Ідентифікація вірусів
Ідентифікація вірусів здійснюється за допомогою специфічних противірусних антисироваток в РН, з, РТГА, РПГ і др, Ці ж реакції можна використовувати для виявлення антитіл в сироватках крові хворих.
Реакція нейтралізації (РН) інфекційного і цитопатичної дії вірусів відтворюється в чутливих до вірусу живих системах. З матеріалу, що містить вірус, готують серійні розведення і добавляють до них специфічну сироватку в розведенні у відповідності з титром, указаним на етикетці ампули. Суміш інкубують 30—60 хв при температурі 37 оС після чого заражають цією рідиною культуру тканини, курячі ембріони або лабораторних тварин. Контролем слугує чутлива система, заражена вірусом, обробленим нормальною сироваткою.
Позитивною вважають РН за відсутності ЦПД в культурі кліток, змін в курячих ембріонах, а також захворювання або загибелі тварин. На підставі результатів РН визначають індекс нейтралізації— відношення титру вірусу (де ще дає ЦПД) в контролі до титру вірусу в досвіді. Якщо індекс нейтралізації менше 10 — реакція є негативною, від 11 до 49 — сумнівна, від 50 і вище — позитивна (достовірна відповідність вірусу антисироватки).
Найчутливішим варіантом РН є придушення вірусного бляшкоутворення завдяки дії антисироватки (реакція редукції вірусних бляшок). При постановці цієї реакції до вірусвміщуючого матеріалу (50—100 БУО — бляшкоутворюючих одиниць) додають антисироватку (в розведенні відповідного титру) і після інкубації в термостаті протягом 30—60 хв суміш наносять на моношар чутливих культур клітин. Бляшкоутворення виявляють вищенаведеними методами (з застосуванням агарового або бентонітового покриття). Відповідність вірусу використаній антисироватці виявляється пригніченням бляшкоутворення в порівнянні з контролем. РН дозволяє визначити видову і типову (варіантну) приналежність вірусу.
Реакція гальмування гемадсорбції (РТГАДС) використовується для ідентифікації гемадсорбуючих вірусів і визначення титру антитіл в сироватках. По 0,2 мл специфічної сироватки, розводить 1:5, вносять в пробірки і після інкубації протягом 30—60 хв додають по 0,2 мл 0,5 % суспензії еритроцитів. В контрольні пробірки додають нормальну сироватку (не імунну сироватку того ж виду тварини) і еритроцити. Пробірки інкубують 20—30 хв при температурі, оптимальній для гемадсорбції вірусу, який виділяється.
Про видову приналежність вірусу судять за відсутністю адсорбції еритроцитів в досвіді при типовій гемадсорбції в контрольних пробірках.
Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА) заснована на блокуванні гемаглютиніну вірусу антитілами. Реакцію проводять на плексиглазових пластинах і оцінюють за відсутністю склеювання еритроцитів, доданих до суміші вірусу і специфічної сироватки. Для видалення або руйнування неспецифічних інгібіторів гемаглютинації сироватки, що використовують для РГГА, заздалегідь обробляють калія перійодатом, каоліном, бентонітом, ацетоном або іншими речовинами. Потім готують двократні розведення сироватки в ізотонічному розчині натрію хлориду, і до кожного розведення додають рівну кількість вірусвміщуючу рідину, в якій знаходяться 4 гемаглютинуючі одиниці. Суміш інкубують 30—60 хв при необхідній для даного типу вірусів температурі (0‘, 4‘, 20‘, 37 оС), а потім додають рівний об'єм 0,5—1 % суспензії еритроцитів. Після цього суміш знов інкубують протягом 30—45 хв і враховують результати реакції. Титром сироватки вважають то її щонайбільше розведення, яке гальмує гемаглютинацію.
Широко застосовується також мікрометод РГГА з використанням мікропанелі і петлі Такачи для розведення матеріалу.
Кольорова проба (колориметрична реакція нейтралізації). В результаті життєдіяльності клітин в живильному середовищі наколпичуються кислі продукти, які, призводять до відповідної зміни рН кольору середовища, яке стає померанчовим. При зараженні культури кліток цитопатогенними вірусами (ентеровірус, реовірус таі ін.) пригнічується метаболізм кліток і рН середовища не змінюється (середовище залишається червоним).
До пробірки вносять по 0,25 мл робочого розведення вірусу (100—1000 ЦПД5о) і відповідного розведення сироватки. Суміш витримують при кімнатній температурі 30—60 хв, додають в кожну пробірку по 0,25 мл клітинної суспензії і закривають їх гумовими пробками або заливають стерильним вазеліновим мастилом. Пробірки поміщають в термостат на 6—8 днів при температурі 37 оС. Результати реакції враховують колориметрично: рН 7,4 і вище вказує на репродукцію вірусу, 7,2 і нижче — на нейтралізацію вірусу антитілами.
Для ідентифікації вірусів в клітинних культурах можна також використовувати РПГ, РСЬК, РИФ, РОНГА, РЕМА, РИМ із специфічними імунними противірусними сироватками. Методики цих реакцій описані в розділі «серологічна діагностика».
Для ідентифікації вірусів, культивованих в курячих ембріонах, використовують РН, яку оцінюють по пригніченню утворення бляшок в ХАО і відсутності гемаглютинації; застосовують також РТГА, РПГ, РСЬК, РИФ і ін.
Виявлення вірусів на лабораторних тваринах. Лабораторні тварини у вірусології застосовуються для наступних цілей:
— діагности вірусних інфекцій (виділення, накопичення, типування і титрування вірусів);
— отримання імунних противірусних сироваток і інгредієнтів крові (еритроцитів, лейкоцитів, плазми і т. д.);
— моделювання вірусних інфекцій для вивчення патогенезу, імунітету, патоморфології і т. д.;
— розробки способів специфічної і неспецифічної профілактики і лікування.
Правила роботи з експериментальними тваринами при вірусних і бактерійних інфекціях аналогічні.
Реакція гемагглютинації (РГА) заснована на здатності деяких вірусів склеювати (аглютинувати) еритроцити певних видів тварин. Механізм РГА неоднаковий у різних вірусів. Віруси грипу і деякі інші, що мають суперкапсидну оболонку, містять поверхневий антиген гемаглютинін, відповідальний за аглютинацію еритроцитів (РГА).
РГА ставлять в пробірках, на спеціальних планшетах з плексигласу і в апараті Такачи. З матеріалу, що містить вірус, готують двократні розведення в 0,5 мл ізотонічного розчину натрія хлориду. У всі пробірки добавляють 0,5 мл 1 % суспензії еритроцитів, тричі відмитих ізотонічним розчином натрія хлориду. Для контролю змішують 0,5 мл еритроцитів з рівним об'ємом ізотонічного розчину натрія хлориду, що не містить вірус. Залежно від властивостей вірусу, що вивчається, інкубацію суміші можна проводити в термостаті при температурі 37‘, 20‘ або 4‘оС.
Результати реакції враховують через 30—60 хвпісля повного осідання еритроцитів в контролі:
(+ + + + ) — інтенсивна і швидка аглютинація еритроц тів, осадок має зірчасту форму з фестончатими краями («парасолька»);
(+ + + ) — осад еритроцитів має просвіти;
(+ + )— менш виражений осад;
( + )— хлопчастий осадок еритроцитів, оточений зоною грудочок еритроцитів, що аглютинували,
і (—) — різко окреслений осад еритроцитів («монетний стовпчик»), такий же як в контролі.
За допомогою РГА можна визначити наявність гемаглютинуючого вірусу в досліджуваному матеріалі, а також його титр. Титром вірусу називають його щонайбільше розведення, при якому ще спостерігається аглютинація еритроцитів. Вважають, що це розведення містить одну гемаглютинуючу одиницю вірусу.
Результати реакції гемаглютинації залежать від низки чинників: видової і індивідуальної чутливості еритроцитів, температури, рН середовища і т. д. Гемаглютінацію еритроцитів можуть викликати і деякі мікроорганізми — стафілококи, ешерихії, а також сальмонелли, шигелли, холерний вібріон Ель-тор. Тому при виявленні вірусів в матеріалі, забрудненому бактеріями, потрібно з обережністю підходити до оцінки результатів реакції.
Реакція гемадсорбції (РГАДС) дозволяє виявити вірус у розвитку ЦПД завдяки появі на поверхні інфікованої клітки вірусспецифічного антигену. В культуру клітин (контрольну і заражену вірусом) після певного для кожного вірусу терміну інкубації додають 0,2 мл 0,5 % суспензії еритроцитів так, щоб був покритий моно шар клітин і залишають на 15—20 хв при температурі 4‘, 20‘ або 37 ‘оС (залежно від властивостей вірусу). Потім пробірки струшують для видалення неадсорбованих еритроцитів і враховують під малим збільшенням мікроскопа скупчення їх на окремих клітинах або на всьому моношарі. На незаражених клітинах еритроцитів не повинне бути.
Слід зазначити, що не всі віруси, що аглютинують еритроцити in vitro, здатні викликати гемадсорбцію в культурі клітин. Гемадсорбція спостерігається лише в тому випадку, якщо в процесі взаємодії вірусу з кліткою вірусний гемаглютинін вбудовується в структуру зовнішньої клітинної мембрани і тим самим змінює її властивості.
9. Графологічна структура заняття.
| Орієнтовна карта для вивчення матеріалів по темі | Завдання для практичної роботи | Протокол |
| 1. Загальна характеристика вірусів. Кардинальні відмінності вірусів від інших живих істот. 2. Структура і хімічний склад вірусів. 3. Характеристика етапів репродукції вірусів (адсорбція, проникнення, депротеїнизація, синтез ранніх білків, синтез нуклеїнових кислот, синтез вірусних структурних білків, формування віріонів, вихід вірусу з клітки). 4. Методи культивування вірусів. 5. Будова курячого ембріона. Методи зараження курячих ембріонів. 6. Види культур кліток (первинно-трипсинізивані, перещеплювані). Живильні середовища для культур кліток. Поняття про ЦПД. | 1. Вивчити будову курячого ембріона і техніку зараження і розкриття курячих ембріонів. 2. Ознайомитися з живильними середовищами для культур кліток, устаткуванням для отримання первинних культур кліток. 3. Ознайомитися з демонстраційними препаратами культур кліток. | Малюнок схеми будови курячого ембріона. |
Будова курячого ембріону
1 - плід; 2 - амніотична порожнина; 3 - порожнина алантоїсу;
4 - хоріоналантоїсна оболонка; 5 - жовтковий мішок; 6 - білок
5 - шкаралупа; 6 – підшкарарлупна оболонка.
| Орієнтовна карта для вивчення матеріалів по темі | Завдання для практичної роботи | Протокол |
| 1.Особливості лабораторної діагностики вірусних інфекцій (призначення, цілі, методи). 2. Швидкі методи вірусологічної діагностики. 3. Вірусологічний метод діагностики у вузькому значенні (заснований на виділенні і ідентифікації вірусу). 4. Методи індикації і ідентифікації вірусу. 5. Серологічна діагностика вірусних інфекцій. Критерії сірологічного діагнозу. | 1. Вивчити ЦПД вірусів в культурах кліток (демонстраційні препарати). 2. Врахувати і оцінити РГА для титрування вірусу грипу (таблиця 2). 3. Врахувати і оцінити результат РТГА з парними сироватками (див. табл. 2 до заняття 54). 4. Врахувати і оцінити РНГА з парними сироватками (таблиця 3). | Висновок Висновок Висновок |
| Експрес-діагностика | Виявлення збудника або його компонентів в клінічному матеріалі | ЕМ, ІЕМ, РИФ, РОНГА, РІА, ІФА, ВІЕФ, РП, РСЬК, МГ, ПЦР |
| Рання діагностика | Виділення і ідентифікація вірусу (вірусологічна діагностика) | Зараження культур кліток, курячих ембріонів, лабораторних тварин. Індикація вірусу: ЦПД, зміни КЕ і лабораторних тварин, РГАДС, РГА; Індикація одночасно, з ідентифікацією: РИФ, РОНГА, РП, РСЬК, ВІЕФ, МГ, ЦПР, ІФА, РІА; Ідентифікація вірусу: РТГА, РТГАДС, РСЬК, РН, ІФА, РІА. |
| Пізня діагностика | Виявлення антитіл до вірусу в сироватці хворого (сірологічна діагностика) | РТГА, РНГА, зворотна РИФ, РСЬК, РН, РІА, ІФА, иммуноблот для: - виявлення діагностичних титрів антитіл, -виявлення діагностичного наростання титрів антитіл в парних сироватках, -виявлення антитіл класу IGM. |
Таблиця 1. МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНОЇ ДІАГНОСТИКИ ВІРУСНИХ ІНФЕКЦІЙ
| Час отримання діагнозу | Ціль методу | Основні реакції і методи вживані для діагностики |
Таблиця 2. РГА для титрування вірусу грипу
| Розведення Інгредієнти | 1 : 10 | 1 : 20 | 1 : 40 | 1 : 80 | 1 : 160 | контроль еритроцитів |
| Алантоїсна рідина | 0,1 | 0,5 | 0.5 | 0,5 | 0,5 | - |
| Ізотонічний розчин NACL | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| 1% суспензія курячих еритроцитів | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Облік після інкубації 45 мін при кімнатній температурі | | | | | | |
(+) - наявність гемаглютинації, (-) - відсутність гемаглютинації.
ВИСНОВОК: титр вірусу грипу ..................
Таблиця 3. РНГА з парними сироватками для серодиагностики вірусної інфекції
-
Сироватка в розведенні
1 : 10
1 : 20
1 : 40
1 : 80
1 : 160
1 : 10
контроль
контроль
діагностикуму
Діагностікум
(+) - добавка діагностикуму
+
+
+
+
+
-
+
інкубація при кімнатній температурі 1 ч
Еритроцити 1 % (+)-
+
+
+
+
+
+
+
облік після ікнкубації при кімнатній температурі 45 мін:
(+) - відсутність гемаглютинації, (-) - наявність гемаглютинації
Результат в 1 сироватці
Результат в 2 сироватці
ОБЛІК: титр антитіл в 1 сироватці ...........
титр антитіл в 2 сироватці ..........
кратність наростання титру ...........
ВИСНОВОК:реакція позитивна, негативна (непотрібне викреслити).
10. Література:
Основна:
1.Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія »:підручник для студ ВНЗ /Андріанова Т.В.,Бобир В.В., Виноград В.О.[та ін.]; за ред. В.П.Широбокова.- Вінниця : «Нова книга», 2011 – 951с. – ISBN 978-966-382-200-6.
2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: ученик для студ. Высш. Мед. Учеб. заведений : перевод с укр. издания / [Андрианова Т.В.. Бобырь В.В., Виноград Н.А. и др.] ; под. ред. В.П. Широбокова. –Винница : Нова книга , 2015 – 856 с.
3.Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б Борисов. – 5-е издание., испр.- М.: ООО«Медицинское информационное агенство» 2016. – 792с.:
4.Review of Medical Microbiology and Immunology, 12 edition/ Warren E. Levinson / McGraw-Hill Prof Med.- Tech., 2012/ -688 р.
5.Jawetz, Melnick, &Adelberg’s Medical Microbiology, 26th edition, 2012, English.- 880p. – ISBN-13 : 978-00717901314
Додаткова:
1.Данилейченко В.В. Мікробіологія з основами імунології: підручник для медичних вузів / В.В.Данилейченко, Й.М. Федечко, О.П. Корнійчук . - 2-ге вид., перероб. та доп .- Київ : Медицина, 2009 . – 391 с. : іл.. –ISBN 978-966-10-0066-6 .
2. Практична мікробіологія: Посібник /С.І. Климнюк, І.О.Ситник, М.С. Творко, В.П. Широбоков. – Тернопіль, Укрмедкнига, [2004]. – 440c. –ISBN 966-673-059-6.
3. Широбоков В.П.. Микробная экология человека с цветным атласом. Учебное пособие. / В.П. Широбоков, Д.С. Янковский, Г.С. Дымент .- К: ООО «Червона Рута-Турс», 2010, - 340 с. (с цветными иллюстр.) – ISBN 978-966-8607-28-8
4.Воробьев А.А. Медицинская и санитарная микробиология. Учебное пособие для студентов ВУЗ / А.А Воробьев, Ю.С Кривошеин, В.П. Широбоков. – М: Издательский центр «Академия», 2010. -464 с. – ISBN 978-5-7695-5081-2.
5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Учебник для студентов медицинских вузов / под. ред. А.А. Воробьева . – 2-е изд. – М : ООО «Медицинское информационное агенство», 2008. – 704 с. – ISBN 5-89481-394-8.
6.Jawets. Medical microbiology / Jawets, Melnick, Adelberg. – The McGraw- Hill Companies, Inc, 2011. – 919 p. – ISBN 13:978-0-07-147666-9/
7.В.П. Широбоков. Микробы в биохимических процессах, эволюции биосферы и существования человечества. / В.П. Широбоков, Д.С. Яновский, Г.С. Дымент. – К:ФОП Верес О.И., 2014. – 464 с. – ISBN 966-.
8. Яновский Д.С. Интегральная роль симбиотической микрофлоры в физиологии человека / Д.С. Яновский, В.П. Широбоков, Г.С. Дымент. – К:ТОВ «Червона Рута-Турс», 2011. – 169 с. – ISBN 978-966-8607-26-4.
Інформаційні ресурси
Офіційне інтернет-представництво Президента України http://www.president.gov.ua/
Верховна Рада України http://www.rada.gov.ua/
Кабінет Міністрів України http://www.kmu.gov.ua/
Міністерство освіти і науки України http://www.mon.gov.ua/
Міністерство екології та природних ресурсів України http://www.menr.gov.ua/
Державна служба України з надзвичайних ситуацій http://www.dsns.gov.ua/
Рада національної безпеки і оборони України http://www.rnbo.gov.ua/
Постійне представництво України при ООН http://ukraineun.org/
Північноатлантичний альянс (НАТО) http://www.nato.int/
Всесвітня організація охорони здоров’я http://www.who.int/en/
Microbiology and immunology on-line http://www.microbiologybook.org/
On-line microbiology note http://www.microbiologyinfo.com/
Centers for diseases control and prevention www.cdc.gov
11. Тема наступного семінарського заняття №17: «Імунопрофілактика. Імунотерапія РНК-геномні віруси: Ортоміксовіруси. Параміксовіруси. Пікорнавіруси, рабдовіруси, арбовіруси.».
Методичну розробку склав _______________________________/П.,І.,Б./ / підпис/
1 2 3