Рівень клітини /50-і роки/. У 1949 р. відкрита можливість культивувати клітки в штучних умовах.
У 1952 році Дж. Эндерс, Ф. Роббінс одержали Нобелівську премію за розробку методу культури клітин. Використання кульури клітин у вірусології виявилось дійсно революційною подією, що послужила основою для виділення численних вірусів, їх ідентифікації, клонування, вивчення їхньої взаємодії з клітиною. З'явилась можливість одержання культуральних вакцин – проти полиемієліту, корі, енцефаліту, ящуру, антирабічної і т.д./.Молекулярний рівень /60-і роки/. Використання методів молекулярної біології.
Субмолекулярний рівень /60-і роки/. Вивчення первинної структури нуклеїнових кислот і білків. Секвеніровання ДНК, визначення амінокислотних послідовностей білка. Одержання перших генетичних карт геномів ДНК - утримуючих вірусів. Відкриття вірусної зворотний транскриптази в складі РНК - утримуючих онкогенних вірусів.
У 1972 р. виникає новий розділ - генна інженерія.
Як показав досвід останніх десятиліть, віруси є незамінними об'єктами і моделями, що допомагають вирішувати загальнобіологічні, генетичній, біохімічні, молекулярно-біологічні, еволюційні і ряд інших проблем.
Віруси відрізняються від про- і еукариотичних мікроорганізмів у структурному і функціональному відношенні.
1/ Вони містять тільки один тип нуклеїнової кислоти - ДНК чи РНК, що містить генетичну інформацію, яку вони можуть передавати своєму потомству;
2/ не мають клітинної побудови;
3/ не здатні до росту і бінарного розподілу, розмноження позначається як роз'єднана репродукція;
4/ не мають власних метаболічних систем;
5/ відтворюються за рахунок однієї нуклеїнової кислоти;
6/ використовують рибосоми клітки хазяїна для синтезу білків. Є генетичними паразитами.
Генетичний паразитизм вірусів реалізується через нав'язування своєї інформації зараженої клітки.
Позаклітинна форма існування вірусу називається віріоном. .
Структура віріона.
Розміри варіюють у широких межах: від 15-18 до 300-400 нм. Форма: палочковидна, нитковидна, сферична, що нагадує багатогранники, кубовидна, сперматозоїдна.
Містять один тип нуклеїнової кислоти ДНК чи РНК, щільно упакованої в білкову оболонку - капсид, що має строго упорядковану структуру. Капсид складається з капсомерів, укладання яких визначає спіральний чи кубічні типи сіимметрии.
Ізометричні вірусиі частки з кубічним типом симетрії мають форму геометричної фігури - икосаэура - багатогранника. Палочковидні і нитковидні форми мають спіральний тип симетрії. По типу икосаэдра добудовані віруси, що мають сферичну форму, дрібні віруси і нуклеокапсиди складно улаштованих вірусів.
Капсид просто організованих вірусів охороняє нуклеїнову кислоту від сприятливих впливів зовнішнього середовища, забезпечує адсорбції вірусу на клітці завдяки спорідненості рецепторів, розташованих на поверхні клітки. З капсидом зв'язані антигенні й імуногенні властивості.
Хімічний склад віріонів.
Просто організовані віруси складаються з нуклеїнової кислоти /ДНК чи РНК/, що покрита білковою оболонкою - капсидом. Капсид складається з капсомерів.
Складно організовані віруси містять зовнішні оболонки, що формують суперкапсид чи "пеплос".
До складу зовнішніх оболонок входять ліпіди, глікопротеїди.
Вірусний геном може бути представлений як однонитковими так і двонитковими молекулами РНК і ДНК, може бути лінійною і кільцевою молекулою. РНК -лінійною, фрагментованою та кільцевою.
У зараженій клітині вірусний геном кодує синтез двох груп білків:
1/ структурних, які входять до складу вірусних часток потомства;
2/ неструктурних, які беруть участь у процесі репродукції вірусу, але до складу вірусних часток не входять.
Білки просто влаштованих вірусів:
1/ структурні: капсидні, геномні;
2/ неструктурні: попередники структурних; полімери; ферменти, що модифікують білки, функції не ідентифіковані.
Білки складно влаштованих вірусів:
1/ структурні: а/у складі капсида: капсидні, геномні, полимерази в складі суперкапсида: прикріплені, білки злиття, ферменти, що модифікують білки.
2/ неструктурні: попередники структурних, полімерази, регулятори синтезу РНК і ДНК; функції не идентифіковані. Усі складно організовані РНК–геномні віруси мають у своєму складі значну кількість ліпідів. З ДНК-геномних вірусів ліпіди містять віруси віспи, герпесу і гепатиту В.
Ліпідний компонент стабілізує структуру вірусної частинки. Екстракція ліпідів органічними розчинниками, обробка вірусної частинки детергентами чи ліпазами приводить до деградації вірусної частинки і втраті інфекційної активності.
Вуглеводний компонент гликопротеїдів відіграє істотну роль у структурі і фукції білку. Він є каркасом для локальних ділянок глікопротеїду, забезпечуючи збереження конформації білкової молекули й обумовлюють захист молекули від протеаз.
Глікопротеїди формують морфологічні субодиниці, вбудовані в подвійний ліпідний шар, що в електронному мікроскопі виглядають у вигляді шипів.
Основи класифікації.
В основу сучасної класифікації покладені наступні основні критерії.
1. Тип нуклеїнової кислоти /РНК чи ДНК/, її структура /кількість ниток/.
2. Наявність ліпопротеїдної оболонки.
3. Стратегія вірусного генома.
4. Розмір і морфологія віріону, тип симетрії, кількість капсомерів.
5. Феномени генетичних взаємодій.
6. Коло сприйнятливих хазяїнів.
7. Патогенність, у тому числі, патологічні зміни в клітинах, і утворення внутрішньоклітинних включень.
8. Географічне поширення.
9. Спосіб передачі.
10. Антигенні властивості.
На підставі перерахованих ознак віруси поділяються на сімейства, підродини, роди і типи. Розподіл на сімейства зроблено за критеріями п.п. 1 і 2, розподіл на роди і типи на підставі нижче перерахованих ознак. Сучасна класифікація вірусів людини і тварин охоплює більш 4/5 усіх відомих вірусів, що розподіленні на 19 сімейств, з них 7-ДНК-геномних і 12- РНК-геномних вірусів.
Номенклатура вірусів.
Для впорядкування найменувань вірусів вироблений ряд правил. Назва сімейств закінчується на «viridae», під-сімейств «virinae», роду «virus». У назвах допускаються латинізовані позначення, цифри при позначенні типів, скорочення, букви і їхні сполучення.
З урахуванням принципових відмінностей вірусів від рослин і тварин вони виділені в самостійне царство vira , що відповідно до змісту тієї чи іонної кислоти поділяють на. РНК утримуючі і ДНК- утримуючі.
Репродукція вірусів.
Розмноження вірусів відбувається шляхом репродукції, тобто відтворення їхній нуклеїнових кислот і синтезу білків з наступною зборкою віріонів. Ці процеси відбуваються в різних частинах клітки, наприклад у ядрі і цитоплазмі. Такий роз’єднаний спосіб одержав назву диз'юнктивного.
Репродукція вірусів характеризується послідовною зміною окремих живих стадій.
1 стадія - адсорбція.
2- проникнення вірусу в клітину.
3- дезінтиграція, чи "роздягання", віріона.
4 - синтез вірусних білків і реплікація нуклеїнових кислот.
5 - зборка, чи морфогенез, віріона.
6 - вихід віріону з клітини.
Розрізняють різні типи взаємодії вірусу з клітиною хазяїна: продуктивна інфекція, абортивна інфекція, вірогенія.
Культивування вірусів.
Проводиться з метою їх виділення і накопчення з діагностичними цілями, для подальшого вивчення і для виробництва вакцин.
Існують три методи: I/ в організмі сприйнятливої тварини; 2/ у курячому ембріоні; 3/ у культурі клітин.
У вірусологічній практиці використовують переважно клітини ембріонів тварин, оскільки вони більш чуттєві до вірусної інфекції.
Курячі ембріони широко застосовуються для культивування ряду вірусів, які можуть репродукуватись в амінотичній оболонці, харіоналлантоїдній оболонці, а також у жовточному мішку.
Багато вірусів, які вражають людину і тварин, можуть більшою чи меншою мірою розмножуватися в курячому ембріоні. Наявність щільною шкаралупи захищає ембріон від попадання мікроорганізмів із зовнішнього середовища.
Метод культивування вірусів в курячих ембріонах використовують при лабораторній діагностиці вірусних інфекцій, а також для виготовлення вірусних вакцин і діагностичних препаратів. Але цей метод має недоліки: 1) неможливо спостерігати в динаміці за патологічними змінами, що відбуваються в ембріоні після зараження його вірусом; 2) при розтині ембріона, зараженого вірусом, часто не виявляється видимих змін і доводиться виявляти наявність вірусу в тканинах, в рідинах ембріона, користуючись іншими вірусологічними методами (наприклад, реакцією гемаглютинації); 3) метод культивування в курячих ембріонах придатний не для всіх вірусів. Незважаючи на наявні недоліки метод порівняно простий, зручний і дешевий і широко використовується в вірусологічних дослідженнях. Найбільше значення він має при роботі з ортоміксовірусами, герпесвірусами, поксвирусами.
Будова курячого ембріона
Курячий ембріон покритий вапняної оболонкою - шкаралупою, до якої зсередини примикає у оболонка. У тупому кінці яйця вона роздвоюється і укладає в собі повітряний простір. Під шкаралуп'яну оболонкою знаходиться хоріоналантоїсна оболонка, в тупому кінці яйця вона проходить по внутрішній стороні шкаралуп'яну оболонки, що замикає повітряний простір. Ця оболонка багата кровоносними судинами і слугує ембріону органом дихання. Зсередини до неї прилягає алантоїсна порожнина, яка є органом виділення і захищає зародок від висихання і травм. Алантоїсна порожнина оточує зародок, що знаходиться в порожнині амніону, яка наповнена навколоплідної рідиною. Через жовтковий канатик зародок з'єднаний з жовтковим мішком - основним джерелом поживних речовин.
Для успішного культивування вірусів в організмі курячих ембріонів потрібний певний температурний режим (360-380С), вологість (50-70%), а також достатня вентиляція. Заражають курячі ембріони певного віку, інкубовані від 6 до 13 днів, залежно від виду вірусів і методу зараження. Необхідно підготувати: підставку для яйця, флакони зі спиртом і йодом, пробірку із стерильним парафіном, покривні скельця, пакетики стерильної вати і марлі, загорнуті в папір стерильний посуд, стерильні шприци, голки, пінцети, препарувальні голки. Інструменти поміщають в стаканчик зі спиртом, де вони знаходяться протягом всієї роботи, перед кожною маніпуляцією їх додатково стерилізують обпаленням в полум'ї пальника. Руки перед роботою ретельно миють, рекомендується надіти маску з марлі.
Для роботи відбирають життєздатні ембріони, просвічуючи інкубовані яйця в овоскопі. Життєздатний ембріон рухливий, кровоносні судини оболонки заповнені кров'ю. Відібрані яйця ретельно дезінфікують на тупому кінці (або на бічній стороні яйця): шкаралупу протирають спиртом, змащують йодом, повторно обробляють спиртом і обпалюють.
Зараження курячого ембріона на хоріоналантоїсну оболонку
Для зараження використовують курячі ембріони 10-12-денного віку. Основні етапи зараження:
1. Яйце поміщають на підставку в вертикальному положенні так, щоб повітряний мішок перебував нагорі, проводять стерилізацію шкаралупи на тупому кінці яйця.
2. Над центром повітряного мішка роблять прокол шкаралупи за допомогою препарувальної голки.
3. В отвір вводять бранш ножиць і вирізують вікно в шкаралупі близько 1,5 см в діаметрі.
4. Через отвір обережно надривають голкою внутрішній листок шкаралуп'яної оболонки і відслоюють на невеликій ділянці (0,5-1 см2).
5. Проводять зараження хоріоналантоїсної оболонки шляхом нанесення на неї 0,1-0,2 мл вірусвміщуючого матеріалу за допомогою пастерівської піпетки або шприца.
6. Віконце в шкаралупі закривають спеціальною еластичною плівкою або стерильним покривним склом і прикріплюють розплавленим парафіном.
Заражені ембріони поміщають в термостат в вертикальному положенні і інкубують протягом 2-3 діб, після чого роблять розтин за такими правилами:
1. Яйце поміщають на підставку так, щоб повітряний простір було нагорі, проводиться стерилізація місця розтину.
2. Стерильними ножицями зрізають шкаралупу по межі повітряного простору.
3. Користуючись пінцетом, знімають шкаралуп'яну оболонку по межі. Оголену хоріоналантоїсну оболонку підрізають уздовж краю шкаралупи. Через отвір, що утворився виливають весь вміст яйця в чашку або лоток.
4. Частину, що залишилась всередині шкаралупи хоріоналантоїсної оболонки обережно витягують пінцетом і поміщають в стерильну чашку з фізіологічним розчином. Тут її розправляють і вивчають зміни, помістивши чашку на темний фон.
Для отримання з хоріоналантоїсної оболонки матеріал, що містить вірус, її потрібно подрібнити ножицями і потім розтерти в ступці з кварцовим склом, додавши сольовий розчин. Отриману суспензію центрифугують при 2000 об / хв протягом 10-15 хвилин і надосадову рідину використовують в якості вірусвміщуючого матеріалу.
Зараження в алантоїсну порожнину
Для зараження беруть ембріони 10-11-денного віку. Основні етапи зараження:
1. Яйце поміщають на підставку тупим кінцем догори і проводять стерилізацію шкаралупи над повітряним простором.
2. У центрі тупого кінця роблять прокол шкаралупи за допомогою препарувальної голки.
3. В отвір вводять голку шприца, що містить розведення вірусу. Голку просувають в вертикальному напрямку на 2-3 мм нижче рівня повітряного мішка і потім вводять 0,1-0,2 мл матеріалу.
4. Отвір в шкаралупі закладають за допомогою розплавленого стерильного парафіну.
Заражені ембріони витримують в термостаті зазвичай протягом 2 доби. Перед розтином яйця поміщають на ніч в холодильник при +40С. Розтин проводиться в такому порядку:
1. Яйце встановлюється на підставці так, щоб повітряний мішок перебував нагорі, шкаралупу над ним стерилізують.
2. За допомогою ножиць шкаралупу зрізають трохи вище межі повітряного простору.
3. Обережно видаляють пінцетом шкаралуп'яну оболонку, після чого хоріоналантоїсну оболонку проколюють пастерівської піпеткою в тому місці, де немає судин, і відсмоктують алантоїсну рідину.
4. Алантоїсну рідину переносять до стерильної пробірки, а частину засівають на бульйон для перевірки на бактеріологічну стерильність.
Зараження в порожнину амніону
Для зараження використовують ембріони 7-12-денного віку. Зараження в амніотичну порожнину проводять відкритим або закритим методом.
Техніка відкритого методу зараження:
1. Яйце поміщають на підставку і проводять стерилізацію шкаралупи в області тупого кінця.
2. Над центром повітряного простору в шкаралупі ножицями вирізують віконце величиною 2 см в діаметрі.
3. Обережно знімають внутрішній листок шкаралуп'яної оболонки за допомогою пінцета, оголюючи підлягаючу хоріоналантоїсну оболонку.
4. Прорізають ножицями невеликий отвір в хоріоналантоїсній оболонці в тому місці, де немає кровоносних судин, і вводять в проріз очний пінцет. Пінцетом захоплюють оболонку амніону і витягають амніотичний мішок над поверхнею хоріоналантоїсної оболонки.
5. Утримуючи амніотичну оболонку в цьому положенні, проводять зараження в порожнину амніону, вводячи шприцом 0,1-0,2 мл розведення вірусу.
6. Отвір в шкаралупі закривають стерильним покривним склом, користуючись для фіксації і герметизації яйця розплавленим парафіном.
Заражені ембріони інкубують протягом 2 діб, відбраковуючи загиблих протягом першої доби. Потім ембріони витримують протягом ночі в холодильнику при 40С.
Техніка розтину ембріона при зараженні в амніотичну порожнину:
1. Простерилізувати місце майбутнього розтину, зрізати шкаралупу трохи вище краю повітряного мішка.
2. Проколоти хоріоналантоїсну оболонку пастерівською піпеткою і видаляють алантоїсну рідину.
3. Захопивши пінцетом амніотичний мішок, проколюють його оболонку голкою шприца або пастерівської піпеткою і відсмоктують амніотичну рідину (від 0,5 до 1,5 мл). У зараженого ембріона рідина повинна бути каламутнішою, між у нормального ембріона, у якого вона прозора.
4. Відібрану рідину переносять в стерильну пробірку. 0,1-0,3 мл засівають в бульйон для контролю на бактеріологічну стерильність.
Культивування вірусів шляхом зараження лабораторних тварин
Чутливі до досліджуваних вірусів тварини називаються експериментальною моделлю. Взяті в досвід тварини повинні бути одного виду, визначеного віку і утримуватись в однакових умовах.
Таблиця - Експериментальні моделі для деяких вірусів
| Найменування вірусу | Експериментальна модель |
| Вірус сказу Вірус Коксаки Вірус поліомієліту Вірус грипу Вірус кліщового енцефаліту | Миші, кролі Миші-сосунки Мавпи, щури Миші, ховрахи Миші |
Для вірусологічної роботи найчастіше використовують так звані «чисті лінії» експериментальних тварин. Вони володіють однотипної спадковістю, мають мінімальне число латентних інфекцій, мають високу сприйнятливістю до вірусів. Особливо чутливі до вірусів тварини-гнотобіонти. Роботу тваринами рекомендується проводити в настільному боксі або в спеціальній операційної віварію. Всі відходи і трупи загиблих тварин автоклавують і спалюють.
При вірусологічних дослідженнях застосовують підшкірне, накожное, внутрішньошкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне, внутрішньовенне, пероральне, інтраназальне, інтрацеребральне зараження лабораторних тварин.
Культури клітин широко застосовуються при діагностиці вірусних інфекцій, у виробництві вакцин, незамінні при проведенні наукових досліджень в області вірусології. Культура клітин - клітини будь-якої тканини тварин або людини, здатні рости і розмножуватися в штучних умовах. Для успішного отримання клітинних культур і подальшого розмноження в них вірусів культивовані клітини повинні постійно перебувати в збалансованої фізіологічному середовищі, що містить всі необхідні компоненти для їх життєдіяльності і розмноження. Поживні потреби клітин забезпечуються наявністю незамінних амінокислот (таких, як глутамат, лейцин, ізолейцин, валін, фенілаланін, аргінін, гістидин, метіонін, треонін, цистин, тирозин), вітамінів (особливо комплексу В), глюкози і сироватки крові.
Ізотонічність і буферність середовища підтримується за допомогою неорганічних солей. Оптимальним є рН 7,2-7,4, при тривалому культивуванні клітин значення рН має залишатися в межах 6,8-7,8. Сталість рН протягом декількох днів забезпечується присутністю карбонатного і фосфатного буферів. Стабілізації значення рН сприяє вирощування культур в пробірках і флаконах, закритих гумовими пробками, внаслідок чого не випаровується СО2 (в іншому випадку це призвело б до зсуву рН в лужну сторону).
Контроль за реакцією середовища здійснюється шляхом додавання індикатора фенолрот: при рН 6,8-7,2 середовище має жовтий колір, при рН 7,2-7,4 - оранжево-рожевий, при рН 7,4-7,6 - червоний, при рН 7,7-7,8 - червоно-фіолетовий.
Під час приготування клітинних культур до сольових розчинів і живильних середовищ нерідко додають антибіотики, щоб уникнути бактеріального і грибкового забруднення. Застосовують пеніцилін і стрептоміцин (по 60 000 ОД / мл), тетрациклін, доксициклін, інші антибіотики широкого спектра дії в концентрації 0,1-0,01 мг / л; протигрибкові антибіотики - ністатин (20 ОД / мл) і фунгізон.
Для приготування живильного середовища потрібна вода високого ступеня очищення, тому що культура клітин дуже чутлива до іонів важких металів. Рекомендується застосовувати бідистильовану воду, яку переганяють в скляних апаратах або очищену в іонообмінних колонках.
Роботу з культурами клітин проводять в ретельно обробленій «вірусологічній» посуді зі спеціальних сортів скла або пластиковому посуді з полістиролу для одноразового використання.
Приготовлену культуру клітин інкубують в термостаті при температурі 36,0-38,50С.
Живильні середовища
Живильні середовища для клітинних культур в більшості випадків готують на основі сольових розчинів, які мають склад солей, якісно і кількісно наближається до складу рідин тваринного організму.
Таблиця - Склад основних сольових розчинів (в г на л)
| Речовини | Розчин Хенксу | Розчин Ерла |
| NaCl | 8,0 | 6,8 |
| KCl | 0,4 | 0,4 |
| CaCl2 | 0,14 | 0,2 |
| MgSO4×7H2O | 0,1 | 0,1 |
| MgSO4×6H2O | 0,1 | - |
| NaH2PO4×H2O | - | 0,125 |
| NaH2PO4×2H2O | 0,06 | - |
| KH2PO4 | 0,06 | - |
| Глюкоза | 1,0 | 1,0 |
| Фенолрот (не завжди) | 0,02 | 0,05 |
| NaHCO3 | 0,35 | 2,2 |
розрізняють:
1. Природні поживні середовища (застосовуються рідко).
Природні поживні середовища готують на основі сольових розчинів Хенкса і Ерла, до яких додають сироватку, амніотичну рідину, ембріональний екстракт. Ці біологічні рідини є джерелами білкового харчування, вітамінів та інших речовин, які сприяють зростанню і розмноженню клітин. Наприклад, середовище для культивування клітин HeLa: сироватка людини - 50%, курячий ембріональний екстракт - 2%, розчин Хенкса - 48%.
2. Ферментативні гідролізати білкових речовин.
В середовища додають ферментативні гідролізати: лактальбумина, казеїну, білків крові великої рогатої худоби.
3. Синтетичні поживні середовища, які відрізняються складним складом:
Середовищі 199 (Паркера) містить 20 амінокислот, 17 вітамінів, пуринів і піримідинів, глюкозу, 9 мінеральних солей і ряд інших речовин. Цієї середи готують на сольовому розчині Хенкса, стерилізують фільтруванням через бактеріальні фільтри.
Середа Ігла містить 13 амінокислот, 4 катіона, 3 аніону, 6 вітамінів, холін, інозит і вуглеводи.
Типи клітинних культур
Для приготування культур клітин використовують різні тканини тварин, людини і птахів як ембріональні, так і зрілі. Крім нормальних використовують і злоякісні перероджені тканини, отримані з пухлин.
Джерелом ембріональної тканини часто слугує курячий зародок, а також ембріони людини, мишей, свиней, кролів та ін. Ембріональна і пухлинна тканини відрізняються кращим виживанням і більш активним ростом, ніж тканини дорослого організму. Зі зрілих тканин найчастіше вживається ниркова тканина (мавп, морських свинок, хом'яків і ін.), Амніотична оболонка людини.
Тканини беруть в асептичних умовах, промивають в сольовому розчині Хенкса і потім піддають подрібнення. У вірусології використовують тільки культури зростаючих тканин, які поділяють на:
1. Культури фіксованих шматочків тканин.
2. Одношарові культури клітин:
а) первинні культури клітин;
б) перещеплювані (стабільні) культури клітин;
в) культури диплоїдних клітин.
3. Культури суспендованих клітин.
Частіше в практичній вірусології використовують одношарові культури, клітини яких ростуть і розмножуються будучи прикріпленими до твердого субстрату (скла, пластику), утворюючи шар товщиною в одну клітку (моношар). Метод обробки одношарових культур клітин заснований на обробці вихідної тканини ферментами (зазвичай трипсином), що руйнують міжклітинні зв'язки; тканину диспергують, і утворюється суспензія ізольованих клітин. При культивуванні клітини прикріплюються до скла судини і ростуть у вигляді суцільного моношару, завдяки чому зручно впливати на клітини, заражаючи їх вірусами, і візуально спостерігати виникають зміни в динаміці.
а) Первинні культури клітин здатні розмножуватися тільки в першій генерації
Методика отримання первинних культур фібробластів курячого ембріона
1. Яйця, інкубовані 7-11 днів, овоскопують. Переконавшись в життєздатності ембріона, окреслюють кордон повітряного мішка.
2. Шкаралупу на тупому кінці яйця протирають спиртом, йодом, знову спиртом, а потім зрізають на рівні повітряного мішка.
3. Мають ембріон і поміщають його в стерильну чашку, видаляють голову. Тіло ембріона омивають 3-5 мл розчину Хенкса, який потім відсмоктують.
4. Тіло ембріона ретельно подрібнюють ножицями, отримані шматочки (розміром близько 1 мм 3) піпеткою переносять в пробірку.
5. Проводять 2-3-кратне відмивання подрібненої тканини від крові. Щоразу наливають в пробірку з тканиною по 2-3 мл розчину, дають тканини осісти, після чого рідина відсмоктують.
6. До відмитої тканини додають 3 мл 0,25% розчину трипсину і ретельно перемішують вміст пробірки за допомогою «піпетування» або енергійного струшування. Завдяки трипсину клітини тканини роз'єднуються і утворюють суспензію, тому після осідання більших тканинних частинок на дно пробірки рідина над осадом повинна залишитися каламутній.
7. Верхній помутнілий шар рідини, що містить суспензію ізольованих клітин, переносять в центрифужную пробірку, куди заздалегідь наливається 2,5 мл живильного середовища гідролізату лактальбуміну. Проводять центрифугування при 1 000 об / хв протягом 10-15 хвилин.
8. Надосадову рідину видаляють, до осаду клітин додають 2-3 мл гідролізату лактальбуміну і ретельно перемішують, щоб клітини знову опинилися в підвішеному стані. Для відділення конгломератів клітин, які можуть потрапити під суспензію, рекомендується наступне фільтрування через сітку з нержавіючої сталі або марлю.
9. Проводиться підрахунок клітин в камері Горяєва під малим збільшенням мікроскопа. Визначивши концентрацію клітин у суспензії, її розводять гидролізатом лактальбуміна до 400 000 клітин в 1 мл.
10. Завись розливають в пробірки по 1 мл, закривають гумовими пробками і поміщають в термостат при 370С в похилому положенні під кутом 50.
Через 3-4 доби від початку культивування, переглядають пробірки при малому збільшенні мікроскопа. Спостерігають витягнуті клітини - фібробласти, які ростуть на стінці пробірки, утворюючи моношар.
б) перещеплювані культури клітин (лінії клітин)
Це стабільні культури клітин, які здатні нескінченно довго розмножуватися поза організмом, якщо їх культивувати у відповідних умовах. Наприклад, перещеплювані культури з амніону людини (FL, А-8), нирки мавп (VERO - від зеленої мавпи, LLCMK 2 - від макаки-резус), ембріона миші (ЗТЗ), з пухлинних клітин людини (HeLa - з раку шийки матки , Нер-2 - з раку гортані) і багато інших.
Перещеплювані культури клітин мають цілу низку переваг в порівнянні первинними. Робота з ними менш трудомістка, вони відрізняються великим діапазоном чутливості до багатьох вірусів. Однак перещеплювані культури не придатні для виробництва вірусних вакцин, так як існують побоювання з приводу їх можливої злоякісності.
Перещеплювані культури клітин без пересіву на свіжу середу досить швидко дегенерують. Тому вихідну культуру клітин вирощують в матрацах з живильним середовищем, щотижня пересіваючи культуру в нові судини. При роботі з пробірочними культурами також рекомендується пересівати їх через 7-8 днів, або ж раз в 3-4 дня замінювати живильне середовище свіжої, тоді клітинні культури зберігають свою життєздатність 2-3 тижні.
Для культивування перещеплюваних культур клітин застосовують середовище 199 (часто з додаванням 10% бичачої сироватки), середовище Ігла з додаванням 20% сироватки, 0,5% гідролізат лактальбуміну, що містить 5% телячої сироватки.
в) Культури диплоїдних клітин
Їх називають напівперещеплюваними культурами, тому що вони мають здатність до пересіву протягом тривалого часу - витримують до 40-50 пасажів, які проводилися протягом 8-10 місяців. Потім культура клітин дегенерує і гине. Диплоїдними їх називають, тому що вони стійко зберігають диплоїдний каріотип, властивий вихідним нормальним клітинам організму - родоначальниці диплоїдної лінії.
Культури диплоїдних клітин отримують з різних тканин ембріона людини, з первинних культур. Так, наприклад, користується популярністю штам ДКЛЧ (диплоїдні клітини легенів людини), штами WJT-38, JMR-90, MRC-5 з легких тканини ембріона людини.
Диплоїдні культури застосовують для виділення і культивування вірусів. Вони чутливі до багатьох штамів вірусів, онкогенні безпечні, придатні для культивування в промислових масштабах і отримання масової кількості вірусних вакцин.
Культури суспендованих клітин
Суспендована культура - це культура, в якій окремі клітини або їх конгломерати постійно знаходяться в підвішеному стані в рідкому середовищі.
Культури клітин в суспензії вдається отримати, якщо проводити їх культивування при постійному інтенсивному перемішуванні середовища шляхом обертання пробірок в барабані, за допомогою магнітної мішалки і т.п. Останнім часом використовують спеціальні апарати - хемостати, в яких забезпечується автоматичне оновлення середовища. Суспендовані клітини мають більшу активністю росту, накопичуються у великій кількості, при регулярній заміні середовища тривалий час залишаються життєздатними.
Залежно від характеру досліджуваного матеріалу і особливостей діагностичних тестів методи дослідження, що застосовуються для діагностики вірусних інфекцій, можна розділити на наступні групи: методи експрес-діагностики, прискорені, вірусоскопічні, вірусологічні, серологічні.
В основі більшості методів діагностики вірусних інфекцій лежить реакція взаємодії вірусних антигенів і гомологічних антитіл в рідкому середовищі (РГГА, РІГА, РОНГА, РТОНГА, РІА), в гелі (РПГ, РРГ, РІЕФ), при фіксації одного з інгредієнтів на твердій основі (РІФ, РГАДС, РТГАДС). Для підвищення чутливості еритроцитів антигени або антитіла адсорбують на еритроцитах (РІГА, РОНГА, РТОНГА, РГАДСТО, РРГ), прив'язують до них ферменти (ІФА), ізотопи (РІА, РПГ), флюорохром (РІФ) або ж використовують принцип лізису еритроцітів під час взаємодії антигенів і антитіл у присутності комплементу (РЗК, РРГ).
Методики перерахованих реакцій детально описані в розділах, присвячених серологічній діагностиці і виявленню і ідентифікації вірусів в культурах клітин. Наводимо їх особливості і модифікації, які застосовуються при діагностиці саме вірусних інфекцій.
Лабораторна діагностика вірусних інфекцій включає наступні етапи: 1) експрес-діагностику, яка дозволяє виявити вірус безпосередньо в пробах, узятих від хворого, і дати відповідь через декілька годин; 2) виділення вірусу біологічними методами з подальшою його ідентифікацією; 3) серологічне дослідження для виявлення наростання титру специфічних антитіл.
Вибір методів лабораторної діагностики визначається в основному характером захворювання і особливостями збудника і розв'язується у кожному конкретному випадку залежно від періоду хвороби і можливостей лабораторій.
Для експрес-діагностики і виділення вірусів важливо взяти матеріал у хворого якомога раніше. Досліджують вміст везикул, пустул, зіскоби епітелію, спинномозкову рідину, фекалії, мазки і змиви з верхніх дихальних шляхів.
Проби для дослідження потрібно брати, дотримуючись правила асептики, щоб запобігти внесенню сторонньої мікрофлори і не інфікувати себе. Зберігають проби у вологому стані на холоді і пересилають в контейнерах з сухою кригою. Якщо проби не можуть бути негайно використані, слід їх заморозити, бажано при температурі — 70 оС. Такі матеріали, як мазки з носової частини глотки і зіскоби з уражених ділянок шкіри, занурюють в стабілізуюче середовище (ізотонічний розчин натрія хлориду з нейтральним рН, містить білок і антибіотики). Можна використовувати також живильні середовища і розчин Хенкса з добавкою 10 % інактивованої бичачої сироватки, антибіотиків для пригнічення супутньої мікрофлори.
Для виявлення антитіл беруть з дотриманням правил асептики стерильним сухим шприцом 15—20 мл крові, не добавляючи антикоагулянтів і консервантів, оскільки вони можуть вплинути на результати серологічного дослідження. Цільну кров не можна заморожувати, оскільки це веде до гемолізу. Сироватку зберігають при температурі —20 оС. Наростання титру антитіл визначають шляхом дослідження парних сироваток.
Електронна мікроскопія (ЕМ) використовується для діагностики вірусних інфекцій, збудники яких характеризуються типовою морфологією (віруси віспи) або в тих випадках, коли їх не вдається культивувати звичайними методами (віруси гепатиту А і В, ротавіруси). Віруси, що містяться в досліджуваному матеріалі, очищають і концентрують ультрацентрифугуванням, колонної хроматографії, адсорбцією за допомогою сорбентів і специфічних антитіл. Останній спосіб покладений в основу імунної електронної мікроскопії (ІЕМ).
Препарати для ЕМ готують методом негативного контрастування. Для цього змішують рівні об'єми вірусної суспензії і 1 % розчину фосфорно-вольфрамової кислоти на формвуглеродній підкладці. «Фарба» оточує вірусну частинку і контрастує зовнішню оболонку віриону, а іноді проникає всередину капсида, внаслідок чого одержують профільне зображення зовнішньої оболонки. Для виявлення вірусів в біологічному матеріалі застосовують також метод ультратонких зрізів.
ІЕМ дозволяє виявити специфічне поєднання антитіл з вірусними антигенами. Перевагою цього методу є одночасна концентрація вірусу і його ідентифікація за допомогою специфічної сироватки. Запропоновані модифікації ІЕМ передбачають обробку вірусвміщуючого матеріалу антисироваткою у високому титрі, додавання до осаду фосфорно-вольфрамової кислоти або урацилацетату з подальшим нанесенням на плівку (підкладку) і висушуванням. При електронній мікроскопії видно скупчення вірусних часток.
ІЕМ використовують для виявлення в біологічному матеріалі поліовірусів, цитомегаловірусів, вірусів гепатиту А і В, аденовірусів в тканині мигдалин, некультивованих ентеро- і ротавирусов у фекаліях, вірусів віспи у віспяному детриті.
Імуноелектрофорез широко застосовується для виявлення поверхневого антигена (HBSAG) в сироватках хворих гепатитом В, а також для виявлення інших вірусних антигенів, що мають негативний заряд.
На скляну пластину наносять шар агару. Після затвердіння в ньому вирізують паралельно низку лунок. Антиген поміщають в лунки, розташовані ближче до катода, а антитіла — в лунки, що знаходяться ближче до анода і проводять електрофорез. HBSAG, маючи негативний заряд, пересувається до анода, а антитіла — до катода. Потім скло поміщають у вологу камеру і через 12—24 ч враховують результати реакції за лініями преципітації між антигеном і антитілом.
Реакція зв’язування комплементу (РЗК) у вірусології використовується для ретроспективної діагностики багатьох вірусних інфекцій на підставі виявлення специфічних антитіл в парних сироватках крові людей, а також для визначення вірусспецифічних антигенів в різних матеріалах, отриманих від хворих.
Особливостями РЗК у вірусології є здійснення поєднання комплементу на холоді (протягом ночі при температурі +4 ‘З), а також включення додаткового контролю з так званим нормальним антигеном (антигени з кліток, в яких вірус репродукувався). Цей антиген використовується в тому ж розведенні, що і вірусний. Робоче розведення комплементу готують ex tempore, за 1—2 ч до використання, і бережуть при температурі 4оС. Реакцію можна ставити мікрометодом.
Реакцію імунофлюоресценції (РІФ) застосовують в прямому і непрямому варіантах для виявлення вірусу в матеріалі, отриманому від хворих в інфікованих культурах кліток і організмі тварин.
Реакція радіального гемолізу (РРГ) заснована на гемолізі сенсибілізованих антигеном еритроцитів під впливом вірусспецифічних антитіл у присутності комплементу в агарозном гелі. Метод широко застосовується для серологічної діагностики грипу, низки інших респіраторних інфекцій, краснухи, паротиту, арбовірусних інфекцій, що викликаються тогавірусами.
Агарозу (30 мг) розплавляють в 2,5 мл фосфатного буфера (рН 7,2), охолоджують до 42 оС і змішують з 3 мл сенсибілізованих еритроцитів і 0,1 мл комплементу. Додають 1 краплю борної кислоти. Суміш обережно перемішують і теплою піпеткою місткістю 5 мл розливають на панелі (або склі). Товщина шару не повинна перевищувати 2 мм. Через 3—4 мін після застигання агарози панель закривають кришкою, перевертають і залишають на 30 мін при кімнатній температурі. В застиглій агарозі вирізують отвори за допомогою пробійника і наповнюють їх досліджуваною або контрольною сироваткою. Панель закривають кришкою і поміщають в переверненому положенні у вологу камеру (чаші Петрі із змоченим шматочком вати) при температурі 37 ‘З на 16—18 ч.
Результати реакції враховують за величиною зони гемолізу навкруги отворів, заповнених сироваткою. В контролі гемоліз повинен бути відсутнім.
Для постановки реакції баранячі еритроцити відмивають фосфатним буфером (рН 7,2) і готують 0,3 мл 10 % суспензії з оптимальним для даного вірусу рН (наприклад, для вірусу кліщового енцефаліту рН 6,2— 6,4). До еритроцитів добавляють 0,1 мл нерозведеного антигену, ретельно змішують і залишають при кімнатній температурі на 10 хв. Сенсибілізовані еритроцити обробляють центрифугуванням протягом 10 хв при 1 000 об/хв, осад відмивають фосфатним буфером (рН 7,2) і ресуспендують в 0,3 мл боратнофосфатного буфера (рН 6,2—6,4).
Реакція гемадсорбціи на твердій основі (РГАТО) є модифікацією РЕМА і РИГА. Висока чутливість реакції дозволяє застосовувати її для експрес-діагностики вірусних інфекцій.
Реакцію проводять за наступною методикою. Лунки полістиролових панелей одноразового використання обробляють імунним глобуліном (імунною сироваткою) і вносять в них суспензію досліджуваного матеріалу, що містить антиген. Через 30—60 хв лунки багато разів промивають буфером, додають суспензію еритроцитів, покритих специфічним імуноглобуліном, і після 30—60 хв визначають наявність гемаглютинації.
В тому випадку, якщо в матеріалі міститься специфічний антиген, він з'єднується з сироваткою, адсорбованою на поверхні лунок, і, у свою чергу, зв'язує імуноглобулін и на поверхні еритроцитів. В результаті відбувається агрегація еритроцитів (гемаглютинація).
В описаній модифікації реакція застосовується для виявлення антигенів ротавірусів і інших ентеровірусів у фекаліях хворих.
1 2 3