4.10. Лактатдегідрогеназа
Лактатдегідрогеназа (L-лактат: НАД-оксидоредуктаза, ЛДГ; КФ 1.1.1.27) каталізує оборотне відновлення пірувату до лактату, як кофермент використовується НАДН.
ЛДГ має молекулярну масу приблизно 134 кДа – це тетрамер, що складається з двох субодиниць – М (muscle – м’язова) і Н (heart – серцева). Субодиниця М виявляється головним чином у тканинах із анаеробним метаболізмом, у той час як субодиниця Н наявна в тканинах, де переважають аеробні процеси. У сироватці крові наявні 5 ізоферментів, що відрізняються складом субодиниць. У порядку зниження їх електорофоретичної рухливості (рух у напрямку до анода) їх позначають як ЛДГ1 (Н4), ЛДГ2 (Н3М), ЛДГ3 (Н2М2), ЛДГ4 (Н1М3), ЛДГ5 (М4). Надлишок як пірувату, так і лактату, що використовується як субстрат, пригнічує активність ферменту, при цьому ефект пірувату вищий.
ЛДГ – гліколітичний цитозольний цинковмісний фермент. Слід зазначити, що оскільки ЛДГ міститься практично в усіх клітинах організму, то вона має низькі диференціально-діагностичні можливості і тому самостійного значення визначення загальної активності ЛДГ не має. У печінці, серці, нирках, скелетному м’язі й еритроцитах активність ЛДГ більше ніж у 500 разів вища, ніж у сироватці крові, тому збільшення загальної активності ЛДГ у сироватці може бути наслідком пошкодження будь-якого з цих органів.
Підвищення показника має місце при широкому спектрі патологічних станів: некрозі тканин, особливо при гострому ураженні серця, ураженні еритроцитів, нирок, скелетних м’язів, печінки, легенів і шкіри. Значним підвищенням активності ЛДГ супроводжуються гемолітичні анемії, пов’язані з дефіцитом вітаміну В12 і фолієвої кислоти. Повільне підвищення впродовж 3–4 днів із подальшим зниженням упродовж 5–7 днів може свідчити про інфаркт міокарда (необхідно, проте, виключити інфаркт легені, пухлину, мегабластну анемію). Підвищення рівня ЛДГ характерне для гострої фази інфекційного гепатиту, однак при хронічних захворюваннях печінки активність ферменту рідко виявляється підвищеною. Цирози, обтураційні жовтяниці, різні захворювання нирок і скелетних м’язів, застійна серцева недостатність дають середні цифри активності. Незначне підвищення активності ферменту відмічається при будь-яких ушкодженнях клітин, що супроводжуються збільшенням проникності мембран (інфаркт міокарда й легені), при лейкозі, лімфомах, хронічних гепатитах. ЛДГ у сечі може підвищуватися в 3–6 разів при хронічному гломерулонефриті, системному червоному вовчаку з ураженням нирок, діабетичному нефросклерозі, пухлинах нирок і сечового міхура. Проте визначення ЛДГ у сечі не практикується через інгібувальну дію на фермент кислого середовища, сечовини й деяких коротколанцюгових пептидів сечі.
Таким чином, загальна активність ЛДГ у сироватці крові не є специфічним тестом для певної патології і тому окреме вимірювання цього показника практично не проводиться у медичній практиці. Тому для диференціальної діагностики захворювань більш доцільно досліджувати зміни спектра ізоферментів ЛДГ і потім оцінювати внесок кожного з них у загальну активність, оскільки вони є більш органоспецифічними.
Нормальне співвідношення ізоферментів ЛДГ у сироватці крові становить: ЛДГ1 – 14–26 %; ЛДГ2 – 29–39 %; ЛДГ3 – 20–26 %; ЛДГ4 – 8–16 %; ЛДГ5 – 6–16 %. Отримані й дещо інші варіанти розподілу ізоферментів ЛДГ у сироватці крові здорових осіб, проте в усіх спостереженнях відсотковий вміст ЛДГ2 у сироватці крові був вищим, ніж ЛДГ1.
У різних тканинах та органах ізоферменти ЛДГ подані в різних співвідношеннях (табл. 3).
Таблиця 3 – Співвідношення (%) ізоферментів ЛДГ
| Ізофер-мент | Серцевий м’яз | Нирки | Еритро-цити | Скелет-ні м’язи | Печінка |
| ЛДГ1 | 60 | 28 | 40 | 3 | 0,2 |
| ЛДГ2 | 30 | 34 | 30 | 4 | 0,8 |
| ЛДГ3 | 5 | 21 | 15 | 8 | 1 |
| ЛДГ4 | 3 | 11 | 10 | 9 | 4 |
| ЛДГ5 | 2 | 6 | 5 | 76 | 94 |
Шостий ізофермент ЛДГ (ЛДГ-Х) виявляється в яєчках дорослих осіб разом із п’ятьма ізоферментами, які містяться в інших тканинах. ЛДГ-Х є тетрамером, що складається із 4 ідентичних Х-субодиниць, які відрізняються за амінокислотним складом від Н- і М-субодиниць. ЛДГ-Х має рухливість, проміжну відносно рухливості ЛДГ3 і ЛДГ4. Цей ізофермент, імовірно, пов’язаний із сперматогенезом. 80 % активності ЛДГ сперматозоїдів зумовлено цим ізоферментом.
Кількість ізоферментів можна визначити за допомогою електрофоретичних, імунологічних, кінетичних методів або шляхом хроматографії.
Найбільш поширений метод електрофорезу на гелі агарози або на плівках із ацетату целюлози. Найбільшу роздільну здатність і чутливість має метод іонообмінної хроматографії, він використовується як референтний відносно електрофорезу. Запропонований також метод імунопреципітації з використанням антитіл проти всіх ізоферментів, що містять М-субодиницю (ЛДГ2–ЛДГ5). У цьому випадку активність цих ізоферментів не виявляється, залишається активною тільки ЛДГ1. Результати визначення ЛДГ1 цим методом тісно корелюють із результатами електрофорезу й хроматографії, а діагностична специфічність методу для інфаркту міокарда становить 94 %. Іншим, порівняно новим методом виявлення активності ЛДГ1 є використання суміші, що пригнічує активність усіх ізоферментів, які містять М-субодиницю. Такою сумішшю є: 1,6-гексанедіол (700 мМ), перхлорат натрію (825 мМ) і хінідинтіоціанат (190 мМ). Результати також тісно корелюють із даними електрофорезу та імуноінгібування.
ЛДГ1 найшвидше просувається до анода при електрофорезі, є термостабільною, інгібується високими концентраціями пірувату та меншою мірою сечовиною й оксалоацетатом. Реакція перетворення лактату на піруват, що каталізується ЛДГ1, відбувається в органах із переважно аеробним метаболізмом, де лактат є субстратом окиснення. Із нього утворюється піруват, який потім через ацетил-СоА окиснюється до СО2 і Н2О, при цьому енергія акумулюється у вигляді молекул АТФ у процесі окиснювального фосфорилювання. ЛДГ1 наявний у високих концентраціях у серці, нирках, мозку, багато ЛДГ1 в еритроцитах. Тому гемоліз недопустимий при визначенні активності ЛДГ1.
Оскільки ЛДГ може окиснювати також α-гідроксибутират до α-оксибутирату (в цьому випадку говорять про α-гідроксибутиратдегідрогеназну активність (α-ГБДГ)), то як аналог ЛДГ1 часто рекомендується визначення α-ГБДГ, хоча активність α-ГБДГ дещо вища, ніж ЛДГ1, це пов’язано з тим, що α-ГБДГ-активність мають усі без винятку ізоферменти ЛДГ.
Показник співвідношення α-ГБДГ/ЛДГ у сироватці крові в нормі становить 0,62–0,82. У випадку інфаркту міокарда навіть через 14 діб від початку захворювання, незважаючи на нормальну загальну активність ЛДГ, коефіцієнт відношення α-ГБДГ/ЛДГ залишається підвищеним.
Співвідношення α-ГБДГ/ЛДГ використовується для диференціальної діагностики інфаркту міокарда і нападу стенокардії, легеневої емболії, панкреатиту, перфорації язви, при яких виявляються нормальні або знижені його значення.
При діагностиці інфаркту міокарда збільшення активності ЛДГ є достовірним тестом у період від 12 до 32 годин після больового нападу. Активність ферменту залишається підвищеною впродовж 8–14 днів. У хворих на стенокардію активність ЛДГ у сироватці крові не збільшується. Одноразове дослідження ЛДГ1 має клінічну специфічність стосовно інфаркту міокарда у 66 % випадків, а визначення її в динаміці (через кожні 4–6 годин упродовж доби) – у 86 % випадків. Усі 5 ізоферментів ЛДГ наявні в кардіоміоцитах, вміст ЛДГ1 в ізоферментному спектрі міокарда становить 55–65 %. Викид міокардіальних ізоферментів ЛДГ у сироватку крові приводить до збільшення активності ЛДГ1 і ЛДГ2, при цьому активність ЛДГ1 буде вищою. Якщо в термін від 8 до 24 годин після нападу ангіозних болів немає наростання активності ЛДГ (а також КК-МВ і АсАТ), то немає й інфаркту. У частини хворих спостерігається кореляція між рівнем ЛДГ і обширністю інфаркту. У деяких випадках додаткову інформацію дає коефіцієнт ЛДГ1/ЛДГ2, який у нормі становить 0,6–0,7. При гострому інфаркті міокарда він стає вище 1,0 і повертається до норми через 2–3 тижні. α-ГБДГ при інфаркті міокарда підвищується в ті самі часові інтервали, що й ЛДГ, досягає максимуму на 2–3-й день і відновлюється до норми на 10–20-й день.
Підвищення ЛДГ1 відмічається також при пухлинах репродуктивних органів: тератомі, семіномі яєчка, дисгерміномі яєчника.
Активність ЛДГ зазнає гормонального впливу. Так, великі дози тироксину знижували синтез ферменту, при цьому здебільшого відмічено інгібування синтезу субодиниці М. Норадреналін і адреналін викликають збільшення загальної активності ЛДГ із переважанням активності ЛДГ1 і ЛДГ2. Активність ферменту в крові зростає при дії анаболічних стероїдів і етанолу, а також ряду медикаментозних препаратів – клофібрату, кофеїну, сульфаніламідів та ін.
ЛДГ2, ЛДГ3 і ЛДГ4 мають проміжні властивості. Активність цих ізоферментів підвищується при масивному руйнуванні тромбоцитів (емболія легеневої артерії, масивні гемотрансфузії) і залученні до патологічного процесу лімфатичної системи. При нелімфоцитарних лейкозах збільшується активність ЛДГ3 і ЛДГ4, причому ступінь збільшення залежить від кількості незрілих клітин. Тромбоз легеневої артерії характеризується переважним збільшенням активності ЛДГ3 і менш значним – ЛДГ4. Активність ЛДГ3 підвищується при захворюваннях нирок, ураженнях серцево-судинної системи з переважанням недостатності в малому колі кровообігу, що викликають порушення метаболічних процесів у легеневій тканині. Зростання активності ЛДГ3 іноді спостерігається при гострому панкреатиті. Активність ЛДГ4 зростає при ураженні печінки вірусного, токсичного або травматичного характеру та загостренні хронічних гепатитів, в активну фазу ревматизму, при кардіосклерозі з порушенням гемодинаміки, гострому нефриті, при ураженнях нирок, пухлинах печінки, передміхурової залози, шийки матки, молочної залози, кишечника, при тяжких формах діабету.
ЛДГ5 при електрофорезі просувається до анода повільніше за інші ізоферменти, є термолабільним, більш чутливим до інгібуючого впливу сечовини й оксалоацетату та має найменшу спорідненість до α-кетобутирату (порівняно з іншими ізоферментами ЛДГ). Найбільший уміст цього ізоферменту характерний для скелетних м’язів, печінки, шкіри, слизових оболонок, а також клітин деяких злоякісних пухлин. Значне збільшення вмісту ЛДГ5 відмічається при травмах, запальних і дегенеративних захворюваннях м’язів і багатьох хворобах печінки (гепатити, цирози та ін.). Онкологічні захворювання (наприклад, лімфолейкози) можуть також супроводжуватися збільшенням ЛДГ5. Активність ЛДГ5 підвищується в активну фазу ревматизму, при значному ураженні нирок, що супроводжується їх гіпоксією, пухлинах нирок і відторгненні пересадженої нирки, а також при тяжких формах діабету.
Останнім часом описано багато випадків низької активності ЛДГ у сироватці крові. Існують дві групи причин, що зумовлюють зниження активності ферменту в крові та тканинах. Одна з них пов’язана з наявністю інгібітора в сироватці крові, інша – з генетичними порушеннями. Дійсно, в сироватці крові навіть практично здорових дорослих людей існує термозалежний інгібітор, наявність якого знижує активність ЛДГ. При дослідженні 20000 зразків сироватки крові виявлено 42 випадки низької активності ЛДГ. Інгібіторами активності ЛДГ крові є IgG, IgA, IgM. Описані випадки утворення антитіл до ЛДГ під час приймання сульфаніламідних препаратів; після відміни препаратів антитіла зникали. Низька активність ЛДГ у сироватці крові може бути пояснена не тільки інгібуванням, але й зменшенням часу перебування в крові, швидкою елімінацією імунних комплексів із циркуляції.
Вторинна причина низької активності ЛДГ у сироватці крові і тканинах пов’язана з генетичними порушеннями. Описані особливі варіанти Н-субодиниць у американських індійців, ферментативно неактивні, оскільки у складі тетрамеру була наявна тільки одна активна субодиниця. Повна відсутність Н- або М-субодиниць відмічена в японській популяції. Поширеність гетерозигот із дефіцитом субодиниць ЛДГ становить 0,15–0,2 %. Клінічно гомозиготи із дефіцитом М-субодиниць мають періодичну міоглобінурію після фізичного навантаження, ураження шкіри; пологи у них проходять тяжко.
Зменшення активності ЛДГ викликають також оксалати (що використовуються як антикоагулянти) та сечовина.
Стабільність активності ЛДГ залежить від температури зберігання та складу середовища. Загальна активність ЛДГ знижується на 10 % через 1 добу зберігання при 4 °С. При зберіганні різні зразки сироватки крові значно відрізняються за ступенем зміни загальної активності ЛДГ і співвідношенням її ізоферментів. Є дані, що зберігання проб замороженими призводить до значних змін у розподілі ізоферментів – зменшення частки малорухливих ізоферментів і збільшення швидких фракцій, що може бути причиною помилкового збільшення відношення ЛДГ1/ЛДГ2. ЛДГ1 і ЛДГ2 зберігають активність незмінною впродовж 10 днів при зберіганні як при 4 °С, так і при -20 °С або 20 °С. Активність ЛДГ4 знижується на 50 % через 48 год зберігання при 4 °С. У цих самих умовах активність ЛДГ5 виявилася зниженою на 72 %. Тому рекомендують визначати активність ЛДГ і співвідношення її фракцій у день взяття крові на аналіз, а якщо такої можливості немає, то зберігати сироватку необхідно впродовж 24 год при кімнатній температурі.
4.11. Лейцинамінопептидаза
Лейцинамінопептидаза (L-лейцилпептидгідролаза, ЛАП, КФ 3.4.1.1) – фермент, що специфічно впливає на N-кінцеві амінокислотні залишки білків. Проявляючи найбільшу активність стосовно субстрату, N-кінцевою амінокислотою якого є альфа-лейцин, фермент руйнує разом із тим пептидні зв’язки білка (N-кінцевих фенілаланіну, триптофану, гістидину або тирозину).
ЛАП лише одна з декількох внутрішньоклітинних амінопептидаз, на яку особливо багаті жовчовивідна система, підшлункова залоза й слизова тонкої кишки.
Фермент проникає в сечу: на думку одних авторів, – із крові за рахунок фільтрації через клубочковий фільтр; на думку інших, – шляхом секреції в сечу клітинами проксимальних канальців нефрону.
ЛАП являє собою гетерогенний фермент. Окремі ізоензими, що розміщуються в ділянці альфа-2-, бета- і гамма-глобулінів, містяться в печінці, плаценті та інших органах.
ЛАП відносно специфічна для захворювань гепатобіліарної системи та, як правило, не підвищується при ураженні кісток. Тому визначення ЛАП використовується для диференціальної діагностики захворювань гепатобіліарної системи та кісткової тканини, коли підвищена активність ЛФ. ЛАП – чутливіший показник холедохолітіазу й местастазів у печінку у хворих без жовтяниці, ніж ЛФ. При гострому інфекційному гепатиті активність ЛАП, як і трансаміназ, підвищена вже у продромальному періоді і може в 100 разів перевищувати верхню межу норми. Нормалізація її відбувається пізніше, ніж нормалізація трансаміназ. При хронічному гепатиті, що супроводжується незміненою активністю АсАТ і АлАТ, активність ЛАП підвищена. Її визначення знайшло використання для раннього виявлення інфекційного гепатиту, контролю за його перебігом, установлення особливостей захворювання та ефективності проведеної терапії.
Збільшення активності ЛАП спостерігається при холестазі, перніціозній анемії.
Помітно підвищена активність цього ферменту при обтураційній жовтяниці, метастазах раку в печінку, панкреатиті і холециститі, навіть якщо вони не супроводжуються жовтяницею. Визначення активності ЛАП має таке саме клініко-діагностичне значення, як і визначення активності ЛФ.
Активність ЛАП зростає в останньому триместрі вагітності, що пов’язано з появою плацентарного ізоферменту в сироватці крові (нормалізація настає через 6–8 тижнів після пологів). Активність ферменту в сироватці крові підвищується і при раку підшлункової залози.
У хворих на гострий гломерулонефрит активність ферменту в сечі перевищує норму в 6 разів, у хворих із загостренням хронічного нефриту – у 4 рази. Високий рівень ЛАП у сечі свідчить про нежиттєздатність донорської нирки.
Активність ЛАП у сироватці крові може підвищуватися під час приймання аміназину, естрогенів, оральних контрацептивів, морфіну.
Для визначення активності ЛАП використовують методи кінцевої точки і кінетичні.
Методи кінцевої точки проводяться з використанням:
1) L-лейцил-нафтиламіду (гідрохлориду); р-нафтиламід, що вивільняється при розщепленні L-лейцил-нафтиламіду, визначають за реакцією утворення забарвленого комплексу з альфа-нафтилетилендіаміндигідрохлоридом;
2) лейцингідразиду – гідразин, що виділяється в процесі ферментативного розпаду, утворює в кислому середовищі оранжево-червоний комплекс із р-диметиламіно-бензальдегідом. Збільшення вмісту забарвленого комплексу є мірою активності ЛАП;
3) хромогенних субстратів. 7-α-лейцил-4-метилкумарин-аланід використовується для визначення активності ЛАП при проведенні швидкісної флюориметрії.
Кінетичний метод полягає у використанні L-лейцин-4-нітроаніліду. Про активність ЛАП судять за вивільненням р-нітроаніліну.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ... 20