Іон-парна хроматографія
Іон-парна хроматографія давно знаходила застосування в рідинної хроматографії та екстракції для вилучення ліків і їх метаболітів з біологічних рідин в органічну фазу. Як самостійний розділ ВЕРХ іон-парна хроматографія, що називалася також екстракційної, парно-іонною, хроматографією з використанням ПАР, хроматографією з рідким іонообмінників, стала розвиватися з середини 70-х років. Метод займає проміжне положення між іонообмінної хроматографією і адсорбційної, розподільної або звернення-фазної. Недоліки іонообмінних матеріалів, а саме невоспроизводимость від партії до партії, менша активність і стабільність у порівнянні з іншими сорбентами і невеликий вибір наповнювального матеріалу, що виключає зміну селективності за рахунок сорбенту, привів до деякого обмеження застосування іонообмінної хроматографії. У іон-парної хроматографії більшість цих недоліків можна подолати. Метод іон-парної хроматографії характеризується універсальністю і володіє перевагою в порівнянні з класичною іонообмінної хроматографією, в якому активні центри фіксовані. Внаслідок більш швидкої массопередачи в іон-парної системі хроматографічне розділення більш ефективно, ніж на іонообмінника з фіксованими і активними зонами.
Іон-парну хроматографію використовують для розділення зразків, що містять як іонні, так і неіонні з'єднання. Її застосовують у тих випадках, коли важко або неможливо отримати прийнятне поділ зразка методом іонообмінної хроматографії адсорбційної або звернення-фазної. У деяких випадках іонні сполуки можна розділити на зверненої фазі, надаючи їм властивості неіонних сполук (придушення іонів) за допомогою буферного розчину з відповідним рН, при якому рівновага зміщується в бік утворення неіонізованій форми. Полярні речовини, що володіють ліпофільною властивостями, поділяються при цьому на зверненої фазі як неполярні. Однак більшість наповнювальних матеріалів колонок надійно працює тільки при рН = 1,5-7,5. Виняток становить партісіл 5 ОДС, що працює при рН = 1-8,5. У цьому діапазоні рН сильні кислоти та основи іонізовані.
Спроби поділу сильних кислот і підстав методом придушення іонів виявляються невдалими через погане утримання речовин і асиметрії піків. Сполуки, що залишаються іонізованими в інтервалі рН = 2-8, задовільно поділяються методом іон-парної хроматографії, коли в рухому фазу додають протівоіони, заряд якого протилежний заряду молекули, і створюється іон-парний комплекс, що володіє властивостями неполярного речовини. Якщо до іонного з'єднанню, розчинного тільки у воді, додати протівоіони, то утворюється іонна пара, яка, володіючи властивістю розчинятися в органічній фазі, розподілиться між водним і органічним шаром. Можлива також адсорбція ліпофільної частини противоиона в вуглеводневої фазі наповнювального матеріалу. Очевидно, що катіони будуть добре екстрагуватися аніонами, і навпаки.
Таким чином, іонізовані молекули знаходяться в рівновазі і утворюють іонну пару: розчинена речовина-протівоіони, причому всі рівноваги мають концентраційні залежності. У спрощеному вигляді розподільчий рівновага може бути представлено у вигляді
В + вод + Р - орг <=> (В + Р -) орг,
де В + - протонувати форма підстави, що потрібно екстрагувати; Р-- аніон кислоти, який застосовують для утворення іонної пари.
Іонна пара В + Р - буде розчинятися в полярній органічній фазі, наприклад в суміші спирту з хлороформом, а іонні форми будуть розчинятися у воді. Для визначення ароматичних сульфокислот застосовують як противоиона тетра-бутіламмоній, а для аналізу хініну-сульфокислоти камфори. Як противоиона зазвичай використовують четвертинні або третинні аміни, солі сульфокислот. Найбільш часто застосовують тетраметил, тетрабутіл, пальметілтріметіламмоній для аналізу кислот, сульфованих барвників і третинні аміни типу тріоктіламіна для аналізу сульфонатів. Протиіонами для аналізу підстав є солі алкіл-і арілсульфокіслот, перхлорати, Пікрати.
Існує чотири варіанти іонно-парної хроматографії:
адсорбційна хроматографія, коли іонні пари вимиваються елюентом з силікагелю;
нормально-фазна розподільна хроматографія, коли вода, нанесена на пористу підкладку, є нерухомою фазою, органічний розчинник-елюентом;
звернення-фазна розподільна хроматографія з органічним розчинником в якості нерухомої фази і водою як елюента;
4) звернення-фазна хроматографія, коли гідрофобний іон, який утворює іонну пару, адсорбується вуглеводневої частиною нерухомої фази. Іноді додають ПАР, наприклад цетилтриметиламмонийбромид (цетрімід).
Іон-парну хроматографію застосовують і для розділення амфотерних речовин. Коли іон-парну хроматографію застосовують в нормально-фазному варіанті як протиіонів, іноді використовують іони, здатні до абсорбції світла або до флуоресценції, для поліпшення ідентифікації деяких не поглинають світло сполук. У цьому варіанті іон-парної хроматографії селективність системи змінюється за рахунок зміни полярності органічної фази. У табл. 3.4 наведено приклади використання іон-парної хроматографії при роботі в режимі нормально-фазною хроматографії.
Однак найбільш часто застосовують іон-парну хроматографію на зверненої фазі, при якій в якості рухомої фази використовують водний буферний розчин і органічний розчинник, що змішується з водою, звичайно метанол або ацетонитрил. У рухливу фазу додають протівоіони, заряд якого протилежний заряду молекули, а в якості сорбенту використовують силікагель з хімічно прищепленої фазою, звичайно С8 або C 18. Іноді поділ здійснюють із застосуванням незмішувані з водою механічно утримується фази, наприклад, бутанолу. При поділі на зверненої фазі більш стабільною, ніж механічно утримується фаза, водні зразки можуть безпосередньо вводитися в колонку, що особливо важливо для аналізу біологічних зразків. При цьому немає необхідності в попередньому очищенню, так як гідрофільні компоненти миттєво викликаються з колонки. Градієнтне елюювання проводять, змінюючи концентрацію противоиона в рухливій фазі або змінюючи полярність розчинника. При зміні концентрації противоиона, який залишається в нерухомій фазі, змінюється сила розчинника, а при зміні рН рухомої фази змінюється селективність розділення.
Від звичайної звернення-фазною хроматографії легко перейти до іон-парної на зверненої фазі, і навпаки.
Іон-парне поділ на зверненої фазі (табл. 3.5) може бути проведено кількома методами:
на прищепленої до матриці нерухомій фазі, що складається з вуглеводнів;
те ж саме, але в якості противоиона використовують ПАР;
на нерухомій фазі, що складається з механічно утримується органічної рідини;
4) на нерухомій фазі, яка містить рідкий ионообменник.
Важливою умовою проведення іон-парної хроматографії є стабільність системи. Це означає у випадку механічно утримується рідини незмішуваності водної та органічної фаз, що досягається чітким термо-статірованіем і попереднім насиченням рухомої фази нерухомою. При роботі з нормальною фазою при введенні противоиона в нерухому фазу необхідно запобігти його винесення нерухомою фазою за рахунок утворення іонних пар, які їдуть з болонку. Протівоіони в цьому випадку додають до зразка до введення його в хроматограф або в рухому фазу. Оскільки в іон-парної хроматографії працюють з полярними речовинами, схильними до утворення хвостів, слід пам'ятати, що в цьому випадку бажано застосувати іншу рухому або нерухому фазу, інший протівоіони. Необхідно, щоб в іон-парної хроматографії при зміні концен-трації не змінювалося значення k 'зразка, що може спричинити утворення хвостів. Водна фаза повинна мати постійну концентрацію лротівоіона і рН. Зазвичай використовують цитратний або фосфатовий буферний розчин. Іноді протівоіони сам є буфером. У разі поділу при низьких рН розчини сильних кислот забезпечують достатню буферну дію.
Цікаво простежити роль противоиона в іон-парної звернення-фазною хроматографії. Можна написати наступні рівняння для зразка, що має аніон і
k '= (Vs / Vm) E (c +), k' = (Vs / Vm) E (c-),
де Е-константа екстракції конкретної іон-парної системи; (з +) і (с-) - концентрації аніонного та катіонного противоиона.
При інших незмінних умовах Е постійна і, отже, підвищення концентрації противоиона в рухливій фазі призводить до збільшення k 'при поділі на зверненої фазі. У нормально-фазною іон-парної хроматографії k 'також змінюється за рахунок зміни концентрації противоиона в рухливій фазі. Значення k 'може регулюватися типом противоиона, наприклад, заміна гептансульфокіслоти пентансуль-фокіслотой може змінити k' в 2-5 разів. Цей ефект яскраво виражений при низьких концентраціях противоиона. Великі молекули противоиона дають великі величини k 'при іон-парному поділі на звичайній фазі. Так, перехід від тетра-етіламмонія до тетрапентіламмонію дозволив змінити k 'на кілька порядків.
Здатність різних аніонів екстрагувати іон тетра-бутлламмонія з води в хлороформ є мірою ефективності цих протиіонів (табл. 3.6).
У тих випадках, коли речовина повністю ионизировано, зміна сили розчинника за рахунок зміни концентрації противоиона не впливає на селективність, і тільки коли речовина частково ионизировано або не ионизировано, селективність змінюється при зміні концентрації противоиона.
У іон-парному поділі на зверненої фазі сила розчинника змінюється за рахунок зміни полярності рухомої фази. Збільшуючи в сумішах води з метанолом або ацетонітрилу-лом вміст води, ми збільшуємо силу розчинника і знижуємо значення k 'для зразка. У іон-парної хроматографії в якості рухомих фаз застосовують бутанол, пентанол, метиленхлорид і гексан. При цьому більш полярні розчинники є сильнішими і дають самі низькі значення k''. Сила розчинника в іон-парної хроматографії залежить від його здатності стабілізувати або розчиняти іони та іонні пари, на відміну від чинника полярності розчинника Р ', пов'язаного з його здатністю розчиняти полярні неіонні речовини. Сила розчинника в іон-парної хроматографії залежить від параметра Р 'і від його діелектричної проникності е. Показником відносної сили розчинника служить функція Р' +0,25 ε (табл. 3.7).
Підвищення іонної сили водної фази призводить до зменшення числа утворюються іонних пар через конкуренцію буферних іонів з протівоіонов за утворення іонної пари. Тому підвищення іонної сили в іон-парної хроматографії приводить до зниження k 'при поділі на зверненої фазі і до підвищення k' при поділі на нормальній фазі. Вплив буферних іонів зростає в послідовності: NO2-<Br-<. Cl-<SO4 2 - Селективність розчинника в іон-парної хроматографії змінюється за тими ж правилами, як і у випадку розподільної рідинної хроматографії.
Оптимальними при іон-парному поділі на зверненої фазі є середні значення рН. При зниженні рН рухомої фази аніони Х - починають перетворюватися в неіонізованій кислоти і число іонних пар зразка в нерухомій фазі зменшується, а отже, знижується і значення k '. Зміна рН виявляється потужним засобом зміни селективності розділення. При високих значеннях рН значення k 'також падає, що аналогічно зменшення обмінної ємності, так як іони ОН - рухомої фази починають пов'язувати протівоіони і конкурувати з аніоном зразка в освіті іонних пар. Слабкі кислоти або підстави зазвичай не використовують як протиіонів для іон-парної хроматографії.
При іон-парному поділі на нормальній фазі залежність k 'від рН обратна. Компоненти зразка більш сильно утримуються при низьких і при високих значеннях рН за умови, що неіонізованій іони зразка не утримуються водної фазою. Обсяг введеного в іон-парної хроматографії речовини звичайно не повинен бути дуже великим, щоб не було розмивання зон. Іноді обмежуючим фактором є
концентрація противоиона в рухливій фазі; підвищуючи його концентрацію, можна збільшити максимальну концентрацію речовини, що вводиться. При підвищенні концентрації противоиона та відповідному зміну значень k 'зразка можливе одночасне додавання надлишку нейтральної солі у водну фазу, що стабілізує значення k'. Отримуємо закономірність, аналогічну закономірності впливу буферного розчину. Максимальна кількість введеного зразка може бути підвищений при додаванні зразка у вигляді іонних пар. При цьому до запровадження в хроматограф протівоіони змішують із зразком, а рН доводять до потрібного значення.
Вплив температури має в іон-парної хроматографії велике значення. При використанні механічно утримуваних нерухомих фаз колонка повинна бути термостатированной. У іон-парної хроматографії застосовують звичайно фази з підвищеною в'язкістю, а підвищення температури знижує її. Залежність селективності від температури також найбільш виражена в іон-парної хроматографії.
Застосовуючи протівоіони, що поглинають в УФ-області, можна отримувати за іон-парному поділі легко виявлені спектрофотометром іонні комплекси. Потрібно, однак, щоб протівоіони не розчинялися в органічній фазі щоб уникнути високого поглинання виходить з колонки розчину. Таким чином, використовуючи іон пікрату або 2-нафтілсульфоната, можна виявити аміни.
Одним з утруднень, найбільш часто зустрічаються в іон-парної хроматографії, є нестабільність колонок, особливо в обіг-фазному режимі. В колонках із звичайною фазою спостерігається поступовий винесення противоиона з нерухомої фази, однак цього можна уникнути, отримуючи іонні пари до введення зразка в хроматограф. Великим недоліком іон-парної хроматографії є утворення хвостів. Причиною цього є або дисоціація іонних пар, що зменшується при підвищенні концентрації противоиона, або неправильна концентрація буферного розчину. Іноді вдається зменшити затягування зон і збільшити ефективність розділення, перейшовши від звичайної іон-парної хроматографії до хроматографії з використанням поверхнево-активних речовин.
Такий спосіб поділу, мабуть, придатний для аналізу дуже полярних молекул, наприклад сульфованих барвників. Довжина вуглецевого ланцюга нерухомої фази також варіюється в іон-парної хроматографії.
Відтворюваність колонок в іон-парної хроматографії задовільна на відміну від такої в іонообмінної хроматографії.
Іон-парну хроматографію зазвичай застосовують для аналізу фізіологічних і біологічних рідин, полярних сполук та речовин з кількома іонізіруемимі групами, в тому числі проміжних продуктів барвників. Розфасовані реагенти для іон-парної хроматографії, що складаються з буфера і противоиона, які можна безпосередньо додавати в рухому фазу, випускає фірма «Уотерс». До них відноситься реактив А (0,005 М розчин тетрабутіламмонійфосфата, рН = 7,5), реактив В-5 (0,005 М розчин пентансульфокіслоти, рН = 3,5) і реактив В-7 (0,005 М розчин гептансульфокіслоти, рН = 3,5 ).
При відсутності чітких літературних аналогій починають поділ методом іон-парної хроматографії на оберненій фазі C 18 із розміром частинок 5-10 мкм. Наповнювачем в іон-арної хроматографії з добавкою органічної нерухомої ази є матеріал, що використовується для зверненої фази, при роботі з нормальною фазою застосовують звичайний силікагель 5-10 мкм, як і у випадку адсорбційної хроматографії. можливе застосування нейтральних полістирол-дівінільних смол або смол ХАД. Колонки з C 18 служать довше в іон-парної хроматографії, ніж колонки з нерухомою фазою, що має більш коротку углеводородную ланцюг. Подальша після «прив'язування» фази сіланізація покращує властивості матеріалу і збільшує термін його служби (партісіл 5 ОДС).
Для збільшення стабільності колонки рН слід зменшувати в міру збільшення концентрації противоиона.
Для цієї ж мети запропоновано використовувати триетиламін в якості підстави, тому що цей реактив доступний, розчинний, зручний в роботі і має малу хімічної актив-ністю. Передбачається, що сильні підстави, так само як четвертинні гідроксиди, руйнують сілікагелевую підкладку. Рухливу фазу для іон-парної хроматографії бажано фільтрувати через фільтр з скловолокна, а після закінчення роботи колонку слід промивати п'ятикратним об'ємом елюента метанол - вода (50: 50).
Рис. 1. Хроматограмма вітамінів, отримана на колонці розміром 300 Х 4 мм з μ-бондапаком C 18, рухома фаза - метанол - вода (70: 30) з 0,1% В7 і В5 (1:1), витрата 1 мл / хв, детектор -УФ (254 нм): 1 - нікотинамід, 2 - піродоксін, 3 - рибофлавін, 4 - тіамін
Рис. 2. Хроматограмма ізомерів фталевої кислоти, отримана на колонці розміром 300 Х 4 мм з μ-бондапаком C 18, рухома фаза - вода з добавкою реактиву А, метанол з добавкою реактиву А, градієнт від 5 до 40% метанолу за 15 хв, швидкість потоку 2 мл / хв, детектор - УФ (254 нм): 1 - терефталевая кислота, 2 - ортофталевої кислота, 3 - ізофталевая кислота
Необхідно, щоб протівоіони розчинявся в елюента. Неправильний вибір противоиона може призвести до утворення осаду, що викличе зростання значень k ', розмивання піку і помітне підвищення тиску на вході. Концентрація зазвичай коливається від 0,01 М для противоиона з малою довжиною ланцюга до 0,005 М для противоиона з більш довгим ланцюгом.
Для препаративних розділень іон-парну хроматографію не застосовують, а кількість введеного зразка можна порівняти з кількістю, що застосовуються для розподільної хроматографії. Збільшення максимально вводиться кількості може бути досягнуто за рахунок попереднього утворення іонних пар у зразку. Для деяких іонізованих (незалежно від рН) аніонів та катіонів не потрібно добавка буфера. Кислоти зазвичай розділяються при рН = 4-7,4, а підстави - при рН = 2-5. При цьому значення рН рухомої фази можуть для поліпшення селективності розділення змінюватись.
Слід пам'ятати, що іон-парна хроматографія на зверненої фазі в цілому метод більш грубий, ніж поділ на зверненої фазі, і повинен використовуватися, коли незастосовні розподільна хроматографія на зверненої фазі або метод придушення іонів.
Література
Baker DR, George S. A / Amer. Lab., 1980, v. 12, No. 1, p. 41-46.
Bly DD / Anal Chem, 1969, v. 41, No. 2, p. 477-480.
Drott EE / / in Chromatographic Science Series, v. 8, Liquid Chromatography of Polymers and Related Materials, ed. J. Gazes. NY, M. Dekker, 1977, p. 41.
Krishen A., Tucker R. G. / Anal. Chem., 1977, v. 49, No. 4, p. 898.
Mori S., Yamakctwa A. / J. Liquid Chromatogr., 1980, v. 3, No. 3, p. 329 - 342.
Verzele M., Geeraert E. / J. Chromatogr. Sci, 1980, v. 18, No. 10, p. 559 - 570.
Nettleton DE / J. Liquid Chromatogr, 1981, suppl. No. 2, p. 359-398.
Rable FM / International Lab, 1980, v. 10, No. 8, p. 91-98.
Small Bore Liquid Chromatography Columns / / ed. RPW Scott. NY, J. Wiley, 1984. 294 p.
Microcolumn High-Performance Liquid Chromatography / / ed. P. Kucera. N. Y, Elsevier, 1984. 302 p.
Scott RPW, Kucera P. / J. Chromatogr, 1979, v. 169, p. 51-62.
Scott RPW, Kucera P. / J. Chromatogr, 1979, v. 185, p. 22-31.
Scott RPW / J. Chromatogr. Sci, 1980, v. 18, No. 1, p. 49-54.
Reese RE, Scott RPW / J. Chromatogr. Sci, 1980, v. 18, No. 8, p. 479 - 486.
Scott RPW, Simpson CF / J. Chromatogr. Sci, 1981, v. 19, No. 5, 224-233.