Іонообмінна хроматографія
Основи методу
У іонообмінної хроматографії поділ компонентів суміші досягається за рахунок оборотного взаємодії іонізуючих речовин з іонними групами сорбенту. Збереження електронейтральності сорбенту забезпечується наявністю здатних до іонного обміну протиіонів, розташованих у безпосередній близькості до поверхні. Іон введеного зразка, взаємодіючи з фіксованим зарядом сорбенту, обмінюється з протиіонів. Речовини, що мають різний спорідненість до фіксованих зарядом, поділяються на аніонітах або на катіоніту. Аніоніти мають на поверхні позитивно заряджені групи і сорбують з рухомої фази аніони. Катіоніти відповідно містять групи з негативним зарядом, що взаємодіють з катіонами.
В якості рухомої фази використовують водні розчини солей кислот, підстав і розчинники типу рідкого аміаку, тобто системи розчинників, що мають високе значення діелектричної проникності і велику тенденцію іонізувати з'єднання. Зазвичай працюють з буферними розчинами, що дозволяють регулювати значення рН.
При хроматографічному поділі іони аналізованого речовини конкурують з іонами, що містяться в елюент, прагнучи вступати у взаємодію з протилежно зарядженими групами сорбенту. Звідси випливає, що іонообмінну хроматографію можна застосовувати для розділення будь-яких з'єднань, які можуть бути будь-яким чином іонізовані. Можна провести аналіз навіть нейтральних молекул цукрів у вигляді їх комплексів з борат-іоном.
Іонообмінна хроматографія незамінна при поділі ви-сокополярних речовин, які без перекладу в похідні не можуть бути проаналізовані методом ГЖХ. До таких сполук відносяться амінокислоти, пептиди, цукру.
Іонообмінну хроматографію широко застосовують у медицині, біології, біохімії, для контролю навколишнього середовища, при аналізі вмісту ліків та їх метаболітів у крові та сечі, отрутохімікатів в харчовому сировину, а також для розділення неорганічних сполук, в тому числі радіоізотопів, лантаноїдів, актиноїдів та ін . Аналіз біополімерів (білків, нуклеїнових кислот тощо), на який зазвичай витрачали години або дні, за допомогою іонообмінної хроматографії проводять за 20-40 хв з кращим поділом. Застосування іонообмінної хроматографії в біології дозволило спостерігати за зразками безпосередньо в середовищі, зменшуючи можливість перегрупування або ізомеризації, що може призвести до неправильної інтерпретації кінцевого результату. Цікаво використання даного методу для контролю змін, що відбуваються з біологічними рідинами. Застосування пористих слабких аніонообменіков на сілікагелевой основі дозволило розділити пептиди. Механізм іонного обміну можна представити у вигляді наступних рівнянь: для аніонного обміну
X - + R + Y - ↔ Y - + R + X - для катіонного обміну
X + + R - Y + ↔ Y + + R - X +
У першому випадку іон зразка X - конкурує з іоном рухомої фази Y - за іонні центри R + іонообмінника, а в другому в конкуренцію з іонами рухомої фази Y + за іонні центри R - вступають катіони зразка Х +.
Природно, що іони зразка, слабо взаємодіють з іонообмінників, при цій конкуренції будуть слабко утримуватися на колонці і першими вимиваються з неї і, навпаки, більш сильно утримувані іони будуть елюіровать з колонки останніми. В основному виникають вторинні взаємодії неіонної природи за рахунок адсорбції або водневих зв'язків зразка з неіонної частиною матриці або за рахунок обмеженою розчинності зразка в рухомій фазі. Важко виділити «класичну» іонообмінну хроматографію в «чистому» вигляді, і тому деякі хроматографісти виходять з емпіричних, а не теоретичних закономірностей при іонообмінної хроматографії.
Поділ конкретних речовин залежить в першу чергу від вибору найбільш підходящого сорбенту і рухомої фази. У якості нерухомих фаз у іонообмінної хроматографії застосовують іонообмінні смоли і силікагелі з прищепленими йоногенних групами.
Полістирольні іонообмінні смоли для ВЕРХ грануляція 10 мкм і менше володіють селективністю і стабільністю, але сітчаста структура їх, що характеризується відстанню між вузлами сітки 1,5 нм, що значно менше розміру пір застосовується для адсорбційної хроматографії силікагелю (10 нм), уповільнює массообмен і, отже , значно знижує ефективність. Застосовувані в ВЕРХ іонообмінні смоли представляють собою в основному сополімери стиролу і дівінілбензола. Звичайно додають 8-12% останнього. Чим більше зміст ді-вінілбензола, тим більше жорсткість і міцність полімеру, вище ємність і, як правило, селективність і тим менше набухає.
Катіоніти отримують сульфування матриці. Протон, іонносвязанний з сульфо-групою, може переміщатися і навіть йти за межі смоли в розчин. При цьому щоб молекула була в цілому електронейтральної, місце протона займає позитивно заряджений іон, який з розчину переходить в смолу. Наприклад, при дії Na + Cl - на катіоно-обмінну смолу в Н +-формі відбувається реакція обміну:
Смола - SO 4 - H + + Na - → Смола - SO 3 - Na + + H +
Якщо реакція протікає до кінця, то смола знаходиться в натрієвої (іонної) формі.
Аніонообмінні смоли отримують хлоруванням матриці і подальшим алкілі-ням алифатическим аміном.
Найбільш поширені аніоніти, що мають четвертинні амонійні групи, отримані при алкілуванні тріметіламін.
У цих смолах рухливий аніон хлору, який може заміщатися іншим аніоном, наприклад ВІН - Катіоніти зазвичай поставляються в Н +-формі або Nа +-формі, а аніоніти - в ОН --формі або Сl --формі. Таким чином вказується протийон іоно-обмінника. Отримані матеріали, що містять сульфатні або тріалкіламмонійние групи, є сильними катіоннообменнікамі і сильними аніонообмінником і називаються відповідно SCX і SAX. Слабкі катіонообменнік і аніонообменнікі отримують на основі карбоксилату СOO - або аміну NH + 3 відповідно. Існують також рідкі органічні іонообмінники - неомешівающіеся з водою рідини, фізично нанесені на пористі або поверхнево-пористі матеріали. Рідкі аніонообменнікі - високомолекулярні аміни або їх солі, а катіонообменнік-ефіри фосфорної або фосфінових кислот.
Для поліпшення умов поділу в іонообмінної хроматографії іноді отримують лігандні комплекси іонів, змінюючи при цьому їх полярність
Fe 3 + + 4Cl - ↔ FeCl 4 - і ділять на аніонообмінної носії аніони заліза. Так як селективність смоли залежить від характеру протівоіона, часто необхідно змінити форму смоли. Протівоіони пов'язані кулоновскими силами взаємного притягання з іонообмінними групами і екранують їх заряд. Це тяжіння залежить від фізичної природи протівоіона, розмірів, форми, щільності електронних оболонок. Одні протівоіони при рівності концентрацій можуть витісняти інші із зв'язку з іонними групами іонообмінника. Нижче наведені ряди протиіонів в порядку спадання активності та зменшення спорідненості до іонообмінної смолі.
Знати ці ряди корисно для вибору системи елюювання. Найбільш швидкий метод перетворення аніоніта у форму, яка в ряду селективності стоїть вище вихідної, полягає в промиванні її чотирикратним об'ємом 1 М розчину відповідної солі. Якщо для роботи необхідна форма слабкіше вихідної, то її спочатку переводять в гідроксильну форму, промиваючи 20-кратним кількостей 1 М розчину NaOH, а потім вже перетворюють на потрібну форму. Катіоніти переводять в необхідну форму промиванням 1 М розчином нітрату відповідного металу.
При зміні іонної форми смоли або в присутності органічних розчинників, таких, як ацетонітрил, тетрагідрофуран, може змінюватися і обсяг смоли. Якщо смола зменшується в об'ємі, упаковка у колонці осідає і утворюється мертвий об'єм нагорі колонки. Це осідання супроводжується втратою ефективності. Якщо смола набухає та пакування у колонці збільшується, то зростає опір у колонці, значно зменшує швидкість потоку і може навіть призвести до руйнування
сорбенту. Невисока стабільність йоногенних матеріалів є одним з недоліків іонообмінної хроматографії, причому аніонообменнікі менш стабільні, ніж катіонообменнік. Для збільшення терміну служби колонок використовують предколонкі, а також регенерацію колонок сильним розчинником. Катіоніти, наприклад, регенерують обробляючи 1 М азотною кислотою і тривало промиваючи тієї рухомою фазою, яка буде використана.
Іонообмінники характеризуються ступенем набухання і ємністю. Ступенем набухання називають обсяг упакованого в колону обмінника (в мл), який припадає на 1 г його в сухому вигляді, і має розмірність мл / г. Максимальна кількість іонів, що може зв'язати іонообмінник, визначає його ємність, яка збігається з концентрацією йоногенних груп. Ємність виражається числах ммоль еквівалентів обмінюваного іона на 1 г сухого обмінника (ммоль екв / г) або на 1 мл упакованого в колону набряклого іонообмінника (ммоль екв / мл) при значеннях рН, що відповідають його повної іонізації. Для високомолекулярних іонів або амфоліти, наприклад білків, вводять поняття «ефективна» ємність, кoтоpaя залежить від розміру молекули амфоліти, відстані між йоногенних групами і ступеня доступності всього обсягу пористої матриці обмінника для цих молекул. Поняття ємності та ефективної ємності можуть не збігатися. Іноді доводиться знижувати корисну ємність сорбенту за рахунок зміни рН, збільшуючи при цьому його ефективну ємність. Катіонообмінні смоли мають ємність близько 4,4 ммоль екв / г, а аніонообмінні - 3,5-4 ммоль екв / г для гелеобразной структури і 2,5 ммоль екв / г для пористої. Обмінна ємність змінюється при зміні рН. При низьких рН відбувається нейтралізація катіоніту при додаванні протона:
R - + H + ↔ R - H +,
а при високих рН подібним чином при дії лугу нейтралізуються аніоніти:
R + + OH - ↔ R + OH -.
Оскільки іонообмінна ємність сильних катіонітів падає до нуля при низьких рН, вони не можуть бути використані при рН <1. Сильні аніоніти повинні застосовуватися при рН <11, слабкі катіоніти при рН> 6, а слабкі аніоніти при рН <8. З малюнка видно, що сильні іонообмінники можуть бути використані в більш широкому діапазоні рН, ніж слабкі. Цим пояснюється широке застосування сильних іонітів, на яких може бути розділене більшу кількість речовин різних класів одночасно, особливо якщо використовується градієнтне зміна рН. Сильно утримувані речовини, нестійкі при крайніх зна ченіях рН, можуть розділятися на слабких іонітах. Ще раз підкреслимо, що сильні іоніти повністю іонізовані в діапазоні рН = 2-11. Слабкі іоніти повністю іонізовані в обмеженій області рН, і їх іонізацією можна управляти, змінюючи рН елюента в межах діапазону робочих значень рН.
Таким чином, до категорії слабких можуть бути віднесені іонообмінники, значно відрізняються один від одного. Для них характерно не толико звуження робочого діапазону рН, а й зменшення міцності сорбції речовини всередині цього діапазону. Слабким іонообмінниками, зокрема аніоніта з замещающими групами діетіламіноетіла (ДЕАЕ), віддають перевагу в тих випадках, коли необхідно елюювання в м'яких умовах, наприклад, при поділі білків і пептидів.
Найбільший інтерес в якості сорбентів для іонообмінної хроматографії представляє хімічно модифікований силікагель, одержуваний щепленням до силікагель йоногенних груп.
Таблиця 1. Характеристика модифікованих силікагелів і іонообмінних смол
Застосування цих матеріалів значно збільшує стабільність роботи колонок, в яких не відбувається зміни ефективності. Однак сильнокислому або сильноосновними середовища (2> рН> 7,5) можуть впливати на силікагель, виводячи з ладу колонку. Щеплені до силікагель іонообмінники можуть бути нестабільні при дії органічних розчинників, концентрованих буферних розчинів, високих температур. Іонообмінні силікагелі грануляція 10 або 5 мм не набухають, не стискуються, як смоли, і відрізняються від них більшою за розміром і доступністю внутрішніх пір як для іонів зразка, так і для протиіонів. Завдяки цьому швидше встановлюється масоперенос навіть без підвищення температури і значно зростає ефективність сорбенту.
Не існує слабких катіонітів на основі силікагелю, тому що при рН <8 матеріал не іонізований, а при рН> 8 руйнується підкладка наповнювального матеріалу. Порівняльні характеристики модифікованих силікагелів і іонообмінних смол, що застосовуються в іонообмінної хроматографії, наведено в табл. 1.
Вибір рухомої фази та умов поділу
Рухома фаза у іонообмінної хроматографії повинна забезпечувати розчинність різних солей і створення буферного розчину, необхідних для іонного обміну, контроль за ступенем утримування зразка за рахунок використання розчинника потрібної сили, отримання необхідної селективності розділення.
Іонообмінне, поділ зазвичай виконують при застосуванні водних розчинів солей, яким надаються буферні властивості. Іноді додають у рухливу фазу невелика кількість смешивающихся з водою органічних розчинників - метанолу, етанолу, ацетонітрилу, тетрагідрофуран. Сила і селективність розчинника залежать від типу і концентрації буферних іонів та інших солей, від значення рН і від виду та концентрації доданих органічних розчинників.
Утримання в іонообмінної хроматографії залежить від двох процесів: розподілу зразка між водної рухомою фазою та органічної нерухомою і освіти іонних пар (тобто аніонного або катіонного обміну), причому останній процес домінує.
Розподіл речовини між фазами залежить від сили електростатичної взаємодії заряджених іонізованих груп речовини із зарядженими групами іонообмінника. Деякі гідрофобні сполуки або речовини, здатні утворювати водневі зв'язки, можуть взаємодіяти з матеріалом матриці неспецифічно.
Ступінь утримування зразка знижується зі збільшенням іонної сили рухомої фази і збільшується зі збільшенням іонообмінної ємності сорбенту. Іонна сила рухомої фази зростає при зростанні концентрації буфера і збереженні незмінним рН або при додаванні солі. Важлива також концентрація буферних розчинів, так як у розчині спостерігається конкуренція між іонами зразка і буфера. Зменшення концентрації буферного розчину збільшує спорідненість смоли до зразка, що призводить до збільшення часу утримування. Концентрація буферного розчину коливається від 0,001 до 6 моль / л, причому верхня межа визначається розчинністю солі, використовуваної в якості буфера, а нижня - самої буферної силою, тому що в слабкому буферному розчині не можна контролювати рівень рН. Сильних буферних розчинів також слід уникати, так як можливе випадання осаду і забивання колонок. Сила розчинника залежить від типу протівоіона, причому ступінь утримування зразка збільшується в ряду, зворотному ряду активності іонів, наведеною вище.
При аналізі рН розчину вибирають таким чином, щоб молекула зразка була повністю іонізована, зазвичай для кислот рН ≅ рКα +1,5, а для основ рН ≅ рКα +1,5. Зміна рН рухомої фази впливає на утримування зразка. Воно з підвищенням рН збільшується при аніонообмінної поділі і зменшується при катіонообмінної, тобто відбувається зменшення сили розчинника при аніонної та збільшення при катіон-ном обміні. Особливо сильно впливає зміна рН розчину, що відбувається поблизу значень рКα зразка.
У іонообмінної хроматографії застосовують такі буферні розчини: ацетатний, фосфатний, цитратний, форміатний, аміачний, боратний. Селективність розділення в іонообмінної хроматографії залежить від концентрації і виду буферних іонів і органічних розчинників, а також від рН середовища. Іонообмінне поділ проходить в межах температур від кімнатної до 60 ° С. Чим вище температура, тим менше в'язкість рухомої фази і тим ефективніше розділення. Однак при високій температурі стабільність колонки або зразка може бути порушена. Багато іоно-обмінники витримують температуру до 60 ° С, а деякі полімерні катіонообмен-ники - навіть до 80 ° С. Біохімічні проби прийнято розрізняти при низьких температурах, часто при 4 ° С, хоча в сучасній ВЕРХ при швидких поділах ймовірність руйнування зразка при 20-30 ° С різко знижується. Підвищення температури може призвести до зниження k 'для всіх компонентів зразка, а зниження іонної сили рухомої фази може привести до зворотного явища.
Введені кількості зразка не повинні перевищувати 5% сумарної іонообмінної ємності. Так, для сполук з молекулярною масою 200-500 передбачається введення близько 50 мг проби на 1 г полімерного сорбенту. Бажано, щоб пароль, обсяг зразка не перевищував 1 / 3 обсягу першого цікавить піку.
У рухливу фазу додають іноді органічні розчинники (метанол, етанол, ацетонітрил, діоксан), дія яких аналогічно додаванню розчинників в обернено-фазною хроматографії: при збільшенні їх кількості ступінь утримування зразка знижується, і цей ефект більш сильний для менш полярних розчинників. Додаванням органічних розчинників можна добитися також зміни селективності системи. Таким чином, знижують час утримування в іонообмінної хроматографії наступні фактори: 1) підвищення температури; 2) підвищення концентрації буферного розчину, 3) зниження ступеня іонізації речовини за рахунок зміни рН.
Іонна хроматографія
Особливим видом іонообмінної хроматографії, застосовуваним для аналізу органічних і неорганічних іонів, не поглинають в УФ-області, є іонна хроматографія. У цьому методі іонообмінне поділ іонів поєднують з кондукт-метричним визначенням їх. Оскільки високочутливе кондуктометричного визначення можливе тільки при невисокій фонової електропровідності потоку рідини, що надходить в детектор, фоновий електроліт рухомої фази попередньо видаляють пропусканням його через іонообмінні смоли.
Запропоновано два основні методи іонної хроматографії.
1. Двухколоночних іонна хроматографія, заснована на компенсації (придушенні) електроліту, що міститься в елюент для розділення суміші іонів на колонці з допомогою другої іонообмінної колонки, розташованої між детектором і роздягли тельной колонкою. Цей метод і був раніше названий іонною хроматографією.
Речовини поділяються на катіонообмінної колонці 4 по іонообмінному механізму, потрапляють в десорбціонную колонку 5 зі смолою в ОН-формі, де відбувається нейтралізація рухомої фази і видалення електроліту з елюента. Аналізовані речовини виходять з колонки 5 в деіонізіванной воді і потрапляють в кондуктометричну кювету 6. Сигнал з кондуктометр 7 надходить на самописець 8 або інтегратор. На аналогічній установці аналізують аніони. Так як десорбціонную колонку доводиться часто регенерувати, відношення обсягів, пропущених через колонку 5, до обсягів, допущеним через колонку 4, повинно бути менше або дорівнює 1O. Пропозицій схеми поділу для іонної хроматографії і варіанти заповнення розділової і десорбується колонок.
2. Іншим варіантом іонної хроматографії є одноколоночная іонна хроматографія, заснована на використанні електроліту з невисокою електропровідністю. У цьому випадку компенсаційна колонка відсутня.
Метод детально не розглядається нами, тому що є ряд непоганих оглядів з іонної хроматографії [17, 18].
Іонні хроматографи від простих до повністю автоматичних випускають фірми «Даонекс корпорейшн», «Бекман» (США) та ін У СРСР іонні хроматографи серійно випускаються Дзержинського Окба. Методом іон-хроматографії визначають незабарвлені аніони і катіони, що знаходяться у зразку у вигляді домішок, і мікрокількостей шкідливих речовин у воді, повітрі та біологічних рідинах.
Рис. 1. Схема установки для аналізу катіонів методом іонної хроматографії: 1 - ємність з елюентом; 2 - насос: 3 - введення проби; 4 - роздільна колонка, 5 - десорбується колонка; 6 - кондуктометрична кювету; 7 - кондуктометричний детектор; 8 - самописець
Практичні рекомендації
Іонообмінна хроматографія в експериментальному відношенні - один з найважчих видів ВЕРХ, тому що є багато параметрів, які необхідно враховувати і контролювати.
Якщо аналіз необхідно вести при рН нижче 2 або вище 7,5, то повинна бути застосована відповідна аніонна або катіонна смола, а в інших випадках - сілікатель з прищепленої іонообмінної смолою.
Для аналізу молекул з молекулярною масою до 2000 застосовують іонообмінники з хімічно прищепленої фазою до силікагелі з розміром частинок 5-10 мкм, а при препаративної поділі можна застосовувати полімерні пористі сорбенти типу даррум ДА-Х8. При поділі великих молекул з молекулярною масою 2000 застосовують слабоосновний іоніти, щеплений на великопористий силікагель.
Швидкість елюента зазвичай встановлюють 1 мл / хв, температуру 50 ° С або кімнатну, якщо контроль температури незручний, а рН підбирають так, щоб компоненти були іонізовані.
Так як в іонообмінної хроматографії ізотерми не паралельні, необхідно знайти оптимальну для кожного частотного поділу температуру, змінюючи її з инкрементом 10 ° С. Зазвичай дотримуються середини знайденого інтервалу оптимальних температур, контролюючи її з точністю 1 ° С.
Для створення певного рН та підтримання на необхідному рівні готують відповідний буферний розчин. Якщо це можливо, то буферний розчин підбирають таким чином, щоб його функціональна група була схожа на функціональну групу зразка. Так, ацетатний буферний розчин прийнятний для аналізу карбонових кислот, фосфатний - для люірованія нуклеотидів. Велике значення має чистота буферного розчину, тому що він не повинен детектуватиметься обраним детектором, що особливо важливо при роботі в режимі градієнтного елюювання. Чистота буферного розчину залежить від фірм-виробників, і навіть різні партії однієї фірми можуть відрізнятися за складом. Кожна нова партія буферного розчину тестується двома холостими хроматографічними дослідами перед використанням. Другий досвід показує, чи існують речовини, відклалися в колонці в процесі регенерації або протягом останніх стадій попереднього градієнта. Хоча більшість розділень проводять у водних буферних розчинах, іноді додають органічний розчинник (метанол, етанол) у кількості 3-10% для підвищення селективності і поліпшення розчинності зразка. При цьому концентрація розчинника не повинна бути велика, щоб не видати осадження буферної солі, про що буде свідчити поява течі в системі і збільшення опору в колонці.
При роботі в градієнтному режимі бажано, щоб до кінця поділу іонна сила буферного розчину підвищувалася. Починають працювати з концентрації буферного розчину 0,1 M, так як оптимізація розподілу при роботі з низькими концентраціями (0,001 М) забирає багато часу. Якщо за цих умов речовини не вдається задовільно розділити, то подальше поліпшення поділу відбувається за рахунок зниження концентрації буферного розчину, зміни рН або температури кроковим методом, що призводять до підвищення значень k 'і збільшення часу утримування.
Часто в буферний розчин для регулювання сили рухомої фази додають нейтральні солі. Особливою популярністю користується нітрат натрію, оскільки він не викликає корозії апаратури. Галогенід-іони мають шкідливий вплив на нержавіючу сталь, і тому їх краще не застосовувати.
Порівнюючи сорбенти, призначені для іонообмінної хроматографії, з сорбентами, застосовуваними в інших варіантах ВЕРХ, можна відзначити ряд недоліків у перших.
Застосовувані в іонообмінної хроматографії сорбенти менш ефективні і стабільні, а також менш відтворювані, Поліпшити ефективність розділення йоногенних з'єднань можна, підвищивши температуру до 60 ° С, змінивши рН, додавши органічний розчинник або перейшовши від іонообмінної хроматографії до роботи в режимі іон-парної хроматографії або обернено -фазної хроматографії з використанням методу придушення іонів.
Підвищення стабільності досягають за рахунок очищення зразка, зменшення температури і рН, зниження кількості органічних розчинників. Для рутинного аналізу і кращої відтворюваності бажано використовувати колонки, набиті в лабораторії.
Література
1. Krstulovic AM, Brown PR Reversed-Phase Liquid Chromatography; Theory, Practice and Biomedical Applications. J. Wiley. NY, 1982. 296 p.
2. Hamaji M., Seki Г. / J. Chromatogr., Biomed. Appl., 1979, v. 163, p. 329 - 336.
3. Фрітц Дж., Гьерзе Д.Г., Поланд К. Іонна хроматографія: Пер. з англ. / Под ред. В.Г. Березкіна. М., Мир, 1984. 224 с.
4. Шпигун О.А., Золоте Ю.Л. / Зав. лаб., 1982, т. 48, № 9, с. 4.
5. Small Я. / Anal. Chem., 1983, v. 55, p. 235A.
6. Бєлєнький Б.Г., Виленчик Л. 3. Хроматографія полімерів. М., Хімія, 1978. 344 с.
7. Van W., Kirkland J., Bly D. Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography. NY, J. Wiley, 1979. 476 p.
8. Нефедов П.П., Лавренко П.М. Транспортні методи в аналітичній хімії полімерів. Л., Хімія, 1979. 232 с.
9. Тенніков М.Б. і dp. / Високомол. соед., 1977, т. А19, № 3, с. 657 - 660.
10. Mori S., Suzuki T. / Anal. Chem, 1980, v. 52, No. 11, p. 1625-1629.
Основи методу
У іонообмінної хроматографії поділ компонентів суміші досягається за рахунок оборотного взаємодії іонізуючих речовин з іонними групами сорбенту. Збереження електронейтральності сорбенту забезпечується наявністю здатних до іонного обміну протиіонів, розташованих у безпосередній близькості до поверхні. Іон введеного зразка, взаємодіючи з фіксованим зарядом сорбенту, обмінюється з протиіонів. Речовини, що мають різний спорідненість до фіксованих зарядом, поділяються на аніонітах або на катіоніту. Аніоніти мають на поверхні позитивно заряджені групи і сорбують з рухомої фази аніони. Катіоніти відповідно містять групи з негативним зарядом, що взаємодіють з катіонами.
В якості рухомої фази використовують водні розчини солей кислот, підстав і розчинники типу рідкого аміаку, тобто системи розчинників, що мають високе значення діелектричної проникності і велику тенденцію іонізувати з'єднання. Зазвичай працюють з буферними розчинами, що дозволяють регулювати значення рН.
При хроматографічному поділі іони аналізованого речовини конкурують з іонами, що містяться в елюент, прагнучи вступати у взаємодію з протилежно зарядженими групами сорбенту. Звідси випливає, що іонообмінну хроматографію можна застосовувати для розділення будь-яких з'єднань, які можуть бути будь-яким чином іонізовані. Можна провести аналіз навіть нейтральних молекул цукрів у вигляді їх комплексів з борат-іоном.
Іонообмінна хроматографія незамінна при поділі ви-сокополярних речовин, які без перекладу в похідні не можуть бути проаналізовані методом ГЖХ. До таких сполук відносяться амінокислоти, пептиди, цукру.
Іонообмінну хроматографію широко застосовують у медицині, біології, біохімії, для контролю навколишнього середовища, при аналізі вмісту ліків та їх метаболітів у крові та сечі, отрутохімікатів в харчовому сировину, а також для розділення неорганічних сполук, в тому числі радіоізотопів, лантаноїдів, актиноїдів та ін . Аналіз біополімерів (білків, нуклеїнових кислот тощо), на який зазвичай витрачали години або дні, за допомогою іонообмінної хроматографії проводять за 20-40 хв з кращим поділом. Застосування іонообмінної хроматографії в біології дозволило спостерігати за зразками безпосередньо в середовищі, зменшуючи можливість перегрупування або ізомеризації, що може призвести до неправильної інтерпретації кінцевого результату. Цікаво використання даного методу для контролю змін, що відбуваються з біологічними рідинами. Застосування пористих слабких аніонообменіков на сілікагелевой основі дозволило розділити пептиди. Механізм іонного обміну можна представити у вигляді наступних рівнянь: для аніонного обміну
X - + R + Y - ↔ Y - + R + X - для катіонного обміну
X + + R - Y + ↔ Y + + R - X +
У першому випадку іон зразка X - конкурує з іоном рухомої фази Y - за іонні центри R + іонообмінника, а в другому в конкуренцію з іонами рухомої фази Y + за іонні центри R - вступають катіони зразка Х +.
Природно, що іони зразка, слабо взаємодіють з іонообмінників, при цій конкуренції будуть слабко утримуватися на колонці і першими вимиваються з неї і, навпаки, більш сильно утримувані іони будуть елюіровать з колонки останніми. В основному виникають вторинні взаємодії неіонної природи за рахунок адсорбції або водневих зв'язків зразка з неіонної частиною матриці або за рахунок обмеженою розчинності зразка в рухомій фазі. Важко виділити «класичну» іонообмінну хроматографію в «чистому» вигляді, і тому деякі хроматографісти виходять з емпіричних, а не теоретичних закономірностей при іонообмінної хроматографії.
Поділ конкретних речовин залежить в першу чергу від вибору найбільш підходящого сорбенту і рухомої фази. У якості нерухомих фаз у іонообмінної хроматографії застосовують іонообмінні смоли і силікагелі з прищепленими йоногенних групами.
Полістирольні іонообмінні смоли для ВЕРХ грануляція 10 мкм і менше володіють селективністю і стабільністю, але сітчаста структура їх, що характеризується відстанню між вузлами сітки 1,5 нм, що значно менше розміру пір застосовується для адсорбційної хроматографії силікагелю (10 нм), уповільнює массообмен і, отже , значно знижує ефективність. Застосовувані в ВЕРХ іонообмінні смоли представляють собою в основному сополімери стиролу і дівінілбензола. Звичайно додають 8-12% останнього. Чим більше зміст ді-вінілбензола, тим більше жорсткість і міцність полімеру, вище ємність і, як правило, селективність і тим менше набухає.
Катіоніти отримують сульфування матриці. Протон, іонносвязанний з сульфо-групою, може переміщатися і навіть йти за межі смоли в розчин. При цьому щоб молекула була в цілому електронейтральної, місце протона займає позитивно заряджений іон, який з розчину переходить в смолу. Наприклад, при дії Na + Cl - на катіоно-обмінну смолу в Н +-формі відбувається реакція обміну:
Смола - SO 4 - H + + Na - → Смола - SO 3 - Na + + H +
Якщо реакція протікає до кінця, то смола знаходиться в натрієвої (іонної) формі.
Аніонообмінні смоли отримують хлоруванням матриці і подальшим алкілі-ням алифатическим аміном.
Найбільш поширені аніоніти, що мають четвертинні амонійні групи, отримані при алкілуванні тріметіламін.
У цих смолах рухливий аніон хлору, який може заміщатися іншим аніоном, наприклад ВІН - Катіоніти зазвичай поставляються в Н +-формі або Nа +-формі, а аніоніти - в ОН --формі або Сl --формі. Таким чином вказується протийон іоно-обмінника. Отримані матеріали, що містять сульфатні або тріалкіламмонійние групи, є сильними катіоннообменнікамі і сильними аніонообмінником і називаються відповідно SCX і SAX. Слабкі катіонообменнік і аніонообменнікі отримують на основі карбоксилату СOO - або аміну NH + 3 відповідно. Існують також рідкі органічні іонообмінники - неомешівающіеся з водою рідини, фізично нанесені на пористі або поверхнево-пористі матеріали. Рідкі аніонообменнікі - високомолекулярні аміни або їх солі, а катіонообменнік-ефіри фосфорної або фосфінових кислот.
Для поліпшення умов поділу в іонообмінної хроматографії іноді отримують лігандні комплекси іонів, змінюючи при цьому їх полярність
Fe 3 + + 4Cl - ↔ FeCl 4 - і ділять на аніонообмінної носії аніони заліза. Так як селективність смоли залежить від характеру протівоіона, часто необхідно змінити форму смоли. Протівоіони пов'язані кулоновскими силами взаємного притягання з іонообмінними групами і екранують їх заряд. Це тяжіння залежить від фізичної природи протівоіона, розмірів, форми, щільності електронних оболонок. Одні протівоіони при рівності концентрацій можуть витісняти інші із зв'язку з іонними групами іонообмінника. Нижче наведені ряди протиіонів в порядку спадання активності та зменшення спорідненості до іонообмінної смолі.
Знати ці ряди корисно для вибору системи елюювання. Найбільш швидкий метод перетворення аніоніта у форму, яка в ряду селективності стоїть вище вихідної, полягає в промиванні її чотирикратним об'ємом 1 М розчину відповідної солі. Якщо для роботи необхідна форма слабкіше вихідної, то її спочатку переводять в гідроксильну форму, промиваючи 20-кратним кількостей 1 М розчину NaOH, а потім вже перетворюють на потрібну форму. Катіоніти переводять в необхідну форму промиванням 1 М розчином нітрату відповідного металу.
При зміні іонної форми смоли або в присутності органічних розчинників, таких, як ацетонітрил, тетрагідрофуран, може змінюватися і обсяг смоли. Якщо смола зменшується в об'ємі, упаковка у колонці осідає і утворюється мертвий об'єм нагорі колонки. Це осідання супроводжується втратою ефективності. Якщо смола набухає та пакування у колонці збільшується, то зростає опір у колонці, значно зменшує швидкість потоку і може навіть призвести до руйнування
сорбенту. Невисока стабільність йоногенних матеріалів є одним з недоліків іонообмінної хроматографії, причому аніонообменнікі менш стабільні, ніж катіонообменнік. Для збільшення терміну служби колонок використовують предколонкі, а також регенерацію колонок сильним розчинником. Катіоніти, наприклад, регенерують обробляючи 1 М азотною кислотою і тривало промиваючи тієї рухомою фазою, яка буде використана.
Іонообмінники характеризуються ступенем набухання і ємністю. Ступенем набухання називають обсяг упакованого в колону обмінника (в мл), який припадає на 1 г його в сухому вигляді, і має розмірність мл / г. Максимальна кількість іонів, що може зв'язати іонообмінник, визначає його ємність, яка збігається з концентрацією йоногенних груп. Ємність виражається числах ммоль еквівалентів обмінюваного іона на 1 г сухого обмінника (ммоль екв / г) або на 1 мл упакованого в колону набряклого іонообмінника (ммоль екв / мл) при значеннях рН, що відповідають його повної іонізації. Для високомолекулярних іонів або амфоліти, наприклад білків, вводять поняття «ефективна» ємність, кoтоpaя залежить від розміру молекули амфоліти, відстані між йоногенних групами і ступеня доступності всього обсягу пористої матриці обмінника для цих молекул. Поняття ємності та ефективної ємності можуть не збігатися. Іноді доводиться знижувати корисну ємність сорбенту за рахунок зміни рН, збільшуючи при цьому його ефективну ємність. Катіонообмінні смоли мають ємність близько 4,4 ммоль екв / г, а аніонообмінні - 3,5-4 ммоль екв / г для гелеобразной структури і 2,5 ммоль екв / г для пористої. Обмінна ємність змінюється при зміні рН. При низьких рН відбувається нейтралізація катіоніту при додаванні протона:
R - + H + ↔ R - H +,
а при високих рН подібним чином при дії лугу нейтралізуються аніоніти:
R + + OH - ↔ R + OH -.
Оскільки іонообмінна ємність сильних катіонітів падає до нуля при низьких рН, вони не можуть бути використані при рН <1. Сильні аніоніти повинні застосовуватися при рН <11, слабкі катіоніти при рН> 6, а слабкі аніоніти при рН <8. З малюнка видно, що сильні іонообмінники можуть бути використані в більш широкому діапазоні рН, ніж слабкі. Цим пояснюється широке застосування сильних іонітів, на яких може бути розділене більшу кількість речовин різних класів одночасно, особливо якщо використовується градієнтне зміна рН. Сильно утримувані речовини, нестійкі при крайніх зна ченіях рН, можуть розділятися на слабких іонітах. Ще раз підкреслимо, що сильні іоніти повністю іонізовані в діапазоні рН = 2-11. Слабкі іоніти повністю іонізовані в обмеженій області рН, і їх іонізацією можна управляти, змінюючи рН елюента в межах діапазону робочих значень рН.
Таким чином, до категорії слабких можуть бути віднесені іонообмінники, значно відрізняються один від одного. Для них характерно не толико звуження робочого діапазону рН, а й зменшення міцності сорбції речовини всередині цього діапазону. Слабким іонообмінниками, зокрема аніоніта з замещающими групами діетіламіноетіла (ДЕАЕ), віддають перевагу в тих випадках, коли необхідно елюювання в м'яких умовах, наприклад, при поділі білків і пептидів.
Найбільший інтерес в якості сорбентів для іонообмінної хроматографії представляє хімічно модифікований силікагель, одержуваний щепленням до силікагель йоногенних груп.
Таблиця 1. Характеристика модифікованих силікагелів і іонообмінних смол
| Характеристика | Силікагель | Смола (сополімери полістиролу з дівінілбензолом) |
| Типовий діаметр частинки в мкм | 5-10 | 7-10 |
| Типова іонообмінна ємність, в мекв / г | 0,5-2 | 3-5 |
| Стійкість до деформації тиском | Дуже гарна | Від задовільною до поганою (у залежності від ступеня зшивання) |
| Форма | Сферична або неправильна | Сферична |
| Перепад тиску на колонці | Високий | Дуже високий |
| Ефективність | Висока | Низька |
| Метод набивання | Суспензійний | Суспензійний |
| Діапазон рН | 2-7,5 | 0-12 (аніонообмінні) 0-14 (катіонообмінні) |
| Швидкість регенерування | Помірна | Повільна |
Не існує слабких катіонітів на основі силікагелю, тому що при рН <8 матеріал не іонізований, а при рН> 8 руйнується підкладка наповнювального матеріалу. Порівняльні характеристики модифікованих силікагелів і іонообмінних смол, що застосовуються в іонообмінної хроматографії, наведено в табл. 1.
Вибір рухомої фази та умов поділу
Рухома фаза у іонообмінної хроматографії повинна забезпечувати розчинність різних солей і створення буферного розчину, необхідних для іонного обміну, контроль за ступенем утримування зразка за рахунок використання розчинника потрібної сили, отримання необхідної селективності розділення.
Іонообмінне, поділ зазвичай виконують при застосуванні водних розчинів солей, яким надаються буферні властивості. Іноді додають у рухливу фазу невелика кількість смешивающихся з водою органічних розчинників - метанолу, етанолу, ацетонітрилу, тетрагідрофуран. Сила і селективність розчинника залежать від типу і концентрації буферних іонів та інших солей, від значення рН і від виду та концентрації доданих органічних розчинників.
Утримання в іонообмінної хроматографії залежить від двох процесів: розподілу зразка між водної рухомою фазою та органічної нерухомою і освіти іонних пар (тобто аніонного або катіонного обміну), причому останній процес домінує.
Розподіл речовини між фазами залежить від сили електростатичної взаємодії заряджених іонізованих груп речовини із зарядженими групами іонообмінника. Деякі гідрофобні сполуки або речовини, здатні утворювати водневі зв'язки, можуть взаємодіяти з матеріалом матриці неспецифічно.
Ступінь утримування зразка знижується зі збільшенням іонної сили рухомої фази і збільшується зі збільшенням іонообмінної ємності сорбенту. Іонна сила рухомої фази зростає при зростанні концентрації буфера і збереженні незмінним рН або при додаванні солі. Важлива також концентрація буферних розчинів, так як у розчині спостерігається конкуренція між іонами зразка і буфера. Зменшення концентрації буферного розчину збільшує спорідненість смоли до зразка, що призводить до збільшення часу утримування. Концентрація буферного розчину коливається від 0,001 до 6 моль / л, причому верхня межа визначається розчинністю солі, використовуваної в якості буфера, а нижня - самої буферної силою, тому що в слабкому буферному розчині не можна контролювати рівень рН. Сильних буферних розчинів також слід уникати, так як можливе випадання осаду і забивання колонок. Сила розчинника залежить від типу протівоіона, причому ступінь утримування зразка збільшується в ряду, зворотному ряду активності іонів, наведеною вище.
При аналізі рН розчину вибирають таким чином, щоб молекула зразка була повністю іонізована, зазвичай для кислот рН ≅ рКα +1,5, а для основ рН ≅ рКα +1,5. Зміна рН рухомої фази впливає на утримування зразка. Воно з підвищенням рН збільшується при аніонообмінної поділі і зменшується при катіонообмінної, тобто відбувається зменшення сили розчинника при аніонної та збільшення при катіон-ном обміні. Особливо сильно впливає зміна рН розчину, що відбувається поблизу значень рКα зразка.
У іонообмінної хроматографії застосовують такі буферні розчини: ацетатний, фосфатний, цитратний, форміатний, аміачний, боратний. Селективність розділення в іонообмінної хроматографії залежить від концентрації і виду буферних іонів і органічних розчинників, а також від рН середовища. Іонообмінне поділ проходить в межах температур від кімнатної до 60 ° С. Чим вище температура, тим менше в'язкість рухомої фази і тим ефективніше розділення. Однак при високій температурі стабільність колонки або зразка може бути порушена. Багато іоно-обмінники витримують температуру до 60 ° С, а деякі полімерні катіонообмен-ники - навіть до 80 ° С. Біохімічні проби прийнято розрізняти при низьких температурах, часто при 4 ° С, хоча в сучасній ВЕРХ при швидких поділах ймовірність руйнування зразка при 20-30 ° С різко знижується. Підвищення температури може призвести до зниження k 'для всіх компонентів зразка, а зниження іонної сили рухомої фази може привести до зворотного явища.
Введені кількості зразка не повинні перевищувати 5% сумарної іонообмінної ємності. Так, для сполук з молекулярною масою 200-500 передбачається введення близько 50 мг проби на 1 г полімерного сорбенту. Бажано, щоб пароль, обсяг зразка не перевищував 1 / 3 обсягу першого цікавить піку.
У рухливу фазу додають іноді органічні розчинники (метанол, етанол, ацетонітрил, діоксан), дія яких аналогічно додаванню розчинників в обернено-фазною хроматографії: при збільшенні їх кількості ступінь утримування зразка знижується, і цей ефект більш сильний для менш полярних розчинників. Додаванням органічних розчинників можна добитися також зміни селективності системи. Таким чином, знижують час утримування в іонообмінної хроматографії наступні фактори: 1) підвищення температури; 2) підвищення концентрації буферного розчину, 3) зниження ступеня іонізації речовини за рахунок зміни рН.
Іонна хроматографія
Особливим видом іонообмінної хроматографії, застосовуваним для аналізу органічних і неорганічних іонів, не поглинають в УФ-області, є іонна хроматографія. У цьому методі іонообмінне поділ іонів поєднують з кондукт-метричним визначенням їх. Оскільки високочутливе кондуктометричного визначення можливе тільки при невисокій фонової електропровідності потоку рідини, що надходить в детектор, фоновий електроліт рухомої фази попередньо видаляють пропусканням його через іонообмінні смоли.
Запропоновано два основні методи іонної хроматографії.
1. Двухколоночних іонна хроматографія, заснована на компенсації (придушенні) електроліту, що міститься в елюент для розділення суміші іонів на колонці з допомогою другої іонообмінної колонки, розташованої між детектором і роздягли тельной колонкою. Цей метод і був раніше названий іонною хроматографією.
Речовини поділяються на катіонообмінної колонці 4 по іонообмінному механізму, потрапляють в десорбціонную колонку 5 зі смолою в ОН-формі, де відбувається нейтралізація рухомої фази і видалення електроліту з елюента. Аналізовані речовини виходять з колонки 5 в деіонізіванной воді і потрапляють в кондуктометричну кювету 6. Сигнал з кондуктометр 7 надходить на самописець 8 або інтегратор. На аналогічній установці аналізують аніони. Так як десорбціонную колонку доводиться часто регенерувати, відношення обсягів, пропущених через колонку 5, до обсягів, допущеним через колонку 4, повинно бути менше або дорівнює 1O. Пропозицій схеми поділу для іонної хроматографії і варіанти заповнення розділової і десорбується колонок.
2. Іншим варіантом іонної хроматографії є одноколоночная іонна хроматографія, заснована на використанні електроліту з невисокою електропровідністю. У цьому випадку компенсаційна колонка відсутня.
Метод детально не розглядається нами, тому що є ряд непоганих оглядів з іонної хроматографії [17, 18].
Іонні хроматографи від простих до повністю автоматичних випускають фірми «Даонекс корпорейшн», «Бекман» (США) та ін У СРСР іонні хроматографи серійно випускаються Дзержинського Окба. Методом іон-хроматографії визначають незабарвлені аніони і катіони, що знаходяться у зразку у вигляді домішок, і мікрокількостей шкідливих речовин у воді, повітрі та біологічних рідинах.
Рис. 1. Схема установки для аналізу катіонів методом іонної хроматографії: 1 - ємність з елюентом; 2 - насос: 3 - введення проби; 4 - роздільна колонка, 5 - десорбується колонка; 6 - кондуктометрична кювету; 7 - кондуктометричний детектор; 8 - самописець
Практичні рекомендації
Іонообмінна хроматографія в експериментальному відношенні - один з найважчих видів ВЕРХ, тому що є багато параметрів, які необхідно враховувати і контролювати.
Якщо аналіз необхідно вести при рН нижче 2 або вище 7,5, то повинна бути застосована відповідна аніонна або катіонна смола, а в інших випадках - сілікатель з прищепленої іонообмінної смолою.
Для аналізу молекул з молекулярною масою до 2000 застосовують іонообмінники з хімічно прищепленої фазою до силікагелі з розміром частинок 5-10 мкм, а при препаративної поділі можна застосовувати полімерні пористі сорбенти типу даррум ДА-Х8. При поділі великих молекул з молекулярною масою 2000 застосовують слабоосновний іоніти, щеплений на великопористий силікагель.
Швидкість елюента зазвичай встановлюють 1 мл / хв, температуру 50 ° С або кімнатну, якщо контроль температури незручний, а рН підбирають так, щоб компоненти були іонізовані.
Так як в іонообмінної хроматографії ізотерми не паралельні, необхідно знайти оптимальну для кожного частотного поділу температуру, змінюючи її з инкрементом 10 ° С. Зазвичай дотримуються середини знайденого інтервалу оптимальних температур, контролюючи її з точністю 1 ° С.
Для створення певного рН та підтримання на необхідному рівні готують відповідний буферний розчин. Якщо це можливо, то буферний розчин підбирають таким чином, щоб його функціональна група була схожа на функціональну групу зразка. Так, ацетатний буферний розчин прийнятний для аналізу карбонових кислот, фосфатний - для люірованія нуклеотидів. Велике значення має чистота буферного розчину, тому що він не повинен детектуватиметься обраним детектором, що особливо важливо при роботі в режимі градієнтного елюювання. Чистота буферного розчину залежить від фірм-виробників, і навіть різні партії однієї фірми можуть відрізнятися за складом. Кожна нова партія буферного розчину тестується двома холостими хроматографічними дослідами перед використанням. Другий досвід показує, чи існують речовини, відклалися в колонці в процесі регенерації або протягом останніх стадій попереднього градієнта. Хоча більшість розділень проводять у водних буферних розчинах, іноді додають органічний розчинник (метанол, етанол) у кількості 3-10% для підвищення селективності і поліпшення розчинності зразка. При цьому концентрація розчинника не повинна бути велика, щоб не видати осадження буферної солі, про що буде свідчити поява течі в системі і збільшення опору в колонці.
При роботі в градієнтному режимі бажано, щоб до кінця поділу іонна сила буферного розчину підвищувалася. Починають працювати з концентрації буферного розчину 0,1 M, так як оптимізація розподілу при роботі з низькими концентраціями (0,001 М) забирає багато часу. Якщо за цих умов речовини не вдається задовільно розділити, то подальше поліпшення поділу відбувається за рахунок зниження концентрації буферного розчину, зміни рН або температури кроковим методом, що призводять до підвищення значень k 'і збільшення часу утримування.
Часто в буферний розчин для регулювання сили рухомої фази додають нейтральні солі. Особливою популярністю користується нітрат натрію, оскільки він не викликає корозії апаратури. Галогенід-іони мають шкідливий вплив на нержавіючу сталь, і тому їх краще не застосовувати.
Порівнюючи сорбенти, призначені для іонообмінної хроматографії, з сорбентами, застосовуваними в інших варіантах ВЕРХ, можна відзначити ряд недоліків у перших.
Застосовувані в іонообмінної хроматографії сорбенти менш ефективні і стабільні, а також менш відтворювані, Поліпшити ефективність розділення йоногенних з'єднань можна, підвищивши температуру до 60 ° С, змінивши рН, додавши органічний розчинник або перейшовши від іонообмінної хроматографії до роботи в режимі іон-парної хроматографії або обернено -фазної хроматографії з використанням методу придушення іонів.
Підвищення стабільності досягають за рахунок очищення зразка, зменшення температури і рН, зниження кількості органічних розчинників. Для рутинного аналізу і кращої відтворюваності бажано використовувати колонки, набиті в лабораторії.
Література
1. Krstulovic AM, Brown PR Reversed-Phase Liquid Chromatography; Theory, Practice and Biomedical Applications. J. Wiley. NY, 1982. 296 p.
2. Hamaji M., Seki Г. / J. Chromatogr., Biomed. Appl., 1979, v. 163, p. 329 - 336.
3. Фрітц Дж., Гьерзе Д.Г., Поланд К. Іонна хроматографія: Пер. з англ. / Под ред. В.Г. Березкіна. М., Мир, 1984. 224 с.
4. Шпигун О.А., Золоте Ю.Л. / Зав. лаб., 1982, т. 48, № 9, с. 4.
5. Small Я. / Anal. Chem., 1983, v. 55, p. 235A.
6. Бєлєнький Б.Г., Виленчик Л. 3. Хроматографія полімерів. М., Хімія, 1978. 344 с.
7. Van W., Kirkland J., Bly D. Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography. NY, J. Wiley, 1979. 476 p.
8. Нефедов П.П., Лавренко П.М. Транспортні методи в аналітичній хімії полімерів. Л., Хімія, 1979. 232 с.
9. Тенніков М.Б. і dp. / Високомол. соед., 1977, т. А19, № 3, с. 657 - 660.
10. Mori S., Suzuki T. / Anal. Chem, 1980, v. 52, No. 11, p. 1625-1629.