що в противному випадку нанесена фаза буде швидко вимиватися з колонки розчинником. Такими комбінаціями фази і розчинника є, наприклад, трис (ціанетоксі) пропан і гексан, парафінове масло і вода. Однак при роботі з такими системами компоненти зразка, як правило, мають коефіцієнтами розподілу близькими або до нуля, або до нескінченності, тобто або елюіруются з фронтом розчинника без поділу, або затримуються у колонці нескінченно довго. Методи нанесення нерухомої фази можуть бути різними. Фаза може бути розчинена у відповідному розчиннику з низькою температурою кипіння і нанесена методом випаровування, як це роблять в ГЖХ. Фаза може бути нанесена безпосередньо у вигляді рідини або пари. В обох випадках заповнення колонок представляє труднощі, якщо частки сорбенту менше 40 мкм і не можуть бути використані для заповнення «сухим» способом.
Більш популярним є динамічний метод нанесення нерухомої фази. Він полягає в тому, що носій, наприклад силікагель з розміром частинок від 5 до 10 мкм, вносять в колонку звичайним суспензійним способом. На колонку подають заданий об'єм розчину нерухомої фази, потім прокачують розчинник, насичений нерухомою фазою, до встановлення рівноваги. Носій у колонці рівномірно покривається нерухомою фазою, вона знаходиться в рівновазі з насиченим фазою розчинником. Така система буде стабільною і не потребує відновлення через віднесення фази. Насичення розчинника фазою може проводитися в предколонке з тією ж фазою, яка встановлюється після насоса до інжeктоpa і періодично замінної. Недоліки розподільної хроматографії з нанесеними фазами наступні. Неможливо використовувати градієнтну ВЕРХ через віднесення фази. Неможливо працювати у препаративних режимі, тому що зібрані фракції, природно, будуть містити помітну кількість нанесеної фази, що залишається у зразку після упарювання розчинника. Важко змінювати склад розчинника, так як при цьому колонка тривало приходить в новий рівноважний стан з новим розчинником. Утруднене використання підвищених температур для аналізу, так як розчинність нерухомої фази при підвищенні температури помітно зростає. Розчинник, до якого вводиться проба, повинен за складом бути максимально близьким до рухомої фазі, інакше можливі частковий змив веподвіжной фази, хибні піки і порушення процесу хроматографії. Кілька слів про носія і його бажаних характеристиках для розподільної хроматографії з нанесеними фазами. Він повинен мати досить великий обсяг часу, бути при цьому міцним механічно (допускати суспензійний заповнення колонки), мати великі пори і не дуже велику поверхню. Наноситься фаза не повинна бути високов'язкої, щоб не було утрудненого масообміну і зниження ефективності поділу з цієї причини.
Література:
Енгельгардт X. Рідинна хроматографія при високих тисках: Пер. з англ. М., Мир, 1980. 245 с.
Рідинна колонкової хроматографії / Под ред. 3. Дейла, К. Мащека, Я. Янакі. Пер. з англ, (в 3-х томах). М., Мир, 1978.
Остерман Л. А. Хроматографія білків і нуклеїнових кислот. М., Наука, 1985. 536 с. 9 Berendsen GE, DeGalan R. / l. Chromatogr., 1980, v. 196, No. 1, p. 21-37.
4. Cooke NHC, Olsen / (. / J. Chromatogr. Sci., 1980, v. 18, p. 1-12.
5. Scottt CD, Lee NE / J. Chromatogr., 1973, v. 83, p. 383-393.
6. Kabra PM, Marion LJ Liquid Chromatography in Clinical Analysis. Humana Press, Cliftond, 1981. 466 p.
7. Edelson EH, ea / J. Chromatogr., 1979, v. 174, p. 409-419.