ГЛАВА 2
МЕТОДИКА И ТЕХНИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Техника отбора проб воды для биотестирования
Для получения достоверной информации о токсичных свойствах пробы, ее необходимо правильно отобрать и хранить до выполнения теста. В связи с этим нужно учитывать следующие обстоятельства - отбор проб воды на определение токсичности должен проводиться в количестве не меньше 1 л в герметическую стеклянную посуду с разных точек.
Универсальных рекомендаций по поводу того, сколько можно хранить пробы для биотестирования, нет. Однако желательно, чтобы это время было максимально малым, иначе многие соединения в пробе могут изменить свои свойства (например, окислиться, восстановиться, соединиться с другими веществами). Только в этом случае свойства самих проб не претерпят существенных изменений, и выполнение биотестирования будет иметь смысл. Однако для большинства химикатов время, за которое они видоизменяются, не известно. Необходимо учитывать также и биологическую составляющую проб. Населяющие их организмы могут погибнуть и начать разлагаться, в результате чего в пробе могут скопиться летальные уровни аммония. Бактерии, присутствующие в пробе, могут утилизировать часть поллютантов и тем самым снизить их концентрацию.
При выполнении биоиндикационных исследований обычно ставят отрицательный контроль, который представляет собой пробу, заведомо нетоксичную для тест-объектов и в которой они могут нормально функционировать. Результаты контрольных тестов подвергаются обязательному статистическому сравнению с результатами тестов, выполненных на исследуемых пробах. Только наличие статистически значимых различий между контрольными и изучаемыми пробами позволяет говорить о токсичности последних.
2.2. Методика биотестирования по снижению
прироста количества инфузорий
Методика определения токсичности основана на установлении различия между количеством инфузорий в анализируемой пробе (опыт) и количеством инфузорий в 0,1 % растворе натрия хлористого (контроль).
Критерием токсичности является достоверное снижение коэффициента прироста инфузорий в опыте по сравнению с контролем за 24 ч (условно «острая токсичность») и 96 ч (условно «хроническая токсичность») биотестирования.
Характеристики погрешности установлены по результатам внутрилабораторного эксперимента с использованием эталонного вещества - калия двухромовокислого (К2Сr2О7).
Объем пробы воды (водной вытяжки) для определения токсичности должен быть не менее 100 см3.
Для контроля и приготовления разбавлений проб воды (водной вытяжки) используют 0,1% раствор натрия хлористого в дистиллированной воде. Результаты биотестирования учитывают, если ЭК50 за 24 ч калия двухромовокислого (К2Сr2О7) для культуры инфузорий находилась в диапазоне его концентраций 0,1 - 0,5 мг/дм3.
Для биотестирования используют лабораторную культуру инфузорий Paramecium caudatum J.
Культивируют инфузорий в пробирках в термостате. Инфузорий культивируют на питательной среде следующего состава (табл. 2.2.1).
Питательную среду готовят следующим образом. Пептон растворяют в 200 см3 дистиллированной воды и фильтруют через фильтровальную бумагу или вату. Глюкозу и натрий хлористый растворяют отдельно в 50 см3 и фильтруют через фильтровальную бумагу.
Таблица 2.2.1
Состав питательной среды для культивирования инфузорий
| Вещество | Концентрация, г/дм3 дистиллированной воды | Вещество | Концентрация, г/дм3 дистиллированной воды |
| Глюкоза | 5,0 | Натрий хлористый | 1,0 |
| Пептон бактериальный | 20,0 | Дрожжевой экстракт | 1,0 см3/дм3 |
Для приготовления дрожжевого экстракта в 1 дм3 кипящей дистиллированной воды вносят 25 г дрожжей и кипятят 5 мин.
Полученные растворы пептона и глюкозы смешивают и добавляют дрожжевой экстракт. Общий объем среды доводят дистиллированной водой до 1,0 дм3. После перемешивания измеряют рН среды и доводят ее до рН 7,1 добавлением 2 н натрия гидроокиси (NaOH). Среду разливают в пробирки по 5 см3.
Культуру инфузорий вносят в пробирки с питательной средой в количестве 0,04 см3 и помещают в термостат при температуре (27+1) °С. Каждые 7-10 дней культуру инфузорий пересевают на свежую питательную среду.
Для биотестирования используют 3-суточную культуру инфузорий, выращенную на питательной среде, состав которой указан в таблице 8.1. Плотность суспензии клеток в культуре должна составлять (6-8·104) кл/см3.
Периодически в процессе культивирования (не реже одного раза в месяц), определяют пригодность культуры инфузорий для биотестирования. Для этого устанавливают среднюю эффективную концентрацию (ЭК50) раствора эталонного вещества К2Сr2О7 за 24 ч биотестирования. Готовят исходный раствор с концентрацией 1,0 г К2Сr2О7 в 1 дм3 0,1 %-ого раствора натрия хлористого. Далее, разбавляя исходный раствор 0,1%-ным раствором натрия хлористого, готовят серию растворов с концентрациями К2Сr2О7 от 0,1 до 1,0 мг/дм3.
Выполнение биотестирования. В три пробирки вместимостью 10-15 см3 наливают по 5 см3 пробы воды (водной вытяжки) или раствора вещества (смеси веществ) - опыт. Другие три пробирки заполняют таким же объемом 0,1% раствора натрия хлористого - контроль.
В каждую из опытных и контрольных пробирок капиллярной пипеткой добавляют 0,04 см3 (2 капли) 3-х суточной культуры инфузорий и определяют исходное количество клеток в контроле и опыте.
Подсчет инфузорий в камере Горяева
Подсчет инфузорий в камере Горяева выполняют в следующей последовательности. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, продувая воздух через пипетку. Этой же пипеткой отбирают суспензию инфузорий из пробирки, наносят по одной капле на сетки в счетной камере и фиксируют клетки 5%-м спиртовым раствором йода. Для этого конец стеклянной палочки смачивают раствором йода и затем касаются им капель суспензии на сетках камеры. Затем камеру накрывают покровным стеклом, которое притирают по бокам до появления колец интерференции. Через 1-2 мин начинают подсчет инфузорий в пяти больших (или восьмидесяти малых квадратах), расположенных по диагонали сетки счетной камеры. Из каждой контрольной и опытной пробирки подсчитывают не менее трех капель.
После определения исходного количества инфузорий пробирки помещают в термостат при температуре (27±1)°С. Биотестирование может длиться 24 или 96 ч.
Индекс токсичности определяют по степени выживаемости инфузорий. Степень резистентности инфузорий (V) рассчитывают по формуле:
V=
где Nt среднее арифметическое значение количества инфузорий в опытном образце, в экземплярах;
No среднее арифметическое значение инфузорий в контроле, в экземплярах.
ГЛАВА 3
АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. Влияние условий вращения на жизнеспособность и чувствительность дафний к модельным токсикантам
Увеличение плотности посадки инфузорий, необходимое для повышения статистической достоверности получаемых результатов, с одной стороны, может привести к возникновению стрессовой ситуации в результате возникновения дефицита кислорода.
Результаты проведенных экспериментов с бихроматом калия, представленные в таблице 3.1.1, убедительно свидетельствует, что при увеличении числа тест-организмов в том же объеме пробы выживаемость инфузорий в присутствии токсикантов возрастает, а смертность, как показатель токсичности, снижается. При этом близкие значения выживаемости инфузорий наблюдаются в вариантах опыта, в которых 3-кратному повышению концентрации токсиканта.
Таблица 3.1.1.
Влияние плотности посадки на выживаемость инфузорий (в %) в среде с различными концентрациями модельных токсикантов.
Объем среды – 50 мл, время экспонирования 48 часов
| Количество инфузорий, экземпляров | Концентрация бихромата калия, мг/л | ||
| Процент выживаемости инфузорий | |||
| 2,0 | 1,0 | 0,5 | |
| 3 | 27,5 | 55 | 67 |
| 15 | 42 | 84 | 87 |
| 75 | 45 | 97 | 99 |
Критерием острой токсичности или пороговой токсичности была гибель 50 и более процентов парамеций в опытном образце по сравнению с контролем в течение 96 часов.
В экспериментах использовали лабораторную культуру инфузорий после предварительной проверки на ее пригодность . Для выявления динамики токсичности в контроле и опытных образцах проводили по три параллельных визуальных определения с периодичностью 1 , 6 , 24 , 48 и 96 часов.
В большинстве контрольных образцов всех серий на момент окончания экспозиции, то есть через 96 часов от начала биотестирования, количество живых особей составляло 90-92 %, что не противоречит методике.
Исследование действия эталонного токсиканта, бихромата калия, на степень выносливости парамеций, показали существенные изменения в чувствительности культуры. Как видим с таблицы 3.1.1, в начальной пробе бихромат калия в концентрациях 0,5 и 1 мг/л не проявлял токсического эффекта на инфузорий. При увеличении концентраций токсиканта отрицательные действия на тест-культуру значительно усиливаются. Что дает возможность сделать вывод о достаточной чувствительности культуры. При этом во всех контрольных вариантах выносливость данного образца культуры парамеций оставалась на уровне 100 %.
Соответствует 5-кратное увеличение плотности посадки. Этот факт указывает на то, что в определенных условиях концентрация токсиканта и плотность посадки инфузорий могут рассматриваться как взаимозаменяемые факторы при установлении дозы токсического воздействия на данные тест-организмы. С учетом этих обстоятельств была принята как оптимальная плотность посадки 15 экземпляров культуры инфузорий на 50 мл тестируемой воды.
Таким образом, проведенные исследования показали, что повышения чувствительности инфузорий к токсикантам можно достичь за счет уменьшения плотности их посадки в тестируемом растворе.
3.2. Отбор проб и проведение биотестирование воды с различных
источников водоснабжения
Пробы воды с источников брали в количестве 1 л. Для Саржин Яр с каждого места по 250 мл (4 бювета), для источника Алексеевский – по 500 мл (2 бювета). Данные источники выбраны потому, что там индекс сапробности ближе 0. В этих источниках превалируют подземные родниковые воды.
Как видно с рис. 3.2.1. тест-реакция определения степени токсичности бутылированной воды «Моршинская» показали, что она является токсичной для инфузорий. Токсичность бутылированной воды «Моршинская» обусловлена присутствием предельной концентрации бикарбонатов. Как указано в заводской этикетки содержание бикарбонатов составляет 200 мг/л (при ПДК=100 мг/л), что имеет негативные последствия для живого организма. Критическая чувствительность тест - культуры на бикарбонаты сопоставима с критическим пределом ПДК, и степень резистентности составляет 5% при экспозиции 96 часов.
К среднетоксичным можно отнести образцы воды источника Саржин Яр, которые имеет степень загрязнения в пределах допустимого ПДК. Полученные результаты в период от 6 до 96 часов показали тенденцию прироста тестовой культуры. Степень резистентности составляет от 20-90%.
Тест-реакция показала, что водопроводная вода относится к слаботоксичным агентам. С этого нельзя делать такие заключения, ведь вода содержит большие концентрации хлорид-ионов, которые имеют сильно выраженный стимулирующий эффект на парамеции.
Благоприятной для тест – культуры является бутылированная вода «Роганская», которая имеет слабовыраженное токсическое действие и степень резистентности парамеций составляет 14-84% (при экспозиции в интервале времени от 6 до 96 часов).
Рис. 3.2.1. Результаты биотестирования воды с различных источников водоснабжения
ВЫВОДЫ
Исследования действия эталонного токсиканта, бихромата калия, на степень чувствительности тест-реакции гибели инфузорий не показали существенных изменений. В начальной пробе с бихроматом калия в концентрациях 0,5 и 1 мг/л токсического эффекта не наблюдали. При увелечении концентраций токсикантов отрецательные действия на тест-культуру значительно увеличивались, что позволило сделать вывод, что данная тест-культура чувствительна и пригодна для проведения биотестирования. В тест-реакции с инфузориями в контрольных вариантах резистентность культуры была в пределах 100%.
Тест-реакция определения степени токсичности бутылированной воды «Моршинская» показали, что она является токсичной для инфузорий и степень резистентности составляет 5% при экспозиции 96 часов.
К среднетоксичным можно отнести образцы воды источника Саржин Яр, которые имеет степень загрязнения в пределах допустимого ПДК. Полученные результаты в период от 6 до 96 часов показали тенденцию прироста тестовой культуры.
Тест-реакция показала, что водопроводная вода относится к слаботоксичным агентам. С этого нельзя делать такие заключения, ведь вода содержит большие концентрации хлорид-ионов, которые имеют сильно выраженный стимулирующий эффект на парамеции.
Благоприятной для тест – культуры является бутылированная вода «Роганская», которая имеет слабовыраженное токсическое действие и степень резистентности парамеций составляет 14-84%.
Наши исследования показали, что метод биотестирования позволяет сделать не только качественный анализ загрязняющего фона природных вод, но и оценить их действия на живые организмы.
ЛИТЕРАТУРА
Авторское свидетельство № 1597722. Способ определения токсичности водных сред/Карасев С. Г., Новосадова Т. Г., Стручкова Н. JI.//Открытия, изобретения. 1990. - № 37. - С. 122.
Айвазова JI. Е. и др. Метод биотестирования водной среды с использованием инфузорий/Айвазова JI. Е., Гроздов А. О., Соколова С. А., Новосадова Т. Г., Трофимова М. ГУ/Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988. - С. 37-42.
Александров В. Я. Методика измерения скорости движения парамеции/Зоологический журнал. 1948 - Т. 27, № 5. - С. 461-464.
Алексеев А. А. и др. Применение парамецийного теста для выявления токсических свойств центральной лимфы/Алексеев А. А., Недошивина Р. В., Кайфаджян М. Л., Клецкина И. 0.//Лабораторное дело. 1981. - № 9. -С. 563-565.
Безценая М.А., Орлов В.Г. Практикум з оцінки забрудненості водних об’єктів. - Л., ЛПІ - ЛГМІ,1983. – 198 с.
Беспамятнов Г. П., Кротов Ю. А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде: Справочник. Л.: Химия, 1985. - 528 с.
Богомолова Н. А. Экспериментальные исследования над свободноживущими и паразитическими инфузориями: Автореф. дис. канд. биол. наук. Л., 1952. - 16 с.
Бойкова Э. Е. Применение простейших в токсикологических ис-следованиях//Экспериментальная водная токсикология. Рига: Зинатне. -1991. - Вып. 15. - С. 155-164.
Болдырева Н. М. Оценка качества природных и сточных вод по биологическим показателям//Комплексный глобальный мониторинг состояния биосферы: 3-й Международный симпозиум, Ташкент, 13-20 октября 1985: Тезисы докладов. М.: 1985. - С. 106-107.
Болдырева Н. М. Метод биотестирования сточных и природных вод на культуре инфузорий//Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988.-С. 42-43.
Бурковский И. В. Экология свободноживущих инфузорий. М.: МГУ, 1984. - 208 с.
Владимиров А.М. Охрана окружающей среды. -М.: Прогресс. – 1990. – 296 с.
Голубец М..А. Актуальные проблемы экологии. К.: Наукова думка. – 1992. – с. 9-23.
Гореев Л.Н. Методика оптимизации природной среды. М.: Прогресс. – 1993. – 165 с.
Гродзинський М.Д. Основи ландшафтної екології.Підручник. - К.: Либідь, 1993. - 224 с.
Давыдов А., Кузнецов Г. Знай, люби, береги…. К.: Веселка. – 1979. – сс. 20-21, 63-65, 104-109.
Екологія та безпека. Довідник. М. ВНІІПІ. 1992. – 645 с.
Материалы державної інспекції екологічної безпеки Вовчанського району.// Вовчанськ. – 2000-2003 рр. – 47 с.
Нікітін Д.П., Новіков Ю.В. Навколишнє середовище та людина. - М.: Вища школа, 1986 – 414 с.
Новиков Ю.В. Проблемы использования и охраны водных ресурсов.
Чорик Ф. П. Место инфузорий в сапробной системе водных организмов//Охрана рыбных запасов и увеличение продуктивности водоемовюжной зоны СССР: Материалы межвузовского совещания, Кишинев, октябрь 1969 г. Кишинев, 1970. - С. 217-219.
Чорик Ф. П., Викол М. М. Использование полунепрерывного метода для культивирования инфузорий/Биологические основы культивирования водных организмов. Кишинев, 1983. - С. 35-44.
1 2